Summary
Het huidige protocol presenteert experimentele procedures ter stimulering van gekweekte macrofagen te worden begiftigd met capaciteit om moleculaire factoren ter bevordering van de uitgroei van de neurite vrij te geven. Behandeling van kamp tot de neuron-macrofaag co culturen induceert de macrofagen produceren geconditioneerde medium dat sterke neurite uitgroei activiteit bezit.
Abstract
Er zijn sterke aanwijzingen dat macrofagen het herstel of de reparatie van gewonde zenuwstelsel kunnen deelnemen. Hier beschrijven we een protocol waarin macrofagen zijn aangezet te produceren geconditioneerd medium (CM), dat neurite uitgroei bevordert. Volwassen achterwortelganglia ganglion (DRG) neuronen zijn acuut losgekoppeld en verguld. Nadat de neuronen stabiel vastgemaakt zijn, zijn peritoneale macrofagen mede gekweekte op een cel cultuur invoegen die op hetzelfde goed worden bedekt. Dibutyryl die cyclisch AMP (db-cAMP) wordt toegepast op de co culturen gedurende 24 uur, waarna de celcultuur invoegen waarin de macrofagen wordt verplaatst naar een ander goed voor het verzamelen van CM voor 72 uur. De CM vanaf de co culturen behandeld met db-cAMP, wanneer toegepast op een afzonderlijke volwassen DRG neuron cultuur, vertoont robuuste neurite uitgroei activiteit. De CM verkregen uit de db-kamp-testgroep culturen die bestaat uit één celtype alleen, DRG neuron of peritoneale macrofaag, deed niet neurite uitgroei activiteit vertonen. Dit geeft aan dat de interactie tussen neuronen en macrofagen is onmisbaar voor de activatie van macrofagen afscheidende moleculaire factoren met neurite uitgroei activiteit in CM. Dus zullen onze co cultuur paradigma ook nuttig zijn te onderzoeken intercellulaire signalering in de neuron-macrofaag interactie te stimuleren de macrofagen te worden begiftigd met een pro-regeneratieve fenotype.
Introduction
Een aantal studies hebben getracht te verbeteren CNS axon regeneratie na de verwondingen van het ruggenmerg of de hersenen. Ontstekingsreacties, onvermijdelijk bij de verwondingen in het zenuwstelsel, worden traditioneel verondersteld deel te nemen aan secundaire pathologische processen die leiden tot de schadelijke resultaten1,2. Methylprednisolon waarin kan worden onderdrukt ontstekingsreacties is immers de enige erkende therapie voor acute ruggenmerg letsel3. Echter, meer recente studies hebben aangetoond dat de regeneratie of reparatie van gewonde zenuwstelsel4,5,6door macrofagen, een representatieve inflammatoire celtype, kunnen deelnemen. Bijvoorbeeld Infiltrerend macrofagen na een lens letsel produceren pro-regeneratieve moleculen ter bevordering van de regeneratie van de retinale ganglion neuronen7,8. Daarnaast verhoogd getransplanteerde DRG neuronen axon groei van de regio waar de macrofagen waren geactiveerd door zymosan9. Bovendien, de macrofagen op de site van de laesie kunnen leiden tot een groei-tolerante milieu voor gewonde perifere zenuwen10.
Ons werk ook sterke aanwijzingen dat macrofagen tot de capaciteit van axon regeneratie in aangrenzende neuronen bijdragen kunnen geboden. We hebben aangetoond dat de activering van de macrofagen in de achterwortelganglia, bevatten (DRG) zijn essentieel in de verbeterde regeneratief vermogen van DRG sensorische neuronen na een voorbehandeling perifere zenuwen letsel11. Vergelijkbaar onderzoek werd onafhankelijk gemeld uit een ander laboratorium12. We toonden ook aan dat intraganglionic injectie van dibutyryl cyclisch ADENOSINEMONOFOSFAAT (db-kamp), die een bekende molecule is tot vergroting van de capaciteit van axon regeneratie13, de activering van macrofagen veroorzaakt. Het deactiveren van macrofagen afgeschaft de effecten van db-kamp op neurite uitgroei activiteit. Volgende werken geïdentificeerd letsel-geïnduceerde expressie van CCL2 in de neuronen als een signaal aan het stimuleren van macrofagen met een pro-regeneratieve fenotype14,15.
Op basis van de bovengenoemde experimentele resultaten, hebben we een in vitro model lijkt op de moleculaire gebeurtenissen die zich voordoen in de DRG na een conditioneringscycli letsel model11,14opgericht. In dit model wordt db-cAMP toegepast op het neuron-macrofaag co culturen opwekken intercellulaire signalering dat leidt tot de activering van de macrofagen met een pro-regeneratieve fenotype. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen waarmee we kunnen genereren macrofagen die afscheiden van moleculaire factoren ter bevordering van neurite uitgroei (Figuur 1). Deze experimentele model illustreert een concept dat macrofagen kunnen worden gestimuleerd of geïnduceerde ter ondersteuning van axon regeneratie na de verwondingen aan zenuwstelsel. Ons model zal ook nuttig zijn bij het bestuderen van de mechanismen in de intercellulaire signalering die leidt tot de activering van de pro-regeneratieve macrofagen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Ajou University School of Medicine.
1. cultuur voorbereiding van gedissocieerde volwassen DRG Neuron
- Vóór de oprichting van de cultuur, jas vooraf een 6-well plaat met poly-D-lysine en laminin. Na een 6-well plaat met 0,01% poly-D-lysine bij 37° C gedurende 2 uur of bij 4° C een nacht bebroeden. Vervolgens wassen de plaat twee keer met gedestilleerd water.
- Incubeer de plaat met laminin-oplossing bij een concentratie van 3 µg/mL gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, en daarna wassen de plaat twee keer met gedestilleerd water. Droog de plaat bij kamertemperatuur op zijn minst gedurende 1 uur.
- Een muis in een transparante CO2 kamer aangesloten op een gecomprimeerde CO2 gasfles euthanaseren. De huid over de wervelkolom met een chirurgisch mes incise en de paravertebral spieren bilateraal om bloot van de wervel botten te ontleden. Verwijder de Vertebrale botten zorgvuldig met een smalle-tipped chirurgische rongeur totdat de DRG volledig worden blootgesteld.
Opmerking: Volwassen DRG neuronen worden verkregen van volwassen C57BL6 mannelijke muizen leeftijd van 8 weken tot 12 weken oud. - Verwijder de DRG bilateraal uit de S1 helemaal tot op het niveau van de C1 met behulp van iridectomy schaar en pincet boete-tipped onder een Microscoop ontleden. Probeer te snijden de wortels volledig uit DRG om te minimaliseren van besmetting van cellen van Schwann en fibroblasten.
- Bewaar de ontleed DRG in een 60 mm petrischaal met 5 mL van de koude Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) op ijs totdat alle de DRG worden verzameld.
Opmerking: Het is cruciaal voor het ontleden van de DRG zo spoedig mogelijk. De collectie van alle DRG van één muis moet niet langer duren dan 30 min. 30 min na de euthanasie, stoppen met het verzamelen van de DRG en gaat u verder met de volgende stap, zelfs als er nog DRG. - De DRG overbrengen in een 1,5 mL Eppendorf buis met behulp van een blauwe pipette uiteinde (1000 µL) met een licht-donkerscheiding einde. Verwijder de DMEM na een snelle spin voor enkele seconden met behulp van een mini centrifuge. Voeg 1 mL DMEM met 125 U/mL type XI collagenase en de buis gedurende 90 minuten met een zachte rotatie (35-40 rpm) met behulp van een shaker twister in een incubator 37 ° C te incuberen. Immobiliseren de buis op de verdieping van de Schudbeker met behulp van de tape.
- Negeren collagenase-bevattende DMEM en voeg 1 mL verse DMEM. Wacht tot de drijvende DRG helemaal naar beneden naar de bodem zinken, en verwijder de DMEM met het weefsel puin. Herhaal deze stap wassen ten minste zes keer.
Opmerking: Probeer niet te Verwijder het supernatant volledig. Wees voorzichtig niet te verwijderen elke DRG met het supernatant DMEM. - De DRG overbrengen in een conische tube van 15 mL met behulp van een blauwe pipette uiteinde (1000 µL) met een licht-donkerscheiding einde. Daarna Pipetteer zachtjes op en neer minstens 15 keer gebruik van een blauwe tip (1000 µL) om een homogeen celsuspensie. Vermijd bubbels te maken en proberen niet te raken van de onderkant van conische buis met een pipet tip.
- Centrifugeer de buis bij 239 x g gedurende 3 min en zorgvuldig Verwijder het supernatant met zwevend puin. Voeg vervolgens 1 mL van Neurobasal medium aangevuld met B27 (2,0% v/v) en resuspendeer de pellet cel door zachtjes op en neer 5 tot 10 keer pipetteren.
- De celsuspensie passeren door een zeef van 70-µm cel overlay op de top van een conische tube van 50 mL. 2 min wacht, en giet Neurobasal/B-27 medium op de zeef met behulp van een pipet controller.
- Alle verzamelde DRG neuronen (een totaal van ongeveer 2 x 106 DRG neuronen van één muisklik) op twee putjes van 6-well plaat plaat. Deutsche Reichsbahn neuronen van een volwassen muis dekken twee putten in een 6-well-plate. Plaats de plaat dan in een CO2 incubator bij 37 ° C totdat de macrofaag mede culturen.
2. co cultuur van P secund peritoneale macrofagen op A cel cultuur invoegen
Opmerking: Stellen de co culturen 4 uur na het eerste laagje van de gedissocieerde DRG neuronen
- Primaire peritoneale macrofagen zijn bereid uit volwassen C57BL6 mannelijke muizen leeftijd van 8 weken tot 12 weken oud. Een dier in een CO2 kamer euthanaseren. Incise de buikhuid tactvol, bloot het buikvlies en Vermijd het buikvlies om te voorkomen dat een lekkage van vloeistof lavage snijden.
- Het buikvlies met behulp van een injectiespuit met een naald 22G doorprikken en 10 mL ijskoud fosfaatgebufferde salin (PBS) injecteren in de peritoneale holte. Zachtjes masseren het buikvlies voor 1-2 min. Vervolgens trek de naald uit de PBS via de naald punctie site uitstotings en verzamelen de lavage vloeistof in een conische buis van 50 mL.
Opmerking: Vóór gebruik, zet de spuit op het ijs om de kou van de PBS. - Centrifugeer de lavage vloeistof bij 239 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot pellet de cellulaire componenten. Resuspendeer de pellet met 3 mL lysis-buffermengsel van de rode bloedcellen (RBC) gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer dan de celsuspensie weer bij 239 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet met 3 mL PBS en centrifugeer de celsuspensie weer als u wilt verwijderen van alle resterende RBC lysis-buffermengsel.
Opmerking: Zorg ervoor dat de RBC lysis-buffermengsel volledig is verwijderd. Anders kunnen resterende RBC lysis-buffermengsel giftig is voor de gekweekte macrofagen. - Resuspendeer de Ingehuld cellen in 1 mL medium Neurobasal/B-27. Plaat de helft van alle verzamelde macrofagen (een totaal van 3 × 10-6 van 6 x 106 cellen) op een cultuur van de cel invoegen met behulp van het effectieve deel van 4.2 cm2, die wordt geplaatst op de top van de waterput van gedissocieerde DRG.
Opmerking: Tijdens de periode van co cultuur, macrofagen worden gekweekt in Neurobasal/B-27 neuron kweekmedium. Voldoende voortbestaan van macrofagen onder deze voorwaarde werd bevestigd.
3. behandeling van Db-Camp en verzameling van Macrophage CM
Opmerking: Beginnen met de behandeling van de db-kamp 4 h na de neuron-macrofaag co culturen.
- Voeg 2 µL van 100 µM db-cAMP oplossing aan de neuron-macrofaag co culturen. Voeg een gelijk volume PBS voor een controle-experiment.
- Vul een lege goed met 1 mL macrofaag kweekmedium in de dezelfde 6-well plaat na 24 uur. De cel cultuur invoegen in het neuron-macrofaag co culturen overbrengen in de lege put met macrofaag kweekmedium. Houd de cellen onder de zelfde voorwaarde voor 72 h zonder het wijzigen van het medium.
Opmerking: We toevoegen dat alleen 1 mL macrofaag kweekmedium tijdens CM collectie om geconcentreerd CM. Tijdens de CM-collectie, indien nodig, wij toegevoegd meer volledig bedekt de macrofagen binnen het invoegen. - Centrifugeer de macrofaag CM bij 239 x g gedurende 5 min om de cellulaire componenten te verwijderen na 72 uur. Het supernatant passeren een 0,2-µm filter te verwijderen van alle resterende cellulaire puin. De verzamelde CM bij-70 ° C bewaren tot gebruik.
4. Neurite uitgroei Assay met verzamelde CM
- Vóór de oprichting van een apart volwassen DRG neuron cultuur, jas vooraf de dia van een 8-well kamer volgens dezelfde procedure beschreven in 1.1 en 1.2.
- Gedissocieerde volwassen DRG neuronen in Neurobasal medium aangevuld met B27 verkrijgen met behulp van dezelfde methoden beschreven van 1.3 tot 1.10. Plaat 5 x 104 cellen per putje op de dia die vooraf gecoate 8-well kamer.
- Plaats de kamer dia in een incubator 37 ° C gedurende 2 uur, waardoor de cellen om te koppelen aan de onderkant. Vervang vervolgens het kweekmedium met de ontdooide CM dat is voorverwarmd bij 37 ° C.
Opmerking: Wees voorzichtig niet te raken van de onderkant van de dia 8-well kamer bij het verwijderen van het kweekmedium en het toevoegen van de verzamelde CM. - 15 h na het eerste laagje, verwijderen van het medium en de cellen met PBS keer wassen. Vervolgens Breng 200 µL van ijskoude 4% paraformaldehyde-oplossing in de putjes en Incubeer de cellen met de paraformaldehyde-oplossing voor 20 min bij 4 ° C
Opmerking: De DRG neuron cultuur voor neurite uitgroei assay moet juist beperkt blijven tot 15u. Onder deze voorwaarde is er geen merkbare neurite uitgroei. - Spoel driemaal met PBS ijskoud en voer blokkeren met 10% normale geit serum (NGS) met 0,1% Triton-X voor 30 min. Incubeer de vaste cellen met primair antilichaam (anti-Tuj-1) oplossing verdund met 10% NGS (bij een concentratie van 1 µg/mL) voor 4 uur op de kamer temperatuur of 's nachts bij 4 ° C.
- Spoel driemaal met PBS en vervolgens Incubeer de cellen met secundair antilichaam (geit-anti-muis) oplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Vervolgens spoel tweemaal met PBS en monteren de cultuur dia met een dekglaasje aan (24 × 50 mm) met behulp van montage oplossing.
- Het nemen van beelden met behulp van een fluorescentie Microscoop te visualiseren neurite uitgroei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We beschrijven een protocol dat macrofagen staat afscheidende moleculaire factoren met neurite uitgroei activiteit kan genereren. De macrofaag CM verkregen uit de co culturen behandeld met db-cAMP resulteerde in robuuste neurite uitgroei wanneer toegepast op een apart DRG neuron cultuur (figuur 2A). In vergelijking, deed CM verkregen van de PBS-behandelde co culturen niet neurite uitgroei induceren in onze 15-h cultuur duur (figuur 2B). Db-cAMP wordt getrakteerd op de cultuur met macrofaag alleen, was CM verkregen van deze voorwaarde niet effectief bij de ondersteuning van neurite uitgroei (figuur 2C). Dit suggereert dat neuron-macrofaag interactie onmisbaar is voor het stimuleren van macrofagen te worden begiftigd met een capaciteit van proregenerative. We testten ook als CM db-kamp-testgroep neuron-alleen cultuur verkregen en geen neurite uitgroei (figuur 2D) gevonden.
Figuur 1: een schematisch schematische weergave van de procedures voor het verkrijgen van geconditioneerd middellange met neurite uitgroei activiteit. Volwassen DRG neuronen (2 x 106 cellen per elk putje) worden gekweekt voor 4 uur. Vervolgens, peritoneale macrofagen worden gekweekt in invoegen Nou, gelegen boven de put in welke DRG neuronen werden gekweekt. 4 h na beplating, PBS of dibutyryl kamp wordt behandeld. Na 24 uur incubatie, wordt de bijsluiter goed overgedragen aan een ander goed gevuld met ongeveer 1 ml medium. Vervolgens het overgedragen goed is ge¨ uncubeerd 72 h. Vervolgens wordt het bebroede geconditioneerde medium (CM) verzameld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: representatieve resultaten van het gebruik van neurite uitgroei assay geconditioneerd medium verkregen van verschillende voorwaarden. (A, B) Volwassen DRG neuronen waren acuut losgekoppeld en gekweekte voor precies 15 h. 2 uur na de beplating, kweekmedium met geconditioneerde medium (CM) neuron-macrofaag co culturen behandeld met PBS (A) verkregen werd vervangen of dibutyryl kamp (db-cAMP) (B). Alleen de CM behandeld met db-cAMP tentoongesteld robuuste neurite uitgroei activiteit. (C, D) CM verkregen uit culturen die bestaat uit beide macrofaag (C) of neuron (D) alleen dat was behandeld met db-cAMP ondersteunden niet neurite uitgroei. Schaal staven geven 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende kritische stappen voor de generatie van dit systeem co cultuur. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de muis DRG neuronen en peritoneale macrofagen vers worden bereid en gezond. Wij hebben ervaren verminderde neurite activiteit van de uitgroei van de CM de dissectie van alle de DRG toen meer dan 30 min. Bovendien, de besmetting van bloedbestanddelen in peritoneale macrofagen ook geleid tot een daling van neurite uitgroei activiteit in de CM. Om te ontlokken robuuste neuron-macrofaag interactie door db-cAMP, grondig wassen ook zou een belangrijke stap om ervoor te zorgen volledige verwijdering van weefsel puin en eliminatie van de resterende potentieel cytotoxische onderdelen, zoals collagenase of RBC lysis-buffermengsel. Een ander punt te worden herhaald, is dat de wortels gekoppeld aan DRG zoveel mogelijk moeten worden verwijderd. Resterende categorie: van wortels zou verhogen de besmetting van cellen van Schwann in DRG neuron cultuur. Cellen van Schwann kunnen produceren hoge hoeveelheid neurotrophic factoren in cultuur die de resultaten zou kunnen verwarren.
In dit protocol waren gedissocieerde macrofagen verguld op een cel cultuur invoegen van de neuronen van de DRG verguld aan de onderkant van de plaat goed gescheiden. Onze vorige studie toonde geen significant verschil in de mate van neurite uitgroei activiteit tussen de CMs verzameld uit directe co culturen (toelatend fysieke contacten tussen de twee celtypes) en de co culturen met de twee celtypes gescheiden door een cultuur van de cel invoegen11. Dit resultaat aangegeven dat neuronen en macrofagen met elkaar met elkaar via oplosbare moleculen uitgebracht vanaf beide cel typen, niet door directe lichamelijke contacten communiceren. Het bleek dat CCL2, uitgescheiden door DRG neuronen, verantwoordelijk is voor het activeren van macrofagen in een pro-regeneratieve fenotype in co-cultuur model14. Dus, zal ons systeem co cultuur de opheldering van de meer gedetailleerde intercellulaire signalering die de activering van de pro-regeneratieve macrofagen bemiddelt toestaan.
De cultuur was juist beperkt tot 15 h tijdens de kwantitatieve analyse van neurite, uitgroei in dit protocol. In proefprojecten en we onderzocht verschillende andere cultuur tijd en vond dat uiterst robuust neurite uitgroei met een minimale omvang van neurite uitgroei in controle staat (15u), werd bereikt met de CM behandeld met db-cAMP. Muis DRG neuronen, groeien als niet geconditioneerd, niet elke belangrijke neurites binnen dit tijdsbestek. Als DRG neuronen langer dan 15 h gekweekt worden, echter beginnen ze te tonen van een zekere mate van neurite uitgroei zelfs in het besturingselement, niet geconditioneerde aandoening, die geen effect van de db-kamp-testgroep CM op neurite uitgroei zou verhullen. Vergelijkbaar resultaat werd gemeld in de neurite uitgroei bepaling met behulp van rat DRG neuronen in een eerdere studie16.
Sommige eerdere studies gebruikt zymosan, een celwand voorbereiding van gist, macrofagen met een pro-regeneratieve fenotype7,9te activeren. De macrofagen gestimuleerd door zymosan uitgegeven echter niet alleen pro-regeneratieve moleculen, maar ook cytotoxische factoren. Wanneer de componenten van de eiwitten in macrofaag CM met zymosan behandeld werden gescheiden door gel-filtratie chromatografie, macrofaag-afgeleide factoren ≥ 30 kDa waren cytotoxische terwijl factoren ≤ 30 kDa bevorderd axon regeneratie7. Zymosan injectie aan het ruggenmerg kan bovendien leiden tot openlijke dood van neuronen en axonen9. Ter vergelijking: onze protocol voor het genereren van pro-regeneratieve macrofagen gebleken meer fysiologische dan de vorige met behulp van zymosan. In feite, versterkt db-cAMP injectie aan de DRG neuronen hun vermogen om groei axonen na een blessure aan de centrale tak zonder een verslag op cellulaire schade17,18. Gedurende een reeks van onze experimenten, hebben wij nooit een significante daling van de DRG neuron dichtheid in de cultuur die na toepassing van de db-kamp-testgroep CM waargenomen. Wij speculeren dat ons protocol stelt ons in staat om te produceren uitsluitend pro-regeneratieve macrofagen zonder gelijktijdige neurotoxiciteit. Dus, het protocol en de experimentele model gemeld hier nuttig zou zijn om te identificeren van moleculaire signaturen van pro-regeneratieve macrofagen en te begrijpen door welke mechanismen de pro-regeneratieve fenotype is geëvolueerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit protocol wordt ondersteund door een subsidie van de NRF-2015R1A2A1A01003410 van het ministerie van wetenschap, ICT en de Planning van de toekomst, Republiek Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
References
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Festoff, B. W., et al. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).
- Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate. Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).
- Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling. Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).
- DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. Neuroinflammation: the devil is in the details. J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).
- Yin, Y., et al. Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration. J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).
- Yin, Y., et al. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells. Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).
- Kwon, M. J., et al. Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).
- Niemi, J. P., et al. A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).
- Hannila, S. S., Filbin, M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).
- Kwon, M. J., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).
- Cafferty, W. B., et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice. J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).
- Cai, D., et al. Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate. J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).
