Summary
여기 우리는 새로운 장비를 사용 하지 않고 키메라 생산을 증가 하는 프로토콜을 제시. 주입에 대 한 배아의 단순한 방향 변경 생산, 배아의 수를 증가 하 고 잠재적으로 생식 전송 타임을 줄일 수 있습니다.
Abstract
ES 셀 방법론을 통해 유전자 변형된 생쥐의 창조에 효율성을 증가 하는 노력에서 선물이 현재 blastocyst 주입 프로토콜을 적응. 여기 우리 보고 배아, 그리고 트랜스 안 세포 질량 (TICM)를 통해 주입의 간단한 회전 50%, 추가 장비에 31%에서 공상 쥐의 비율을 증가 또는 추가 훈련을 전문. 26 다른 근 친 클론, 그리고 9 개월의 기간 동안 35 총 클론 주입 했다. 전통적인 주입 기술 및 TICM 사이 임신 속도 또는 배아의 회복 속도에 상당한 차이가 있었습니다. 따라서 주입 프로세스와는 blastocyst의 간단한 위치는 ICM을 통해 주입에 모든 주요 변경 없이 blastocoel 구멍에 ES 세포 방출 잠재적으로 향상 시킬 수 있습니다 공상 생산 이후 수량 생식 전송입니다.
Introduction
거의 25 년 동안, 유전자 표적으로 쥐의 창조 자주 키메라를 전송 하는 생식의 세대를 위한 blastocysts ES 세포 microinjection 단계에서 병목 현상에 의해 방해, 느린 과정 되었습니다. CRISPR/Cas91,2 ES 세포 및 높은 처리량 ES에 타겟팅을 포함 한 최근 전진 호 같은 세대 컨소시엄 세포, 유전자 변형된 ES 세포의 생성/가용성 향상. 그러나, 생식 키메라의 생성이 ES 세포3,4에서 유전자 변형된 쥐를 만들기에 병목을 남아 있다. 높은 처리량 ES 세포 생성 프로젝트 생식 키메라의 성공적인 창조에 대 한 중요 한 ES 세포 품질 높은 가변성에 의해 괴 롭 혀 왔다. 또한, 일반적으로 이용한 ES 세포 선의 일부 높은 이수성, 및 생식 유능한 키메라5의 어려운 생산 알려져 있다.
어느 높은 키메라와 쥐를 만들기 위한 많은 방법은 개발 되었다 또는 완전히 ES 세포 파생 마우스6,7,8,,910. 이러한 시스템의 각 그것의 자신의 공로 있다, 그러나 그들은 또한 그들의 결점 있다. Tetraploid chimeras, 마우스, 파생 된 100 %ES 세포를 생성 하는 동안 생성, 비효율적 이며 outbred 라인 5,6에 일반적으로 제한 된. Morula 주입의 새로운 방법 높은 백분율 chimeras, 100%에 접근을 얻을 수 있지만 일반적으로 상당한 추가 장비 (레이저 또는 piezos) 및 훈련10,11필요로 합니다. 이러한 기술은 이미 자리에는 실험실,이 새로운 방법론 필요 없을 수 있습니다.
이 연구의이 목적은 키메라 세대, 이후 마우스 식민지를 설치 하는 돌연변이 체 대립 유전자의 생식 전송의 기회를 증가의 속도 높이기 위해 일반적인 기술과 쉽게 사용할 수 있는 장비를 사용 하는 메서드를 찾아야 했다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 작업은 마우스 코어의 NIEHS 노크 밖으로 인해 시설 정상 작동의 일환으로 수행 되었다. 모든 마우스는 12시 12분에 유지 했다 h 빛: 다크 사이클, NIH-31와 물 다이어트를 공급 했다 ad libitum. 모든 실험 동물 관리 및 사용 위원회는 국립 연구소의 환경 건강 과학의 수행 했다.
1. 동물 준비
- 기증자 쥐, b 6 번 식 (Cg)-Tyr < c-2J > b 6 자연스럽 게 나이의 8-10 주에 /J 여성 쥐 (Cg)-Tyr < c-2J > /J 남성 쥐 나이의 8과 26 주 사이. 시각적으로 플러그 다음 아침 (E0.5)을 확인 합니다.
- 받는 사람 마우스, 스위스 웹스터 여성 쥐 나이의 6 그리고 9 주 사이 자연스럽 게 vasectomized 스위스 웹스터 남성 쥐 사육 번 식. 시각적으로 플러그 다음 아침 (E0.5)을 확인 합니다.
2. ES 세포 준비
- 129-derieved AB2.2 ES 세포에 대 한 문화 15 보충 DMEM 셀 %FBS, 1% 글루타민, 1% 펜/strep, 및 0.1% β-mercaptoethanol. 그들의 권장된 프로토콜을 사용 하 여 ES 셀 공급 업체의 지시 당 다른 모든 ES 세포 문화.
3. 배아 컬렉션
-
동물 해 부
- 여러 가지 60mm 요리, 약 1 5 마우스 플러스 10 mL 폭발 컬렉션 미디어 (BCM)와 3 추가 준비 (10 %FBS DMEM), 그리고 한 4 잘 잘 당 0.5 mL BCM으로 접시. 37 ° C, 5% CO2에서 equilibrate.
- B 6를 안락사 (Cg)-Tyr < c-2J > 10%의 유량과 CO2 질를 사용 하 여 E3.5에 /J 여성 쥐.
- Euthanizing, 후 부정사 위치에 쥐를 놓고 젖은 70% 에탄올으로 깨끗이 복 부.
- 가능한 넓은 개방을 만드는 복 부의 중앙에만, 피부를 통해 첫 번째 절 개를 확인 합니다. 다음 다시 가능한 광범위 한 절 개를 만드는 복 벽을 통해 열.
참고:이 두 단계에 일을 줄이거나 모피 오염 제거에 도움이 됩니다. - 난소에서 시작 하 고 무딘 집게와 난소의 지방 패드를 들고 조심 스럽게 난소, 수 란 관, 및 지방 조직을 최소로 유지 하 여분 배려를 복용 하는 자 궁을 제거. 하나의 단일 단위로 또는 다음 절차에서 변경 되지 않고 개별 뿔으로 자 궁을 제거 합니다.
- 제거 후 자 궁 폭발 컬렉션 미디어를 포함 하는 60 m m 접시에 놓습니다.
-
배아 제거
- BCM, 가득 10 mL 주사기를 준비 하 고 25g 바늘으로 적합.
- 한 번에 한 자 궁 BCM의 지주 접시에서 그들을 제거, 과잉 혈액을 제거 하 고 해 부 현미경 저 배율에서 60 mm 접시에 배치 하는 조직에서 그들을 얼룩.
- 신중 하 고 부드럽게 집게 해 부와 (수 란 관) 근처 선단부 바로 아래 자 궁을 잡고, 병렬 가능한 비행기로에 자 궁의 중앙에 바늘을 삽입 합니다. 그냥 넘어는 집게의 끝에 바늘을 삽입 합니다.
- 바늘, 자 궁을 겸 자에 압력을 적용 하 고 약 1 mL의 자 궁 경적을 통해 BCM의 추방.
참고: 합니다 주의이 단계에서 주사기에 너무 많은 압력, 미디어의 통제 스트림 하면로 자주 요리를 떠나. - 60 mm 접시 당 최대 5 전체 uteri 자 궁 홍 후 컬렉션까지 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
-
배아 컬렉션
- 손으로 그린된 유리 피 펫 및 입 피 펫 장치 using, blastocysts 25 X 35 X 사이의 설정 해 범위에서 수집 합니다. (그림 1)입니다.
참고: 유연한 튜브의 30-40 cm의 입 피 펫 장치 구성, 5mm 미만 아이디 삽입 1, 000 µ L 피 펫 팁, 처음에 한쪽 끝을 가리키고 접사에 유리 피 펫. 연결 1 cc 주사기 배럴, 아니 플런저, 입 조각으로, 다른 끝에 주사기 필터를 추가 합니다. - 인큐베이터에서 요리를 제거 하 고 격자 패턴을 사용 하 여 태아에 대 한 접시의 모든 부분을 검사 합니다. 배아 선택은 개별적으로 하 고 보조 접시에서 BCM의 드롭에.
- 모든 요리에서 수집 후 신선한 BCM, 한 방울에 배아를 한 번 더 세척 하 고 주입을 기다리고 4 잘 접시에 놓습니다.
- 손으로 그린된 유리 피 펫 및 입 피 펫 장치 using, blastocysts 25 X 35 X 사이의 설정 해 범위에서 수집 합니다. (그림 1)입니다.
4. 태아 주입
- 확인에 따라 주사 바늘으로 개별적으로 ES 세포를 선택 합니다.
- 5-7 mL 주입 미디어를 추가 하 여 주입 접시를 준비 (DMEM, 10 %FBS 및 20 mM HEPES) 유리 하단 주입 접시. 주사는 상 온에서 수행 됩니다.
- 공기 또는 기름 microinjector를 사용 하 여 ES 세포를 주사 바늘을 진공을 적용 됩니다. 셀 사이의 가능한 작은 공간으로 유지 하는 것을 주의. 여기, 또는 사출 단계에서 ES 세포를 계산.
- ES 셀을 셀, 매끄러운 표면, 그리고 명백한 결함이 그들 등의 일반 인구에 비해 크기가 작은 매체를 선택 합니다.
참고: ES 세포 인구 형태학 품질에 크게 변화 하 고 사용 되는 표준 그들과 함께 조정 해야 합니다.
- 약 15 ES 세포 (그림 1)와 배아를 주사.
- 연결 지주 피 펫 팁 두 번째 공기 microinjector를 및 소유자의 오프닝 근처 태아 위치. 소유자에 게 태아를 보호 하는 진공을 적용 합니다.
- 태아는 구역에 잘 집중 하 여 다음 슬라이드를 만지고 그냥은 그래야 지주 피펫으로 위나 아래로 이동 하 여 z 축에 대 한 조정. ES 세포 끝 근처 초점이 되도록 다음, 주사 바늘의 Z 축을 조정 합니다.
- 부드럽게 주사 바늘 위쪽 이나 아래쪽으로 원하는 위치에 ICM을 넣어 회전에서 추진 하 여 지금 배아를 조정 합니다.
- 구역, 그리고 ICM 또는 확고 하지만 제어 푸시를 사용 하 여 trophoblast 통해 주사 바늘을 삽입 합니다. 붕괴에서 blastocoel를 유지 하기 위해 주사 바늘의 microinjector에 약간의 압력을 적용 됩니다.
- 바늘은 blastocoel를 침투 하 고, 일단 태아의 blastocoel ES 세포를 전송 하는 microinjector에서 압력을 적용. 바늘의 경사로 잠시 일시 중지 셀 유지 하면서 정상으로 돌아갑니다 배아에 압력을 허용 하는 배아를 종료 하기 시작 합니다.
참고: 참조 그룹 ES 세포는 일반적으로 주입 했다, 전통에 따라 세포 주입 프로토콜9, ICM을 터치 하지 않도록 주의 복용. ES 세포 또한 ICM, 직접 통해는 ICM (TICM) (그림 2보충 영화) 바늘을 밀어를 통해 주입 했다.
5입니다. eEmbryos의 전송
- 제조의 절차 당 비 외과 배아 전송 장치를 사용 하 여 E2.5에서 스위스 웹스터 마우스 배아를 전송 합니다. 이 아닌-수술 마 취 또는 수술에 특별 한 주의 요구 한다. 집 쥐의 배아, 그리고 배달 및 후속 이유를 통해 전송 후 개별적으로.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
임의 효과로 셀-선 치료, 혼합된 효과 선형 모델 소프트웨어 (예: SAS (버전 9.2))에서 데이터를 분석 하 사용 되었다. 각 분석 배아 전송 및 셀 라인의 수에 대 한 제어. 두 번째 분석 또한 살아남은 새끼의 수에 대 한 제어.
이 연구를 위해 각 ES 세포 선 및 복제 주입 했다 전통 둘 다 및 TICM 기법, 각 배아 후 두 가지 방법 사이의 교류. 사출, 후 배아 접시에 차별 하 고 송금 받는 여성 당 12의 그리고 15 태아 사이 일반적으로 그룹화 했다. 명확 하 게 보이는 blastocoel 하지 않은 배아 Zona pellucida, 부족 또는 microinjected ES 세포는 blastocoel를 입력 하는 데 실패 하는 곳에,이 실험에서 탈락 했다.
첫 번째 데이터 검사 임신 률 이었다입니다. 그림 3에서 보듯이 임신 속도 제어 그룹에서 TICM 그룹에서 변경 되지 않았습니다. 또한, 새끼의 동등한 비율 이유 살아 났다 (P = 0.50, 그림 4). 가장 중요 한 것은, 남아 그대로, 새끼 수 이유에서 쥐의 수는 동안 코트 색상 chimerism 표시 31%에서 50% 증가 TICM 그룹에 대 한 (p = 0.005, 그림 5). 코트 색상 chimerism의 정도 너무 주관적이 연구를 평가 하 고 진정으로 관련이 없는 생식 chimerism 고려 되었다.
그림 1: 장비 전문. (왼쪽) (A) 마이크로 컨트롤러 등 (B) 셀 트램 공기 주입 현미경 설치 (오른쪽) (C) 그려진된 유리 피 펫, (D) 1000µL 피 펫 팁, (E) 배관, (F) 필터 및 (G) 주사기와 입 피 펫 장치 배럴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: blastocyst 태아 주입의 예. (A, B) 전통적인 주입 방법, 주사 바늘 반대 ICM와 어떤 상호 작용을 피하는 ICM의 입력입니다. (C, D) TICM 메서드는 blastocoel를 주사 바늘에 ICM을 통해 직접 입력 하는 어디. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 임신 률. 임신 비율 전통 (39/50) 및 TICM (64/76) 사이의 큰 차이 보였다. 평균 플러스 평균 (SEM)의 표준 오차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 생존 율. 생존 율은 이유, 살아남은 새끼 수 유아 쓰레기 되었다. 이유, 살아나지 않았다 강아지 및 새끼 어디 아무 새끼 이유, 살아 났다이 데이터에 포함 되지 않았다. 평균 플러스 평균 (SEM)의 표준 오차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: Chimerism 속도. 키메라, 생산과 chimerism의 품질을 해결 하지 않는 경우이 데이터만 수를 나타냅니다. 전통적인 그룹에서 자손의 31% (34/110)는 chimerism, TICM 그룹의 평균 50% (79/158)을 했다 보여주었다. 평균 플러스 평균 (SEM)의 표준 오차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
그것은 오래는 ICM의 어떤 소란 이어질 수 사망, 사실, 현재 blastocyst microinjection 프로토콜 여전히이12,13의 경고 생각 되었습니다. 그것은 우리가 여기에 표시는 ICM 통해 microinjection는 태아에 게 해로운 고 키메라의 수확량을 증가.
이 효과 대 한 정확한 메커니즘 확인 하지 했다. 그러나, ICM와 함께 hypoblast의 기계적 장애 ES 세포 통합 microinjection 다음 새로 형성된 된 ICM의 발생률을 증가 한다. Ipsc의 분야에서 최근 작품 기계적 자극 인간의 iPSC14의 프로그래밍에 도움이 나타났습니다. 기계 조작 마우스 배아의 ICM 비슷한 효과 있으면, 그것은 셀 ICM 만능 상태로 차별화 하는 잠재적으로 시작 했던 ' 시작 ' blastocyst 기증자의 잠재적인 제거의 반환의 영향을 미칠 수 있습니다. 파생된 셀에 배아 조직 형성입니다. 마지막으로, 유전자는 microinjected에 대 한 경쟁의 수준을 낮추는 ICM에서 셀의 수 알된 수의 죽음에 ICM 결과 통해 주입 ES 세포 수정이 가능 하다.
방법 수정이의 기본 혜택은 전혀 새로운 학습, 문제 해결, 또는 장비 필요. 모든 기술 표준 blastocyst 주입에서 월. 가장 중요 한 단계도 변경 되지 않습니다; 적절 하 고 적시의 배아, 그리고 전에, 동안, 그리고 주입 후 배아에 대 한 적절 한 문화 조건 컬렉션입니다. 비-외과 배아 전송 기술을 사용 하 여, 그것은 적절 한 받는 사람 마우스 선택에 더 중요 한 될지 않습니다. 수술 전송, 외과 의사 기회가 적절 한 생식 상태를 확인 하려면 마우스 검사 어디 비 외과 이동이 불가능 하다. 마우스 주요 생식 시대 (6-9 주)의 고 표시 플러그와 마우스만을 사용 해야 합니다. 이 기법의 가장 중요 한 부분 및 모든 ES 세포 주사, ES 세포의 품질입니다.
높은 품질, 강력한 셀 라인으로 처리이 기술은 수 있습니다만 최소한의 차이, 항복 하 하지만 차선 ES와 셀 라인 또는 라인으로 작동 하기 어려운, 심지어 개선 마이너, 상당한 고 수 프로젝트 성공 사이의 차이 만들 그리고 실패입니다. 그것은 또한 주의이 연구의 과정, 여러 상용 ES 세포 라인 생성 생식 키메라, 그리고 거의 모든 생식 키메라 생성 상업 ES 라인 TICM 주사 했다. 여기 우리는 그 기술에 간단한 변화를 발생할 수 있습니다 크게 향상 생산성, 새로운 장비에 대 한 추가 비용을 들이지, 훈련, 또는 동물의 사용을 증가 없이 나타났습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.
Acknowledgments
이 연구는 [부분적으로] 보건원, 국립 연구소의 환경 건강 과학의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다. 통계 분석에 대 한 특별 Shyamal Peddada 감사 합니다. 우리는 또한 험프리 야 오, 게리 조류, 유키 아 라오 그의 지속적인 지원과 조언을 위해이 원고, 및 프랑코 DeMayo의 검토를 위해 감사 하고자.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse embryo. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
