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Biology

ट्रांस-इनर सेल भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के इंजेक्शन उच्च Chimerism दरों की ओर जाता है

Published: May 29, 2018 doi: 10.3791/56955
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Knock Out Mouse Core, NIEHS/NIH

Summary

यहां हम नए उपकरणों के उपयोग के बिना कल्पना उत्पादन बढ़ाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इंजेक्शन के लिए भ्रूण का एक सरल अभिविन्यास परिवर्तन उत्पादित भ्रूण की संख्या में वृद्धि कर सकते हैं, और संभावित germline संचरण के लिए समय रेखा को कम.

Abstract

ES सेल के तरीके के माध्यम से आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के निर्माण में दक्षता बढ़ाने के प्रयास में, हम वर्तमान ब्लास्टोसिस्ट इंजेक्शन प्रोटोकॉल के लिए एक अनुकूलन प्रस्तुत करते हैं । यहां हम रिपोर्ट है कि भ्रूण का एक सरल रोटेशन, और ट्रांस के माध्यम से इंजेक्शन इनर-आंतरिक कोशिका (TICM) 31% से ५०% से chimeric चूहों का प्रतिशत बढ़ा, कोई अतिरिक्त उपकरण या आगे विशेष प्रशिक्षण के साथ । 26 विभिंन नस्ल क्लोन, और ३५ कुल क्लोन 9 महीने की अवधि में इंजेक्शन थे । या तो गर्भावस्था दर या पारंपरिक इंजेक्शन तकनीक और TICM के बीच भ्रूण की वसूली की दर में कोई महत्वपूर्ण अंतर था । इसलिए, इंजेक्शन प्रक्रिया में किसी भी बड़े परिवर्तन और ब्लास्टोसिस्ट के एक साधारण स्थिति और आईसीएम के माध्यम से इंजेक्शन के बिना, blastocoel गुहा में ES कोशिकाओं को रिहा संभावित chimeric उत्पादन और बाद की मात्रा में सुधार कर सकते हैं germline ट्रांसमिशन.

Introduction

लगभग 25 वर्षों के लिए, आनुवंशिक रूप से लक्षित चूहों के निर्माण के लिए एक धीमी प्रक्रिया रही है, अक्सर germline संचारण chimeras की पीढ़ी के लिए blastocysts ES सेल microinjection मंच पर एक टोंटी द्वारा बाधा । CRISPR/Cas91सहित हाल ही की प्रगति,2 es कोशिकाओं और उच्च प्रवाह es KOMP तरह सेल पीढ़ी के संघ में लक्ष्यीकरण, आनुवंशिक रूप से संशोधित ES कोशिकाओं की पीढ़ी/ हालांकि, germline chimeras की पीढ़ी इन ES कोशिकाओं3,4से आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों बनाने में एक अड़चन बनी हुई है । उच्च प्रवाह es सेल जनरेशन परियोजनाएं es सेल गुणवत्ता में उच्च परिवर्तनशीलता से त्रस्त किया गया है, जो germline chimeras के सफल निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अतिरिक्त, सामांयतः उपयोग की जाने वाली कुछ कक्ष रेखाओं को उच्च aneuploidy, और germline सक्षम chimeras5के कठिन उत्पादन के लिए जाना जाता है ।

कई तरीकों या तो एक उच्च कल्पना, या पूरी तरह से ES सेल चूहों6,7,8,9,10के साथ चूहों बनाने के लिए विकसित किया गया है । जबकि इनमें से प्रत्येक सिस्टम की अपनी योग्यता होती है, लेकिन उनमें भी उनकी कमियाँ हैं । tetraploid chimeras की पीढ़ी है, जबकि १००% ES सेल व्युत्पंन चूहों पैदा करने, अक्षम है, और आम तौर पर लाइनों 5,6नस्ल को सीमित । मोरूला इंजेक्शन के नए तरीकों उच्च प्रतिशत chimeras उपज, १००% आ सकता है, लेकिन आम तौर पर महत्वपूर्ण अतिरिक्त उपकरण (पराबैंगनीकिरण या piezos) और प्रशिक्षण10,11की आवश्यकता है । प्रयोगशालाओं में जहां इन तकनीकों को पहले से ही जगह है, यह नई पद्धति आवश्यक नहीं हो सकता है ।

इस अध्ययन के उद्देश्य के लिए एक तरीका है कि आम तकनीक और आसानी से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करता है कल्पना पीढ़ी की दर बढ़ाने के लिए, उत्परिवर्ती एलील के germline संचरण का मौका बढ़ाने के बाद माउस कॉलोनी की स्थापना की थी ।

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Protocol

सभी आपरेशनों NIEHS बाहर माउस कोर सुविधा दस्तक के सामांय ऑपरेशन के भाग के रूप में किया गया । सभी चूहों एक 12:12 ज लाइट पर रखा गया था: डार्क साइकिल, और NIH के आहार फ़ीड थे-31 और जल विज्ञापन libitum । राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान की एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी के अनुसार सभी प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया ।

1. पशु तैयारी

  1. नस्ल दाता चूहों, बी-6 (सीजी)-Tyr < c-2J >/जे महिला चूहों की उम्र के 8-10 सप्ताह में स्वाभाविक रूप से बी-6 (तटरक्षक) के लिए-Tyr < c-2J >/जे पुरुष चूहों के बीच 8 और 26 की उम्र के सप्ताह. नेत्रहीन निम्नलिखित सुबह प्लग की जाँच करें (ई 0.5).
  2. नस्ल प्राप्तकर्ता चूहों, स्विस Webster महिला चूहों के बीच 6 और 9 उम्र के सप्ताह स्वाभाविक रूप से vasectomized स्विस Webster पुरुष चूहों के लिए नस्ल हैं. नेत्रहीन निम्नलिखित सुबह प्लग की जाँच करें (ई 0.5).

2. ES सेल तैयारी

  1. १२९-derieved अटल बिहारी 2.2 ES कोशिकाओं के लिए, DMEM में संस्कृति कोशिकाओं 15% FBS, 1% Glutamine, 1% पेन/strep, और ०.१% β-mercaptoethanol के साथ पूरक । प्रति es सेल आपूर्तिकर्ता के निर्देशों के अनुसार अंय सभी es कोशिकाओं संस्कृति, उनके अनुशंसित प्रोटोकॉल का उपयोग कर ।

3. भ्रूण संग्रह

  1. पशु विच्छेदन
    1. कई ६० मिमी व्यंजन तैयार, लगभग 1 प्रति 5 चूहों प्लस 3 अतिरिक्त, 10 मिलीलीटर विस्फोट संग्रह मीडिया (बीसीएम) के साथ (DMEM में 10% FBS), और अच्छी तरह से प्रति ०.५ मिलीलीटर बीसीएम के साथ एक 4 अच्छी डिश । ३७ ° c, 5% सह2पर Equilibrate ।
    2. Euthanize बी-6 (तटरक्षक)-Tyr < c-2J >/जे महिला चूहों पर 3.5 कं2 का उपयोग कर 10% की एक प्रवाह दर के साथ asphyxiation, ।
    3. euthanizing के बाद, चूहों लापरवाह स्थिति में जगह है, और ७०% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से पेट गीला.
    4. त्वचा के माध्यम से पहला चीरा ही, पेट के मध्यबिंदु पर, खोलने के रूप में संभव के रूप में व्यापक बनाने । अगले पेट की दीवार के माध्यम से खुला है, फिर से संभव के रूप में व्यापक चीरा बनाने.
      नोट: दो चरणों में ऐसा करने में मदद करता है कम या फर संदूषण को खत्म करने ।
    5. एक अंडाशय में शुरू, और कुंद संदंश के साथ अंडाशय के वसा पैड पकड़, ध्यान से अंडाशय, ओवीडक्ट, और गर्भाशय को हटाने, अतिरिक्त देखभाल करने के लिए एक ंयूनतम वसा ऊतक रखने के लिए । निंनलिखित प्रक्रिया में कोई परिवर्तन के साथ एक एकल इकाई, या व्यक्तिगत सींग के रूप में, के रूप में गर्भाशय निकालें ।
    6. हटाने के बाद, गर्भाशय विस्फोट संग्रह मीडिया युक्त एक ६० मिमी डिश में जगह है ।
  2. भ्रूण हटाने
    1. एक 10 मिलीलीटर बीसीएम से भरा सिरिंज तैयार करें, और एक 25 जी सुई के साथ फिट बैठते हैं ।
    2. एक समय में एक गर्भाशय, उंहें बीसीएम के धारण पकवान से हटा दें, उंहें एक ऊतक पर दाग अतिरिक्त रक्त को हटाने के लिए, और एक कम आवर्धन विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक ६० mm पकवान में जगह है ।
    3. जबकि ध्यान से और धीरे बस बाहर का अंत (ओवीडक्ट के पास) के नीचे गर्भाशय विदारक संदंश के साथ पकड़, सुई में गर्भाशय के केंद्र में डालने के रूप में संभव के रूप में समानांतर एक विमान । बस संदंश के सुझावों से परे सुई डालें ।
    4. सुई के लिए गर्भाशय पकड़ करने के लिए संदंश के लिए कुछ दबाव लागू करें, और गर्भाशय के सींग के माध्यम से बीसीएम के लगभग 1 मिलीलीटर निष्कासित ।
      नोट: देखभाल इस कदम पर लिया जाना चाहिए, सिरिंज पर बहुत अधिक दबाव के रूप में मीडिया के एक बेकाबू स्ट्रीम, अक्सर पकवान छोड़ने का कारण होगा.
    5. गर्भाशय निस्तब्धता के बाद, अप करने के लिए 5 ६० mm पकवान प्रति पूरे uteri, जगह डिश मशीन में वापस संग्रह तक ।
  3. भ्रूण संग्रह
    1. एक हाथ से तैयार की ग्लास पिपेट और एक मुंह पिपेट तंत्र का उपयोग करना, एक विदारक गुंजाइश के तहत blastocysts इकट्ठा, 25X और 35X के बीच सेट । (चित्र 1) ।
      ध्यान दें: मुंह पिपेट तंत्र लचीले टयूबिंग के 30-40 cm के होते हैं, 5 मिमी आईडी के तहत एक अंत करने के लिए एक 1, 000 µ एल पिपेट टिप, बिंदु डालें, और यह में कांच पिपेट प्रत्यय । दूसरे छोर पर एक सिरिंज फिल्टर जोड़ें, एक संलग्न 1 प्रतिलिपि सिरिंज बैरल के साथ, कोई गोताख़ोर, एक मुंह टुकड़ा के रूप में कार्य करने के लिए.
    2. मशीन से बर्तन हटाने, और एक ग्रिड पैटर्न का उपयोग कर, भ्रूण के लिए पकवान के हर हिस्से की जांच । भ्रूण को व्यक्तिगत रूप से उठाया और एक माध्यमिक पकवान में बीसीएम की बूंद पर जगह है ।
    3. सभी व्यंजन से इकट्ठा करने के बाद, ताजा बीसीएम की एक बूंद में एक बार और भ्रूण धोने, और फिर इंजेक्शन का इंतजार करने के लिए 4 अच्छी तरह से पकवान में जगह है ।

4. भ्रूण इंजेक्शन

  1. पुष्टि के आधार पर इंजेक्शन सुई के साथ व्यक्तिगत रूप से ES कोशिकाओं उठाओ.
    1. इंजेक्शन मीडिया के 5-7 मिलीलीटर (DMEM, 10% FBS और 20 mM HEPES) एक गिलास नीचे इंजेक्शन पकवान को जोड़कर एक इंजेक्शन पकवान तैयार करें । इंजेक्शन कमरे के तापमान पर किया जाता है ।
    2. या तो एक हवा या तेल microinjector का प्रयोग, इंजेक्शन सुई में ES कोशिकाओं को आकर्षित करने के लिए निर्वात लागू कोशिकाओं के बीच संभव के रूप में कम स्थान के रूप में रखने के लिए ध्यान रखना । यहां ES कोशिकाओं गिनती, या इंजेक्शन कदम पर ।
    3. ES कक्षों का चयन करें जो मध्यम आकार में छोटे से कोशिकाओं की सामांय जनसंख्या की तुलना में, एक चिकनी सतह के साथ, और रिक्तिकाएं जैसे स्पष्ट दोषों के बिना ।
      नोट: ES सेल आबादी रूपात्मक गुणवत्ता में बहुत भिंनता है, और उनके साथ समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया मानकों की आवश्यकता होगी ।
  2. लगभग 15 ES कोशिकाओं के साथ भ्रूण इंजेक्षन (चित्रा 1).
    1. एक दूसरे एयर microinjector के लिए एक होल्डिंग पिपेट टिप देते हैं, और धारक के उद्घाटन के पास एक भ्रूण की स्थिति । वैक्यूम लागू करने के लिए धारक को भ्रूण सुरक्षित ।
    2. पकड़ पिपेट ऊपर या नीचे ले जाने से z अक्ष के लिए समायोजित करें ताकि भ्रूण सिर्फ स्लाइड छू रहा है, ठीक द्वारा zona पर ध्यान केंद्रित पीछा किया । अगले, इंजेक्शन सुई के जेड अक्ष को समायोजित इतना है कि टिप के पास ES कोशिकाओं ध्यान में हैं ।
    3. धीरे इंजेक्शन सुई से ऊपर या नीचे, यह घूर्णन करने के लिए इच्छित स्थिति में आईसीएम डाल करने से धक्का अब भ्रूण समायोजित करें ।
    4. zona के माध्यम से इंजेक्शन सुई डालें, और या तो आईसीएम या trophoblast, एक फर्म लेकिन नियंत्रित धक्का का उपयोग कर. इंजेक्शन सुई के microinjector के लिए एक मामूली दबाव लागू करने के लिए मदद blastocoel टूट से रखने के लिए ।
    5. एक बार सुई blastocoel प्रवेश किया है, microinjector से दबाव लागू करने के लिए ES कोशिकाओं भ्रूण के blastocoel को हस्तांतरण । संक्षेप में सुई के बेवल के रूप में रोकें भ्रूण में दबाव को सामान्य करने के लिए वापस लौटने के लिए अनुमति देने के लिए शुरू होता है, जबकि अभी भी कोशिकाओं को बनाए रखने.
      नोट: संदर्भ समूह ES कोशिकाओं सामांय इंजेक्शन थे, एक पारंपरिक ES सेल इंजेक्शन प्रोटोकॉल9के बाद, ध्यान रखना नहीं आईसीएम को छूने के लिए । ES कोशिकाओं को भी आईसीएम के माध्यम से इंजेक्शन थे, आईसीएम (TICM) (चित्रा 2, पूरक फिल्म) के माध्यम से सीधे सुई धक्का ।

5. eEmbryos का अंतरण

  1. ई 2.5 पर स्विस Webster चूहों को भ्रूण हस्तांतरण, एक गैर सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण उपकरण का उपयोग कर, है विनिर्माण प्रक्रियाओं के अनुसार । इस गैर सर्जिकल प्रक्रिया कोई संज्ञाहरण या विशेष के बाद सेशन देखभाल की आवश्यकता है । घर चूहों व्यक्तिगत रूप से भ्रूण के हस्तांतरण के बाद, और प्रसव के माध्यम से और बाद में प्रातः ।

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Representative Results

यादृच्छिक प्रभाव के रूप में सेल लाइन का इलाज, एक मिश्रित प्रभाव रैखिक मॉडल सॉफ्टवेयर में डेटा का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (जैसे एसएएस (संस्करण ९.२)). प्रत्येक विश्लेषण भ्रूण स्थानांतरित की संख्या और सेल लाइन के लिए नियंत्रित । दूसरा विश्लेषण भी कि बच पिल्ले की संख्या के लिए नियंत्रित ।

इस अध्ययन के लिए, प्रत्येक ES सेल लाइन और क्लोन दोनों पारंपरिक और TICM तकनीक के साथ इंजेक्ट किया गया था, प्रत्येक भ्रूण के बाद दो तरीकों के बीच बारी । इंजेक्शन के बाद, भ्रूण पकवान पर अलग और हस्तांतरण द्वारा समूहीकृत किया गया, आम तौर पर 12 और 15 प्राप्तकर्ता के प्रति भ्रूण महिला के बीच । भ्रूण है कि एक स्पष्ट रूप से दिखाई blastocoel नहीं था, एक Zona pellucida कमी आई है, या जहां microinjected ES कोशिकाओं blastocoel में प्रवेश करने में विफल, इस प्रयोग से समाप्त किया गया ।

पहले डाटा की जांच गर्भावस् था की दर से होती है । के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है, गर्भावस्था दरों TICM समूह में नियंत्रण समूह से अनछुए थे । इसके अतिरिक्त, पिल्ले के बराबर अनुपात प्रातः (पी = ०.५०, चित्रा 4) के लिए बच गया । सबसे महत्वपूर्ण बात है, जबकि प्रातः में चूहों की संख्या अपरिवर्तित बनी हुई है, कोट रंग chimerism प्रदर्शित पिल्ले की संख्या TICM समूह के लिए ५०% से 31% की वृद्धि हुई (पी = ०.००५, चित्रा 5). कोट रंग chimerism की डिग्री भी इस अध्ययन में मूल्यांकन किया जा व्यक्तिपरक माना जाता था, और germline chimerism के लिए वास्तव में प्रासंगिक नहीं है ।

Figure 1
चित्र 1: विशेष उपकरण. बाएं) इंजेक्शन माइक्रोस्कोप सेटअप, सहित (एक) माइक्रो जोड़तोड़ और (ख) सेल ट्राम हवा. (दाएं) मुंह पिपेट तंत्र, के साथ (ग) तैयार कांच पिपेट, (घ) १००० µ एल पिपेट टिप, (ई) टयूबिंग, (एफ) फिल्टर, और (जी) सिरिंज बैरल । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: ब्लास्टोसिस्ट भ्रूण इंजेक्शन का उदाहरण । (A, B) पारंपरिक इंजेक्शन विधि, जहां इंजेक्शन सुई आईसीएम के विपरीत में प्रवेश करती है, आईसीएम के साथ किसी भी बातचीत से परहेज । (C, D) TICM विधि, जहां इंजेक्शन सुई आईसीएम के माध्यम से सीधे में प्रवेश करती है blastocoel के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: गर्भावस्था दर. गर्भावस्था की दर पारंपरिक (39/50) और TICM (64/76) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाई । औसत प्लस माध्य (SEM) के मानक त्रुटि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: जीवित रहने की दर । जीवित रहने की दर पिल्ले कि प्रातः, जहां एक कूड़े को छुड़ाने के लिए बच गया की संख्या है । पिल्ले कि प्रातः करने के लिए जीवित नहीं था, और कूड़े जहां कोई पिल्ले प्रातः करने के लिए बच, इस डेटा में शामिल नहीं थे. औसत प्लस माध्य (SEM) के मानक त्रुटि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Chimerism दर. यह डेटा केवल संख्या का प्रतिनिधित्व करता है यदि chimeras का उत्पादन किया, और chimerism की गुणवत्ता का पता नहीं है । पारंपरिक समूह में, वंश के 31% (34/110) chimerism, जहां TICM समूह ५०% (79/158) की एक औसत था दिखाया । औसत से अधिक माध्य (SEM) के मानक त्रुटि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह लंबे समय सोचा गया है कि आईसीएम के किसी भी गड़बड़ी मृत्युदर को जन्म दे सकता है, वास्तव में, वर्तमान ब्लास्टोसिस्ट microinjection प्रोटोकॉल अभी भी इस12,13की चेतावनी दी । क्या हम यहां दिखाया गया है कि आईसीएम के माध्यम से microinjection भ्रूण के लिए हानिकारक नहीं है, और chimeras की उपज बढ़ जाती है ।

इस आशय की सटीक व्यवस्था की पहचान नहीं हो पाई है । हालांकि, आईसीएम के यांत्रिक विघटन, और साथ hypoblast, नए गठन आईसीएम निंनलिखित microinjection में ES सेल एकीकरण की घटनाओं में वृद्धि करनी चाहिए । iPSCs के क्षेत्र में हाल के काम से पता चला है कि यांत्रिक उत्तेजना मानव iPSC14के reprogramming में मदद करता है । यदि यांत्रिक हेरफेर माउस भ्रूण के आईसीएम में एक समान प्रभाव है, यह आईसीएम जो संभावित अंतर करने के लिए शुरू कर दिया था की कोशिकाओं को लौटने का असर हो सकता है, वापस एक pluripotent राज्य के लिए, एक ' संभावित सिर ब्लास्टोसिस्ट दाता के शुरू ' हटाने भ्रूण ऊतक बनाने में व्युत्पंन कोशिकाओं । अंत में, यह संभव है कि आईसीएम में कोशिकाओं की एक अज्ञात संख्या की मौत में आईसीएम परिणाम के माध्यम से इंजेक्शन, microinjected आनुवंशिक रूप से संशोधित ES कोशिकाओं के लिए प्रतिस्पर्धा के स्तर को कम करने ।

इस विधि संशोधन के प्राथमिक लाभ है कि यह कोई नया सीखने की आवश्यकता है, समस्या निवारण, या उपकरण । सभी तकनीक मानक ब्लास्टोसिस्ट इंजेक्शन से अधिक ले । सबसे महत्वपूर्ण कदम भी अपरिवर्तित रहते हैं; भ्रूण के उचित और समय पर संग्रह, और पहले भ्रूण के लिए उचित संस्कृति की स्थिति, के दौरान, और इंजेक्शन के बाद । गैर सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण तकनीक का उपयोग करते समय, यह उचित प्राप्तकर्ता चूहों का चयन करने के लिए और अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है. शल्य चिकित्सा स्थानान्तरण के साथ, सर्जन के लिए माउस की जांच करने के लिए उचित प्रजनन राज्य, जहां गैर सर्जिकल स्थानांतरण के साथ, यह संभव नहीं है सत्यापित करने का अवसर था । चूहों प्रधानमंत्री प्रजनन आयु (6-9 सप्ताह) के होना चाहिए और केवल दिखाई प्लग के साथ चूहों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इस तकनीक का सबसे महत्वपूर्ण पहलू है, और सभी es सेल इंजेक्शन, es कोशिकाओं की गुणवत्ता है ।

जब उच्च गुणवत्ता, मजबूत सेल लाइनों से निपटने, इस तकनीक केवल ंयूनतम अंतर उपज सकता है, लेकिन उपइष्टतम ES सेल लाइनों या लाइनों के साथ काम करने के लिए मुश्किल है, किसी भी, मामूली सुधार के साथ, महत्वपूर्ण हो सकता है और परियोजना की सफलता के बीच अंतर कर सकते है और असफलता । यह ध्यान दें की भी है, कि इस अध्ययन के दौरान, कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध es सेल लाइनों germline chimeras उत्पंन, और लगभग सभी वाणिज्यिक ES लाइनों कि उत्पंन germline chimeras TICM इंजेक्शन थे । यहां हमें पता चला है कि तकनीक में एक साधारण परिवर्तन उत्पादकता में एक महत्वपूर्ण सुधार में परिणाम कर सकते हैं, नए उपकरणों, प्रशिक्षण, या पशुओं के उपयोग में वृद्धि के लिए किसी भी अतिरिक्त लागत खर्च के बिना ।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी हितों का खुलासा नहीं है.

Acknowledgments

इस अनुसंधान का समर्थन किया गया था [भाग में] NIH, राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान के अंदर अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए श्यामल Peddada को विशेष धन्यवाद. हम भी इस पांडुलिपि की समीक्षा के लिए Humphrey याओ, गैरी बर्ड, और युकी अराव शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और अपने निरंतर समर्थन और सलाह के लिए फ्रेंको मेयो ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ES Cell injection needle Humagen MSC-20-0
NSET device Paratechs 60010
DMEM Gibco (life technologies) 11965-092
FBS Gibco (life technologies) 10439-024 lots should be individually tested for ES Cell compatibility.
HEPES Sigma H0887
β-mercaptoethanol Sigma M7522
Micro manipulator Leica Micro manipulator
micro injector Eppendorf AG Cell Tram Air 5176
Microscope Leica DM IRB
4 well dish Thermo Scientific 176740
60 mm dish Sarstedt 83.3901
B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA 000058
Swiss Webster mice Taconic, USA Tac:SW
Injection Dish MatTek Corp. P50G-0-30-F

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References

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Scott, G. J., Gruzdev, A., Hagler,… More

Scott, G. J., Gruzdev, A., Hagler, T. B., Ray, M. K. Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates. J. Vis. Exp. (135), e56955, doi:10.3791/56955 (2018).

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