Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

قياس النفاذية الحاجز الظهارية في أورجانويدس المعوية البشرية في الوقت الحقيقي

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56960
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Infectious Disease, University of Michigan

Summary

هذا البروتوكول وصف قياس نفاذية الحاجز الظهارية في معالجة دوائية التالية في الوقت الحقيقي في أورجانويدس المعوية البشرية باستخدام مجهر فلوري ويعيش خلية مجهرية.

Abstract

وأسفرت أوجه التقدم في الثقافة 3D من الأنسجة المعوية التي تم الحصول عليها عن طريق خزعة أو المتولدة من الخلايا الجذعية pluripotent عن طريق توجيه التمايز، نماذج متطورة في المختبر مخاطية الأمعاء. الاستفادة من هذه النظم النموذجية الجديدة سوف تتطلب تكييف الأدوات والتقنيات المتقدمة لنظم الاستزراع 2D والحيوانات. وهنا يصف لنا تقنية لقياس نفاذية الحاجز الظهارية في أورجانويدس المعوية البشرية في الوقت الحقيقي. يتم ذلك عن طريق microinjection ديكستران المسمى فلوريسسينتلي وتصوير المعني مجهر مقلوب مزودة بمرشحات ابيفلوريسسينت. القياس في الوقت الحقيقي من نفاذية الحاجز في الأمعاء أورجانويدس تيسر توليد البيانات العالية الاستبانة الزمانية في الأنسجة الظهارية المعوية البشرية، على الرغم من أن هذا الأسلوب يمكن أن تطبق أيضا على تيميبوينت الثابتة التصوير النهج. هذا البروتوكول سهولة التكيف لقياس نفاذية الحاجز الظهارية عقب التعرض لعوامل دوائية أو المنتجات البكتيرية أو السموم أو الكائنات الحية الدقيقة. مع تعديلات طفيفة، هذا البروتوكول يمكن أيضا بمثابة تمهيدي عام في microinjection أورجانويدس المعوية، ويمكن للمستخدمين اختيار لتكملة هذا البروتوكول مع التطبيقات المتلقين للمعلومات الإضافية أو البديلة عقب microinjection.

Introduction

ظهارة الأمعاء يشكل حاجزاً انتقائي الذي يتوسط اتجاهي نقل المواد المغذية،2س ح والايونات ومنتجات النفايات مع التقليل من تبادل نشر بوساطة غير محدد من الجزيئات الأخرى بين التجويف الوسيطة أنسجة أو دم العرض1،2. نفاذية الحاجز الظهارية المعوية غير محدد منذ فترة طويلة تعتبر معلمة فنية أساسية في الصحة والمرض3،4،،من56، يعكس معدل نشر الجزيئات الصغيرة عبر الظهارة عبر الفضاء باراسيلولار. يمكن إجراء قياس نفاذية الحاجز الظهارية في النماذج الحيوانية7 و المرضى البشرية8 عن طريق ابتلاع lactulose، الذي لديه لا الناقل محددة في الجهاز الهضمي، وجمع اللاحقة وقياس تركيزات lactulose في الدم المحيطي. علامات بلعها بديل لوظيفة الحاجز مثل الكربوهيدرات المسمى فلوريسسينتلي هي أيضا متاح9،10. وهذا النهج قد تم تكييفه للثقافات الخلية الظهارية المعوية نمت على ترانسويل يدعم11، نهج مبسط يسمح لقدر أكبر من السيطرة تجريبية لكنها انتقدت أيضا منبئ فقيرة من فيفو نفاذية نظراً لعدم وجود الأنواع الفرعية الظهارية متمايزة والأنسجة هيكل12. استخدام الدوائر تمثل نهجاً آخر، وتسمح لقياس وظيفة الحاجز الظهارية في الغشاء المخاطي المعوي كله السابقين فيفو13. وكثيراً ما يقتصر تطبيق هذه التقنية الأنسجة توافر والشرط13،14. وهكذا الأساليب الجديدة التي توازن بين إمكانية تكرار نتائج والإنتاجية ذات الصلة الفسيولوجية ضرورية.

لقد أدت التطورات الأخيرة في organogenesis في المختبر إلى اعتماد نظم زراعة الأنسجة 3D النموذجي كمنصة متطورة لأتصدى ديناميات الأنسجة المعقدة15،16،17 ،،من1819،20،21،،من2223. على وجه الخصوص، ظهرت البشرية pluripotent الخلايا الجذعية (هبسك) تستمد البشرية أورجانويدس المعوية (هيوس)19،24 كنظام استنساخه وتجريبيا يستهدف نموذج لدراسة التفاعلات بين المضيف للميكروبات و حاجز الظهارية ديناميات25،26،،من2728. وبالمثل، يمكن أن يستمد من إجراء خزعة بسيطة أورجانويدس المستمدة من الأنسجة البشرية (يعرف أيضا باسم انتيرويدس) ويمكن استخدامها كنظام المرونة لدراسة علم وظائف الأعضاء البشرية والمرض15،،من2930. Microinjection أورجانويدس المعوية البشرية يسمح لتسليم المركبات التجريبية25 أو تعيش الميكروبات25،31،32،33 إلى قمي طلائي سطح التجويف أورجانويد. ليزلي وهوانغ et al. 25 مؤخرا تكييف هذه التقنية لقياس نفاذية الحاجز في هيوس ميكروينجيكتيد مع fluorescein isothiocyanate (فيتك) المسمى ديكستران عقب التعرض للسموم البكتيرية.

ويهدف هذا البروتوكول كدليل لقياس نفاذية الحاجز الظهارية في هيوس المستمدة من هبسك وهيوس المستمدة من الأنسجة باستخدام مجهر فلوري. مع تعديلات طفيفة، فإنه يمكن أيضا بمثابة تمهيدي عام على microinjection هيوس مع المركبات التجريبية. المستخدمين قد يكمل هذا البروتوكول مع تطبيقات المتلقين للمعلومات الإضافية أو البديلة بعد microinjection.

Protocol

عادي، حدد إزالة الأنسجة المعوية الكبار البشرية تم الحصول عليها من الجهات المانحة الجهاز المتوفى من خلال "هبة الحياة"، ميشيغان. وفاق البشرية الخلية خط H9 (التسجيل #0062 من المعاهد الوطنية للصحة) تم الحصول عليها من معهد بحوث ويسل. تم إلغاء تحديد جميع الأنسجة البشرية المستخدمة في هذا العمل تم الحصول عليها من الجهات المانحة غير الحية وأجرى مع الموافقة من جامعة ميشيغان مجلس الهجرة واللاجئين (البروتوكول رقم HUM00093465 و HUM00105750).

1-الإعداد ميكروينجيكتور

  1. الحصول على المواد المدرجة في الجدول المواد.
  2. مكان ميكرومانيبولاتور، ونطاق تشريح، ومصدر الضوء في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. تنظيف الإعداد microinjection مع الإيثانول 70% أو غيرها مطهر قبل الاستخدام التجريبي. تجنب التعرض المطول للمطهرات المحتوية على التبييض، والتي قد تآكل المعدات microinjection.
    ملاحظة: يظهر مثال جمعية ميكروينجيكتور كاملة في الشكل 1.
  3. ضع نطاق تشريح بحيث يمكن استخدام قطعة العين عن طريق ميناء الوصول في الدرع للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
    1. بدلاً من ذلك، استخدام منضدة نظيفة مع نظام تدفق الهواء إيجابية بدلاً من مجلس الوزراء مع نقاط الوصول مجهر السلامة الأحيائية.
  4. التجمع في ميكرومانيبولاتور على الجانب الأيمن من المجهر طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة وضبط بحيث يمكن بسهولة التوصل إلى عناصر التحكم وتعديلها. ينبغي شنت على صفيحة حديد ميكرومانيبولاتور أو خلاف ذلك استقرت.
    ملاحظة: قد ترغب مستخدمي اليد اليسرى في المكان ميكرومانيبولاتور إلى يسار نطاق تشريح.
  5. جبل صاحب ميكروبيبيتي في الذراع ميكرومانيبولاتور وتوصيل أنابيب التناظرية بإدراجه في حامل ميكروبيبيتي.
  6. ملء المحاقن الزجاجية 10 مل بحوالي 5-7 مل الزيوت المعدنية العقيمة.
  7. قم بتوصيل المحاقن الزجاجية 10 مل مليئة بالزيوت المعدنية إلى نهاية الأنبوب التناظرية استخدام إليه قفل اللوير مفتوحة. ضع المحاقن الزجاجية إلى يسار نطاق تشريح، مقابل من ميكرومانيبولاتور.
  8. كساد المحاقن، دفع النفط عبر الأنبوب بلطف. تدفق ما يقرب من 10 قطرات الزيوت المعدنية من طرف صاحب ميكروبيبيتي وجمع في طبق بتري أو سفينة مماثلة وتجاهل.
    ملاحظة: هذه الخطوة يزيل جميع الهواء من الأنابيب ويجب تنفيذها من قبل كل دورة microinjection.

2-الإعداد ل microinjection

  1. 24 ساعة قبل microinjection:
    1. إعداد فيتك ديكستران الحل بإعادة تعليق ديكستران فيتك بتركيز 2 مغ/مل في برنامج تلفزيوني أو المحلول الملحي المعقم. إعداد إجمالي حجم > 250 ميليلتر.
      ملاحظة: تركيزات أعلى أو أدنى من ديكستران فيتك قد تستعمل، تتراوح ما بين حوالي 0.1-10 ملغ/مل. ضبط تركيز فيتك-ديكستران لتتناسب مع مجرى النهر من تطبيق التصوير.
    2. الإعداد أورجانويد الثقافات على 4 أو 8 آبار زجاج غرفة الشرائح أو غيرها من السفن الثقافة مناسبة للعيش مجهرية، مع يصل إلى 4-6 هيوس الواحدة أيضا، جزءا لا يتجزأ من 50 ميليلتر خلية مصفوفة الحل ومثقف في مماثلة ورأس سبوندين R (ENR) عامل نمو وسائل الإعلام 19 ،24. الحرص على المساحة أورجانويدس بالتساوي (حوالي 5 ملم وبصرف النظر) لتجنب التقاط هيوس متعددة في حقل مفرد مجهرية أثناء تحليل التصوير في الوقت الحقيقي. للحصول على دليل كامل لثقافة HIO وصيانة راجع مككراكين et al. 24.
      ملاحظة: وضعت هذا البروتوكول باستخدام الخلايا الجذعية المشتقة هيوس وتدل نتائج الممثل (انظر أدناه) استخدام هذا النموذج زراعة الأنسجة. بيد أن البروتوكول نفسه هو تتكيف بسهولة المستمدة من أنسجة الأمعاء الظهارية أورجانويدس15،29. هيوس المستمدة من الأنسجة عادة أصغر من هيوس المستمدة من PSC والافتقار إلى دعم mesenchymal basolateral خلية هيكل15،29،30. Microinjection هيوس المستمدة من الأنسجة قد تتطلب درجة أكبر من القدرة التقنية والخبرة. الدرجة التي قد ربط البيانات نفاذية الحاجز الظهارية الحصول عليها باستخدام هيوس المستمدة من الأنسجة مع هيوس المستمدة من هبسك غير معروف.
    3. احتضان هيوس في حاضنة ثقافة خلية قياسية في 42 درجة مئوية و 5% CO2 قبل microinjection.
  2. 30 دقيقة قبل microinjection، بدوره في السلامة الأحيائية في مجلس الوزراء ورفع درع الزجاج إلى ذروة العمل الأمثل.
  3. إزالة كافة العناصر غير الضرورية من السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. فوضى يزيد من مخاطر الانسكابات أو غيرها من الحوادث عندما تعمل قصر المسافات.
  4. رذاذ ودقة تنظيف سطح العمل مع الإيثانول 70% أو المطهرات الأخرى. مسح نظيفة باستخدام منشفة ورقية.
  5. التحقق من مستوى الزيت المعدني في المحاقن الزجاجية يعلق إلى ميكروينجيكتور. إذا كان هناك أقل من 3 مل الزيوت المعدنية المتبقية، فك المحاقن والملء داخل السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، مع الحرص على تجنب إدخال الفقاعات. لا تملأ أكثر من 7 مل.
  6. قم بتشغيل المصباح لإلقاء الضوء على نطاق تشريح. ضبط العدسة للراحة الشخصية.
  7. موقف ميكرومانيبولاتور الحق في نطاق تشريح. تأمين ميكرومانيبولاتور لصفيحة حديد استخدام موقفا مغناطيسية. تبديل موقف المغناطيسي إلى الوضع OFF ضبط موضع ميكرومانيبولاتور وتأمين الموقف لصفيحة الحديد بإعداد موقف المغناطيسي إلى موضع ON.
  8. تركيب ميكروكابيلاري
    1. استرداد خيوط زجاج واحد 1 مم من حاوية التخزين التي توفرها الشركة المصنعة.
    2. إدراج خيوط الزجاج من خلال مركز اللولب تدفئة النحاس من ساحبة ميكروبيبيتي.
      ملاحظة: انظر الشكل 2 لدليل لإعداد ساحبة ميكروبيبيتي.
    3. ضع الشعيرة حيث يكون لفائف نحاسية تدفئة تقريبا في منتصف خيوط الزجاج. وهذا يضمن أن يولد ساحبة اثنين للاستخدام microinjection الإبر من كل خيوط الزجاج.
    4. تأمين خيوط الزجاج باستخدام المشبك المشابك بتشديد الأعلى أولاً، مع التأكد من أن يتم تأمين خيوط الزجاج داخل بستان مسنن منع الكسر.
    5. تمديد الذراع ساحبة إلى الموضع العمودي الحد الأقصى قبل تشديد المشبك السفلي.
      ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية. سيؤدي إلى فشل تماما تمديد الذراع ساحبة في الفصل غير النظامية بين هذين الفرعين من خيوط الزجاج.
    6. تحقق من الإعدادات على التدفئة وسحب إليه.
حدد الحرارة #1 مع التبديل (990) وسحب في 059 (الشكل 2).
  • قم بتشغيل الأداة باستخدام تبديل تشغيل/إيقاف تشغيل.
  • إغلاق الدرع الواقية شبكي واضغط على زر السحب على وجه ساحبة اليمين أسفل. لفائف نحاسية سوف تبدأ في الحرارة وتوهج اللون البرتقالي مشرق. ومع ارتفاع درجة الحرارة، سوف تبدأ خيوط الزجاج على امتداد وفصل في نهاية المطاف. بناء على الفصل بين طرفي خيوط الزجاج، الصك سوف الطاقة باستمرار.
    ملاحظة: لفائف نحاسية ستبقى ساخنة للغاية لعدة دقائق. خيوط الزجاج سحبت سوف يشار إليها باسم 'ميكروكابيلاري' من هذه النقطة إلى الأمام في البروتوكول.
  • مع الحرص على تجنب لمس اللولب النحاس، قم بإزالة واحدة من ميكروكابيلاريس الزجاج. يجب أن يكون ميكروكابيلاري نقطة دقيقة جداً. التعامل مع ميكروكابيلاري بعناية مع قفازات اللاتكس أو النتريل وتشرع فورا في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية التي تحتوي على الإعداد ميكروينجيكتور.
    ملاحظة: ميكروكابيلاري الزجاج حاد جداً وهشة للغاية. التعامل مع الرعاية.
  • قم بفك الغطاء نهاية الذراع ميكرومانيبولاتور. إدراج نهاية كليلة ميكروكابيلاري سحبت في النهاية المفتوحة لصاحب ميكروبيبيتي ودفعها إلى الداخل حتى توقف.
  • تأمين نهاية كليلة ميكروكابيلاري في الذراع ميكرومانيبولاتور بإعادة شد الغطاء الغاية.
    ملاحظة: عند تثبيت ميكروكابيلاري شأن نظام microinjection الحرص على تجنب لمس نهاية شحذ. وهذا الحد من فرصة للتلوث والمحافظة على النقطة الجميلة ل microinjection. يمكن أن يؤدي الفشل في تأمين بشكل صحيح في ميكروكابيلاري عدم الاستقرار أو الكسر من خيوط الزجاج خلال microinjection.
  • فتح غيض ميكروكابيلاري الزجاج. أثناء إعداد ميكروكابيلاري سحبت الزجاج، سوف تذوب غيض النقطة المحتمل في طريقة ختم نهاية أشار ميكروكابيلاري. لإزالة هذا الانسداد:
    1. ضع ميكرومانيبولاتور مثل ميكروكابيلاري هو أشار إلى أسفل المرحلة الزجاج في نطاق تشريح دون لمس هذا السطح.
    2. العثور على سطح بلاستيك عقيمة (الجزء السفلي من غطاء لوحة الثقافة يعمل تماما) ووضعه في مرحلة مجهر مباشرة أسفل الإبرة ميكروكابيلاري في مرحلة نطاق تشريح.
    3. مركز غيض ميكروكابيلاري تحت منطقة العرض، والتأكد من أنها تظهر عند النظر من خلال العدسة المجهر تحت 1.5 X التكبير.
    4. استخدام عناصر تحكم ميكرومانيبولاتور، تقدم ببطء الذراع ميكرومانيبولاتور وميكروكابيلاري نحو غطاء الثقافة بلاستيكية معقمة حتى التلميح بالكاد اتصالات سطح البلاستيك وغيض من ميكروكابيلاري يكسر مجاناً.
      ملاحظة: تهدف لكسر ممكن أصغر يسمح بتدفق السائل من خيوط الزجاج للتقليل من الأضرار التي لحقت HIO أثناء microinjection.
    5. مرة أخرى ميكروكابيلاري بعيداً عن السطح العقيمة لتقليل الفرصة للكسر العرضي قبل المتابعة.
    6. تحقق من ميكروكابيلاري للتدفق بالاكتئاب المحاقن الزجاجية، دفع النفط عبر الأنبوب. إذا تم فتح نهاية ميكروكابيلاري سوف تشاهد قطرات صغيرة من الزيوت المعدنية الخروج من غيض ميكروكابيلاري بعد بضع ثوان. إذا لم يحدث ذلك، كرر الخطوة السابقة وإعادة اختبار.

    • 3-معقم Microinjection

    ملاحظة: بمجرد أعد ميكروكابيلاري، وتثبيت، واختبارها، تبدأ هيوس ميكروينجيكتينج. ويوضح الشكل 3 المستمدة من الأنسجة HIO التي ضخت بنجاح مع فيتك-ديكستران.

    1. تعبئة في ميكروكابيلاري مع مواد الحقن. غمر غيض ميكروكابيلاري الزجاج في تعليق حقن ديكستران فيتك، مع الحرص على تجنب كسر غيض ميكروكابيلاري ضد الجانبين أو أسفل الأنبوبة. مجرد غيض من ميكروكابيلاري هي غارقة في الحل، التراجع في محقن الزيت المعدني لجذب حوالي 10 ميليلتر من تعليق ديكستران فيتك إلى ميكروكابيلاري.
      ملاحظة: من المستحسن استخدام أنابيب 1.5 مل أو 0.5 مل للحقن بالحلول/الثقافات منذ هذه سوف تكون أكثر سهولة ميكروكابيلاري المثبتة. وبدلاً من ذلك، حقن الحلول التي يمكن استخلاصها من طبق بتري معقم أو بارافيلم العقيمة، التي قد تقلل من فرصة الإصابة الأدوات الحادة عن طريق الحد من الحاجة إلى عقد أنبوب في مقربة من ميكروكابيلاري. إذا كان التعليق عالية اللزوجة أو إذا كانت افتتاح ميكروكابيلاري شكل استثنائي صغيرة، قد يستغرق عدة الثاني لملء في ميكروكابيلاري. لا رسم تعليق microinjection في الأنابيب البلاستيكية microinjection كهذا قد تلوث النظام microinjection كامل.
    2. وقف شغل في ميكروكابيلاري عند تعليق microinjection يملأ 90% طول ميكروكابيلاري الزجاج. كساد المحاقن قليلاً قبل أن تنسحب ميكروكابيلاري من حل microinjection لضمان عدم احتواء غيض ميكروكابيلاري جيوب الهواء.
      ملاحظة: إذا كان يكشف فحص ميكروكابيلاري جيوب الهواء، فارغة وإعادة التعبئة.
    3. إزالة plate(s) الثقافة HIO من خلية ثقافة حاضنة ونقل للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع ميكروينجيكتور.
    4. إزالة الغطاء من لوحة الثقافة HIO داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية ومركز البئر الأولى على المسرح المجهر حيث أنها واضحة للعيان من خلال العدسة النطاق على أقل إعداد التكبير.
    5. تشغيل الذراع ميكرومانيبولاتور أن ميكروكابيلاري هو أشار إلى أسفل إلى ثقافة HIO جيدا في زاوية > 45 درجة بالنسبة إلى مرحلة المجهر. هذا هو إنجاز الأكثر بسهولة يدوياً تشغيل الجمعية الذراع ميكرومانيبولاتور على المحور الأفقي في النقطة التي يلتقي فيها دعم الذراع الأفقي ميكرومانيبولاتور الوقوف العمودي، نظراً لعناصر التحكم الدقيقة (الأوجه السوداء) مجموعة محدودة من الحركة. ضع غيض ميكروكابيلاري أعلاه ثقافة الأولى جيدا في حوالي 1 سم فوق سطح وسائط الإعلام (الشكل 3A). ويبين الشكل 3Bصورة تمثيلية يدل microinjection أورجانويدس الظهارية المعوية المستمدة من الأنسجة.
    6. تحقق من أن كلا غيض من خيوط الزجاج و HIO(s) مرئية من خلال العدسة. إعادة تحديد موضع إذا لزم الأمر.
    7. المضي قدما في ميكروكابيلاري ببطء عن طريق تحويل مقبض التحكم محور ع عكس اتجاه عقارب الساعة.
      ملاحظة: الحكم على موقف نصيحة ميكروكابيلاري، لا سيما العمق، يتطلب ممارسة. كما يخالف الطرف السطح من وسائط الإعلام، لاحظ تشويه بصرية طفيفا لنصيحة ميكروكابيلاري.
    المضي قدما في الرعاية من هذه النقطة لتجنب كسر ميكروكابيلاري ضد الجزء السفلي من لوحة الثقافة أو إتلاف في هيوس.
  • بيرس HIO مع نصيحة ميكروكابيلاري. وسوف تخفض على السطح الخارجي HIO قليلاً كما ميكروكابيلاري يبدأ بتطبيق الضغط وسوف البوب العودة إلى الشكل كالتلميح تخترق التجويف. قد يكون من الصعب تحديد غيض ميكروكابيلاري داخل التجويف HIO. ضبط إعدادات الإضاءة أو تكبير نطاق تشريح إذا كان هناك صعوبة في رؤية ميكروكابيلاري.
  • إزالة اليدين من عناصر التحكم ميكرومانيبولاتور عند وضع في ميكروكابيلاري بشكل صحيح مع غيض ميكروكابيلاري القرب من مركز HIO.
  • كساد المحاقن المعدنية النفط قليلاً لدفع الحل microinjection الخروج من ميكروكابيلاري وفي التجويف HIO. قد تتوسع HIO قليلاً لاستيعاب حجم الحقن.
    ملاحظة: الحرص على تجنب الإفراط ملء HIO أن هذا سوف يسبب أورجانويد للانفجار. وكقاعدة عامة، أي توسيع حجم HIO مرئية يعني أنه حان الوقت لوقف. متوسط حجم التجويف HIO ناضجة حوالي 1 ميليلتر، لكن قد تختلف بشكل ملحوظ. الآلي المحاقن يمكن استخدام مضخات بدلاً من المحاقن يدوية لتسمح بتحكم جيد في حجم المحقون.
  • سحب ميكروكابيلاري من HIO استخدام مراقبة محور ع وموقف فوق السطح لوسائط الإعلام.
  • الانتقال إلى الهدف التالي HIO مع ميكروكابيلاري المتمركزة فوق وسائل الإعلام لتجنب التلف العرضي هيوس خلال المناورة وحقن بطريقة مماثلة (انظر خطوات 3.6-3.11).
    1. إعادة ملء ميكروكابيلاري استخدام النهج المبين أعلاه.
      ملاحظة: إذا كان التلميح فواصل عند أي نقطة أثناء microinjection، لا تحاول الاستمرار في الحقن. تغيير التلميح وفقا للتعليمات المبينة أدناه.
  • تغيير ميكروكابيلاري بين العلاجات أو في حالة الكسر. قم بفك المشبك في نهاية الذراع ميكرومانيبولاتور وإزالة ميكروكابيلاري من صاحب ميكروبيبيتي.
    تنبيه: لا تتعامل مع ميكروكابيلاري بالقرب من نهاية حادة. نقطة خير من ميكروكابيلاري حاد جداً، وسوف بسهولة ثقب الجلد وقفازات. يجب توخي الحذر ويكون على بينه من جميع الحركات، التعامل مع ميكروكابيلاري استخدام مناور فقط ولم يضع يديه بين نقطة ميكروكابيلاري والثقافات HIO. التماس العلاج الطبي فورا في حال عصا إبرة من ميكروكابيلاري التي تحتوي على العوامل المعدية أو السموم.
    ملاحظة: في بعض الحالات، قد يكون صعباً لتأكيد نجاح HIO microinjection بصريا. باستخدام إضافة تركيزات أعلى من ديكستران فيتك، يمكن أن تعزز رؤية المعلقات microinjection واضحة.

    • 4-المعالجة في هيوس

    1. لاختبار المركبات تسليمها إلى ظهارة قمي، ريسوسبيند في برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على 2 مغ/مل ديكستران فيتك وميكروينجيكت في التجويف HIO كما هو مبين أعلاه (الفرع 3). للتجربة التمثيلية، ريسوسبيند المطثيّة العسيرة تكسين تكدا 12.8 نانوغرام/ميليلتر في برنامج تلفزيوني يتضمن فيتك-ديكستران.
    2. لاختبار المركبات تسليمها إلى حجرة basolateral، تحل محل ثقافة وسائل الإعلام الخارجية مع وسائط الإعلام الجديدة تحتوي على 2 مم جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-N، N، N '، ن'--حمض tetraacetic (اجتا)(positive control)، برنامج تلفزيوني المركبة وحدها (مراقبة سلبية )، أو أخرى المجمع التجريبي بعد microinjection فيتك-ديكستران.
      ملاحظة: قد تختلف الجرعات وتوقيت تطبيق مركبات دوائية أو السموم أو وكلاء آخرين وفقا لمسألة تجريبية.

    5-يعيش التصوير من أورجانويدس ميكروينجيكتيد

    1. تبدأ microinjection فور التصوير الحي. نقل لوحات الثقافة إلى مجهر فلوري مجهزة بغرفة هوميديفيد للحفاظ على 37 درجة مئوية و 21% O2 و 5% CO2 مع خلية يعيش الآلي نظام التصوير. إغلاق دائرة البيئة والبدء بعملية التصوير.
    2. إطلاق برنامج تحليل الصورة (مثلاً، سوفتوركس) من على سطح المكتب. انقر فوق "ملف" ثم حدد "اكتساب (تصميم ثلاثي الأبعاد)" لتهيئة بالتصوير وبرنامج حاسوبي لمراقبة المجهر.
    3. مجموعة الإثارة/الانبعاثات إلى فيتك (475 نيوتن متر الإثارة/523 نانومتر الانبعاث)، تعيين انتقال السلطة إلى 5%، والعدسة إلى 4 X. تعيين وقت التعرض إلى 0.025 مرض التصلب العصبي المتعدد (الشكل 4 أ).
      ملاحظة: ينبغي أن يختلف وقت التعرض لتتناسب مع قوة الإشارة الفلورسنت. وبصفة عامة، سينخفض فقط إشارة fluorescence فيتك. ولذلك، لضمان أقصى قدر من الحساسية، ينبغي أن تعدل مرات التعرض الأولى أن إشارة الفلورسنت مسجل فقط أقل من نقطة التشبع للكاميرا وبرامج التصوير.
    4. العثور في هيوس في 4 X التكبير باستخدام وحدة التحكم الرقمية بتعلق بالمجهر. مركز HIO داخل عرض الحقل (الشكل 4 أ).
    5. انقر فوق "عرض" على شريط الأدوات، وحدد "أشر قائمة" لإظهار نافذة جديدة. انقر فوق "وضع علامة نقطة" لتخزين الموضع الحالي للمرحلة في القائمة نقطة (الشكل 4 أ).
    6. كرر الخطوات من 5، 4 و 5-5 حتى تم تسجيل مواقف هيوس جميع. باستخدام "المفكرة" أو سجل رقمي، جعل علما برقم معرف فريد تم تعيينها لكل موقف مجهرية المبرمجة والصور التي تم التقاطها في هذا الموضع. ملفات الصور سوف تكون المعلمة مع رقم معرف هذه، وسيكون من المهم إقران أرقام معرف الصورة المحددة هيوس والعلاجات بعد الانتهاء من جمع البيانات.
    7. لإعداد مجموعة الصور التلقائية، انقر فوق "ملف" ثم "التجربة" في شريط الأدوات. اسم التجربة مع التاريخ أو اسم فريد آخر.
    8. تعيين المعلمات لمجموعة الصور التي يمر بها كل من علامات التبويب الخيار كما هو موضح في الشكل 4 باء.
      1. الأمم المتحدة--الاختيار "تقطيع Z" ضمن علامة التبويب "تقطيع".
      2. ضمن علامة التبويب "قنوات"، أدخل المعلمات من الإطار العلوي الأيسر "حل 3D". لتوفير الوقت، سيتم ملء الصف الأول تلقائياً عند التحقق من المربع الموجود على اليسار.
      3. ضمن علامة التبويب 'الوقت الفاصل بين"، حدد المربع المسمى"مرور الوقت"وأدخل الفاصل الزمني بين الصور في الصف المسمى"مرور الزمن"والمدة الإجمالية لهذه التجربة في الصف المسمى"إجمالي الوقت". سيقوم البرنامج تلقائياً بحساب عدد النقاط الزمنية.
      4. ضمن علامة التبويب "النقاط"، حدد المربع المسمى "قائمة بزيارة نقطة".
    يمكنك أيضا يدوياً إدخال أرقام النقطة المحددة التي ستدرج في التجربة بالكتابة في مربع النص.
  • لا تتغير الخيارات الافتراضية ضمن علامات التبويب "الأفرقة" أو "الإجراءات".
  • انقر فوق علامة التبويب "تشغيل" أدخل تاريخ التجربة في المربع المسمى "اسم ملف الصورة"، وتعيين البيانات حفظ الموقع ضمن "إعدادات".
  • انقر على السهم الأخضر لتشغيل الماكرو التجربة. عداد مرور وقت سوف تتبع التقدم المحرز في التجريبية.
  • في نهاية الدورة الزمنية المخططة، تصدير وحفظ جميع ملفات الصور كالصور ذات 24-بت RGB TIFF (الشكل 4).
    1. على شريط الأدوات، حدد العملية التي تليها منشئ المهمة.
    2. في القائمة منشئ المهمة، إضافة الملفات عن طريق الانتقال إلى مجلد البيانات المحددة في 5.9. تسليط الضوء على كافة الملفات التي تنتهي في ".dv" بكتابة "المنزلي" في موجه الأوامر. حدد كافة (Ctl + A)، ثم انقر فوق "إضافة".
    3. انقر على + تحت القسم المسمى "المهمة". حدد "تصدير as..."، وانقر فوق علامة التبويب "خيارات".
    4. تعيين "تنسيق" إلى "صور TIFF" تصدير وحدد المربع أدناه لإضافة "مجلد الإخراج مخصصة". هذا هو الموقع حيث سيتم تصدير الصور TIFF. حدد ذات 24-بت RGB تحت "نوع الإخراج TIFF" وانقر فوق "تم".
    5. انقر فوق "إرسال إلى قائمة انتظار" لتشغيل "الماكرو تصدير".
  • نسخ الصور TIFF المصدرة في 5.11 إلى سائق خارجي أو الخادم إذا كنت سوف يكون إجراء التحليل بعد انتهاء التصوير (الجزء 6) على جهاز كمبيوتر مختلف.
    ملاحظة: HIO الأنسجة ووسائل الإعلام قد تكون مخزنة للأنسجة34، بكر35)، وغربي لطخة36، أو أخرى تحليل المتلقين للمعلومات.

    • 6-تحليل ما بعد التصوير

    1. تأكد من تثبيت ImageJ37 ويعمل بشكل صحيح على جهاز الكمبيوتر لاستخدامها للتحليل.
      ملاحظة: فيجي37 هو بتوزيع بديلة للبرنامج الأساسي إيماجيج الذي سوف تعمل جيدا على قدم المساواة لهذا التحليل.
    2. بدء تحليل دفعة عن طريق تحديد "عملية"، ثم "دفعة"، وأخيراً "ماكرو" قائمة إيماجيج.
    3. قم بتعيين الإدخال إلى الدليل الذي يحتوي على الصور TIFF التي تم جمعها أثناء الوقت التجريبي. فتح ملف الماكرو إيماجيج "thesholdmeasure.ijm" أو مباشرة نسخ/لصق التعليمة البرمجية الماكرو في الإطار. انقر فوق "عملية" لبدء معالجة الملفات.
      ملاحظة: قيمة العتبة الدنيا x (يمكن تعيين setThreshold(x,255);) إلى أي رقم 0-255 وينبغي تعديلها بغية القضاء على خلفية الأسفار. القيم < ينصح 100. تجريبيا تحديد قيمة حدية مناسبة، تشغيل الماكرو التصوير في صورة واحدة تمثل أورجانويد مع لا إشارة الفلورسنت. يمكن أن متوسط كثافة هذه الصورة بمثابة دليل لتحديد العتبة على نحو ملائم. لتحليل الممثل المعروضة أدناه، تم تعيين العتبة إلى "42".
    4. إيماجيج سوف تنتج جدول كبير يحتوي على المنطقة لكل بكسل داخل نطاق كثافة عتبة، ويعني، والوسيط، والحد الأدنى، وكثافة كحد أقصى (الحد الأقصى) قيمة للمنطقة الواقعة ضمن حدود كثافة عتبة. حفظ هذا التقرير كأحد CSV أو XLS.
    5. تكون يمكن حسابها تغير في كثافة على مر الزمن عن طريق التلاعب في جدول البيانات إجراء العملية الحسابية أدناه في جدول بيانات39 ، أو يمكن أن تكون تلقائية باستخدام مناسبة لغة البرمجة. ويرد برنامج نصي تحليل مثال مكتوب في ص 40 مع هذه المخطوطة.
      ملاحظة: لكل HIO، الكثافة النسبية الأسفار قد يكون كمياً ك Equation 1 . القضاء على الوقت 41 (t1/2) من ديكستران فيتك في التجويف HIO كانت تحسب على النحو التالي:
      1. أولاً، حساب المنطقة تحت المنحنى (AUC) من المنحنى واصفاً شدة الأسفار النسبي على مر الزمن (t):
        Equation 2
      2. ثم، حساب "تصريح" (Equation 3) معدل مع حجم التوزيع (تد) يعرف 1 للأسفار تم تسويتها في t = 0:
        Equation 4
      3. بعد ذلك، تعريف "القضاء على معدل ثابت" (Equation 5) ك:
        Equation 6
      4. وأخيراً، حساب "وقت القضاء" (تي1/2) أنه:
        Equation 7
        المعادلة انخفاض التالي:
        Equation 8

    Representative Results

    كانت متباينة من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية هيوس ومثقف في خلية مصفوفة الحل كما سبق وصف19،24. بعد 4 أسابيع في الثقافة، وسعت هيوس بما فيه الكفاية للسماح ل microinjection. وقد ميكروينجيكتيد هيوس مع 4 كاتشين مترافق FITC ديكستران علقت في برنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني يتضمن المطثيّة العسيرة السمية تكدا. جيم من مسببات الأمراض المعدية معوية انتهازية يسلك السمية بوساطة سمية الظهارية في هيوس25. كعنصر إيجابي، أضيف إلى وسائط الثقافة HIO في مجموعة فرعية هيوس حقن ببرنامج تلفزيوني وفيتك-ديكستران اجتا. عطا هو تشيلاتور كالسيوم الذي يسبب سرعة البلمرة دي cytoskeleton أكتين42. تم رصد الأسفار فيتك في الوقت الحقيقي على مجهر تصوير العيش داخل دائرة البيئة التي تسيطر عليها، وتم القبض على الصور في فواصل زمنية 10 دقائق.

    وكشف تحليل وظيفة مخصصة لبيانات التصوير اختلافات كبيرة في الاحتفاظ بالأسفار فيتك (الشكل 5). هيوس حقن مع برنامج تلفزيوني الإبقاء على ما يقرب من كل إشارة الفلورسنت حاضرا في تي = 0، لكن هيوس التي تم حقنها أيضا مع تكدا من تعامل مع عطا انخفاض كبير في شدة الفلورسنت أظهرتها microinjection بعد 8 ساعات (الشكل 5A). تم قياس كمية بيانات التصوير لجميع هيوس في جميع النقاط الزمنية لإنشاء مجموعة بيانات ذات الدقة عالية تمثل التغير النسبي في كثافة الفلورسنت على مر الزمن في كل حالة تجريبية (الشكل 5 (ب)). وقيمت الاختلافات في نفاذية الظهارية باحتساب الوقت يعني القضاء على (تي1/2 ) من فيتك لكل مجموعة العلاج (الجدول 1) ومقارنة الاختلافات في تي تي1/2 بين المجموعات استخدام الطالب t-اختبار. هيوس المعالجة بالتحكم الاحتفاظ بأغلبية فيتك إشارة مضيئة لأكثر من 16 ساعة (t1/2 = 17 ± 0.3 ح). المعاملة مع اجتا انخفاضا كبيرا فيتك-ديكستران وقت القضاء بالنسبة إلى مراقبة هيوس (t1/2 = ± 2.6 0.2 ح؛ P = 1.3 × 10-8). واتساقا مع النتائج المنشورة سابقا25، microinjection تكدا زيادة كبيرة نفاذية الحاجز الظهارية مقارنة بمعاملة السيطرة (t1/2 = 7.6 ± 0.6 ح؛ P = 5.4 × 10-4). وهكذا، خارجي (عطا) وميكروينجيكتيد (تكدا) المركبات قادرة على استحثاث تعديلات هامة في نفاذية الحاجز الظهارية في هيوس. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن تقييم آثار مجموعة واسعة من عوامل دوائية ونواتج الأيض والمنتجات البكتيرية، السيتوكينات، عوامل النمو وغيرها من المركبات على حاجز الظهارية الدالة باستخدام هذا النهج.

    العلاج نصف عمر (ح) (ح) ووزارة شؤون المرأة انخفاض 95% CI (ح) العليا 95% CI (ح) n
    عنصر التحكم 17، 11 0.3 16.45 17.78 11
    اجتا 2.58 0.19 1.78 3.38 3
    تكدا 7.56 0.63 5.93 9.18 6

    الجدول 1: يعني القضاء على الوقت (t1/2) فيتك-ديكستران في هيوس تعامل مع اجتا أو تكدا. وتعتبر الوحدات microinjection بعد ساعات.

    Figure 1
    رقم 1: تخطيط أساسي ميكروينجيكتور وميكرومانيبولاتور ل HIO microinjection- تظهر هذه الصورة تكملة كاملة من المعدات المستخدمة لأداء microinjection هيوس. تتم تسمية العناصر الرئيسية ويمكن الاطلاع على معلومات الطلب في الجدول المواد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 2
    رقم 2: ساحبة ميكروبيبيتي. النحاس تدفئة لفائف المفوض السامي، c1من المشبك أعلى، أسفل المشبك (c2)، ساحبة ذراع (السلطة الفلسطينية)، الحرارة التحديد تبديل (ht) تعرف بالأسهم. يتم الإشارة إلى الإعداد الصحيح للحرارة 1 وسحب في نص أحمر. اقحم يظهر خيوط زجاج محملة بشكل صحيح استعداد لتدفئة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 3
    الشكل 3: صور الممثل من HIO المستمدة من الأنسجة حقن فيتك-ديكستران. (أ) صورة تبين الموضع من ميكروكابيلاري الزجاج قبل الإدراج في HIO و microinjection. (ب) صورة برايتفيلد من أورجانويدس المعوية البشرية المستمدة من الأنسجة بعد microinjection فيتك-ديكستران. علما أن إشارة fluorescence الواضح حتى بدون استخدام مجموعة عوامل تصفية معينة. هذا التلون الإيدز الدقة microinjection. 3 X التكبير الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 4
    الشكل 4: يعيش سير العمل التصوير- (أ) الصورة توضح الخطوات اللازمة لتعيين معلمات المجهر، وتجد في هيوس على الشريحة وحفظ موقف الساحة لكل HIO تصويرها. (ب) تصوير قبل الإعدادات لالتقاط قناة فيتك في فترات منتظمة في كل من المواقف التي المحدد في ألف (ج) تصوير ما بعد تصدير DV تنسيق البيانات الملفات كصور TIFF مع صورة TIFF واحدة كل HIO كل نقطة مرة.الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Figure 5
    الرقم 5: نتائج الممثل. (أ) الخلايا الجذعية المشتقة أورجانويدس المعوية البشرية (HIO) ميكروينجيكتيد مع 2 مغ/مل فيتك-ديكستران (كاتشين 4) تصويرها لمدة 20 ساعة. كانت ميكروينجيكتيد هيوس أيضا مع برنامج تلفزيوني (تحكم) أو السمية العسيرة Clostridium تكدا (12.8 نانوغرام/ميليلتر) أو تعامل مع 2 مم عطا إضافة إلى ثقافة وسائل الإعلام الخارجية. 4 X التكبير. الأرض (ب) متوسط كثافة فيتك طبيعية على مر الزمن في هيوس تعامل مع برنامج تلفزيوني (تحكم) أو تكدا اجتا. تمثل أشرطة الخطأ S.E.M. و n = هيوس 11 (مراقبة)، هيوس 3 (اجتا)، هيوس 6 (تكدا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Discussion

    يضع هذا البروتوكول طريقة عامة microinjection هيوس المستمدة من هبسك والمستمدة من الأنسجة المعوية أورجانويدس وقياس النفاذية الحاجز الظهارية في الوقت الحقيقي. كما أثبتنا نهجنا لتحليل وتفسير البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الأساليب. ونظرا لتزايد اعتماد أورجانويدس المعوية نظم نموذجية16،،من2021،28 واهتمام منذ أمد بعيد في نفاذية الجدار المعوي كالناحية الفسيولوجية ذات الصلة الوظيفية نتائج3،،من45،6، ونحن نتوقع أن الآخرين الذين يعملون في هذا المجال سوف تكون قادرة على تطبيق والاستفادة من هذه الأساليب.

    وهناك العديد من الخطوات التي حاسمة بالنسبة لتطبيق هذا الأسلوب. الحصول على جودة عالية هبسك-أو الأنسجة المشتقة HIO الأنسجة ينبغي قبل إجراء تجارب واسعة النطاق مع microinjection. قد يكون حداتها HIO ايربان، مع اختلاف في الحجم والشكل، وعلى الرغم من أن هوية الأنسجة ومورفولوجيا الخلوية يتم استنساخه بدرجة عالية عند استخدام المنهجية المتبعة لتوليد هيوس24. هيوس كروية تتكون من التجويف شبه شفافة مفردة وقياس حوالي 1 ملم في القطر مثالية ل microinjection وقياس fluorescence لومينال في الوقت الحقيقي. وفي بعض الحالات، سوف تفشل microinjection، مما أدى إلى انهيار HIO أو التسرب الواضح لحقن المواد. يمكن إزالة هيوس الفاشلة من ثقافة جيدا في السلطة التقديرية للمستخدم باستخدام ميكروبيبيتي قياسية. النظر العدسات الهدف المتوفرة على منصة تصوير عند اختيار هيوس microinjection والتصوير. وبصفة عامة، 2-4 X الهدف العدسات مثالية لالتقاط الإشارات الفلورسنت HIO كاملة، على الرغم من أن يمكن استخدام هدفا X 10 إذا لم تتوفر العدسات طاقة منخفضة، أو إذا كانت هيوس المتاحة < 1 ملم في القطر. يجب أن تسمح برامج التصوير لالتقاط الآلي للصور الفلورية في نقاط محددة مع مرور الوقت.

    عدة تعديلات لهذا البروتوكول الممكنة كي يتلاءم مع متطلبات التجريبية. على سبيل المثال، قد تكون نتائج اختبارات وظيفة الحاجز تعتمد على حجم الجزيئي للمركبات في استخدام43 وقد يكون من المناسب لاختبار الاستعدادات ديكستران الوزن الجزيئي متفاوتة. وبالإضافة إلى ذلك، قد يتم تنفيذ التصوير برايتفيلد بالإضافة إلى تصوير الأسفار كمؤشر السلامة الهيكلية العامة ل الأنسجة25. عند أداء microinjection من البكتيريا يعيش25،28،31،32،،من3344، قد يكون من الضروري إضافة البنسلين و ستربتوميسين أو الجنتاميسين لوسائل الإعلام ثقافة HIO قبل أو بعد microinjection. الخارجي ميكروكابيلاري سوف تصبح ملوثة أثناء الملء مع تعليق ثقافة البكتيرية، وهذا يمكن نقلها إلى وسائط الإعلام HIO. بدلاً من ذلك، يمكن إجراء microinjection في هيوس معلقة في المصفوفة خارج الخلية (على سبيل المثال، ماتريجيل) بدون وسائل الإعلام، إضافة وسائل الإعلام بعد اكتمال microinjection. وهذا قد يحد من التلوث إلى المصفوفة خارج الخلية والوجه الخارجي HIO. عند التخطيط لفحوصات النمو الميكروبية، فإنه قد يكون من الضروري على إزالة المضادات الحيوية في وسائل الإعلام بعد 1-2 ساعة لتجنب إبطاء أو منع نمو الكائنات ميكروينجيكتيد.

    أخيرا، وإذ تسلم بأن ليس جميع الباحثين سوف يحصلون على معدات الفحص المجهري مناسبة للتصوير في المختبر ، من المهم الإشارة إلى أن الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول لجمع البيانات الأسفار يمكن تطبيقها على الصور الملتقطة في تيميبوينتس الثابتة باستخدام الفحص المجهري ابيفلوريسسينت القياسية دون التقاط الصور الآلي أو الضوابط البيئية. يمكن الاطلاع على أمثلة لهذا النهج في التقارير قبل ليزلي وهوانغ et al. 25، الذين فحصوا نشاط السمية جيم في اشتقاق هبسك أورجانويدس المعوية، وكارفي ومنظمة et al. 44، الذي فحص نفاذية الحاجز الظهارية في مماثلة أورجانويدس المعوية المستمدة من هبسك ميكروينجيكتيد مع العيش كولاي. دليل تشغيل معدات التصوير قد يؤدي مزيد من التباين وصعوبة في تطبيع إشارة الفلورسنت. عند القيام بالتصوير اليدوي من فيتك-ديكستران حقن هيوس من الضروري الإبقاء على التكبير الثابتة، وشدة الإثارة الفلورسنت، وأوقات التعرض طوال هذه التجربة لتجنب تشويه قياسات شدة الفلورسنت.

    Disclosures

    الكتاب قد لا يوجد تضارب المصالح المالية أو تضارب المصالح الأخرى بالكشف عن.

    Acknowledgments

    الكتاب يود أن يشكر الدكتور ستيفاني سبوهن وأبوايتا بازل للعديد من المناقشات المفيدة بشأن microinjection أورجانويد. العمال معتمد من قبل "اتحاد الخلايا الجذعية المعوية" (U01DK103141)، مشروع بحثي تعاوني يمولها المعهد الوطني للسكري والجهاز الهضمي، وأمراض الكلي (NIDDK) والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (نييد). العمال وفبي معتمدة من "رواية نييد"، نظم نموذج بديل لاتحاد الأمراض المعوية (نامسيد) (U19AI116482). DRH ويدعم "الآليات المرضية الجرثومية" منحة التدريب من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (نييد، T32AI007528) وجائزة السريرية والعلوم متعدية الجنسيات إلى معهد ميشيغان السريرية والصحة البحوث (UL1TR000433).

    تتوفر ملفات بيانات كاملة وبيانات تحليل التعليمات البرمجية المستخدمة في هذه المخطوطة في https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) Bioworld 405200081
    Cell matrix solution (Matrigel) Corning 354230
    Deltavision RT live cell imaging system GE Life Sciences 29065728 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
    Camera GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
    softWoRx Imaging software GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
    Biosafety cabinet Labconco Cell Logic+ http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
    1X PBS Life Technologies 10010-023
    Advanced DMEM-F12 Life Technologies 12634-010 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    B27 supplement (50X) Life Technologies 17504044 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    L-glutamine (100X) Life Technologies 25030-081 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    HEPES buffer Life Technologies 15630080 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Manipulator Narshge UM-3C
    Micromanipulator Narshge UM-1PF
    Pipette Holder Narshge UP-1 Alternate to Xenoworks pipette holder
    Magnetic stand Narshge GJ-1
    Dissecting scope Olympus SX61 Recommended scope, although other models are likely compatible
    Olympus IX71 Fluorescent microscope Olympus IX71 Included with Deltavision system
    CoolSNAP HQ2 Photometrics 29065728 Included with Deltavision system
    Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein R&D Systems 8619-GT-020
    EGF R&D Systems 236-EG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    R-spondin 1 R&D Systems 4645-RS Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Noggin R&D Systems 6057-NG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Mineral oil Sigma-Aldrich M8410
    FITC-dextran (4 kDa) Sigma-Aldrich 46944
    Micropipette puller Sutter Instruments P-30
    Nunc Lab-Tek II Chamber Slides ThermoFisher Scientific 154526PK
    Glass filaments WPI TW100F-4
    Micropipette holder Xenoworks BR-MH2 Preferred device
    Analog Tubing kit Xenoworks BR-AT
    1/16 in clear ferrule Xenoworks V001104
    1-1.2 mm O-ring Xenoworks V300450

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Standring, S., Borley, N. Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).
    2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).
    3. Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest. 84, 282-291 (2004).
    4. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
    5. Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).
    6. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target? Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).
    7. Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat. Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).
    8. Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. Intestinal permeability tests in coeliac disease. Clin Lab. 47, 143-150 (2001).
    9. Salles Teixeira, T. F., et al. Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls. Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).
    10. Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).
    11. Donato, R. P., et al. Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells. Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).
    12. Balimane, P. V., Chong, S. Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique. Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).
    13. Vidyasagar, S., MacGregor, G. Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability. Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).
    14. Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).
    15. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
    16. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
    17. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).
    18. Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids. Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).
    19. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
    20. Aurora, M., Spence, J. R. HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue. Dev Biol. 420, 230-238 (2016).
    21. Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).
    22. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
    23. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).
    24. McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).
    25. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
    26. Leslie, J. L., Young, V. B. A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions. Anaerobe. 37, 25-28 (2016).
    27. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).
    28. Hill, D. R., Spence, J. R. Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).
    29. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).
    30. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
    31. Engevik, M. A., et al. Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).
    32. Forbester, J. L., et al. Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells. Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).
    33. Engevik, M. A., et al. Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).
    34. Bancroft, J., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. , Churchill Livingstone. (2008).
    35. Kennedy, S., Oswald, N. PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
    36. Kurien, B., Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
    37. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
    38. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
    39. Winston, W. Microsoft excel data analysis and business modeling. , Pearson Education. (2016).
    40. R Core Team. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2017).
    41. Rosenbaum, S. Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , Wiley. (2016).
    42. Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).
    43. Vojdani, A. For the assessment of intestinal permeability, size matters. Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).
    44. Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli. PLoS One. 12, e0178966 (2017).

    Tags

    علم الأحياء التنموي، 130 قضية، أورجانويدس المعوية البشرية، microinjection، نفاذية الحاجز الظهارية، انتيرويدس، وزراعة الأنسجة 3D، التصوير في المختبر
    قياس النفاذية الحاجز الظهارية في أورجانويدس المعوية البشرية في الوقت الحقيقي
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., … More

    Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (130), e56960, doi:10.3791/56960 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter