Summary
Denne protokollen beskriver måling av epitelial barriere permeabilitet i sanntid følgende farmakologisk behandling i menneskelig intestinal organoids med fluorescerende mikroskopi og levende celle mikroskopi.
Abstract
Fremskritt i 3D kultur av intestinal vev innhentet gjennom biopsi eller generert fra pluripotent stamceller via rettet differensiering, har resultert i sofistikert i vitro modeller av tarmen. Utnytte disse nye modellsystemer krever tilpasning av verktøy og teknikker utviklet for 2D kultur og dyr. Her beskriver vi en metode for å måle epithelial barriere permeabilitet i menneskelig intestinal organoids i sanntid. Dette oppnås ved microinjection av fluorescently-merket dekstran og bildebehandling på en invertert mikroskopet med epifluorescent filtre. Sanntids måling av barriere permeabilitet i intestinal organoids muliggjør generasjonen av høy oppløsning timelige data i menneskelig intestinal epitel vev, selv om denne teknikken kan også benyttes til fast timepoint imaging tilnærminger. Denne protokollen er lett tilpasses for måling av epitelial barriere permeabilitet etter eksponering for farmakologisk agenter, bakteriell produkter eller giftstoffer eller levende mikroorganismer. Denne protokollen kan også tjene som en generell primer på microinjection av intestinal organoids med mindre endringer, og brukere kan velge å supplere denne protokollen med ytterligere eller alternative nedstrøms programmer etter microinjection.
Introduction
Intestinal epitel danner en selektiv barriere som formidler retningsbestemt transport av næringsstoffer, H2O, ioner og avfallsprodukter samtidig minimere uspesifikke diffusion-mediert utveksling av andre partikler mellom lumen og mesenchymal vev eller blod forsyning1,2. Uspesifikke permeabilitet av intestinal epithelial barrieren har lenge vært ansett som en funksjonell Nøkkelparameteren i både helse og sykdom3,4,5,6, som reflekterer satsen av spredning av små molekyler over epitel via paracellular plassen. Måling av epitelial barriere permeabilitet kan gjennomføres på dyr modeller7 og i menneskelige pasienter8 gjennom inntak av Laktulose, som har bestemte transporter i fordøyelsessystemet, og den påfølgende samlingen og måling av Laktulose konsentrasjonene i perifert blod. Alternative inntatt markører for barriere funksjon som fluorescently merket karbohydrater er også tilgjengelige9,10. Denne tilnærmingen har blitt tilpasset for intestinal epithelial cellekulturer dyrket på Transwell støtter11, en forenklet tilnærming som tillater større eksperimentelle kontroll, men har også blitt kritisert som en dårlig prediktor for i vivo permeabilitet av differensiert epithelial subtyper og vevet struktur12. Bruke kamre representerer enda en tilnærming og tillate måling av epitelial barriere funksjon i hele tarmen ex vivo13. Bruk av denne teknikken er ofte begrenset av vev tilgjengelighet og tilstand13,14. Dermed er nye metoder som balanserer reproduserbarhet og gjennomstrømning med fysiologiske relevans nødvendig.
Siste utviklingen i i vitro organogenesen har ført til innføringen av 3D vev kultur modellsystemer som en sofistikert plattform for recapitulating dynamikken i komplekse vev15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. Spesielt menneskelige pluripotent stamceller (hPSC) avledet menneskelige intestinal organoids (HIOs)19,24 har dukket opp som en reproduserbare og eksperimentelt medgjørlig modellsystem for studiet av vert-mikrobiell interaksjoner og epitel barriere dynamics25,26,27,28. Tilsvarende menneskelig vev-avledet organoids (også kjent som enteroids) kan utledes fra en enkel biopsiprosedyre og kan brukes som et tett system menneskelige fysiologi og sykdom15,29,30. Microinjection av menneskelig intestinal organoids tillater for levering av eksperimentelle forbindelser25 eller live mikrober25,31,32,33 til apikale epithelial overflaten av organoid-lumen. Leslie og Huang et al. 25 tilpasset nylig denne teknikken for å måle barriere permeabilitet i HIOs microinjected med fluorescein isothiocyanate (FITC) kalt dekstran etter eksponering for bakteriell giftstoffer.
Denne protokollen er ment som en guide for måling av epitelial barriere permeabilitet i hPSC-avledet HIOs og vev-avledet HIOs med fluorescerende mikroskopi. Med mindre endringer, kan den også fungere som en generell primer på microinjection av HIOs med eksperimentelle forbindelser. Brukere kan supplere denne protokollen med ytterligere eller alternative nedstrøms programmer etter microinjection.
Protocol
Normal, de identifiserte menneskelige voksne tarmen tissue ble innhentet fra avdøde orgel givere gjennom livets gave, Michigan. Human ES celle linje H9 (NIH register #0062) ble innhentet fra WiCell Research Institute. Alle menneskelig vev brukes i dette arbeidet er Hentet fra ikke-levende givere, de ble identifisert og ble gjennomført med godkjenning fra University of Michigan IRB (protokollen # HUM00093465 og HUM00105750).
1. microinjector installasjon
- Få materialer som er nevnt i Materialer.
- Sett den micromanipulator, dissecting omfang og lyskilden i fravær av smittefarlige stoffer skap. Rengjør microinjection oppsettet med 70% etanol eller andre desinfiserende før eksperimentell bruk. Unngå langvarig eksponering for desinfeksjonsmidler som inneholder blekemiddel, som kan føre til rust på microinjection utstyret.
Merk: Et eksempel på en komplett microinjector samlingen er vist i figur 1. - Plasser dissecting området slik at øyet stykke kan brukes gjennom tilgangsportens i skjoldet for biosikkerhet kabinett.
- Alternativt bruke en ren benk med positiv air flow-systemet i stedet for en biosafety kabinett med mikroskopet tilgangspunkter.
- Montere micromanipulator på høyre side av mikroskopet i henhold til produsentens instruksjoner og justere slik at kontrollene kan enkelt nås og justert. I micromanipulator bør være montert på en jernplate eller ellers stabilisert.
Merk: Venstrehendte brukere kan du plassere micromanipulator til venstre for dissecting omfanget. - Montere brønnene innehaver å micromanipulator armen og koble analoge slangen ved å sette det inn i brønnene holderen.
- Fyll sprøyten 10 mL glass med ca 5-7 mL steril mineralolje.
- Koble 10 mL glass sprøyten fylt med mineralolje til den åpne enden av analoge slangen med Luer låsemekanisme. Plass glass sprøyten til venstre for dissecting omfang, overfor fra micromanipulator.
- Forsiktig trykker sprøyten, skyve mineralolje gjennom slangen. Tømme ca 10 dråper av mineralolje fra spissen av brønnene holderen og samle i en Petriskål eller lignende fartøy og forkaste.
Merk: Dette trinnet fjerner alle luft fra slangen og skal utføres før hver microinjection økt.
2. forberedelse til microinjection
- 24 timer før microinjection:
- Klargjør FITC dekstran løsning ved å suspendere FITC dekstran i en konsentrasjon av 2 mg/mL steril PBS eller saltvann. Forberede et totalt volum på > 250 µL.
Merk: Høyere eller lavere konsentrasjoner av FITC-dekstran kan brukes, varierer fra ca 0,1 - 10 mg/mL. Justere konsentrasjonen av FITC-dekstran for nedstrøms til bildebehandlingsprogrammet. - Setup organoid kulturer på 4 - eller 8-godt glass kammer lysbilder eller andre kultur fartøy egnet for leve mikroskopi, med opp til 4-6 HIOs per Vel, innebygd i 50 µL celle matrix løsning og kultivert i EGF, Noggin og R-Spondin (ENR) vekstfaktor media 19 ,24. Pass på at avstand til organoids (ca 5 mm fra hverandre) for å unngå fange flere HIOs i en enkelt mikroskopiske felt under sanntid tenkelig analyse. En komplett guide til HIO kultur og vedlikehold se McCraken et al. 24.
Merk: Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av Stamcelle-avledet HIOs og representant resultatene (se nedenfor) viser bruk av denne vev kultur-modellen. Samme protokoll er imidlertid lett tilpasses til vev-avledet intestinal epithelial organoids15,29. Vev-avledet HIOs er vanligvis mindre enn PSC-avledet HIOs og mangel på støtte mesenchymal basolateral celle struktur15,29,30. Microinjection av vev-avledet HIOs kan kreve en større grad av tekniske ferdigheter og erfaring. Graden som epithelial barriere permeabilitet data innhentet ved hjelp av vev-avledet HIOs kan relatere med hPSC-avledet HIOs er ukjent. - Inkuber HIOs i en standard celle kultur inkubator på 42 ° C og 5% CO2 før microinjection.
- Klargjør FITC dekstran løsning ved å suspendere FITC dekstran i en konsentrasjon av 2 mg/mL steril PBS eller saltvann. Forberede et totalt volum på > 250 µL.
- 30 minutter før microinjection, slå på fravær av smittefarlige stoffer skap og heve glass skjoldet optimale arbeider høyden.
- Fjern alle unødvendige elementer fra biosikkerhet kabinett. Rot øker risikoen for søl eller andre ulykker når arbeider i begrenset mellomrom.
- Spray og rengjør arbeidet overflaten med 70% etanol eller andre desinfeksjonsmiddel. Tørk clean med tørkepapir.
- Kontrollere nivået av mineralolje i glass sprøyten festet til microinjector. Hvis det er mindre enn 3 mL mineralolje gjenværende, skru sprøyten og fylle innsiden biosikkerhet skap, forsiktige for å unngå å innføre bobler. Ikke fyll mer enn 7 mL.
- Slå på lampen å belyse dissecting omfanget. Justere okular for personlig komfort.
- Plasser micromanipulator til høyre for dissecting omfanget. Sikker micromanipulator til en jernplate med en magnetisk stand. Bytte magnetiske standen til stillingen å justere plasseringen av micromanipulator og Fest stativet jern platen ved å sette den magnetiske stå på on.
- Microcapillary installasjon
- Hente en enkelt 1 mm glass filament fra beholderen som leveres av produsenten.
- Sett inn glass filament gjennom midten av kobber oppvarming spolen av brønnene puller.
Merk: Se figur 2 for en guide å forberede brønnene puller. - Plasser filament slik at kobber oppvarming spolen er omtrent midt i glass filament. Dette vil sikre at puller genererer to brukbare microinjection pinner fra hvert glass filament.
- Sikre glass filament bruker klemmer ved å stramme de klemme først sørge for at glass filament er sikret i hakk grove å forhindre brudd.
- Utvide avtrekker armen til maksimal vertikal posisjon før stramme bunnen klemmen.
Merk: Dette trinnet er viktig. Unnlatelse av å fullt utvide avtrekker armen vil resultere i uregelmessig separasjon av de to delene av glass-filament. - Kontroller innstillingene på oppvarming og trekke mekanisme.
Merk: Kobber CoILen vil varme i flere minutter. Trakk glass filament vil bli referert til som en 'microcapillary' fra dette tidspunktet i protokollen.
Merk: Glass microcapillary er svært skarp og svært skjøre. Håndteres med forsiktighet.
Merk: Når du installerer microcapillary på microinjection systemet ta vare for å unngå å berøre skjerpet slutt. Dette reduserer sjansen for smitte og bevare det fine punktet for microinjection. Unnlatelse av å sikre riktig til microcapillary kan resultere i ustabilitet eller brudd av glass filament under microinjection.
- Plasser micromanipulator slik at microcapillary peker ned på glass scenen på dissecting området uten å berøre denne overflaten.
- Finne en steril plast overflate (undersiden av kultur plate lokk fungerer perfekt) og plassere den på mikroskopet scenen rett under microcapillary nålen på scenen av dissecting omfanget.
- Midtstiller spissen av microcapillary under visningsområdet og sikre at den er synlig når du ser gjennom i okularet av mikroskopet under 1,5 X forstørrelse.
- Micromanipulator-kontroller langsomt vil avansere micromanipulator armen og microcapillary mot steril plast kultur lokket til spissen knapt kontakter plast overflaten og spissen av microcapillary bryter gratis.
Merk: Mål for minste mulige bruddet som tillater væske-og gasstrøm fra glass filament for å minimere skader på HIO under microinjection. - Tilbake microcapillary fra sterilt overflaten for å redusere risikoen for utilsiktet brudd før du fortsetter.
- Sjekk microcapillary for flyt av nedslående glass sprøyten, skyve mineralolje gjennom slangen. Hvis slutten av microcapillary er åpnet vil du se en liten dråpe mineralolje komme fra spissen av microcapillary etter noen sekunder. Hvis dette ikke skjer, gjenta forrige trinn og re-teste.
3. sterilt Microinjection
Merk: Når microcapillary har vært forberedt, installert og testet, begynne microinjecting HIOs. Figur 3 viser en vev-avledet HIO som har blitt vellykket injisert med FITC-dekstran.
- Fyll microcapillary med injeksjon materialet. Senk spissen av glass microcapillary i FITC dekstran injeksjon suspensjon, forsiktige for å unngå å bryte spissen av microcapillary mot sidene eller bunnen av røret. Når spissen av microcapillary er neddykket i løsningen, trekke tilbake på mineralolje sprøyten å trekke ca 10 µL av FITC dekstran suspensjon i microcapillary.
Merk: Det anbefales å bruke 1,5 mL eller 0,5 mL rør for injeksjon løsninger/kulturer siden disse vil være den mest lett tilgjengelig for den installerte microcapillary. Alternativt injeksjon løsninger kan trekkes fra sterilt Petriskål eller sterilt parafilm, noe som kan redusere sjansen for sharps skader ved å begrense måtte holde et rør i umiddelbar nærhet til microcapillary. Hvis suspensjon er svært tyktflytende eller åpningen av microcapillary er svært liten, kan det ta flere andre til å fylle microcapillary. Ikke trekke microinjection suspensjoner i plast microinjection slangen som dette kan smitte hele microinjection systemet. - Stoppe fylle microcapillary når microinjection suspensjon fyller 90% av glass microcapillary. Trykke ned sprøyten litt før microcapillary fra den microinjection løsningen for å sikre at spissen av microcapillary ikke inneholder lommer av luft.
Merk: Hvis undersøkelse av microcapillary avslører lommer av luft, tømme og fylle. - Fjern HIO kultur plate(s) fra celle kultur inkubator og overføring til biosikkerhet kabinett med microinjector.
- Fjern lokket fra HIO kultur plate i biosikkerhet skap og center første brønn på mikroskopet scenen slik at den er synlig gjennom i okularet av omfanget på den laveste innstillingen for forstørrelse.
- Slå micromanipulator armen slik at microcapillary peker ned i HIO kulturen i en vinkel > 45° i forhold til mikroskopet scenen. Dette gjøres enkelt ved manuelt å slå samlingen micromanipulator armen på den vannrette aksen på punktet der vannrett micromanipulator arm støtte møter det vertikalt stativet, siden fin kontrollene (svart ringer) har et begrenset utvalg av bevegelse. Plasser tuppen av microcapillary over første kulturen i ca 1 cm over overflaten av media (figur 3A). Et representativt bilde viser microinjection av vev-avledet intestinal epithelial organoids er vist i figur 3B.
- Kontroller at begge spissen av glass filament og HIO(s) er synlig gjennom i okularet. Flytte om nødvendig.
- Gå til microcapillary langsomt ved å dreie kontrollknappen z-aksen.
Merk: Bedømme plasseringen av microcapillary spissen, krever spesielt dybden, praksis. Som spissen bryter overflaten av media, merke en liten visuelle forstyrrelser microcapillary tips.
Merk: Pass på å unngå over fylle HIO som dette får organoid til å sprekke. Som en tommelfingerregel betyr noen synlig utvidelse av HIO volumet det er tid til å stoppe. Betyr mengden av modne HIO lumen er ca 1 µL, men kan variere betraktelig. Automatisert sprøyte pumper kan brukes i stedet for en manuell sprøyte for å ha bedre kontroll av injisert.
- Fylle microcapillary ved hjelp av tilnærming som beskrevet ovenfor.
Merk: Hvis spissen bryter når som helst under microinjection, ikke forsøk å fortsette injeksjoner. Endre spissen i henhold til instruksjonene nedenfor.
Forsiktig: Håndter ikke microcapillary nær den skarpe enden. Det fint hensikten til microcapillary er svært skarp og vil lett punkterte hansker og hud. Vær forsiktig og være klar over alle bevegelser, håndtering microcapillary bruker manipulatoren bare og aldri å plassere hendene mellom punktet av microcapillary og HIO kulturer. Søk medisinsk behandling umiddelbart ved en nål pinne fra en microcapillary som inneholder smittestoffer eller giftstoffer.
Merk: I noen tilfeller kan det være vanskelig å visuelt bekrefte vellykket HIO microinjection. Synligheten av klart microinjection suspensjoner kan styrkes ved bruk av tillegg av høyere konsentrasjoner av FITC-dekstran.
4. farmakologiske behandlingen av HIOs
- For å teste forbindelser levert til apikale epitel, resuspend i sterilt PBS inneholder 2 mg/mL FITC-dekstran og microinject i HIO lumen som angitt ovenfor (del 3). For representant eksperimentet, resuspend Clostridium difficile gift TcdA på 12,8 ng/µL i PBS som inneholder FITC-dekstran.
- For å teste forbindelser levert basolateral rommet, erstatte det eksterne kultur mediet med nye medier som inneholder 2 mM etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N N', N'-tetraacetic syre (EGTA)(positive control), PBS kjøretøy alene (negativ kontroll ), eller andre eksperimentelle sammensatt etter microinjection av FITC-dekstran.
Merk: Dosering og timing av farmakologisk forbindelser, giftstoffer eller andre agenter varierer avhengig eksperimentelle spørsmålet.
5. live bildebehandling av Microinjected Organoids
- Starte live bildebehandling umiddelbart microinjection. Overføre kultur platene til fluorescerende mikroskop utstyrt med en fuktet kammer opprettholdt på 37 ° C og 21% O2 og 5% CO2 med en automatisert levende celle tenkelig system. Lukk miljømessige kammeret og starte avbildingsprosessen.
- Starte bildet analyseprogramvare (f.eks softWoRx) fra skrivebordet. Klikk "Fil" og velg "Hent (løse 3D)" initialisere bildebehandling og mikroskopet programvare.
- Angi eksitasjon/utslipp til FITC (475 nm eksitasjon/523 nm utslipp), satt inn signalstyrken til 5%, og objektivet til 4 X. Angi eksponeringstid til 0.025 ms (figur 4A).
Merk: Eksponeringstid bør varieres etter styrke fluorescerende signalet. Generelt vil FITC fluorescens signalet bare redusere. Derfor, for å sikre maksimal følsomhet, de første eksponeringstider skal justeres slik at fluorescerende endres bare under metningspunkt kamera og programvare. - Finne HIOs på 4 X forstørrelse med digitale kontrolleren knyttet til mikroskopet. Midtstill HIO i visningshurtigbufferen feltet (figur 4A).
- Klikk "Vis" på verktøylinjen og velg "Velg liste" å avsløre et nytt vindu. Velger "punktet" lagre gjeldende plassering for scenen i listen punktet (figur 4A).
- Gjenta trinn 5.4 og 5.5 til plasseringen av alle HIOs er spilt. Bruker en Notisblokk eller digital post, noter det unike ID-nummeret som er tilordnet hver programmert mikroskopi posisjon og bildene tatt i den posisjonen. Bildefilene vil bli merket med dette ID-nummeret og det vil være viktig å knytte bilde ID-numrene til bestemte HIOs og behandlinger når datainnsamlingen er fullført.
- For å setup automatisert bildesamlingen, klikk på "File" og deretter "Eksperiment" i verktøylinjen. Navn på eksperimentet med datoen eller en annen unikt navn.
- Angi parametere for bildesamlingen ved å gå gjennom hver av alternativkategoriene som vist i figur 4B.
- U--sjekk "Z snitting" under kategorien "Snitting".
- Under fanen "Kanaler", Angi parameterne fra øverste venstre "løse 3D"-vinduet. For å spare tid, fyller automatisk 1.p når boksen til venstre i merket.
- Under kategorien "Time-lapse", sjekk boksen "Tid forfalle" og angi tidsintervallet mellom bildene i kolonnen kalt "Time-lapse" og den totale varigheten av forsøket i kolonnen kalt "totaltid". Programmet beregner automatisk antallet tidspunkt.
- Under fanen "Poeng", sjekk boksen "Besøk punkt liste".
- Velg prosess etterfulgt av oppgaven builder på verktøylinjen.
- Legge til filer ved å navigere til datamappen angitt i 5,9 i oppgaven builder-menyen. Merk alle filer som slutter på ".dv" ved å skrive "*.dv" i ledeteksten. Velg alle (Ctl + A) og klikk "Legg til".
- Klikk på + under delen "Oppgave." Velg "Eksporter som..." og klikk på "Alternativer"-kategorien.
- Angi "Eksporter Format" på "TIFF-bilder" og sjekk boksen nedenfor for å legge en "egendefinert Output mappe". Dette er plasseringen der TIFF-bildene skal eksporteres. Velg 24-biters RGB under "TIFF utdatatype" og klikk "Ferdig".
- Klikk "Send til kø" for å kjøre makroen eksportere.
Merk: Den HIO vev og media kan oppbevares i histology34, PCR35), Western blot36eller andre nedstrøms analyse.
6. etter imaging analyse
- Kontroller at ImageJ37 er installert og fungerer på datamaskinen som skal brukes for analyse.
Merk: Fiji37 er en alternativ distribusjon av ImageJ kjernen program som fungerer like godt for denne analysen. - Starte satsvis analyse ved å velge "Prosess" og "Batch" og til slutt "Makro" menyen ImageJ.
- Angi innspill til katalogen som inneholder TIFF-bilder som er samlet inn under eksperimentelle time course. Åpne filen "thesholdmeasure.ijm" ImageJ makro eller direkte lime inn makrokoden i vinduet. Klikk "Prosess" for å begynne å behandle filene.
Merk: Laveste terskelen verdien x (setThreshold(x,255);) kan settes til så mange 0 - 255 og bør justeres for å fjerne bakgrunnen fluorescens. Verdiene < 100 anbefales. Å empirisk bestemme riktig terskelverdien, kjøre makroen tenkelig på et enkelt bilde som representerer en organoid med noe fluorescerende signal. Mener intensiteten i dette bildet kan fungere som en guide for å angi terskelen riktig. For representant analyse nedenfor, ble terskelen satt til "42". - ImageJ vil produsere et stort bord som inneholder alle bildepunkter i den terskelen optimale området, og de mener, median, minimum og maksimum (grense) intensitet verdi for området innenfor grensen intensitet. Lagre dette som en CSV- eller XLS.
- Endring i intensiteten over tid kan bli beregnet i en regneark39 ved å manipulere tabellen å utføre beregningen nedenfor eller kan være automatisert bruker en passende programmering språk. Et eksempelskript for analyse skrevet i R 40 leveres med dette manuskriptet.
Merk: For hver HIO,-relativ fluorescens intensitet, kan kvantifiseres som
. Eliminering tid 41 (t1/2) i FITC-dekstran i HIO lumen ble beregnet som følger:- Først beregne "området under kurven" (AUC) fra kurven beskriver relative fluorescens intensiteten over tid (t) som:
- Deretter beregne "clearance" (
) rate med volumet av distribusjon (Vd) definert som 1 for den normaliserte fluorescensen på t = 0:
- Deretter definerer "eliminering rate konstant" (
) som:
- Og til slutt, beregne "eliminering tid" (t1/2) som:
Redusert ligningen er derfor:
- Først beregne "området under kurven" (AUC) fra kurven beskriver relative fluorescens intensiteten over tid (t) som:
. Eliminering tid 41 (t1/2) i FITC-dekstran i HIO lumen ble beregnet som følger:
) rate med volumet av distribusjon (Vd) definert som 1 for den normaliserte fluorescensen på t = 0:
) som:
Representative Results
HIOs var differensiert fra menneskelige pluripotent stamceller og kultivert i cellen matrix løsning som tidligere beskrevet19,24. Etter 4 uker i kultur, hadde HIOs utvidet tilstrekkelig for å tillate microinjection. HIOs var microinjected med 4 kDa FITC-konjugerte dekstran suspendert i PBS eller PBS med Clostridium difficile gift TcdA. C. difficile er en opportunistisk gastrointestinal patogen som viser gift-mediert epithelial toksisitet i HIOs25. Som en positiv, ble EGTA lagt til HIO kultur media i et delsett av HIOs injisert med PBS og FITC-dekstran. EGTA er en kalsium chelator som fører til rask de polymerisering av utgangen cytoskjelett42. FITC fluorescens var overvåking i sanntid på live bildebehandling mikroskop i et kontrollert miljø kammer og bilder ble tatt i 10 minutters intervaller.
Post-hoc analyse av tenkelig data avslørte betydelige forskjeller i oppbevaring av FITC fluorescens (figur 5). HIOs injisert med PBS beholdt nesten alle fluorescerende signalet tilstede ved t = 0, men HIOs som også ble injisert med TcdA av behandlet med EGTA utstilt en betydelig reduksjon i fluorescerende intensiteten av 8 timer etter microinjection (figur 5a). bildebehandling data kvantifisert for alle HIOs på alle tidspunkt å generere høy oppløsning dataset som representerer den relative endringen i fluorescerende intensitet over tid i hver eksperimentelle tilstand (figur 5B). Forskjeller i epithelial permeabilitet ble vurdert ved beregning av gjennomsnittlig eliminering-tid (t1/2 ) av FITC for hver behandling (tabell 1) og sammenligne forskjeller i t t1/2 mellom grupper ved hjelp av Student t-test. Kontroll-behandlet HIOs beholdt fleste FITC fluorescerende signalet for mer enn 16 timer (t1/2 = 17 ± 0,3 h). Behandling med EGTA betydelig redusert FITC-dekstran eliminering tid i forhold til kontrollen HIOs (t1/2 = 2.6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10-8). I samsvar med tidligere publiserte resultatene25, microinjection av TcdA betydelig økt epithelial barriere permeabilitet i forhold til kontrollen behandling (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5.4 x 10-4). Dermed er både eksterne (EGTA) og microinjected (TcdA)-forbindelser i stand til å indusere betydelige endringer i epithelial barriere permeabilitet i HIOs. Disse resultatene tyder på at effekten av en rekke pharmacologic agenter, metabolitter, bakteriell produkter, cytokiner, vekstfaktorer og andre forbindelser på epithelial barriere funksjonen kan evalueres ved hjelp av denne tilnærmingen.
| Behandling | Half-Life (h) | SEM (h) | Lavere 95% CI (h) | Øvre 95% CI (h) | n |
| Kontroll | 17.11 | 0,3 | 16.45 | 17.78 | 11 |
| EGTA | 2,58 | 0,19 | 1,78 | 3.38 | 3 |
| TcdA | 7.56 | 0,63 | 5.93 | 9.18 | 6 |
Tabell 1: betyr eliminering tid (t1/2) for FITC-dekstran i HIOs behandlet med EGTA eller TcdA. Enhetene er timer etter microinjection.
Figur 1: utforming av microinjector og micromanipulator for HIO microinjection. Dette bildet viser den komplette komplettere av utstyr som brukes til å utføre microinjection av HIOs. Nøkkelkomponenter merket og bestillingsinformasjon finnes i tabellen materialer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: brønnene avtrekker. Kobber oppvarming coil hc, topp klemme c1bunnen klemme (c2), avtrekker arm (pa), varme utvalg veksle (ht) identifiseres av pilene. Riktig innstilling for 1 HEAT og trekk vises i rød tekst. Rammemargen viser en riktig montert glass filament klar for oppvarming. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant bilder av en vev-avledet HIO injisert med FITC-dekstran. (A) bildet viser plasseringen av glass microcapillary like før innsetting i HIO og microinjection. (B) Brightfield bildet av en vev-avledet menneskelige intestinal organoids etter microinjection av FITC-dekstran. Merk at fluorescens signalet er tilsynelatende selv uten bruk av et spesifikt filter-sett. Denne farge hjelpemidler microinjection presisjon. 3 X forstørrelse Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Live bildebehandling. (A) skjermbilde illustrerer nødvendig for å angi parametere for mikroskop, finne HIOs på lysbildet og lagre posisjonen til scenen for hver HIO til å avbildes. (B) før imaging innstillinger for å fange FITC kanalen med jevne mellomrom på hver av posisjonene angitt i A. (C) etter imaging eksport av DV formatere data filer som TIFF-bilder med et TIFF-bilde per HIO per punkt.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representant resultater. (A) Stamcelle-avledet menneskelige intestinal organoids (HIO) microinjected med 2 mg/mL FITC-dekstran (4 kDa) avbildet i 20 timer. HIOs var også microinjected med PBS (kontroll) eller Clostridium difficile giften TcdA (12,8 ng/µL) eller behandlet med 2 mM EGTA lagt til eksterne kultur media. 4 X forstørrelse. (B) tomt betyr normaliserte FITC intensitet over tid i HIOs behandlet med PBS (kontroll), TcdA eller EGTA. Feilfelt representerer S.E.M. og n = 11 HIOs (kontroll), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Denne protokollen etablerer en generell metode for microinjection av hPSC-avledet HIOs og vev-avledet intestinal organoids og måling av epitelial barriere permeabilitet i sanntid. Vi har også vist vår tilnærming til analyse og tolkning av dataene som genereres ved hjelp av disse metodene. Gitt den økende bruk av intestinal organoids modellsystemer16,20,21,28 og langvarig interesse i intestinal barriere permeabilitet som en fysiologisk relevante funksjonelle utfallet3,4,5,6, forventer vi at andre arbeider på dette feltet vil kunne bruke og bygge på disse metodene.
Det er flere trinn som er avgjørende for anvendelsen av denne teknikken. Tilgang til høykvalitets hPSC- eller vev avledede HIO vev bør opprettes før omfattende eksperimentering med microinjection. HIO macrostructure kan være heterogene, med variasjon i både størrelse og form, men vev identitet og mobilnettet morfologi er svært reproduserbar når utnytte etablerte metodikk for å generere HIOs24. Sfærisk HIOs består av en enkelt semi-transparent lumen og måler ca 1 mm i diameter er ideelle for microinjection og måling av luminal fluorescens i sanntid. I noen tilfeller mislykkes microinjection, som resulterer i sammenbruddet av HIO eller åpenbare lekkasje injisert materiale. Mislykkede HIOs kan fjernes fra kulturen i brukerens skjønn bruker standard brønnene. Vurder målet linsene tilgjengelig på en tenkelig plattform når HIOs for microinjection og bildebehandling. Generelt, 2-4 X målet linser er ideelt for å fange fullstendig HIO fluorescerende signalet, selv om en 10 X-målet kan brukes hvis strømsparingsmodus linser ikke er tilgjengelig eller hvis de tilgjengelig HIOs < 1 mm i diameter. Bildebehandlingsprogrammer må tillate automatiserte Chu fluorescerende bilder på definerte poeng over tid.
Flere endringer i denne protokollen er mulig for å dekke kravene eksperimentelle. For eksempel resultatene av barriere funksjon tester kan være avhengig av molekylære størrelsen av forbindelser i bruk43 og det kan være hensiktsmessig å teste dekstran forberedelser av varierende molekylvekt. I tillegg kan brightfield imaging utføres i tillegg til fluorescens imaging som en indikator på den generelle strukturelle integriteten av vev25. Når du utfører microinjection av levende bakterier25,28,31,32,33,44, det kan være nødvendig å legge penicillin og Streptomycin eller gentamicin til HIO kultur media før eller etter microinjection. Utsiden av microcapillary vil bli forurenset under fylling med bakteriell kultur suspensjon og dette kan overføres til HIO media. Alternativt kan microinjection utføres på HIOs suspendert i ekstracellulær matrix (f.eks Matrigel) uten media, legge til media etter at microinjection er fullført. Dette kan begrense forurensning ekstracellulær matrix og eksterne ansiktet til HIO. Når du planlegger mikrobiell vekst analyser, kan det være nødvendig å fjerne antibiotika i media etter 1-2 h å unngå bremse eller hindrer vekst av microinjected organismer.
Endelig er erkjenner at ikke alle forskere vil ha tilgang til mikroskopi utstyr egnet i vitro bildebehandling, det viktig å påpeke at prosedyrene som står på denne protokollen for innsamling av fluorescens data kan brukes på bilder tatt på fast timepoints med standard epifluorescent mikroskopi uten automatiserte image fange eller miljøkontroller. Eksempler på dette finnes i rapportene av Leslie og Huang et al. 25, som undersøkte C. difficile gift aktivitet i hPSC-avledet intestinal organoids og Karve og Pradan et al. 44, som undersøkte epithelial barriere permeabilitet i lignende hPSC-avledet intestinal organoids microinjected med live E. coli. Manuelle betjening av tenkelig utstyr kan medføre større variasjon og vanskeligheter med å normalisere fluorescerende signalet. Når utføre manuell avbildning av FITC-dekstran injisert HIOs er det viktig å opprettholde fast forstørrelse, fluorescerende eksitasjon intensitet og eksponeringstider gjennom å unngå å fordreie fluorescerende intensitet målinger.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Dr. Stephanie Spohn og Basel Abuaita for mange nyttig diskusjoner om organoid microinjection. JRS støttes av Intestinal stamcelleforskningen Consortium (U01DK103141), en felles forskningsprosjekt finansiert av National Institute for Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer (NIDDK) og National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIAID). JRS og VBY støttes av NIAID romanen, alternativ modellsystemer for Enteric sykdommer (NAMSED) consortium (U19AI116482). DRH støttes mekanismer av mikrobielle patogenesen trening stipend fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIAID, T32AI007528) og kliniske og translasjonsforskning Science award til Michigan Institute for klinisk og helse Forskning (UL1TR000433).
Komplett datafilene og data analyse som brukes i dette manuskriptet er tilgjengelig på https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) | Bioworld | 405200081 | |
| Cell matrix solution (Matrigel) | Corning | 354230 | |
| Deltavision RT live cell imaging system | GE Life Sciences | 29065728 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/ |
| Camera | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
| softWoRx Imaging software | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
| Biosafety cabinet | Labconco | Cell Logic+ | http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262 |
| 1X PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Advanced DMEM-F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| B27 supplement (50X) | Life Technologies | 17504044 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| L-glutamine (100X) | Life Technologies | 25030-081 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| HEPES buffer | Life Technologies | 15630080 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Manipulator | Narshge | UM-3C | |
| Micromanipulator | Narshge | UM-1PF | |
| Pipette Holder | Narshge | UP-1 | Alternate to Xenoworks pipette holder |
| Magnetic stand | Narshge | GJ-1 | |
| Dissecting scope | Olympus | SX61 | Recommended scope, although other models are likely compatible |
| Olympus IX71 Fluorescent microscope | Olympus | IX71 | Included with Deltavision system |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | 29065728 | Included with Deltavision system |
| Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein | R&D Systems | 8619-GT-020 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| R-spondin 1 | R&D Systems | 4645-RS | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| FITC-dextran (4 kDa) | Sigma-Aldrich | 46944 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | 154526PK | |
| Glass filaments | WPI | TW100F-4 | |
| Micropipette holder | Xenoworks | BR-MH2 | Preferred device |
| Analog Tubing kit | Xenoworks | BR-AT | |
| 1/16 in clear ferrule | Xenoworks | V001104 | |
| 1-1.2 mm O-ring | Xenoworks | V300450 |
References
- Standring, S., Borley, N. Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).
- Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest. 84, 282-291 (2004).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target? Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).
- Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat. Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).
- Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. Intestinal permeability tests in coeliac disease. Clin Lab. 47, 143-150 (2001).
- Salles Teixeira, T. F., et al. Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls. Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).
- Donato, R. P., et al. Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells. Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).
- Balimane, P. V., Chong, S. Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique. Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).
- Vidyasagar, S., MacGregor, G. Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability. Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).
- Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).
- Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids. Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- Aurora, M., Spence, J. R. HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue. Dev Biol. 420, 230-238 (2016).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).
- McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
- Leslie, J. L., Young, V. B. A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions. Anaerobe. 37, 25-28 (2016).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).
- Hill, D. R., Spence, J. R. Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Engevik, M. A., et al. Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).
- Forbester, J. L., et al. Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells. Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).
- Engevik, M. A., et al. Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).
- Bancroft, J., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. , Churchill Livingstone. (2008).
- Kennedy, S., Oswald, N. PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
- Kurien, B., Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Winston, W. Microsoft excel data analysis and business modeling. , Pearson Education. (2016).
- R Core Team. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2017).
- Rosenbaum, S. Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , Wiley. (2016).
- Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).
- Vojdani, A. For the assessment of intestinal permeability, size matters. Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).
- Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli. PLoS One. 12, e0178966 (2017).
