Summary
このプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いたヒトの腸オルガノイドのリアルタイム次の薬理学的治療における上皮バリア透過性の測定について説明し、細胞顕微鏡検査をライブします。
Abstract
腸粘膜の高度な体外モデル腸組織生検により得られたまたは、分化多能性幹細胞から生成される 3 D の文化の進歩をもたらしました。これらの新興国のモデル システムを活用ツールと 2次元培養系や動物のための技術の適応が必要になります。ここでは、リアルタイムで人間の腸 organoids 上皮関門の透過性を測定するための手法について述べる。これは、蛍光標識デキストランと epifluorescent フィルター装備倒立顕微鏡のイメージングのインジェクションで。腸オルガノイドの関門の透過性のリアルタイム計測を容易に人間の腸上皮組織の高分解能時系列データの生成この手法は固定 timepoint アプローチをイメージングにも適用できます。このプロトコルは生きている微生物や毒素、細菌の製品薬理学的薬剤への露出に続く上皮関門の透過性の測定のため容易に適応可能であります。マイナーな変更でこのプロトコルは腸オルガノイドのマイクロインジェクションの一般的な入門としても利用できます、ユーザー可能性があります次のマイクロインジェクション追加または代替のダウン ストリーム アプリケーションでこのプロトコルを補完するを選択します。
Introduction
腸上皮は内腔間の他の粒子の非特異的な拡散を介した exchange を最小限に抑えながら栄養素、H2O、イオン、および廃棄物の方向の輸送を仲介する選択的なバリアを形成し、間葉系組織または血液供給1,2。腸管の上皮バリアの非特異的な透磁率は長く健康と病気3,4,5,6の割合を反映する重要な機能パラメーターを考慮されました。傍細胞スペースを介して上皮小分子の拡散。上皮関門の透過性の測定を行なえる動物モデル7と消化管とその後のコレクションで特定のトランスポーターの無い、ラクツロースの摂取を介して人間の患者8ラクツロース末梢血中濃度の測定。蛍光に分類された炭水化物などバリア機能の代替摂取マーカー使用可能な9,10しています。このアプローチは、腸管上皮細胞文化 Transwell サポート11より実験的に制御できますが、 in vivoの貧しい予言者として批判されても単純化されたアプローチの栽培に適応されています。透水性上皮分化のサブタイプと組織構造12の不在のため。チャンバーを使用してもう一つのアプローチを表し、腸粘膜ex vivo13上皮バリア機能の測定を可能にします。この技法の応用頻繁、組織の可用性と条件13,14によって制限されます。従って生理学的な関連性と再現性とスループットのバランスを調整する新しい方法が必要です。
器官形成の in vitroにおける最近の動向は、複雑な組織15,16,17 のダイナミクスの概説のため高度なプラットフォームとして 3次元組織培養モデル システムの採用につながっています。 ,18,19,20,21,22,23。特に、ひと多能性幹細胞 (hPSC) に由来ひと腸 organoids (HIOs)19,24が宿主と細菌の相互作用の研究の再現性と実験的に解き得るモデル システムとして浮上していると上皮バリア ダイナミクス25,26,27,28。同様に、ヒト組織由来 organoids (として知られている enteroids) は単純な生検の手順から派生できるし、人間の生理と疾患15,29,30の勉強を扱いやすいシステムとして使用することができます。人間の腸オルガノイドのマイクロインジェクション実験化合物25を配信できますまたは微生物25,31,32,33頂端に上皮をライブorganoid 内腔の表面。レスリーと黄ら25最近 HIOs かに (FITC) デキストラン細菌毒素への暴露を次のラベルの microinjected の関門の透過性を測定するこの手法に適応。
このプロトコルは、hPSC 由来 HIOs と蛍光顕微鏡を用いた組織由来 HIOs 上皮関門の透過性の測定のためのガイドとして使用されます。マイナーな変更と実験的化合物と HIOs のマイクロインジェクションの一般的なプライマーとしても使えます。ユーザーは、マイクロインジェクション後追加または代替のダウン ストリーム アプリケーションでこのプロトコルを補う可能性があります。
Protocol
通常、デ識別人間大人の腸組織は命の贈り物、ミシガン州で死亡したドナーから得られました。ヒト ES 細胞 H9 (NIH レジストリ #0062)-研究所から得られました。この作品で使用されているすべての人体組織は、非生体ドナーから得られた、解除識別され、ミシガン大学 IRB (プロトコル # HUM00093465 と HUM00105750) からの承認を得て実施しました。
(1) マイクロインジェクター セットアップ
- 材料表に掲げる材料を取得します。
- キャビネット、バイオ セーフティにおけるマイクロマニピュレーター、切り裂くスコープ、光源を配置します。70% のエタノールまたは実験的使用する前に他の消毒剤とマイクロインジェクション セットアップをクリーニングします。漂白剤は、マイクロインジェクション装置を腐食する可能性がありますを含む消毒剤への長期暴露を避けます。
注: 完全なマイクロインジェクター アセンブリの例は、図 1に示すです。 - 目の部分はバイオ セーフティ キャビネットのためシールドでアクセス ポートを使えるように切り裂くスコープを配置します。
- また、バイオ セーフティ キャビネット顕微鏡アクセス ポイントの代わりに肯定的な気流方式のクリーン ベンチを使用します。
- 製造元の指示に従って顕微鏡の右側にあるマニピュレーターを組み立てるし、コントロールを簡単に到達し、調整することができますを調整します。マニピュレーターを鉄プレートにマウントするか、そうでなければ安定します。
注: 左利きのユーザー可能性があります切り裂くスコープの左側にマニピュレーターを配置するとしています。 - マニピュレーター アームにマイクロ ピペット ホルダーをマウント、ピペット ホルダーに挿入してアナログのチューブを接続します。
- 滅菌の鉱物油の約 5-7 mL と 10 mL のガラス製注射器を入力します。
- 満ちているルアーのロック メカニズムを使用してアナログの管の開放端に鉱物油 10 mL のガラス製の注射器を接続します。マニピュレーターから切り裂くスコープの左に向かいのガラス製注射器を配置します。
- 優しく注射器、チューブ内の鉱物油を押すを押します。ピペット ホルダーの先端から鉱物油の約 10 滴をフラッシュ シャーレまたは類似の容器で収集および破棄します。
注: この手順はチューブからすべての空気を削除し、各マイクロインジェクション セッションの前に実行する必要があります。
2. マイクロインジェクションの準備
- マイクロインジェクションの前に 24 h:
- FITC デキストラン ソリューションを準備するには、再滅菌 PBS または生理食塩水で 2 mg/mL の濃度で FITC デキストランを中断します。総量を準備 > 250 μ L。
注: FITC デキストランの上位または下位の濃度が使用されます約至る 0.1 - 10 mg/mL。FITC-デキストラン下流イメージング アプリケーションに合わせて濃度を調整します。 - 4 または 8 よくチャンバー スライド ガラスまたは他の培養器に適したセットアップにおける文化は生きることと顕微鏡、まあ、50 μ L のセル ・ マトリックス ・ ソリューションに埋め込まれ、EGF、酒を飲むこと、R Spondin (ENR) 成長因子メディアの19 培養あたり 4-6 HIOs、24。リアルタイム イメージング分析中に顕微鏡単一のフィールドに複数の HIOs をキャプチャを避けるために均等に (約 5 mm 離れて)、オルガノイドのスペースに注意してください。HIO 文化、保守のための完全なガイドは、McCrakenらを参照してください。24。
注: このプロトコル幹細胞由来 HIOs を使用して開発された、代表的な結果 (下記参照) は、この組織培養モデルの使用方法を示します。ただし、同じプロトコル組織由来腸管上皮 organoids15,29に適応します。組織由来 HIOs、PSC 派生 HIOs と欠如サポート間葉系基底細胞構造15,29,30より通常小さくなります。HIOs の組織由来の可能性が高い技術力を必要として経験します。HPSC 派生 HIOs と関係して上皮バリア透過性データ組織由来 HIOs を使用して取得する程度が知られています。 - HIOs をマイクロインジェクション前に CO2を 42 ° C、5% で標準細胞文化のインキュベーターで孵化させなさい。
- FITC デキストラン ソリューションを準備するには、再滅菌 PBS または生理食塩水で 2 mg/mL の濃度で FITC デキストランを中断します。総量を準備 > 250 μ L。
- 30 分前にマイクロインジェクション、オン、バイオ セーフティ キャビネットと最適な作業高さにガラスの盾を上げます。
- バイオ セーフティ キャビネットからすべての不要な項目を削除します。クラッタ限られたスペースでの作業時の流出その他の事故のリスクが高まります。
- スプレーし、70% のエタノールまたは他の消毒剤と作業面を徹底的に掃除します。紙タオルを使用してきれいに拭きます。
- ガラスシリンジに接続されているガラス製注射器の鉱物油のレベルを確認します。残っている鉱物油の 3 mL よりも少ない場合、注射器を外し、バイオ セーフティ キャビネット、気泡を導入することに注意しながら中を補充します。7 mL 以上は記入しないでください。
- 解離の範囲を照らすランプを点灯します。個人的な快適さのための接眼レンズを調整します。
- 解離の範囲の右側にマイクロマニピュレーターを配置します。磁気スタンドを使用して鉄板をマイクロマニピュレーターを保護します。マニピュレーターの位置を調整し、マグネット スタンドを on に設定すると、鉄の板をスタンドに固定 OFF の位置にマグネット スタンドを切り替えます。
- マイクロキャピ ラリー インストール
- 製造元によって提供されるストレージ コンテナーから単一 1 mm ガラス フィラメントを取得します。
- マイクロ ピペットの引き手の銅加熱コイルの中心を通るガラス フィラメントを挿入します。
注: は、ピペットの引き手を準備するためのガイドの図 2を参照してください。 - 銅加熱コイルは約ガラス フィラメント フィラメントを位置します。引き手が各ガラス フィラメントからの 2 つの使用可能なマイクロインジェクション針を生成するようになります。
- 上部を締めてクランプ クランプ最初、ガラス フィラメントが破損を防ぐための切欠きを有するグローブ内でセキュリティ保護されることを確かめて使用してガラス フィラメント安全します。
- 下部クランプを締める前に最大垂直位置に引く腕が伸びる。
注意: この手順は重要です。引き手腕を伸展障害は、ガラス繊維の 2 つのセクションの不規則な分離になります。 - メカニズムを引っ張って、冷暖房の設定を確認します。
メモ: 銅のコイルは、数分間非常に熱いままが。この時点でプロトコルの 'マイクロキャピ ラリー' として引っ張られたガラス フィラメントを参照します。
注: ガラス マイクロキャピ ラリーは非常に鋭いと非常に壊れやすいです。取り扱いに注意。
注: インジェクション システムに、マイクロキャピ ラリーをインストールするときはシャープの端に触れるように世話します。汚染のチャンスを減らす、マイクロインジェクションの細かい点を保持します。正しく、マイクロキャピ ラリーを確保するため失敗はマイクロインジェクション中に不安定またはガラス繊維の破損につながります。
- この表面に触れることがなく切り裂くスコープのガラス ステージで、マイクロキャピ ラリーは下向きにマニピュレーターを移動します。
- 滅菌プラスチック表面を見つける (文化板蓋の下側は完全に動作します) と解離の範囲のステージでマイクロキャピ ラリー針の下に直接顕微鏡ステージ上に置きます。
- 表示領域の下でマイクロキャピ ラリーの先端を中心し、下 1.5 倍の倍率の顕微鏡の接眼レンズを通して見るとき、それが表示されていることを確認します。
- マニピュレーター アームを進めるマイクロマニピュレーター コントロールを使用してゆっくりと先端はほとんどプラスチックの表面と、マイクロキャピ ラリーの先端を接触するまで滅菌プラスチック文化蓋に向かってマイクロキャピ ラリー休憩無料。
注: は、マイクロインジェクション中、HIO への被害を最小限にするためにガラス繊維からの流体の流れは、最小の可能な休憩を目指してください。 - 続行する前に誤って破損の可能性を最小限に抑えるため滅菌表面かマイクロキャピ ラリーをバックアップします。
- ガラス製注射器、チューブ内の鉱物油を押すを押すことによって流れのマイクロキャピ ラリーを確認してください。マイクロキャピ ラリーの最後が開かれている場合は、数秒後、マイクロキャピ ラリーの先端から出てくる鉱物油の小さな滴が表示されます。これが発生しない場合は、前の手順と再テストを繰り返します。
3. 滅菌マイクロインジェクション
注: 一度、マイクロキャピ ラリーは、準備、インストール、およびテストされている、マイクロインジェクション HIOs を開始します。図 3は、組織由来 HIO が正常に挿入されたかを FITC デキストランとを示しています。
- 注入材料で、マイクロキャピ ラリーを埋めます。側面または管の底に対してマイクロキャピ ラリーの先端を破損しないように注意しながら、FITC デキストラン注入停止ガラス マイクロキャピ ラリーの先端を沈めます。ソリューションに、マイクロキャピ ラリーの先端を浸漬すると、一度、マイクロキャピ ラリーに FITC デキストラン懸濁液の約 10 μ L を描画する鉱物油注射器を引いてください。
注: これらがインストールされているマイクロキャピ ラリーに最も簡単にアクセスされるので、注入ソリューション/文化に 1.5 mL または 0.5 mL チューブを使用することをお勧めします。また、滅菌シャーレや滅菌のパラフィルムでチューブを保持する必要がありますを制限することによってシャープに傷害のチャンスを減らすことからソリューションを描画できる注入は、マイクロキャピ ラリーに近接します。懸濁液は非常に粘性、マイクロキャピ ラリーの開口部が非常に小さい場合、マイクロキャピ ラリーに合わせて 2 番目がかかる可能性がある場合。これは全体のインジェクション システムを汚染する可能性があります、マイクロインジェクションのプラスチック チューブにマイクロインジェクション懸濁液を描画しません。 - マイクロインジェクション サスペンションがガラス マイクロキャピ ラリーの長さの 90% を満たすとき、マイクロキャピ ラリーを充填を停止します。若干、マイクロキャピ ラリーの先端に空気のポケットが含まれていないことを確認するマイクロインジェクション ソリューションから、マイクロキャピ ラリーを撤退する前に注射器を押します。
注: 場合、マイクロキャピ ラリーの試験では、空気のポケットを明らかにする、空に、再入力します。 - ガラスシリンジと細胞培養インキュベーター転送からバイオ セーフティ キャビネットに HIO 文化プレートを削除します。
- 図 2 安全キャビネット内で HIO 培養プレートから蓋を外し、最低倍率のスコープの接眼レンズを通して明確に表示されるように、顕微鏡ステージ上最初の井戸を中心します。
- 角度で HIO 文化に、マイクロキャピ ラリーを挙げられるようにマイクロマニピュレーター腕を回す > 顕微鏡ステージに対して 45 °。細かいコントロール (ブラック ダイヤル) の限られた範囲を持っているので、水平マイクロマニピュレーター アーム サポートが垂直スタンドを満たす時点で水平軸方向のマニピュレーター アーム組立部品を手動で回してこれは、最も簡単にモーション。メディア (図 3 a) の表面の上約 1 cm にも最初の文化上マイクロキャピ ラリーの先端を配置します。図 3Bの組織由来腸管上皮オルガノイドのマイクロインジェクションを示す代表的な画像が表示されます。
- ガラス フィラメントの先端に、HIO(s) が接眼レンズを通して表示されることを確認します。必要に応じてを再配置します。
- Z 軸制御ノブを時計回りに回して、マイクロキャピ ラリーをゆっくりと前進します。
注: マイクロキャピ ラリー チップの位置を判断すると、特に深さ、練習が必要です。先端メディアの表面に違反、マイクロキャピ ラリー チップのわずかな視覚的歪みに気づきます。
注: 過剰バースト organoid しまうので、HIO を充填しないように注意してください。親指のルールとして HIO ボリュームの任意の目に見える拡大しを停止する時間です。成熟した HIO 内腔の平均の容積は約 1 μ L が大幅に異なる場合があります。自動注射器のポンプは、噴射量の細かい制御を許可する手動の注射器の代わりに使用することがあります。
- 上記で説明したアプローチを使用してマイクロキャピ ラリーを補充します。
注: 場合先端は、マイクロインジェクション中の任意の時点で中断、しないで注射を続けます。次の手順に従ってヒントを変更します。
注意: 鋭い端近くマイクロキャピ ラリーを処理しません。マイクロキャピ ラリーの罰金のポイントは非常にシャープで、簡単に手袋や皮膚に穴をあけます。注意し、だけ、決して、マイクロキャピ ラリー ポイントと HIO 文化間手を配置するマニピュレーターを用いたマイクロキャピ ラリーを取り扱い、すべての動きに注意してください。感染性病原体や毒素を含むマイクロキャピ ラリーから針棒が発生した場合すぐに治療を求めます。
注: いくつかのケースでそれがあります成功 HIO マイクロインジェクションを視覚的に確認することは困難。FITC デキストランの高濃度添加による明確なマイクロインジェクション懸濁液の可視性を拡張できます。
4. HIOs 薬物療法
- 根尖部の上皮に配信される化合物をテストするためには、2 mg/mL FITC デキストランを含む滅菌 PBS に再懸濁し、HIO 内腔 (セクション 3) 上記のように microinject。代表的な実験は、FITC デキストランを含む PBS で 12.8 ng/μ L でのクロストリジウム ・ ディフィシル毒素 TcdA を再懸濁します。
- 置き換える外部文化メディア化合物基底外側コンパートメントに配信をテストするには、新しいを含むメディア 2 mM エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)(positive control)、PBS は、単独で車 (ネガティブ コントロール)、または FITC デキストランのマイクロインジェクション後他の実験的化合物。
注: 投与と薬理学的化合物、毒素、または他のエージェントの適用のタイミングは、実験の質問によると異なる場合があります。
5. ライブ Microinjected オルガノイドのイメージング
- ライブ イメージング直後マイクロインジェクションを開始します。自動ライブセル イメージング システムと 5% CO2と 21% O2 37 ° C で維持加湿チャンバを搭載した蛍光顕微鏡に培養皿を転送します。環境制御チャンバーを閉じて、イメージング プロセスを開始します。
- デスクトップから画像解析ソフト (例えば、softWoRx) を起動します。「ファイル」をクリックし、「(解決 3 d) を獲得」イメージング顕微鏡制御ソフトウェアを初期化するを選択します。
- 励起/蛍光を FITC に設定 (475 nm 励起/523 nm 排出), 5% と 4 X レンズに送信電力を設定します。露出時間を 0.025 ms (図 4 a) に設定します。
注: 露光時間は、蛍光シグナルの強さに合わせて変える必要があります。一般的には、FITC の蛍光信号が減少のみ。したがって、最大感度を確保するため記録された蛍光信号をカメラおよびイメージング ソフトウェアの飽和点より下だけに初期露出時間を調整する必要があります。 - デジタル コント ローラーを顕微鏡を使って 4 倍の倍率で、HIOs を見つけます。表示フィールド (図 4 a) 内で HIO を中心します。
- ツールバーの「表示」をクリックし、「ポイント リスト」を選択新しいウィンドウを明らかにします。「ポイントをマーク」をクリックしてポイントの一覧 (図 4 a) のステージの現在の位置を格納します。
- 5.4 と 5.5 の手順を繰り返して、すべて HIOs の位置が記録されています。メモ帳またはデジタル レコードを使用して、各プログラムの顕微鏡の位置とその位置で撮影された画像に割り当てられたユニークな ID 番号をメモしておきます。この ID 番号を持つ、タグ付きのイメージ ファイルとデータの収集が完了した後、特定 HIOs と治療イメージ ID 番号を関連付けることが重要ででしょう。
- 自動画像収集をセットアップするには、ツールバーの「ファイル」をクリックし、"実験"をクリックしてします。名前、日付または別の一意の名前を使用して実験。
- 図 4 bに示すように、各オプションのタブを経由してイメージのコレクションのパラメーターを設定します。
- 国連チェック タブの下「Z 区分"「断面」.
- 「チャンネル」タブの下には、トップ左「解決」3 d ウィンドウからパラメーターを入力します。時間を節約するには、最初の行は、左側のボックスをオンに自動的に表示されます。
- タブの下「コマ撮り」、チェック ボックスをオン「経過時間」、「タイムラプス」と「時間」というラベルの付いた行に実験の合計期間というラベルの付いた行の画像間の時間間隔を入力します。ソフトウェアは、タイム ポイントの数を自動的に計算されます。
- 「ポイント」タブの下の「訪問ポイント リスト」をラベルをオンにします。
- ツールバーのタスク ビルダーのプロセスを選択します。
- タスク ビルダー メニューで 5.9 で指定されたデータ フォルダーに移動してファイルを追加します。プロンプトで"*.dv"を入力して".dv"で終わるすべてのファイルを強調表示します。すべて (Ctl + A) を選択し、「追加」をクリックします。
- +「タスク」というラベルの付いたセクションの下をクリックします。「エクスポート...」を選択し、「オプション」タブをクリックしますします。
- 「TIFF 画像」「エクスポートの形式」、「カスタム出力フォルダー」を追加するには下ボックスを確認します。これは、TIFF イメージのエクスポート先の場所です。「TIFF 出力タイプ」の下で 24 ビット RGB を選択し、、「完了」をクリックします。
- エクスポートのマクロを実行する「キューに送信」をクリックします。
注: HIO 組織やメディアが格納される組織学34, PCR35)、西36、またはその他のダウン ストリーム解析のしみ。
6. 後イメージングによる解析
- ImageJ37がインストールされていることを確認し、分析に使用するコンピューターで正しく動作します。
注: フィジー37は動作する ImageJ コア ・ プログラムの代替配信この分析にも同様します。 - ImageJ メニューから「プロセス」し、"バッチ"と最後に"マクロ"を選択してバッチ分析を開始。
- 実験の経過中に収集された TIFF イメージが含まれるディレクトリへの入力を設定します。"Thesholdmeasure.ijm"ImageJ マクロ ファイルを開くか直接コピー/貼り付けマクロ コード ウィンドウにします。「プロセス」のファイルの処理を開始するをクリックします。
注: 最小しきい値値x (setThreshold(x,255);) が 0 - 任意の数に設定できます 255 と背景の蛍光性を排除するように調整する必要があります。値 < 100 をお勧めします。経験的適切なしきい値を判断、蛍光信号 organoid を表す単一のイメージのイメージングのマクロを実行します。この画像の平均輝度は、しきい値を適切に設定するためのガイドとして使用できます。以下に示す代表的な解析、しきい値は「42」に設定しました。 - ImageJ は閾値強度範囲内のすべてのピクセルの領域を含む大きなテーブルを生産し、平均、中央値、最小と最大 (上限) 強度限界強度値の範囲内の領域に対応する値します。CSV や xls ファイルとして保存します。
- 時間の経過とともに強度の変化は、以下の計算を行うデータ テーブルを操作することでスプレッドシート39に計算できるまたは言語プログラミング自動を使用して適切なすることができます。40 R で書かれたスクリプトの例分析はこの原稿で提供されます。
注: 各 HIO の相対的な蛍光強度が定量化することとして
。除去時間41 (t1/2) デキストラン投与により HIO ルーメンでは、次のとおり算出されました。- まず、「曲線下面積」を計算 (AUC) として時間 (t) をかけて相対蛍光強度を記述する曲線から。
- 「クリアランス」を計算 (
) tで正規化された蛍光性ための 1 として定義されている分布 (Vd) 容積率 = 0。
- 次に、「消失速度定数」を定義 (
) として。
- 最後に、「除去時間」を計算し (t1/2) として。
減らされた式はこうです。
- まず、「曲線下面積」を計算 (AUC) として時間 (t) をかけて相対蛍光強度を記述する曲線から。
。除去時間41 (t1/2) デキストラン投与により HIO ルーメンでは、次のとおり算出されました。
) tで正規化された蛍光性ための 1 として定義されている分布 (Vd) 容積率 = 0。
) として。
Representative Results
HIOs ひと多能性幹細胞から分化した培養細胞マトリックス ソリューションとして以前に説明した19,24.文化の 4 週間後、HIOs はマイクロインジェクションように十分に拡大していた。HIOs は、PBS またはクロストリジウム ・ ディフィシル毒素 TcdA を含む PBS で中断 4 kDa FITC 結合デキストランと microinjected いた。C. ディフィシルは HIOs25で毒素を介する上皮毒性を示す日和見消化管病原体です。肯定的な制御としてグリコールエーテルジアミン四酢酸は、PBS と FITC デキストラン注入 HIOs のサブセットの HIO 文化メディアに追加されました。グリコールエーテルジアミン四酢酸はアクチン細胞骨格42の急速な解消重合を引き起こすカルシウムのキレート剤です。FITC の蛍光は制御環境チャンバ ライブ イメージング顕微鏡上でリアルタイムに監視され、10 分間隔で撮影します。
画像データの非定型分析では、FITC の蛍光 (図 5) の保持の相当な相違を明らかにしました。PBS の注入 HIOs 保持ほぼすべてtでの蛍光信号のグリコールエーテルジアミン四酢酸で処理の TcdA を注入したまた HIOs によって 8 時間後 (図蛍光強度の相当な減少を展示したしかし 0 を =5 a). イメージ投射データの各実験条件 (図 5 b) に時間をかけて蛍光強度の相対的な変化を表す高解像度データセットを生成するすべての時点ですべて HIOs の定量を行った。各治療群 (表 1) の FITC の平均除去時間 (t1/2 ) を計算してt t 1/2グループ間の違いを比較することによって評価した上皮の透過性の違い学生のtを使用して-をテストします。制御処理 HIOs 保持 16 時間以上の FITC の蛍光信号の大半 (t1/2 = 17 ± 0.3 h)。グリコールエーテルジアミン四酢酸による治療が相対 HIOs FITC デキストラン除去時間を大幅に削減 (t1/2 = 2.6 ± 0.2 h;P = 10-8x 1.3)。以前に公開した結果25に一貫した、TcdA の大幅増加コントロール治療を基準にして上皮バリア透過性 (t1/2 = 7.6 ± 0.6 h;P = 10-4x 5.4)。したがって、外部 (グリコールエーテルジアミン四酢酸) と microinjected (TcdA) の化合物は、HIOs 上皮関門の透過性の重要な変化を誘発することができます。このアプローチを使用して上皮バリア機能に及ぼす薬理学的薬剤、代謝物質、細菌の製品、サイトカイン、成長因子および他の化合物の広い範囲を評価することがありますが示唆されました。
| 治療 | 半減期 (h) | SEM (h) | 下限 95年 %ci (h) | 上 95年 %ci (h) | n |
| コントロール | 17.11 | 0.3 | 16.45 | 1,778万 | 11 |
| グリコールエーテルジアミン四酢酸 | 2.58 | 0.19 | 1.78 | 3.38 | 3 |
| TcdA | 7.56 | 0.63 | 5.93 | 9.18 | 6 |
表 1: 除去時間を意味する (t1/2) HIOs の FITC デキストラン グリコールエーテルジアミン四酢酸または TcdA で治療したため。単位は、時間後のインジェクションです。
図 1: マイクロインジェクターと HIO のインジェクション用マイクロマニピュレーターの基本的なレイアウトします。この画像は、HIOs のマイクロインジェクションを実行するために使用される機器の完全な補完を示します。主要なコンポーネントのラベルが付いています、材料表に注文情報を見つけることができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マイクロ ピペット引き手。加熱コイルhc、上側クランプc1、下部クランプ (c2)、銅の引き手の腕 (pa)、熱の選択の切り替え (ht) は、矢印によって識別されます。熱 1 とプルの正しい設定は赤のテキストで表示されます。はめ込みは、暖房の準備が正しくマウントされているガラス フィラメントを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: FITC デキストラン注入組織由来の HIO の代表的なイメージです。(A) イメージは HIO とマイクロインジェクション挿入直前ガラス マイクロキャピ ラリーの位置を示します。(B) FITC デキストランの顕微注入後の組織由来、人間の腸オルガノイドの明視野イメージ。蛍光信号が特定のフィルターのセットの使用がなくても明らかであることに注意してください。この配色機能は、マイクロインジェクション精度を支援します。3 倍の倍率この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 画像処理ワークフローのライブします。(A) スクリーン ショット顕微鏡パラメーターを設定、スライド上の HIOs を見つけるし、イメージを作成する各の HIO のための段階の位置を保存するための手順を示します。それぞれの位置で定期的に FITC チャンネルをキャプチャするため (B) 事前イメージング設定が、DV フォーマット データの A. (C) イメージ作成後輸出時点あたり HIO 1 つの TIFF イメージを持つ TIFF イメージとしてのファイルを指定します。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。
図 5: 代表結果。(A) 幹細胞由来 2 mg/ml の FITC デキストラン microinjected 人間の腸 organoids (HIO) 20 時間 (4 kDa) のイメージを作成します。HIOs いた PBS (コントロール) とクロストリジウム ・ ディフィシル毒素 TcdA microinjected も (12.8 ng/μ L) か、外部の文化メディアに追加されますグリコールエーテルジアミン四酢酸 2 mM。4 倍の倍率。HIOs で時間の経過と共に平均正規化 FITC 強度 (B) プロットは PBS (コントロール)、TcdA、またはグリコールエーテルジアミン四酢酸で処理。誤差範囲を表す S.E.M. とn = 11 HIOs (コントロール)、3 HIOs (グリコールエーテルジアミン四酢酸)、6 HIOs (TcdA)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、リアルタイムで hPSC 派生 HIOs と組織由来腸オルガノイドのマイクロインジェクションと上皮関門の透過性の測定のための一般的な方法を確立します。これらのメソッドを使用して生成されたデータの分析と解釈へのアプローチもわかってきました。腸オルガノイドの成長の採用モデル システムを与えられた16,20,21,28と生理関連として腸管バリア透過性, 機能の長年の興味結果3,4,5,6、我々 はこの分野で働く人は適用し、これらのメソッドに基づいて構築することができることを見込んでいます。
この手法の適用に不可欠ないくつかの手順があります。高品質 hPSC - または派生 HIO 組織はマイクロインジェクションの広範な実験の前にすべき組織にアクセスできます。HIO マクロ組織は、組織アイデンティティおよび細胞形態が再現性の高い、この HIOs24を生成する確立された方法論を活用した異種サイズや形のバリエーションを持つ可能性があります。単一の半透明な内腔から成ると直径約 1 mm の球形 HIOs はマイクロインジェクションとリアルタイムで内腔の蛍光の測定に最適です。いくつかのケースで、HIO の崩壊や注入材の明らかな漏れのインジェクションは失敗します。失敗した HIOs は、標準的なマイクロ ピペットを使用してユーザーの裁量でよく文化から削除できます。マイクロインジェクションとイメージングの HIOs を選択するときは、イメージング プラットフォームで使用可能な対物レンズを検討してください。一般に、2-4 倍の対物レンズは完全な HIO 蛍光信号をキャプチャするために理想的な対物レンズ 10 倍は低消費電力のレンズが利用できない場合、または使用可能な HIOs が使用できますが < に直径 1 mm。イメージング ソフトウェア定義されたポイントで蛍光画像の自動キャプチャ時間をかけて考慮しなければなりません。
このプロトコルのいくつかの変更は、実験の条件に適するために可能です。障壁関数テストの結果が使用43化合物の分子の大きさに依存して可能性がありますなど、さまざまな分子量デキストラン製剤をテストする適切なことがあります。また、組織25の全体的構造健全性の指標としての蛍光イメージングに加え明視野イメージングを実行可能性があります。生きたバクテリア25,28,31,32,33,44のマイクロインジェクションを実行すると、ペニシリンを追加する必要があり、ストレプトマイシンまたは前または後マイクロインジェクション HIO 文化メディアにゲンタマイシン。細菌培養懸濁液充填時、マイクロキャピ ラリーの外側が汚染になるし、これは HIO メディアに転送することがあります。また、マイクロインジェクションは HIOs 媒体なしで、細胞外基質 (例えば、マトリゲル) で中断、マイクロインジェクションが完了した後にメディアを追加することで実行できます。これは、細胞外マトリックスと、HIO の外部面への汚染を制限があります。微生物の増殖の試金を計画するときは、減速または microinjected の生物の成長を防止するを避けるために 1-2 時間後メディアで抗生物質を削除する必要があります。
最後に、撮影した画像をこのプロトコル蛍光データを収集するために記載されている手順を適用できることを指摘することが重要ですすべての研究者が体外イメージングに適した顕微鏡機器へアクセスできることを認識し、で自動化された画像のキャプチャや環境制御なし標準 epifluorescent 顕微鏡を用いた固定の縦長。このアプローチの例がレスリーと黄らレポート25、腸オルガノイドの hPSC から派生したと Karve と Pradanら c. ディフィシル毒素活性を調べた44、ライブ大腸菌と microinjected と同様 hPSC 由来腸 organoids 上皮関門の透過性を調べた。大きい変化と蛍光信号の正規化の難しさの画像装置の手動操作があります。HIOs を注入するデキストラン投与により手動イメージングを実行する固定倍率、蛍光励起強度および蛍光強度測定の歪みを防ぐため実験全体の露光時間を維持するために不可欠です。
Disclosures
著者を開示するない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係があります。
Acknowledgments
著者は、organoid マイクロインジェクションの多くの有益な議論の夫妻ステファニー スポーンとバーゼルの Abuaita を感謝したいです。JRS は、腸管幹細胞コンソーシアム (U01DK103141)、国立研究所糖尿病・消化器・腎臓病 (NIDDK) と国立研究所のアレルギー ・感染症 (NIAID) によって資金を供給する共同研究プロジェクトによってサポートされます。JRS と VBY NIAID の小説、腸疾患 (NAMSED) コンソーシアム (U19AI116482) のための代替モデル システムによってサポートされます。DRH のサポート臨床および健康のためミシガン研究所国立研究所のアレルギーおよび感染症 (NIAID, T32AI007528) と臨床トランスレーショナル科学賞から微生物病因メカニズムの訓練グラント研究 (UL1TR000433)。
Https://github.com/hilldr/HIO_microinjection では、完全なデータ ファイルやこの原稿で使用されるデータ解析コードを楽しめます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) | Bioworld | 405200081 | |
| Cell matrix solution (Matrigel) | Corning | 354230 | |
| Deltavision RT live cell imaging system | GE Life Sciences | 29065728 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/ |
| Camera | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
| softWoRx Imaging software | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
| Biosafety cabinet | Labconco | Cell Logic+ | http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262 |
| 1X PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Advanced DMEM-F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| B27 supplement (50X) | Life Technologies | 17504044 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| L-glutamine (100X) | Life Technologies | 25030-081 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| HEPES buffer | Life Technologies | 15630080 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Manipulator | Narshge | UM-3C | |
| Micromanipulator | Narshge | UM-1PF | |
| Pipette Holder | Narshge | UP-1 | Alternate to Xenoworks pipette holder |
| Magnetic stand | Narshge | GJ-1 | |
| Dissecting scope | Olympus | SX61 | Recommended scope, although other models are likely compatible |
| Olympus IX71 Fluorescent microscope | Olympus | IX71 | Included with Deltavision system |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | 29065728 | Included with Deltavision system |
| Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein | R&D Systems | 8619-GT-020 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| R-spondin 1 | R&D Systems | 4645-RS | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| FITC-dextran (4 kDa) | Sigma-Aldrich | 46944 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | 154526PK | |
| Glass filaments | WPI | TW100F-4 | |
| Micropipette holder | Xenoworks | BR-MH2 | Preferred device |
| Analog Tubing kit | Xenoworks | BR-AT | |
| 1/16 in clear ferrule | Xenoworks | V001104 | |
| 1-1.2 mm O-ring | Xenoworks | V300450 |
References
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