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Developmental Biology

मानव आंत्र Organoids में उपकला बाधा पारगम्यता के वास्तविक समय माप

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56960
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Infectious Disease, University of Michigan

Summary

इस प्रोटोकॉल मानव आंत्र organoids में औषधीय उपचार के बाद फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और लाइव सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर वास्तविक समय में उपकला बाधा पारगम्यता की माप का वर्णन करता है.

Abstract

बायोप्सी के माध्यम से प्राप्त या pluripotent स्टेम सेल द्वारा निर्देशित विभेद के माध्यम से उत्पन्न आंतों के ऊतकों की 3 डी संस्कृति में अग्रिम, आंत्र म्यूकोसा के इन विट्रो मॉडल में परिष्कृत में हुई है । इन उभरते मॉडल प्रणालियों का लाभ उपकरण और 2 डी संस्कृति प्रणालियों और जानवरों के लिए विकसित तकनीकों के अनुकूलन की आवश्यकता होगी । यहाँ, हम वास्तविक समय में मानव आंत्र organoids में उपकला बाधा पारगम्यता को मापने के लिए एक तकनीक का वर्णन. यह epifluorescent फिल्टर के साथ लगे एक औंधा माइक्रोस्कोप पर फ्लोरोसेंट-लेबल dextran और इमेजिंग के microinjection द्वारा पूरा किया जाता है । आंत्र organoids में बाधा पारगम्यता के वास्तविक समय मापन मानव आंत्र उपकला ऊतक में उच्च संकल्प लौकिक डेटा की पीढ़ी की सुविधा, हालांकि इस तकनीक को भी तय timepoint इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए लागू किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल को औषधीय एजेंटों, बैक्टीरियल उत्पादों या विषाक्त पदार्थों, या जीवित सूक्ष्मजीवों के लिए जोखिम के बाद उपकला बाधा पारगम्यता की माप के लिए आसानी से अनुकूलनीय है. मामूली संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल भी आंतों organoids के microinjection पर एक सामान्य प्राइमर के रूप में सेवा कर सकते हैं और उपयोगकर्ताओं को microinjection निम्नलिखित अतिरिक्त या वैकल्पिक बहाव अनुप्रयोगों के साथ इस प्रोटोकॉल के पूरक करने के लिए चुन सकते हैं.

Introduction

आंतों उपकला एक चयनात्मक बाधा है कि पोषक तत्वों के दिशात्मक परिवहन, एच2ओ, आयनों, और अपशिष्ट उत्पादों जबकि गैर विशिष्ट प्रसार-लुमेन और के बीच अन्य कणों की मध्यस्थता विनिमय को कम करने के लिए फार्म mesenchymal ऊतक या रक्त की आपूर्ति1,2. आंत्र उपकला बाधा के विशिष्ट पारगम्यता लंबे समय दोनों स्वास्थ्य और रोग में एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक पैरामीटर माना गया है3,4,5,6, की दर को दर्शाता है कि paracellular अंतरिक्ष के माध्यम से उपकला भर में छोटे अणुओं के प्रसार. उपकला बाधा पारगम्यता का मापन पशु मॉडल7 में और मानव रोगियों में8 lactulose की घूस, जो जठरांत्र संबंधी मार्ग में कोई विशेष ट्रांसपोर्टर है के माध्यम से आयोजित किया जा सकता है, और बाद में संग्रह और परिधीय रक्त में lactulose सांद्रता का मापन. इस तरह के फ्लोरोसेंट लेबल कार्बोहाइड्रेट के रूप में बाधा समारोह के वैकल्पिक घूस मार्करों भी उपलब्ध है9,10। इस दृष्टिकोण आंत्र उपकला कोशिका Transwell पर उगाया संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया गया है11का समर्थन करता है, एक सरलीकृत दृष्टिकोण है कि अधिक से अधिक प्रयोगात्मक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी vivo में एक गरीब कारक के रूप में आलोचना की गई है विभेदक उपकला उपप्रकार और ऊतक संरचना के अभाव के कारण पारगम्यता12. कक्षों का उपयोग अभी तक एक और दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं और पूरे आंत्र म्यूकोसा में उपकला बाधा समारोह की माप के लिए अनुमति पूर्व vivo13. इस तकनीक के आवेदन अक्सर ऊतक उपलब्धता और हालत13,14द्वारा सीमित है । इस प्रकार नए तरीकों जो संतुलन reproducibility और शारीरिक प्रासंगिकता के साथ प्रवाह आवश्यक हैं ।

इन विट्रो organogenesis में हाल की घटनाओं में 3 डी ऊतक संस्कृति के गोद लेने के लिए नेतृत्व किया है recapitulating जटिल ऊतकों की गतिशीलता के लिए एक परिष्कृत मंच के रूप में मॉडल सिस्टम15,16,17 ,18,19,20,21,22,23। विशेष रूप से, मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) व्युत्पन्न मानव आंत्र organoids (HIOs)19,24 मेजबान के अध्ययन के लिए एक प्रतिलिपि और प्रयोग करने योग्य मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है माइक्रोबियल बातचीत और उपकला बैरियर गतिशीलता25,26,27,28. इसी प्रकार, मानव ऊतक-व्युत्पंन organoids (enteroids के रूप में भी जाना जाता है) एक सरल बायोप्सी प्रक्रिया से व्युत्पंन किया जा सकता है और मानव शरीर क्रिया विज्ञान और रोग15,29,30का अध्ययन करने के लिए एक तंत्र के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । Microinjection मानव आंत्र organoids प्रायोगिक यौगिकों के वितरण के लिए अनुमति देता है25 या जीवित रोगाणुओं25,31,३२,३३ शिखर उपकला के लिए organoid लुमेन की सतह । Leslie और हुआंग एट अल. 25 हाल ही में इस तकनीक को अनुकूलित करने के लिए fluorescein isothiocyanate (FITC) के साथ HIOs microinjected में बाधा पारगम्यता को मापने जीवाणु विषाक्त पदार्थों को dextran के बाद प्रदर्शन लेबल ।

इस प्रोटोकॉल hPSC में उपकला बाधा पारगम्यता की माप के लिए एक गाइड के रूप में करना है-व्युत्पन्न HIOs और ऊतक-फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर HIOs व्युत्पंन. मामूली संशोधनों के साथ, यह भी प्रयोगात्मक यौगिकों के साथ HIOs के microinjection पर एक सामान्य प्राइमर के रूप में सेवा कर सकते हैं. उपयोगकर्ताओं को microinjection के बाद अतिरिक्त या वैकल्पिक बहाव अनुप्रयोगों के साथ इस प्रोटोकॉल के पूरक हो सकता है ।

Protocol

सामांय, de-पहचान मानव वयस्क आंत्र ऊतक मृतक अंग दाताओं से जीवन, मिशिगन के उपहार के माध्यम से प्राप्त किया गया था । ह्यूमन ईएस सेल लाइन H9 (NIH रजिस्ट्री #0062) WiCell रिसर्च इंस्टिट्यूट से प्राप्त हुई । इस काम में प्रयुक्त सभी मानव ऊतक गैर रहने वाले दानदाताओं से प्राप्त किया गया था, और डी की पहचान की थी मिशिगन आईआरबी (प्रोटोकॉल # HUM00093465 और HUM00105750) के विश्वविद्यालय से अनुमोदन के साथ आयोजित किया गया ।

1. Microinjector सेटअप

  1. सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध सामग्री प्राप्त करें ।
  2. micromanipulator, विदारक गुंजाइश, और प्रकाश स्रोत को सुरक्षा कैबिनेट में रखें । प्रायोगिक उपयोग करने से पहले ७०% इथेनॉल या अंय विसंक्रमित के साथ microinjection सेटअप साफ । ब्लीच युक्त कीटाणुनाशक को लंबे समय तक निवेश से बचें, जो microinjection उपकरण को जीर्णशीर्ण कर सकते हैं ।
    नोट: पूर्ण microinjector असेंबली का एक उदाहरण चित्र 1में दिखाया गया है ।
  3. इस विदारक गुंजाइश की स्थिति तो यह है कि आंख का टुकड़ा उपयोग के लिए ढाल में प्रवेश बंदरगाह के माध्यम से किया जा सकता है ।
    1. वैकल्पिक रूप से, माइक्रोस्कोप का उपयोग अंक के साथ एक सुरक्षा कैबिनेट के स्थान पर सकारात्मक हवा प्रवाह प्रणाली के साथ एक साफ बेंच का उपयोग करें ।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार माइक्रोस्कोप के दाईं ओर पर micromanipulator इकट्ठा करने और नियंत्रण आसानी से पहुंचा और समायोजित किया जा सकता है ताकि समायोजित । micromanipulator एक लोहे की थाली पर रखा जाना चाहिए या अंयथा स्थिर ।
    नोट: बाएँ हाथ के उपयोगकर्ता micromanipulator को विदारक कार्यक्षेत्र के बाईं ओर जगह देना चाहते हैं.
  5. micromanipulator बांह के लिए micropipette धारक माउंट और micropipette धारक में डालने के द्वारा एनालॉग टयूबिंग कनेक्ट ।
  6. 10 मिलीलीटर गिलास बाँझ खनिज तेल की लगभग 5-7 मिलीलीटर के साथ सिरिंज भरें ।
  7. Luer ताला तंत्र का उपयोग एनालॉग टयूबिंग के खुले अंत करने के लिए खनिज तेल से भरा 10 मिलीलीटर गिलास सिरिंज कनेक्ट करें । micromanipulator से विपरीत, विदारक गुंजाइश के बाईं ओर ग्लास सिरिंज रखें ।
  8. धीरे दबाना सिरिंज, टयूबिंग के माध्यम से खनिज तेल धक्का । micropipette धारक की नोक से खनिज तेल के लगभग 10 बूंदें फ्लश और एक पेट्री पकवान या इसी तरह के पोत और त्याग में इकट्ठा ।
    नोट: यह कदम टयूबिंग से सभी हवा निकालता है और प्रत्येक microinjection सत्र से पहले किया जाना चाहिए ।

2. microinjection के लिए तैयारी

  1. 24 ज से पहले microinjection:
    1. 2 मिलीग्राम/एमएल में बाँझ पंजाब या खारा में एकाग्रता पर FITC dextran पुनः सस्पैंड द्वारा FITC dextran समाधान तैयार करें । & #62 की कुल मात्रा तैयार करना; २५० µ l.
      नोट: FITC-dextran के उच्च या निंन सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है, लगभग ०.१ मिलीग्राम/एमएल से लेकर । FITC-dextran की एकाग्रता समायोजित करने के लिए बहाव इमेजिंग आवेदन सूट ।
    2. 4 पर सेटअप organoid संस्कृतियों-या 8 अच्छी तरह से ग्लास चैंबर स्लाइड या अंय संस्कृति रहते माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त पोत, अप करने के लिए 4-6 HIOs के साथ अच्छी तरह से, ५० µ एल सेल मैट्रिक्स समाधान में एंबेडेड और EGF, नोगिन और आर Spondin (एंर) वृद्धि फैक्टर मीडिया में संस्कृति 19 ,24. organoids समान रूप से अंतरिक्ष के लिए ध्यान रखना (लगभग 5 मिमी के अलावा) वास्तविक समय इमेजिंग विश्लेषण के दौरान एक एकल सूक्ष्म क्षेत्र में कई HIOs पर कब्जा करने से बचने के लिए. हीयो संस्कृति और रखरखाव के लिए एक पूरा गाइड के लिए McCraken एट अल देखें । 24.
      नोट: इस प्रोटोकॉल स्टेम सेल व्युत्पंन HIOs और प्रतिनिधि परिणाम का उपयोग कर विकसित किया गया था (नीचे देखें) इस ऊतक संस्कृति मॉडल के उपयोग का प्रदर्शन । हालांकि, एक ही प्रोटोकॉल आसानी से ऊतक व्युत्पंन आंत्र उपकला organoids15,29के लिए अनुकूलित है । ऊतक व्युत्पंन HIOs आम तौर पर पीएससी व्युत्पंन HIOs से छोटे है और सहायक mesenchymal basolateral सेल संरचना15,29,30की कमी है । ऊतक के Microinjection-व्युत्पंन HIOs तकनीकी क्षमता और अनुभव के एक अधिक से अधिक डिग्री की आवश्यकता हो सकती है । डिग्री जो करने के लिए उपकला बाधा पारगम्यता डेटा ऊतक-व्युत्पन्न HIOs का उपयोग कर प्राप्त hPSC-व्युत्पन्न HIOs के साथ सहसंबंधी हो सकता है अज्ञात है.
    3. ४२ डिग्री सेल्सियस पर एक मानक सेल संस्कृति मशीन में HIOs मशीन और 5% सह2 microinjection करने से पहले ।
  2. 30 मिनट पहले microinjection करने के लिए, पर बारी के लिए सुरक्षा कैबिनेट और इष्टतम कार्य ऊंचाई के लिए कांच ढाल बढ़ा ।
  3. सभी अनावश्यक आइटम को सुरक्षा कैबिनेट से निकालें । अव्यवस्था फैल या अंय दुर्घटनाओं के जोखिम जब सीमित स्थानों में काम बढ़ जाती है ।
  4. स्प्रे और अच्छी तरह से ७०% इथेनॉल या अंय विसंक्रमित के साथ काम की सतह को साफ । पोंछ साफ एक कागज तौलिया का उपयोग कर ।
  5. ग् microinjector से जुड़ी सिरिंज में मिनरल ऑयल के लेवल की जांच करें । अगर वहां खनिज तेल शेष के 3 मिलीलीटर से भी कम नहीं है, सिरिंज unक्रू और के अंदर फिर से भरना, इस के लिए बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है । 7 मिलीलीटर से अधिक न भरें ।
  6. दीपक को मोड़कर विदारक कार्यक्षेत्र रोशन करें । व्यक्तिगत आराम के लिए ऐपिस समायोजित करें ।
  7. micromanipulator को विदारक गुंजाइश के अधिकार की स्थिति में करें । एक लोहे की थाली के लिए micromanipulator एक चुंबकीय खड़े का उपयोग कर सुरक्षित । micromanipulator की स्थिति को समायोजित करने के लिए बंद की स्थिति के लिए चुंबकीय स्टैंड स्विच और पर स्थिति के लिए चुंबकीय स्टैंड की स्थापना करके लोहे की थाली के लिए खड़े सुरक्षित ।
  8. Microcapillary स्थापना
    1. निर्माता द्वारा प्रदान की भंडारण कंटेनर से एक एकल 1 मिमी गिलास रेशा निकालते हैं ।
    2. micropipette खींचने के तांबे हीटिंग कुंडल के केंद्र के माध्यम से कांच रेशा डालें ।
      नोट: micropipette खींचने की तैयारी करने के लिए मार्गदर्शिका के लिए चित्र 2 देखें ।
    3. रेशा की स्थिति इतनी है कि तांबे हीटिंग का तार गिलास रेशा के बीच में लगभग है । इस खींचने प्रत्येक गिलास रेशा से दो प्रयोग करने योग्य microinjection सुई उत्पन्न करता है कि यह सुनिश्चित करेंगे.
    4. कांच रेशा सबसे पहले ऊपर दबाना कस द्वारा clamps का उपयोग कर, सुनिश्चित करें कि कांच तंतु टूटना रोकने के लिए पायदान वाले उपवन के भीतर सुरक्षित है बनाने के लिए सुरक्षित ।
    5. नीचे दबाना कस से पहले अपनी अधिकतम ऊर्ध्वाधर स्थिति के लिए खींचने हाथ का विस्तार ।
      नोट: यह चरण आवश्यक है । पूरी तरह से खींचने के हाथ विफलता कांच रेशा के दो वर्गों की अनियमित जुदाई में परिणाम होगा ।
    6. हीटिंग और pulling प्रणाली पर सेटिंग्स की जांच करें ।
चुनें हीट #1 के साथ टॉगल (९९०) और सेट पर खींचो ०५९ (चित्रा 2).
  • चालू/बंद टॉगल का उपयोग कर साधन पर बारी ।
  • सुरक्षात्मक सामिल शील्ड को बंद करें और खींचने के नीचे सही चेहरे पर पुल बटन दबाएँ । तांबे का तार गर्मी शुरू हो जाएगा और चमकीले नारंगी चमक जाएगा । तापमान बढ़ जाता है के रूप में, कांच रेशा खिंचाव और अंततः अलग करने के लिए शुरू हो जाएगा । कांच रेशा के दो सिरों की जुदाई पर, साधन शक्ति नीचे होगा ।
    नोट: तांबे का तार कई मिनट के लिए बेहद गर्म रहेगा । खींचे हुए काँच के रेशा को प्रोटोकॉल में इस बिंदु से एक ' microcapillary ' के रूप में संदर्भित किया जाएगा.
  • तांबे का तार छूने से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है, कांच microcapillaries के एक एक को हटा दें । microcapillary की बात बहुत महीन होनी चाहिए । microcapillary ध्यान से लेटेक्स या नाइट्राइल दस्ताने के साथ संभाल और तुरंत microinjector सेटअप युक्त सुरक्षा कैबिनेट के लिए आगे बढ़ें ।
    नोट: ग् microcapillary बेहद तेज और बहुत ही नाजुक है । देखभाल के साथ संभाल ।
  • micromanipulator बांह के अंत टोपी ढीला । micropipette धारक के खुले अंत में खींच microcapillary के कुंद अंत डालें और यह आवक धक्का जब तक यह बंद हो जाता है ।
  • microcapillary के कुंद अंत फिर से micromanipulator हाथ को सुरक्षित अंत टोपी कस ।
    नोट: जब microinjection प्रणाली पर microcapillary स्थापित ध्यान रखना करने के लिए तेज अंत छू से बचने के । इससे प्रदूषित होने की संभावना कम होगी और microinjection के लिए फाइन पॉइंट को बचाना होगा । सही ढंग से सुरक्षित करने के लिए विफलता microcapillary अस्थिरता या microinjection के दौरान कांच रेशा के टूटना में परिणाम कर सकते हैं ।
  • ग् microcapillary की नोक खोल ᱶ । खींचा कांच microcapillary की तैयारी के दौरान, बिंदु की नोक की संभावना इस तरह के रूप में पिघल जाएगा microcapillary के बिंदु अंत सील करने के लिए । इस रुकावट को दूर करने के लिए:
    1. micromanipulator की स्थिति ऐसी है कि microcapillary इस सतह को छूने के बिना विदारक गुंजाइश की कांच की अवस्था में नीचे बताया है ।
    2. एक बाँझ प्लास्टिक की सतह का पता लगाएं (एक संस्कृति प्लेट ढक्कन के नीचे पूरी तरह से काम करता है) और यह सीधे विदारक गुंजाइश के मंच पर microcapillary सुई के नीचे माइक्रोस्कोप मंच पर जगह है ।
    3. केंद्र को देखने के क्षेत्र के तहत microcapillary के टिप और यह सुनिश्चित करें कि जब 1.5 x आवर्धन के तहत माइक्रोस्कोप के ऐपिस के माध्यम से देख रहा है दिखाई देता है ।
    4. micromanipulator नियंत्रण का उपयोग करना, धीरे micromanipulator हाथ और बाँझ प्लास्टिक संस्कृति ढक्कन की ओर microcapillary तक टिप बमुश्किल संपर्क प्लास्टिक की सतह और microcapillary की नोक मुक्त टूटता है ।
      नोट: microinjection के दौरान हीयो को नुकसान को कम करने के क्रम में कांच रेशा से द्रव प्रवाह के लिए अनुमति देता है कि सबसे छोटी संभव तोड़ने के लिए निशाना लगाओ ।
    5. वापस microcapillary बाँझ सतह से दूर आगे बढ़ने से पहले आकस्मिक टूटना की संभावना को कम करने के लिए ।
    6. कांच सिरिंज निराशाजनक द्वारा प्रवाह के लिए microcapillary की जांच करें, टयूबिंग के माध्यम से खनिज तेल धक्का । microcapillary के अंत में खोला गया है, तो आप खनिज तेल की एक छोटी सी बूंद कुछ सेकंड के बाद microcapillary की नोक से उभरने देखेंगे । यदि यह उत्पंन नहीं होती है, तो पिछले चरण को दोहराएं और पुन: परीक्षण करें ।

    • ३. बाँझ Microinjection

    नोट: एक बार microcapillary तैयार किया गया है, स्थापित है, और परीक्षण, microinjecting HIOs शुरू करते हैं । चित्रा 3 एक ऊतक-व्युत्पंन हीयो है कि सफलतापूर्वक FITC-dextran के साथ इंजेक्शन किया गया है दिखाता है ।

    1. इंजेक्शन सामग्री के साथ microcapillary भरें । FITC dextran इंजेक्शन निलंबन में कांच microcapillary की नोक जलमग्न, पक्ष या ट्यूब के नीचे के खिलाफ microcapillary की नोक तोड़ने से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है । एक बार microcapillary के टिप समाधान में जलमग्न है, खनिज तेल सिरिंज पर वापस खींचने के लिए microcapillary में FITC dextran निलंबन के लगभग 10 µ एल आकर्षित ।
      नोट: यह इंजेक्शन समाधान के लिए १.५ मिलीलीटर या ०.५ मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग करने की सिफारिश की है के बाद से इन सबसे आसानी से स्थापित microcapillary के लिए सुलभ हो जाएगा । वैकल्पिक रूप से, इंजेक्शन समाधान एक बाँझ पेट्री पकवान या बाँझ parafilm, जो microcapillary के करीब निकटता में एक ट्यूब पकड़ की जरूरत सीमित द्वारा sharps चोट की संभावना को कम कर सकते हैं से तैयार किया जा सकता है । यदि निलंबन अत्यधिक चिपचिपा है या यदि microcapillary का उद्घाटन असाधारण छोटा है, यह microcapillary को भरने के लिए कई सेकंड लग सकते हैं । इस पूरे microinjection प्रणाली दूषित हो सकता है के रूप में प्लास्टिक microinjection टयूबिंग में microinjection सस्पेंशन आकर्षित मत करो ।
    2. microcapillary भरना बंद करो जब microinjection निलंबन कांच microcapillary की लंबाई के ९०% भरता है । दबाना microinjection समाधान से microcapillary को वापस लेने से पहले थोड़ा सिरिंज को सुनिश्चित करें कि microcapillary की नोक हवा की जेब शामिल नहीं करता है ।
      नोट: यदि microcapillary की परीक्षा हवा की जेब से पता चलता है, खाली और फिर से भरें ।
    3. सेल संस्कृति मशीन से हीयो संस्कृति प्लेट (ओं) को हटा दें और microinjector के साथ सुरक्षा कैबिनेट के लिए स्थानांतरण ।
    4. हीयो संस्कृति प्लेट से ढक्कन हटाने के भीतर सुरक्षा कैबिनेट और केंद्र पहले अच्छी तरह से माइक्रोस्कोप मंच पर इतना है कि यह स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है के माध्यम से ऐपिस के दायरे में सबसे कम आवर्धन सेटिंग.
    5. micromanipulator बांह को इस तरह मोड़ें कि microcapillary को हीयो कल्चर में अच्छी तरह से बताया जाता है एक कोण & #62; माइक्रोस्कोप स्टेज के सापेक्ष ४५ °. यह सबसे आसानी से मैन्युअल बिंदु पर अपनी क्षैतिज अक्ष पर micromanipulator बांह विधानसभा मोड़ द्वारा पूरा किया जाता है, जहां क्षैतिज micromanipulator बांह समर्थन ऊर्ध्वाधर स्टैंड मिलता है, के बाद से ठीक नियंत्रण (काले डायल) की एक सीमित सीमा है गति. पहली संस्कृति के ऊपर microcapillary की नोक की स्थिति अच्छी तरह से लगभग 1 सेमी मीडिया की सतह (चित्रा 3) से ऊपर ऊपर) । ऊतक-व्युत्पन्न आंत्र उपकला organoids के microinjection प्रदर्शन एक प्रतिनिधि छवि चित्र बीमें दिखाया गया है.
    6. जांच लें कि ग् रेशा और हीयो (ओं) के दोनों सिरे ऐपिस के माध् यम से दिखाई देते हैं । पुन: स्थिति यदि आवश्यक हो ।
    7. microcapillary धीरे जेड अक्ष नियंत्रण घुंडी दक्षिणावर्त मोड़ से अग्रिम ।
      नोट: microcapillary टिप की स्थिति को देखते हुए, विशेष रूप से गहराई, अभ्यास की आवश्यकता है । के रूप में टिप मीडिया की सतह का उल्लंघन, microcapillary टिप की एक छोटी सी दृश्य विकृति सूचना ।
    इस बिंदु से देखभाल के साथ आगे बढ़ना संस्कृति की थाली के नीचे के खिलाफ microcapillary तोड़ने से बचने के लिए या HIOs को नुकसान पहुँचाए ।
  • microcapillary टिप के साथ हीयो पियर्स । हीयो की बाहरी सतह थोड़ा दबाना जाएगा के रूप में microcapillary दबाव लागू शुरू होता है और आकार में वापस पॉप जाएगा के रूप में टिप लुमेन प्रवेश । यह हीयो लुमेन के भीतर microcapillary की नोक की पहचान करने के लिए मुश्किल हो सकता है । यदि microcapillary को देखने में कठिनाई हो तो, विदारक कार्यक्षेत्र के प्रकाश या आवर्धन सेटिंग्स को समायोजित करें ।
  • micromanipulator नियंत्रण से हाथ निकालें जब microcapillary सही ढंग से हीयो के केंद्र के पास microcapillary के टिप के साथ तैनात है ।
  • दबाना खनिज तेल थोड़ा सिरिंज को microcapillary से बाहर microinjection समाधान धक्का और हीयो लुमेन में । हीयो इंजेक्शन की मात्रा को समायोजित करने के लिए थोड़ा विस्तार हो सकता है ।
    नोट: इस हीयो को भरने से बचने के लिए ध्यान रखना के रूप में इस organoid फट करने के लिए कारण होगा । अंगूठे के एक नियम के रूप में, हीयो मात्रा के किसी भी दृश्य विस्तार का मतलब है कि यह समय के लिए बंद है । परिपक्व हीयो लुमेन के माध्य मात्रा लगभग 1 µ एल है, लेकिन काफी भिन्न हो सकते हैं. स्वचालित सिरिंज पंप एक मैनुअल सिरिंज के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता इंजेक्शन मात्रा के ठीक नियंत्रण के लिए अनुमति देते हैं.
  • Z-अक्ष नियंत्रण और मीडिया की सतह के ऊपर की स्थिति का उपयोग कर हीयो से microcapillary को वापस ले ।
  • microcapillary के साथ अगले हीयो लक्ष्य के लिए कदम मीडिया के ऊपर तैनात करने के लिए युद्धाभ्यास के दौरान HIOs को आकस्मिक क्षति से बचने और एक समान तरीके से सुई (कदम ३.६-३.११ देखें) ।
    1. ऊपर वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर microcapillary फिर से भरना ।
      नोट: यदि टिप microinjection के दौरान किसी भी बिंदु पर टूटता है, इंजेक्शन जारी रखने का प्रयास नहीं करते । नीचे दिए गए निर्देशों के अनुसार टिप बदलें ।
  • उपचार के बीच या टूटना की स्थिति में microcapillary बदलें । micromanipulator बांह के अंत पर दबाना ढीला और micropipette धारक से microcapillary हटा दें ।
    चेतावनी: तेज अंत के पास microcapillary संभाल नहीं है । microcapillary के ठीक बिंदु बेहद तेज है और आसानी से दस्ताने और त्वचा पंचर होगा । सावधानी का प्रयोग करें और सभी आंदोलनों के बारे में पता हो, microcapillary से निपटने के लिए केवल जोड़ तोड़ का उपयोग कर और microcapillary और हीयो संस्कृतियों के बिंदु के बीच हाथ रखने कभी नहीं । संक्रामक एजेंटों या विषाक्त पदार्थों से युक्त एक microcapillary से एक सुई छड़ी की स्थिति में तुरंत चिकित्सा उपचार की तलाश ।
    नोट: कुछ मामलों में, यह दृश्य सफल हीयो microinjection की पुष्टि करने के लिए कठिन हो सकता है । स्पष्ट microinjection निलंबन की दृश्यता FITC-dextran के उच्च सांद्रता के अलावा के उपयोग के द्वारा बढ़ाया जा सकता है ।

    • 4. HIOs के औषधीय उपचार

    1. शिखर उपकला के लिए वितरित यौगिकों का परीक्षण करने के लिए, ऊपर संकेत के रूप में हीयो लुमेन में 2 मिलीग्राम/एमएल FITC-dextran और microinject युक्त बाँझ पंजाबियों में reसस्पेंड (धारा 3). प्रतिनिधि प्रयोग के लिए, FITC-dextran युक्त पंजाबियों में १२.८ एनजी/µ एल पर क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल विष TcdA reसस्पेंड ।
    2. basolateral डिब्बे में वितरित यौगिकों का परीक्षण करने के लिए, नए मीडिया के साथ बाहरी संस्कृति मीडिया की जगह 2 मिमी ईथीलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (β-aminoethyl ईथर)-एन, एन, एन ', N'-tetraacetic एसिड (EGTA) (सकारात्मक नियंत्रण), पंजाबियों अकेले वाहन (नकारात्मक नियंत्रण ), या FITC-dextran के microinjection के बाद अंय प्रायोगिक यौगिक ।
      नोट: खुराक और औषधीय यौगिकों, विषाक्त पदार्थों, या अन्य एजेंटों के आवेदन के समय प्रयोगात्मक प्रश्न के अनुसार भिन्न हो सकते हैं.

    5. Microinjected Organoids की लाइव इमेजिंग

    1. लाइव इमेजिंग तुरंत निंनलिखित microinjection शुरू करते हैं । एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप एक humidified ३७ डिग्री सेल्सियस और 21% हे2 और 5% सह एक स्वचालित रहते सेल इमेजिंग प्रणाली के साथ2 पर बनाए रखा के साथ सुसज्जित करने के लिए संस्कृति प्लेट स्थानांतरण । पर्यावरण चैंबर बंद करो और इमेजिंग प्रक्रिया शुरू करते हैं ।
    2. डेस्कटॉप से छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (उदा., softWoRx) लॉंच करें । "फ़ाइल" पर क्लिक करें और इमेजिंग और माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर शुरू करने के लिए "मोल (3 डी संकल्प)" का चयन.
    3. सेट उत्तेजना/उत्सर्जन करने के लिए FITC (४७५ एनएम उत्तेजना/523 एनएम उत्सर्जन), 5% करने के लिए संचरण शक्ति सेट, और 4x करने के लिए लेंस । ०.०२५ ms (चित्र 4a) के लिए जोखिम समय निर्धारित करें ।
      नोट: जोखिम समय फ्लोरोसेंट संकेत की शक्ति के अनुरूप करने के लिए विविध किया जाना चाहिए । सामांय में, FITC प्रतिदीप्ति संकेत केवल कमी होगी । इसलिए, अधिकतम संवेदनशीलता को सुनिश्चित करने के लिए, प्रारंभिक जोखिम बार इस तरह है कि दर्ज फ्लोरोसेंट संकेत कैमरा और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के संतृप्ति बिंदु के नीचे है समायोजित किया जाना चाहिए ।
    4. 4x आवर्धन पर HIOs माइक्रोस्कोप के लिए संलग्न डिजिटल नियंत्रक का उपयोग कर खोजें । हीयो को देखने के क्षेत्र (चित्र 4a) के भीतर केंद्र ।
    5. उपकरण पट्टी पर "देखें" क्लिक करें और एक नई विंडो प्रकट करने के लिए "पॉइंट सूची" का चयन करे । बिंदु सूची में चरण की वर्तमान स्थिति को संग्रहीत करने के लिए "मार्क पॉइंट" पर क्लिक करें (चित्र 4a) ।
    6. दोहराएँ चरण ५.४ और ५.५ जब तक सभी HIOs की स्थिति दर्ज किया गया है । एक नोटपैड या डिजिटल रिकॉर्ड का उपयोग कर, अद्वितीय आईडी प्रत्येक क्रमादेशित माइक्रोस्कोप स्थिति और उस स्थिति पर कब्जा कर लिया छवियों को सौंपा संख्या का ध्यान दें । छवि फ़ाइलों को इस आईडी नंबर के साथ टैग किया जाएगा और यह डेटा संग्रह के पूरा होने के बाद विशिष्ट HIOs और उपचार के साथ छवि आईडी नंबर सहयोगी के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा.
    7. स्वचालित छवि संग्रह सेटअप करने के लिए, उपकरण पट्टी में "फ़ाइल" और उसके बाद "प्रयोग" पर क्लिक करें । प्रयोग को दिनांक या अंय अनंय नाम के साथ नाम दिया जाए ।
    8. आरेख 4Bमें दिखाए गए अनुसार विकल्प टैब्स में से प्रत्येक के माध्यम से जाकर छवि संग्रह के लिए पैरामीटर्स सेट करें ।
      1. संयुक्त राष्ट्र की जांच "Z अनुभाग" टैब के तहत "अनुभागिंग" ।
      2. टैब "चैनल" के तहत, ऊपर छोड़ दिया "3 डी संकल्प" खिड़की से पैरामीटर दर्ज करें । समय बचाने के लिए, पहली पंक्ति स्वचालित रूप से पॉप्युलेट होगी जब चेक में बाईं ओर बॉक्स ।
      3. ' समय चूक ' टैब के तहत, "समय चूक" लेबल बॉक्स की जाँच करें और "समय-चूक" लेबल पंक्ति में छवियों के बीच समय अंतराल दर्ज और "कुल समय" लेबल पंक्ति में प्रयोग की कुल अवधि. सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से समय अंक की संख्या की गणना करेगा ।
      4. टैब "अंक" के तहत, "यात्रा बिंदु सूची" लेबल बॉक्स की जाँच करें.
    आप पाठ बॉक्स में टाइप करके प्रयोग में शामिल करने के लिए विशिष्ट पॉइंट संख्याओं को मैन्युअल रूप से भी दर्ज कर सकते हैं.
  • टैब "पैनलों" या "क्रियाएं" के अंतर्गत डिफ़ॉल्ट विकल्प परिवर्तित न करें ।
  • "चलाएँ" टैब पर क्लिक करें. "छवि फ़ाइल नाम" लेबल बॉक्स में प्रयोग की तारीख दर्ज करें और "सेटिंग" के तहत डेटा सहेजें स्थान सेट.
  • प्रयोग मैक्रो को चलाने के लिए हरे तीर पर क्लिक करें । एक समय चूक काउंटर प्रयोगात्मक प्रगति को ट्रैक करेगा ।
  • नियोजित समय पाठ्यक्रम के अंत में, निर्यात करें और 24-bit RGB TIFF छवियां (चित्र 4c) के रूप में सभी छवि फ़ाइलों को सहेजें ।
    1. उपकरण पट्टी पर, कार्य बिल्डर द्वारा फ़ॉलो की गई प्रक्रिया का चयन करें ।
    2. कार्य बिल्डर मेनू में, ५.९ में निर्दिष्ट डेटा फ़ोल्डर में नेविगेट करके फ़ाइलें जोड़ें । प्रॉंप्ट में "*. dv" लिखकर ". dv" में समाप्त होने वाली सभी फ़ाइलों को हाइलाइट करें । सभी (Ctl + A) चुनें और "जोड़ें" पर क्लिक करें.
    3. पर क्लिक करें + लेबल अनुभाग के तहत "कार्य." चुनें "के रूप में निर्यात..." और "विकल्प" टैब पर क्लिक करें ।
    4. सेट "निर्यात प्रारूप" करने के लिए "TIFF छवियां" और एक "कस्टम आउटपुट फ़ोल्डर" जोड़ने के लिए नीचे बॉक्स की जांच करें । यह वह स्थान है जहां TIFF छवियां निर्यात की जाएंगी । "TIFF आउटपुट प्रकार" के अंतर्गत 24-बिट RGB चुनें और "पूर्ण" क्लिक करें ।
    5. निर्यात मैक्रो को चलाने के लिए "सबमिट करने के लिए क्यू" क्लिक करें ।
  • यदि आप किसी अन्य कंप्यूटर पर पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण (अनुभाग 6) कर रहा हो जाएगा एक बाहरी ड्राइवर या सर्वर के लिए ५.११ में निर्यात TIFF छवियाँ की प्रतिलिपि बनाएँ ।
    नोट: हीयो ऊतक और मीडिया प्रोटोकॉल३४, पीसीआर३५), वेस्टर्न ब्लाट३६, या अंय अनुप्रवाह विश्लेषण के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।

    • 6. पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण

    1. सुनिश्चित करें कि ImageJ३७ स्थापित है और विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले कंप्यूटर पर ठीक से कार्य कर रहा है ।
      नोट: फिजी३७ ImageJ कोर प्रोग्राम है कि इस विश्लेषण के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करेंगे का एक वैकल्पिक वितरण है ।
    2. बैच विश्लेषण "प्रक्रिया" फिर "बैच" और अंत में "मैक्रो" ImageJ मेनू से का चयन करके प्रारंभ करें ।
    3. निवेश के प्रायोगिक समय पाठ्यक्रम के दौरान एकत्र झगड़ा छवियों युक्त निर्देशिका में सेट करें । "thesholdmeasure. ijm" ImageJ मैक्रो फ़ाइल खोलें या सीधे प्रतिलिपि बनाएं/मैक्रो कोड को विंडो में चिपकाएं । क्लिक करें "प्रक्रिया" फ़ाइलों के प्रसंस्करण शुरू करने के लिए ।
      नोट: न्यूनतम थ्रेशोल्ड मान x (setThreshold (x, 255);) किसी भी संख्या 0-255 के लिए सेट किया जा सकता है और ताकि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को समाप्त करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । मान & #60; १०० अनुशंसित हैं । empirically उचित थ्रेशोल्ड मान निर्धारित करने के लिए, कोई फ्लोरोसेंट संकेत के साथ एक organoid का प्रतिनिधित्व करने वाले किसी एकल छवि पर इमेजिंग मैक्रो चलाएँ । इस छवि का मतलब तीव्रता उचित सीमा की स्थापना के लिए एक गाइड के रूप में सेवा कर सकते हैं । नीचे प्रस्तुत प्रतिनिधि विश्लेषण के लिए, थ्रेशोल्ड "४२" के लिए सेट किया गया था ।
    4. ImageJ दहलीज तीव्रता सीमा के भीतर सभी पिक्सल के क्षेत्र से युक्त एक बड़ी तालिका का उत्पादन होगा, और सीमा की तीव्रता सीमा के भीतर क्षेत्र के लिए मतलब है, औसत, न्यूनतम, और अधिकतम (सीमा) तीव्रता मूल्य. यह एक CSV या XLS के रूप में सहेजें ।
    5. समय के साथ तीव्रता में परिवर्तन एक स्प्रेडशीट३९ में नीचे परिकलन करने के लिए डेटा तालिका जोड़ तोड़ या एक उपयुक्त प्रोग्रामिंग भाषा का उपयोग कर स्वचालित किया जा सकता द्वारा परिकलित किया जा सकता है । एक उदाहरण के विश्लेषण आर ४० में लिखा स्क्रिप्ट इस पांडुलिपि के साथ प्रदान की जाती है ।
      नोट: प्रत्येक हीयो के लिए, सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में मात्रा किया जा सकता है । Equation 1 हीयो लुमेन में FITC-dextran के उन्मूलन समय ४१ (t1/2) निम्नानुसार गणना की गई थी:
      1. सबसे पहले, वक्र के तहत "क्षेत्र की गणना" (ईमेज) वक्र से समय के सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता का वर्णन (टी) के रूप में:
        Equation 2
      2. फिर, "क्लीयरेंस" () दर को बंटन की मात्रा के साथ परिकलित करें (Equation 3Vd) t = 0 पर सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति के लिए 1 के रूप में परिभाषित किया गया है:
        Equation 4
      3. अगले, "उंमूलन दर निरंतर" () के रूप में परिभाषित:Equation 5
        Equation 6
      4. और अंत में, "उंमूलन समय" (टी1/2) के रूप में गणना:
        Equation 7
        कम समीकरण इस प्रकार है:
        Equation 8

    Representative Results

    HIOs मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं और कोशिका मैट्रिक्स समाधान में प्रसंस्कृत से विभेदित के रूप में पहले वर्णित19,24थे । संस्कृति में 4 सप्ताह के बाद, HIOs पर्याप्त विस्तार किया था microinjection के लिए अनुमति देते हैं । HIOs के साथ microinjected गए थे जिनमें से 4 केडीए FITC-संयुग्मित dextran में निलंबित किए गए पंजाब या पंजाबियों से युक्त क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल विष TcdA. C. डिफीसाइल एक अवसरवादी जठरांत्र रोगज़नक़ कि HIOs25में विष की मध्यस्थता उपकला विषाक्तता प्रदर्शित करता है । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, EGTA के एक सबसेट में हीयो संस्कृति मीडिया को जोड़ा गया था HIOs का इंजेक्शन के साथ पंजाबियों और FITC-dextran । EGTA एक कैल्शियम chelator है जो actin cytoskeleton४२के रैपिड डे-बहुलकीकरण का कारण बनता है । FITC प्रतिदीप्ति एक नियंत्रित पर्यावरण चैंबर और छवियों के भीतर एक जीवित इमेजिंग माइक्रोस्कोप पर वास्तविक समय में निगरानी की गई 10 मिनट के अंतराल में कब्जा कर लिया गया था ।

    इमेजिंग डेटा के बाद हॉक विश्लेषण FITC प्रतिदीप्ति की अवधारण में पर्याप्त अंतर का पता चला (चित्र 5) । HIOs पंजाब के साथ इंजेक्शन लगभग फ्लोरोसेंट संकेत के सभी टी = 0 पर मौजूद बनाए रखा, लेकिन HIOs कि भी EGTA के साथ इलाज के TcdA के साथ इंजेक्शन थे 8 घंटे के बाद से फ्लोरोसेंट तीव्रता में काफी कमी का प्रदर्शन-microinjection (चित्रा 5 ए). इमेजिंग डेटा प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति (चित्रा 5B) में समय के साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता में सापेक्ष परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक उच्च संकल्प डेटासेट उत्पन्न करने के लिए सभी समय बिंदुओं पर सभी HIOs के लिए मात्रा थे. उपकला पारगम्यता में अंतर प्रत्येक उपचार समूह (तालिका 1) और समूहों के बीच टी टी1/2 में मतभेद की तुलना करने के लिए FITC का मतलब उन्मूलन समय (टी1/2 ) की गणना करके मूल्यांकन किया गया छात्र का t-परीक्षण उपयोग कर रहा है । नियंत्रण इलाज HIOs अधिक से अधिक 16 घंटे (टी1/2 = 17 ± ०.३ ज) के लिए FITC फ्लोरोसेंट संकेत के बहुमत बनाए रखा । EGTA के साथ उपचार काफी कम FITC-dextran उन्मूलन समय के सापेक्ष नियंत्रण HIOs (t1/2 = २.६ ± ०.२ h; P = १.३ x 10-8). पहले प्रकाशित परिणामों के साथ सुसंगत25, TcdA के microinjection काफी वृद्धि हुई उपकला बाधा पारगम्यता नियंत्रण उपचार (t1/2 = ७.६ ± ०.६ एच के सापेक्ष; P = ५.४ x 10-4). इस प्रकार, दोनों बाहरी (EGTA) और microinjected (TcdA) यौगिकों HIOs में उपकला बाधा पारगम्यता में महत्वपूर्ण परिवर्तन उत्प्रेरण करने में सक्षम हैं. इन परिणामों का सुझाव है कि औषधीय एजेंटों की एक विस्तृत श्रृंखला के प्रभाव, चयापचयों, बैक्टीरियल उत्पादों, साइटोकिंस, विकास कारकों, और उपकला बाधा समारोह पर अन्य यौगिकों इस दृष्टिकोण का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है.

    उपचार आधा जीवन (ज) SEM (h) लोअर ९५% CI (एच) ऊपरी ९५% CI (एच) एन
    नियंत्रण १७.११ ०.३ १६.४५ १७.७८ 11
    EGTA २.५८ ०.१९ १.७८ ३.३८ 3
    TcdA ७.५६ ०.६३ ५.९३ ९.१८ 6

    तालिका 1: मतलब उंमूलन समय (टी1/2) के लिए FITC-dextran में EGTA या TcdA के साथ इलाज HIOs। इकाइयां घंटों बाद microinjection हैं ।

    Figure 1
    चित्र 1: हीयो microinjection के लिए एक microinjector और micromanipulator का मूल लेआउट. इस छवि HIOs के microinjection प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों की पूरी पूरक से पता चलता है. मुख्य घटक लेबल और आदेश जानकारी सामग्री तालिका में पाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्रा 2: Micropipette खींचने. कॉपर हीटिंग का तार hc, शीर्ष क्लैंप c1, नीचे दबाना (c2), खींचने बांह (pa), हीट सेलेक्शन टॉगल (एचटी) तीर से पहचाने जाते हैं. हीट 1 और PULL के लिए सही सेटिंग लाल पाठ में इंगित की गई हैं । इनसेट में एक सही ढंग से घुड़सवार ग्लास रेशा हीटिंग के लिए तैयार दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्रा 3: एक ऊतक के प्रतिनिधि छवियों-व्युत्पंन हीयो FITC-dextran के साथ इंजेक्शन । (एक) कांच microcapillary की स्थिति का प्रदर्शन बस हीयो और microinjection में प्रवेश करने से पहले छवि । (ख) एक ऊतक की Brightfield छवि-व्युत्पंन मानव आंत्र organoids के microinjection के बाद FITC-dextran । प्रतिदीप्ति संकेत भी एक विशिष्ट फिल्टर सेट के उपयोग के बिना स्पष्ट है कि ध्यान दें । कधी रंगाई एड्स microinjection काटेकोर. 3x आवर्धन कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्र 4: लाइव इमेजिंग कार्यप्रवाह. (A) खुर्दबीन पैरामीटर सेट करने के लिए आवश्यक कदम illustrating स्क्रीनशॉट, स्लाइड पर HIOs मिल जाए, और प्रत्येक हीयो के लिए मंच की स्थिति को बचाने के लिए छवि बनाई जा करने के लिए । (B) में निर्दिष्ट प्रत्येक स्थान पर नियमित अंतराल पर FITC चैनल कैप्चरिंग के लिए Pre-इमेजिंग सेटिंग्स (C) के बाद-इमेजिंग निर्यात DV प्रारूप डेटा फ़ाइलों के रूप में एक tiff छवि के साथ tiff छवियां के रूप में हीयो प्रति समय बिंदु ।कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 5
    चित्र 5: प्रतिनिधि परिणाम । (क) स्टेम सेल व्युत्पंन मानव आंत्र organoids (हीयो) microinjected के साथ 2 मिलीग्राम/एमएल FITC-dextran (4 केडीए) 20 घंटे के लिए छवि । HIOs भी पंजाब (नियंत्रण) या क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल विष TcdA (१२.८ एनजी/µ एल) या 2 मिमी EGTA के साथ इलाज के साथ microinjected थे बाहरी संस्कृति मीडिया में जोड़ा । 4x बढ़ाई । (ख) पंजाब (नियंत्रण), TcdA, या EGTA के साथ इलाज HIOs में समय के साथ अर्थ सामान्यीकृत FITC तीव्रता की साजिश । त्रुटि पट्टियां S.E.M. और n = 11 HIOs (नियंत्रण), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA) का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Discussion

    इस प्रोटोकॉल hPSC-व्युत्पंन HIOs और ऊतक व्युत्पंन आंत्र organoids और वास्तविक समय में उपकला बाधा पारगम्यता की माप के microinjection के लिए एक सामान्य प्रयोजन विधि स्थापित करता है । हम भी विश्लेषण और इन तरीकों का उपयोग कर उत्पंन डेटा की व्याख्या करने के लिए हमारे दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया है । आंतों organoids मॉडल सिस्टम की बढ़ती गोद16,20,21,28 और एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक कार्यात्मक के रूप में आंतों बाधा पारगम्यता में लंबे समय से ब्याज को देखते हुए परिणाम3,4,5,6, हमें आशा है कि इस क्षेत्र में काम कर रहे दूसरों को लागू करने और इन तरीकों पर निर्माण करने में सक्षम हो जाएगा ।

    कई कदम है जो इस तकनीक के आवेदन के लिए महत्वपूर्ण हैं । उच्च गुणवत्ता hPSC-या ऊतक व्युत्पंन हीयो ऊतक microinjection के साथ व्यापक प्रयोग करने से पहले स्थापित किया जाना चाहिए करने के लिए उपयोग । हीयो macrostructure हो सकता है heterogenous, दोनों आकार और आकार में भिन्नता के साथ, हालांकि ऊतक पहचान और सेलुलर आकृति विज्ञान अत्यधिक प्रतिलिपि है जब स्थापित पद्धति का उपयोग करने के लिए HIOs24उत्पन्न. गोलाकार HIOs एक एकल अर्द्ध पारदर्शी लुमेन से मिलकर और लगभग माप 1 मिमी व्यास में microinjection और वास्तविक समय में चमकदार प्रतिदीप्ति की माप के लिए आदर्श होते हैं । कुछ मामलों में, microinjection, हीयो या इंजेक्शन सामग्री के स्पष्ट रिसाव के पतन में जिसके परिणामस्वरूप विफल हो जाएगा । विफल HIOs एक मानक micropipette का उपयोग कर उपयोगकर्ता के विवेक पर अच्छी तरह से संस्कृति से हटाया जा सकता है । microinjection और इमेजिंग के लिए HIOs का चयन करते समय एक इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर उपलब्ध उद्देश्य लेंस पर विचार करें । सामांय में, 2 4x उद्देश्य लेंस पूरा हीयो फ्लोरोसेंट संकेत पर कब्जा करने के लिए आदर्श होते हैं, हालांकि एक 10x उद्देश्य इस्तेमाल किया जा सकता है अगर कम पावर लेंस उपलब्ध नहीं है या यदि उपलब्ध HIOs & #60; व्यास में 1 मिमी । इमेजिंग सॉफ्टवेयर समय के साथ परिभाषित बिंदुओं पर फ्लोरोसेंट छवियों के स्वचालित कब्जा के लिए अनुमति चाहिए ।

    इस प्रोटोकॉल के कई संशोधनों के क्रम में प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप संभव हो रहे हैं । उदाहरण के लिए, बैरियर समारोह परीक्षणों के परिणामों का उपयोग४३ में यौगिकों के आणविक आकार पर निर्भर हो सकता है और यह आणविक वजन बदलती की dextran तैयारियों का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त हो सकता है । इसके अलावा, brightfield इमेजिंग ऊतक के समग्र संरचनात्मक अखंडता के एक संकेतक के रूप में प्रतिदीप्ति इमेजिंग के अलावा किया जा सकता है25। जब जीवित जीवाणुओं के microinjection प्रदर्शन25,28,31,३२,३३,४४, यह पेनिसिलिन जोड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है और streptomycin या gentamicin करने से पहले या बाद में हीयो कल्चर मीडिया को microinjection । microcapillary के बाहर बैक्टीरियल संस्कृति निलंबन के साथ भरने के दौरान दूषित हो जाएगा और यह हीयो मीडिया को हस्तांतरित किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, microinjection मीडिया के बिना extracellular मैट्रिक्स (जैसे, Matrigel) में निलंबित HIOs पर किया जा सकता है, microinjection पूरा होने के बाद मीडिया को जोड़ने । इस extracellular मैट्रिक्स और हीयो के बाहरी चेहरे को प्रदूषित सीमा हो सकती है । जब माइक्रोबियल विकास परख की योजना बना, यह 1-2 एच के बाद मीडिया में एंटीबायोटिक दवाओं को दूर करने के लिए धीमी गति से बचने या microinjected जीवों के विकास को रोकने के लिए आवश्यक हो सकता है ।

    अंत में, पहचानने कि नहीं सभी शोधकर्ताओं ने सूक्ष्म उपकरणों के लिए उपयोग होगा इन विट्रो इमेजिंग में करने के लिए उपयुक्त है, यह कहना महत्वपूर्ण है कि प्रतिदीप्ति डेटा इकट्ठा करने के लिए इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रक्रियाओं छवियों के लिए लागू किया जा सकता है फिक्स्ड timepoints पर स्वचालित छवि पर कब्जा या पर्यावरण नियंत्रण के बिना मानक epifluorescent माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । इस दृष्टिकोण के उदाहरण Leslie और हुआंग एट अल द्वारा रिपोर्टों में पाया जा सकता है । 25, जो hPSC-व्युत्पन्न आंत्र organoids में सी. डिफीसाइल विष गतिविधि की जांच की, और कर्वे और Pradan एट अल. ४४, जो इसी तरह hPSC में उपकला बाधा पारगम्यता की जांच की-लाइव ई. कोलाईके साथ आंत्र organoids microinjected व्युत्पंन । इमेजिंग उपकरण के मैनुअल आपरेशन अधिक भिंनता में परिणाम और फ्लोरोसेंट संकेत सामांय में कठिनाई हो सकती है । जब FITC के मैनुअल इमेजिंग प्रदर्शन-dextran इंजेक्शन HIOs यह निश्चित आवर्धन, फ्लोरोसेंट उत्तेजना तीव्रता बनाए रखने के लिए आवश्यक है, और प्रयोग भर में जोखिम बार फ्लोरोसेंट तीव्रता माप बदरंग से बचने के लिए ।

    Disclosures

    लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के अंय संघर्ष का खुलासा किया है ।

    Acknowledgments

    लेखक डीआरएस का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । स्टेफ़नी Spohn और बेसल Abuaita पर कई उपयोगी चर्चा के लिए organoid microinjection. JRS आंत्र स्टेम सेल कंसोर्टियम (U01DK103141), मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों के राष्ट्रीय संस्थान (NIDDK) और एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (NIAID) द्वारा वित्त पोषित एक सहयोगी अनुसंधान परियोजना द्वारा समर्थित है । JRS और VBY NIAID उपंयास, दर्ज रोगों (NAMSED) कंसोर्टियम (U19AI116482) के लिए वैकल्पिक मॉडल प्रणालियों द्वारा समर्थित हैं । DRH एलर्जी और संक्रामक रोग के राष्ट्रीय संस्थान से माइक्रोबियल रोगजनन प्रशिक्षण अनुदान के तंत्र का समर्थन किया है (NIAID, T32AI007528) और नैदानिक और स्वास्थ्य के लिए मिशिगन संस्थान को नैदानिक और शोधों विज्ञान पुरस्कार रिसर्च (UL1TR000433) ।

    इस पांडुलिपि में उपयोग किया गया पूरा डेटा फ़ाइलें और डेटा विश्लेषण कोड https://github.com/hilldr/HIO_microinjection पर उपलब्ध हैं ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) Bioworld 405200081
    Cell matrix solution (Matrigel) Corning 354230
    Deltavision RT live cell imaging system GE Life Sciences 29065728 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
    Camera GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
    softWoRx Imaging software GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
    Biosafety cabinet Labconco Cell Logic+ http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
    1X PBS Life Technologies 10010-023
    Advanced DMEM-F12 Life Technologies 12634-010 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    B27 supplement (50X) Life Technologies 17504044 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    L-glutamine (100X) Life Technologies 25030-081 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    HEPES buffer Life Technologies 15630080 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Manipulator Narshge UM-3C
    Micromanipulator Narshge UM-1PF
    Pipette Holder Narshge UP-1 Alternate to Xenoworks pipette holder
    Magnetic stand Narshge GJ-1
    Dissecting scope Olympus SX61 Recommended scope, although other models are likely compatible
    Olympus IX71 Fluorescent microscope Olympus IX71 Included with Deltavision system
    CoolSNAP HQ2 Photometrics 29065728 Included with Deltavision system
    Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein R&D Systems 8619-GT-020
    EGF R&D Systems 236-EG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    R-spondin 1 R&D Systems 4645-RS Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Noggin R&D Systems 6057-NG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Mineral oil Sigma-Aldrich M8410
    FITC-dextran (4 kDa) Sigma-Aldrich 46944
    Micropipette puller Sutter Instruments P-30
    Nunc Lab-Tek II Chamber Slides ThermoFisher Scientific 154526PK
    Glass filaments WPI TW100F-4
    Micropipette holder Xenoworks BR-MH2 Preferred device
    Analog Tubing kit Xenoworks BR-AT
    1/16 in clear ferrule Xenoworks V001104
    1-1.2 mm O-ring Xenoworks V300450

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Standring, S., Borley, N. Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).
    2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).
    3. Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest. 84, 282-291 (2004).
    4. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
    5. Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).
    6. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target? Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).
    7. Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat. Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).
    8. Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. Intestinal permeability tests in coeliac disease. Clin Lab. 47, 143-150 (2001).
    9. Salles Teixeira, T. F., et al. Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls. Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).
    10. Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).
    11. Donato, R. P., et al. Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells. Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).
    12. Balimane, P. V., Chong, S. Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique. Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).
    13. Vidyasagar, S., MacGregor, G. Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability. Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).
    14. Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).
    15. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
    16. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
    17. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).
    18. Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids. Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).
    19. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
    20. Aurora, M., Spence, J. R. HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue. Dev Biol. 420, 230-238 (2016).
    21. Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).
    22. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
    23. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).
    24. McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).
    25. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
    26. Leslie, J. L., Young, V. B. A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions. Anaerobe. 37, 25-28 (2016).
    27. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).
    28. Hill, D. R., Spence, J. R. Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).
    29. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).
    30. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
    31. Engevik, M. A., et al. Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).
    32. Forbester, J. L., et al. Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells. Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).
    33. Engevik, M. A., et al. Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).
    34. Bancroft, J., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. , Churchill Livingstone. (2008).
    35. Kennedy, S., Oswald, N. PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
    36. Kurien, B., Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
    37. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
    38. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
    39. Winston, W. Microsoft excel data analysis and business modeling. , Pearson Education. (2016).
    40. R Core Team. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2017).
    41. Rosenbaum, S. Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , Wiley. (2016).
    42. Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).
    43. Vojdani, A. For the assessment of intestinal permeability, size matters. Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).
    44. Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli. PLoS One. 12, e0178966 (2017).

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    Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (130), e56960, doi:10.3791/56960 (2017).

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