Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Realtid mätning av epiteliala barriären permeabilitet i Human Intestinal Organoids

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56960
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Infectious Disease, University of Michigan

Summary

Detta protokoll beskriver mätning av epiteliala barriären permeabilitet i realtid efter farmakologisk behandling i human intestinal organoids använder fluorescerande mikroskopi och levande cell mikroskopi.

Abstract

Framsteg inom 3D kultur av intestinal vävnader erhålls genom biopsi eller genereras från pluripotenta stamceller via riktad differentiering, har resulterat i sofistikerade in vitro- modeller av tarmslemhinnan. Att utnyttja dessa framväxande modellsystem kräver anpassning av verktyg och tekniker som utvecklats för 2D kultur system och djur. Här, beskriver vi en teknik för att mäta epiteliala barriären permeabilitet i human intestinal organoids i realtid. Detta sker genom Mikroskop fluorescently-märkt dextran och bildbehandling på ett inverterat Mikroskop som är utrustat med epifluorescerande filter. Realtid mätning av barriär permeabiliteten i intestinal organoids underlättar generationen högupplösta tidsmässiga data i human intestinal epitelvävnad, även om denna teknik kan också tillämpas på fast tidpunkt imaging metoder. Detta protokoll är lätt anpassningsbar för mätning av epiteliala barriären permeabilitet efter exponering för farmakologiska agenter, bakterieprodukter eller toxiner eller levande mikroorganismer. Med smärre ändringar, detta protokoll kan också fungera som en allmän primer på Mikroskop av intestinal organoids och användare kan välja att komplettera protokollet med ytterligare eller alternativa nedströms tillämpningar efter Mikroskop.

Introduction

Intestinal epitel bildar en selektiv barriär som medierar riktad transport av näringsämnen, H2O, joner och slaggprodukter samtidigt minimera ospecifik diffusion-medierad utbyte av andra partiklar mellan lumen och den mesenkymala vävnader och allt blod leverans1,2. Ospecifik genomträngligheten av epitelial tarmbarriären har länge ansetts vara en funktionell nyckelparameter i hälsa och sjukdom3,4,5,6, som återspeglar graden av spridning av små molekyler över epitelet via det paracellular utrymmet. Mätning av epiteliala barriären permeabilitet kan utföras på djur modeller7 och i mänskliga patienter8 genom intag av Laktulos, som har inga specifika transportör i mag-tarmkanalen, och den efterföljande samlingen och mätning av Laktulos koncentrationer i perifert blod. Alternativa intagna markörer för barriärfunktion såsom fluorescently märkt kolhydrater är också tillgänglig9,10. Detta tillvägagångssätt har anpassats för tarmens epitelceller kulturer odlas på Transwell stöder11, en förenklad metod som möjliggör större experimentell kontroll men har också kritiserats som en dålig prediktor för i vivo permeabilitet på grund av avsaknad av differentierade epitelceller subtyper och vävnad struktur12. Med kammare representerar ännu ett annat tillvägagångssätt och möjliggör mätning av epitelial barriärfunktion i hela tarmslemhinnan ex vivo13. Tillämpningen av denna teknik begränsas ofta av vävnad tillgänglighet och villkor13,14. Således behövs nya metoder som balanserar reproducerbarhet och genomströmning fysiologiska betydelse.

Senaste utvecklingen i in vitro- organogenesen har lett till antagandet av 3D vävnadsodling modellsystem som en sofistikerad plattform för går igenom dynamiken i komplexa vävnader15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. I synnerhet mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) härrör human intestinal organoids (HIOs)19,24 har dykt upp som reproducerbara och experimentellt eftertraktansvärda modellsystem för att studera värd-mikrobiella interaktioner och epiteliala barriären dynamics25,26,27,28. Likaså, mänsklig vävnad-derived organoids (även känd som enteroids) kan härledas från en enkel biopsi förfarande och kan användas som ett fogligt system för att studera människans fysiologi och sjukdom15,29,30. Mikroskop av human intestinal organoids möjliggör leverans av experimentella föreningar25 eller levande mikrober25,31,32,33 till de apikala epitelial yta av organoid lumen. Leslie och Huang et al. 25 nyligen anpassat denna teknik för att mäta barriär permeabilitet i HIOs microinjected med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) märkt dextran efter exponering för bakteriella toxiner.

Detta protokoll är avsedd som en vägledning för mätning av epiteliala barriären permeabilitet i hPSC-derived HIOs och vävnad-derived HIOs använder fluorescerande mikroskopi. Med smärre ändringar, kan det också fungera som en allmän primer på Mikroskop av HIOs med experimentella föreningar. Användare kan komplettera detta protokoll med ytterligare eller alternativa nedströms tillämpningar efter Mikroskop.

Protocol

Normal, avidentifierad mänskliga vuxen Tarmvävnaden erhölls från avlidna organdonatorer genom livets gåva, Michigan. Mänskliga ES cellinje H9 (NIH-registret #0062) erhölls från WiCell Research Institute. Alla mänskliga vävnader som används i detta arbete erhölls från icke-levande givare, var avidentifieras och genomfördes med godkännande från University of Michigan IRB (protokoll nr HUM00093465 och HUM00105750).

1. microinjector Setup

  1. Hämta material i Material tabell.
  2. Placera micromanipulator, dissekera omfattning och ljuskälla i biosäkerhet skåp. Ren den Mikroskop setup med 70% etanol eller andra desinfektionsmedel innan experimentell användning. Undvik långvarig exponering för desinfektionsmedel som innehåller blekmedel, som kan korrodera Mikroskop utrustningen.
    Obs: Ett exempel på en komplett microinjector församling visas i figur 1.
  3. Placera den dissekera omfattningen så att ögat bit kan användas via tillgång porten i skölden för biosäkerhet skåp.
    1. Alternativt använda en ren bänk med positiva air flow system i stället för en biosäkerhet skåp med mikroskopet åtkomstpunkter.
  4. Montera micromanipulator på höger sida av mikroskopet enligt tillverkarens anvisningar och justera så att kontrollerna kan lätt nås och justeras. Micromanipulator bör monteras på en järn-tallrik eller annars stabiliserat.
    Anmärkning: Vänsterhänta användare kanske vill placera micromanipulator till vänster om den dissekera omfattningen.
  5. Montera hållaren mikropipett i micromanipulator arm och ansluta analoga slangen genom att infoga det i innehavaren av en mikropipett.
  6. Fyll 10 mL glassprutan med ca 5-7 mL steril mineralolja.
  7. Anslut den 10 mL spruta av glas fyllda med mineralolja till den öppna änden av analoga slangen med Luer lock mekanism. Placera sprutan av glas till vänster om dissekera tillämpningsområdet, mittemot från micromanipulator.
  8. Tryck försiktigt ner sprutan, driver mineralolja genom slangen. Spola ca 10 droppar av mineralolja från spetsen av innehavaren av en mikropipett och samla i en petriskål eller liknande fartyg och kassera.
    Obs: Detta steg tar bort all luft från slangen och bör utföras före varje Mikroskop session.

2. förberedelse för Mikroskop

  1. 24 h före Mikroskop:
    1. Förbereda FITC dextran lösning genom att åter avbryta FITC dextran vid en koncentration på 2 mg/mL i sterilt PBS eller saltlösning. Förbereda en total volym på > 250 µL.
      Obs: Högre eller lägre koncentrationer av FITC-dextran kan användas, och den skall alltifrån cirka 0,1 - 10 mg/mL. Justera koncentrationen av FITC-dextran som passar nedströms i bildprogram.
    2. Setup organoid kulturer på 4 - eller 8-väl kammaren glasskivor eller andra kultur fartyg passar leva mikroskopi, med upp till 4-6 HIOs per brunn, inbäddade i 50 µL cellen matris lösning och odlade i EGF, skalle och R-Spondin (ENR) tillväxtfaktor media 19 ,24. Ta hand till rymden organoids jämnt (ca 5 mm mellanrum) för att undvika att fånga flera HIOs i ett enda mikroskopiska fält under realtid bildanalys. För en komplett guide till HIO kultur och underhåll se McCraken o.a. 24.
      Obs: Detta protokoll utvecklades med hjälp av stamceller härstammar HIOs och de representativa resultat (se nedan) demonstrera användningen av denna vävnadsodling modell. Samma protokoll är dock lätt anpassas till vävnad-derived intestinal epitelial organoids15,29. Vävnad-derived HIOs är vanligtvis mindre än PSC-derived HIOs och brist på stödjande mesenkymala basolateral cell struktur15,29,30. Mikroskop av vävnad-derived HIOs kan kräva en högre grad av teknisk förmåga och erfarenhet. Graden som epiteliala barriären permeabilitet data som erhållits med hjälp av vävnad-derived HIOs kan korrelera med hPSC-derived HIOs är okänd.
    3. Inkubera HIOs i en vanlig cell kultur inkubator på 42 ° C och 5% CO2 före Mikroskop.
  2. 30 minuter före Mikroskop, slå på biosäkerhet skåp och höja glaset sköld till optimala arbetshöjden.
  3. Ta bort alla onödiga objekt från biosäkerhet skåp. Röran ökar risken för spill eller andra olyckor när arbetar i trånga utrymmen.
  4. Spraya och rengör noggrant yta med 70% etanol eller andra desinfektionsmedel. Torka rent med hushållspapper.
  5. Kontrollera graden av mineralolja i glasspruta bifogas microinjector. Om det finns mindre än 3 mL mineralolja återstående, skruva loss sprutan och fyll inuti biosäkerhet skåp, vara noga med att undvika att införa bubblor. Fyll inte mer än 7 mL.
  6. Slå på lampan att lysa upp den dissekera omfattningen. Justera okularet för personlig komfort.
  7. Ställning i micromanipulator till höger om den dissekera omfattningen. Säkra micromanipulator till ett järn med hjälp av en magnetisk stå. Växla magnetiska stativet till OFF-läge att justera positionen för micromanipulator och säkra stativet till järn plattan genom att ställa in det magnetiska stativet till positionen.
  8. Microcapillary installation
    1. Hämta en enda 1 mm glas glödtråd från förvaringsbehållaren som tillhandahålls av tillverkaren.
    2. Sätt glas glödtråden genom centrum av koppar värmebatteriet av en mikropipett avdragare.
      Obs: Se figur 2 för en guide för att förbereda den mikropipett avdragare.
    3. Placera glödtråden så att de koppar värmeslinga är ungefär mitt glas glödtråden. Detta kommer att säkerställa att avdragare genererar två användbara Mikroskop nålar från varje glas glödtråden.
    4. Säkra den glas filament med klämmorna genom att strama upp klämma först, se till att glas glödtråden är säkrad inom den skårade grove att förhindra brott.
    5. Förlänga avdragare armen till dess maximala vertikala position innan åtdragning botten klämman.
      Obs: Detta steg är viktigt. Underlåtenhet att fullt förlänga avdragare armen kommer att resultera i oregelbunden separation av två sektioner av glas glödtråden.
    6. Kontrollera inställningarna på uppvärmning och dra mekanism.
Välj Heat #1 med växlingsknappen (990) och Ställ in PULL på 059 (figur 2).
  • Slå på instrumentet med hjälp av växlingsknappen på/av.
  • Stäng skyddande plexiglas sköld och tryck på knappen dra på botten rätt inför avdragare. Den koppar coil börjar att värma och lyser ljus orange. När temperaturen stiger, börjar glas glödtråden sträcka och så småningom separat. Vid avskiljandet av de två ändarna av glas glödtråden stängs instrumentet av.
    Obs: Den koppar coil förblir extremt varmt i flera minuter. Draget glas glödtråden kommer att betecknas som en 'microcapillary' från denna punkt framåt i protokollet.
  • Var försiktig och Undvik att vidröra den koppar coil, ta bort en av glas microcapillaries. Microcapillary bör ha en mycket fin punkt. Hantera microcapillary noga med latex eller Nitril handskar och genast fortsätta till skåpet biosäkerhet innehållande microinjector installationen.
    Obs: Glas microcapillary är extremt vassa och mycket ömtålig. Hantera med försiktighet.
  • Lossa ändlock av micromanipulator armen. Infoga den trubbiga änden av den drog microcapillary i den öppna änden av innehavaren av en mikropipett och driva det inåt tills den stannar.
  • Säkra den trubbiga änden av microcapillary i micromanipulator arm genom efterdragning ändlock.
    Obs: När du installerar microcapillary på Mikroskop systemet ta hand för att undvika att vidröra vässade slutet. Detta kommer att minska risken för kontaminering och bevara den fin punkten för Mikroskop. Underlåtenhet att korrekt säkra microcapillary kan leda till instabilitet eller brott på glas glödtråden under mikroskop.
  • Öppna glas microcapillary spets. Under beredningen av drog glas microcapillary, kommer spetsen på punkten sannolikt smälta på en sådant sätt försegla den spetsiga ändan av microcapillary. Ta bort blockeringen:
    1. Placera micromanipulator så att microcapillary är pekade nedåt skede glas dissekera tillämpningsområdet utan att röra denna yta.
    2. Hitta en steril plast yta (undersidan av kultur plattan lock fungerar perfekt) och placera den på Mikroskop scenen direkt under microcapillary nålen på scenen av dissekera tillämpningsområdet.
    3. Centrum spetsen av microcapillary under visningsområdet och säkerställa att det syns när man tittar genom okularet av Mikroskop under 1,5 X förstoring.
    4. Med hjälp av micromanipulator kontrollerna, långsamt förväg micromanipulator arm och microcapillary mot sterila plast kultur locket tills spetsen knappt kontakter plastytan och spetsen på microcapillary lossnar.
      Obs: Sträva efter minsta möjliga avbrottet som möjliggör vätskeflöde från glas glödtråden för att minimera skadorna på HIO under mikroskop.
    5. Tillbaka microcapillary bort från steril yta att minimera risken för oavsiktliga brott innan du fortsätter.
    6. Kontrollera microcapillary för flöde genom deprimerande glassprutan, driver mineralolja genom slangen. Om slutet av microcapillary har öppnats kommer du se en liten droppe av mineralolja ur spetsen av microcapillary efter några sekunder. Om detta inte sker, upprepa det föregående steget och testa.

    • 3. sterila Mikroskop

    Obs: När en microcapillary har upprättats, installerat, och testade, börja microinjecting HIOs. Figur 3 illustrerar en vävnad-derived HIO som framgångsrikt har injicerats med FITC-dextran.

    1. Fyll i microcapillary med injektion materialet. Doppa spetsen av glas microcapillary i FITC dextran injektion avstängning, vara noga med att undvika att bryta mot spetsen av microcapillary mot sidorna eller i botten av röret. När spetsen på microcapillary är nedsänkt i lösningen, dra tillbaka på mineralolja sprutan dra ca 10 µL av FITC dextran suspensionen i microcapillary.
      Obs: Det rekommenderas att använda 1,5 eller 0,5 mL tuber för injektion lösningar/kulturer eftersom dessa kommer att vara den mest lättillgängliga för de installerade microcapillary. Alternativt injektion lösningar kan dras från en steril petriskål eller steril parafilm, vilket kan minska risken för sharps skada genom att begränsa behovet av att hålla en tub i nära närhet till microcapillary. Om suspensionen är mycket trögflytande eller om öppnandet av microcapillary är exceptionellt små, kan det ta flera sekunder för att fylla microcapillary. Dra inte Mikroskop suspensioner i plast Mikroskop slangen som detta kan förorena hela Mikroskop systemet.
    2. Sluta fylla microcapillary när Mikroskop suspensionen fyller 90% av längden på glas microcapillary. Tryck ner sprutan något innan du drar microcapillary från Mikroskop lösningen att se till att spetsen på microcapillary inte innehåller luftfickor.
      Obs: Om prövningen av microcapillary visar luftfickor, Töm och åter fylla.
    3. Ta bort de HIO kultur skylt(ar) från cell kultur inkubator och överföring till biosäkerhet skåp med microinjector.
    4. Ta bort locket från HIO kultur plattan inom biosäkerhet skåp och centrera den första brunnen på Mikroskop scenen så att det syns tydligt genom okularet räckvidd vid den lägsta förstoring inställningen.
    5. Vrid micromanipulator armen så att microcapillary är pekade nedåt in i HIO kulturen väl i vinkel > 45° i förhållande till Mikroskop scenen. Detta sker enklast genom att manuellt aktivera sin horisontella axel vid den punkt där den horisontella micromanipulator armstöd möter vertikala ställningen, eftersom fina kontrollerna (svarta rattar) har ett begränsat utbud av församlingens micromanipulator arm rörelse. Placera spetsen på microcapillary ovanför den första kulturen väl ca 1 cm ovanför ytan av media (figur 3A). En representativ bild visar Mikroskop av vävnad-derived intestinal epitelial organoids visas i figur 3B.
    6. Kontrollera att båda spets glas glödtråden och HIO(s) är synliga genom okularet. Placera om vid behov.
    7. Förskott på microcapillary långsamt genom att vrida ratten på z-axeln medsols.
      Obs: Att döma positionen för microcapillary spets, kräver särskilt djup, övning. När spetsen bryter mot ytan av media, märke en liten visuell snedvridning av den microcapillary spetsen.
    Fortsätt med omsorg från denna punkt för att undvika att bryta microcapillary mot botten av kultur plattan eller HIOs.
  • Pierce i HIO med microcapillary spets. Den yttre ytan av HIO kommer sänka något som microcapillary börjar att utöva påtryckningar och dyker i form igen som spetsen penetrerar lumen. Det kan vara svårt att identifiera spetsen av microcapillary inom HIO lumen. Justera inställningarna för belysning eller förstoring av dissekera räckvidden om det är svårt att se microcapillary.
  • Ta bort händerna från micromanipulator kontroller när microcapillary är rätt placerad med spetsen på microcapillary nära centrum av HIO.
  • Tryck mineralolja sprutan något för att driva den Mikroskop lösningen ur microcapillary och in i HIO lumen. HIO kan expandera något för att rymma volymen av injektionen.
    Obs: var noga med för att undvika alltför fylla HIO som detta kommer att orsaka organoid att brista. Som en tumregel innebär någon synlig utvidgning av HIO volymen är det dags att sluta. Den genomsnittliga volymen av mogen HIO lumen är ca 1 µL, men kan variera avsevärt. Automatiserad spruta pumpar kan användas i stället för en manuell spruta för fina kontroll av den injicerade volymen.
  • Återkalla microcapillary från de HIO som med hjälp av z-axelkontrollen och mediernas ställning ovanför ytan.
  • Flytta till nästa HIO mål med den microcapillary placerad ovanför media för att undvika oavsiktlig skada på HIOs under manövrering och injicera på ett liknande sätt (se steg 3,6-3.11).
    1. Fyll i microcapillary med hjälp av den metod som beskrivs ovan.
      Obs: Om spetsen bryter när som helst under Mikroskop, försök inte att fortsätta injektioner. Byter spets enligt instruktionerna nedan.
  • Ändra microcapillary mellan behandlingar eller i händelse av brott. Lossa klämman på slutet av micromanipulator armen och ta bort microcapillary från innehavaren mikropipett.
    Varning: Kan inte hantera microcapillary nära den vassa änden. Fina i microcapillary är mycket vass och kommer lätt punktera handskar och hud. Var försiktig och tänk över alla förflyttningar, hantera den microcapillary som använder manipulatorn endast och aldrig placera händer mellan peka av microcapillary och HIO kulturer. Sök medicinsk behandling omedelbart i händelse av ett nålstick från en microcapillary som innehåller smittämnen eller toxiner.
    Obs: I vissa fall kan det vara svårt att bekräfta visuellt framgångsrika HIO Mikroskop. Synbarheten av tydliga Mikroskop suspensioner kan förbättras genom användning av tillägg av högre koncentrationer av FITC-dextran.

    • 4. farmakologisk behandling av HIOs

    1. För att testa föreningar levereras till apikala epitel, Återsuspendera i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning innehållande 2 mg/mL FITC-dextran och microinject i HIO lumen som anges ovan (avsnitt 3). För representativa experimentet, Återsuspendera Clostridium difficile toxin TcdA på 12,8 ng/µL i PBS med FITC-dextran.
    2. För att testa föreningar levereras till basolateral facket, ersätta de externa kultur media med nya medier som innehåller 2 mM etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic acid (EGTA)(positive control), PBS fordonet ensam (negativ kontroll ), eller andra experimentella förening efter Mikroskop av FITC-dextran.
      Obs: Dosering och tidpunkten för tillämpningen av farmakologiska ämnen, toxiner eller andra agenter kan variera beroende på experimentell frågan.

    5. live avbildning av Microinjected Organoids

    1. Börja leva imaging omedelbart följande Mikroskop. Överföra kultur plattorna till fluorescerande Mikroskop utrustat med en fuktad kammare som hålls vid 37 ° C och 21% O2 och 5% CO2 med en automatiserad levande cell imaging system. Stäng klimatkammare och starta avbildningsprocessen.
    2. Starta programvaran bild analys (t.ex. softWoRx) från skrivbordet. Klicka på ”File” och välj ”förvärva (lös 3D)” för att initialisera imaging och Mikroskop styrprogram.
    3. Inställt FITC excitation/utsläpp (475 nm excitation/523 nm utsläpp), inställd sändningseffekten på 5% och linsen till 4 X. Ställa in exponeringstiden till 0,025 ms (figur 4A).
      Obs: Exponeringstid bör varieras för att passa den fluorescerande signalen styrka. I allmänhet minskar bara FITC fluorescens signalen. Därför, för att säkerställa maximal känslighet, de inledande exponeringstiderna bör justeras så att inspelade fluorescerande signalen är precis nedanför mättnad av kameran och bildprogram.
    4. Hitta HIOs på 4 X förstoring med digital controller bifogas mikroskopet. Centrera HIO inom visning fält (figur 4A).
    5. Klicka på ”Visa” i verktygsfältet och välj ”punkt lista” att avslöja ett nytt fönster. Klicka på ”Markera punkten” att lagra den aktuella positionen för scenen i listan (figur 4A).
    6. Upprepa steg 5.4 och 5.5 tills alla HIOs ståndpunkter har registrerats. Med ett anteckningsblock eller digital post, anteckna det unika ID-nummer som tilldelats varje programmerad mikroskopi position och de bilder som tagits på den positionen. Bildfiler kommer att märkas med detta ID-nummer och det blir viktigt att associera bild ID-nummer med specifika HIOs och behandlingar när datainsamlingen har slutförts.
    7. För att installera automatiserade bildsamling, klicka på ”File” och sedan ”Experiment” i verktygsfältet. Namnet experimentet med datum eller en annan unikt namn.
    8. Ange parametrar för bildsamling genom att gå igenom var och en av flikarna alternativ som visas i figur 4B.
      1. Avmarkera ”Z snittning” under fliken ”snitt”.
      2. Under fliken ”kanaler”, ange parametrar från fönstret övre vänstra ”lösa 3D”. För att spara tid, visas den första raden automatiskt uppdateringsfilens när rutan till vänster i markerad.
      3. Under fliken ”Time-lapse”, markera rutan märkt ”Time lapse” och ange tidsintervallet mellan bilderna i raden märkt ”Time-lapse” och den totala varaktigheten av experimentet i raden märkt ”totaltid”. Programvaran kommer automatiskt beräkna antalet tidpunkter.
      4. Markera kryssrutan märkt ”besök punkt lista” under fliken ”punkter”.
    Du kan också manuellt ange specifik punkt numren ska ingå i experimentet genom att skriva i textrutan.
  • Ändra inte alternativ för standardenhet under flikarna ”paneler” eller ”åtgärder”.
  • Klicka på fliken ”kör” retur datum för experimentet i rutan märkt ”bild filnamn” och Ställ in data sparas under ”Inställningar”.
  • Klicka på den gröna pilen att köra makrot experiment. En tid förflutit räknare kommer spåra de experimentella framsteg.
  • I slutet av planerad tid kursen, exportera och spara alla bildfiler som 24-bitars RGB-TIFF-bilder (figur 4 c).
    1. I verktygsfältet, Välj Process följt av uppgift builder.
    2. I menyn aktivitet builder, lägga till filer genom att navigera till datamappen anges i 5,9. Markera alla filer som slutar med ”.dv” genom att skriva ”*.dv” i prompten. Välj alla (Ctl + A) och klicka ”Lägg till”.
    3. Klicka på + under avsnittet märkt ”uppgift”. Välj ”Exportera som...” och klicka på fliken ”Alternativ”.
    4. Ange ”exportera Format” ”TIFF bilder” och markera rutan nedan för att lägga till en ”Custom Output mapp”. Detta är platsen där de TIFF-bilderna ska exporteras. Välj 24-bitars RGB under ”TIFF output type” och klicka ”klar”.
    5. Klicka på ”Skicka till kö” för att köra makrot exportera.
  • Kopiera de TIFF-bilder som exporteras i 5.11 till en extern förare eller server om du kommer att utföra efter imaging analys (avsnitt 6) på en annan dator.
    Obs: De HIO vävnad och media kan förvaras i histologi34, PCR-35), Western blot36eller andra efterföljande analys.

    • 6. efter imaging analys

    1. Kontrollera att ImageJ37 är installerad och fungerar korrekt på datorn som används för analys.
      Obs: Fiji37 är en alternativ distribution av programmet ImageJ kärna som fungerar lika bra för denna analys.
    2. Starta batch analysen genom att välja ”Process” och sedan ”Batch” och slutligen ”makro” från menyn ImageJ.
    3. Ange indata till katalogen som innehåller de TIFF-bilder som samlats in under experimentell tid. Öppna filen ”thesholdmeasure.ijm” ImageJ makro eller direkt kopiera/klistra in makrokoden i fönstret. Klicka på ”Process” för att börja bearbeta filerna.
      Obs: Minsta värde x (setThreshold(x,255);) kan ställas in till valfritt antal 0 - 255 och bör justeras för att eliminera bakgrund fluorescens. Värden < 100 rekommenderas. För att empiriskt fastställa lämplig tröskelvärdet, köra makrot imaging på en enda bild som representerar en organoid med ingen fluorescerande signal. Genomsnittliga intensiteten i denna bild kan fungera som en guide för att ställa in tröskelvärdet på lämpligt sätt. För representativa analysen presenteras nedan, sattes tröskeln till ”42”.
    4. ImageJ kommer att producera en stor tabell som innehåller området av alla pixlar inom intervallet tröskel intensitet och den medelvärde, median, minimum och maximum (limit) intensitet värde för området inom gränsvärdena för intensitet. Spara denna som en CSV- eller XLS.
    5. Förändring i intensitet över tid kan beräknas en spreadsheet39 genom att manipulera datatabellen för att utföra beräkningen nedan eller kan vara automatiserad använder ett lämpligt programmeringsspråk. Ett exempel analys script skrivet i R 40 är försedd med detta manuskript.
      Obs: För varje HIO, relativa fluorescensintensitet kan kvantifieras som Equation 1 . Eliminering tid 41 (t1/2) av FITC-dextran i HIO lumen beräknades enligt följande:
      1. Först beräkna ”area under kurvan” (AUC) från den kurva som beskriver relativa fluorescensintensiteten över tiden (t) som:
        Equation 2
      2. Sedan beräkna ”clearance” (Equation 3) som med distributionsvolymen (Vd) definieras som 1 för de normaliserade fluorescensen vid t = 0:
        Equation 4
      3. Nästa, definiera konstanten ”eliminering rate” (Equation 5) som:
        Equation 6
      4. Och slutligen, beräkna den ”eliminering tid” (t1/2) som:
        Equation 7
        Minskad ekvationen är således:
        Equation 8

    Representative Results

    HIOs var åtskilt från mänskliga pluripotenta stamceller och odlade i cellen matris lösning som tidigare beskrivits19,24. Efter 4 veckor i kultur, hade HIOs expanderat tillräckligt för att möjliggöra Mikroskop. HIOs var microinjected med 4 kDa FITC-konjugerad dextran upphängd i PBS eller PBS som innehåller Clostridium difficile toxin TcdA. C. difficile är en opportunistisk gastrointestinala patogen som uppvisar toxin-medierad epitelial toxicitet i HIOs25. Som positiv kontroll lades EGTA till HIO kultur media i en delmängd av HIOs injiceras med PBS och FITC-dextran. EGTA är en kalcium kelator som orsakar snabb avinstallation polymerisation av aktin cytoskelettet42. FITC fluorescens var övervakas i realtid på ett levande imaging Mikroskop inom en kontrollerade klimatkammare och bilder fångades i 10 minuters mellanrum.

    Post-hoc analys av imaging data visade betydande skillnader i lagring av FITC fluorescens (figur 5). HIOs injiceras med PBS kvar nästan alla av de fluorescerande signalen som är närvarande vid t = 0, men HIOs som injicerades också med TcdA av behandlade med EGTA uppvisade en betydande minskning av fluorescerande intensitet av 8 timmar efter Mikroskop (figur 5a). Imaging data kvantifierades för alla HIOs vid alla tidpunkter att generera en högupplöst datamängd som representerar den relativa förändringen i fluorescerande intensitet över tid i varje experimentella villkor (figur 5B). Skillnader i epitelial permeabilitet utvärderades genom att beräkna genomsnittlig eliminering tiden (t1/2 ) av FITC för varje behandlingsgrupp (tabell 1) och jämföra skillnader i t t1/2 mellan grupper med hjälp av Students t-test. Kontroll-behandlade HIOs behöll majoriteten av FITC fluorescerande signalen mer än 16 timmar (t1/2 = 17 ± 0.3 h). Behandling med EGTA signifikant FITC-dextran eliminering tid relativt kontrollen HIOs (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10-8). Med tidigare publicerade resultat25, Mikroskop av TcdA betydligt ökad epiteliala barriären permeabilitet i förhållande till kontroll behandling (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5,4 x 10-4). Således är både externa (EGTA) och microinjected (TcdA) föreningar kan framkalla betydande förändringar i epiteliala barriären permeabilitet i HIOs. Dessa resultat tyder på att effekterna av ett brett utbud av farmakologiska agenter, metaboliter, bakterieprodukter, cytokiner, tillväxtfaktorer och andra föreningar på epitelial barriärfunktion kan utvärderas med hjälp av denna metod.

    Behandling Halveringstid (h) SEM (h) Lägre 95% CI (h) Övre 95% CI (h) n
    Kontroll 17.11 0,3 16.45 17,78 11
    EGTA 2,58 0,19 1,78 3.38 3
    TcdA 7,56 0,63 5,93 9,18 6

    Tabell 1: genomsnittlig eliminering (t1/2) för FITC-dextran i HIOs behandlas med EGTA eller TcdA. Enheter är timmar efter Mikroskop.

    Figure 1
    Figur 1: grundläggande layouten av en microinjector och micromanipulator för HIO Mikroskop. Denna bild visar det kompletta komplementet av utrustning som används för att utföra Mikroskop av HIOs. Viktiga komponenter är märkta och beställningsinformation kan hittas i tabellen material. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 2
    Figur 2: mikropipett avdragare. Den koppar värme spole hc, övre klämma c1, botten klämman (c2), avdragare arm (pa), värme urval växla (ht) identifieras med pilarna. Rätt inställning för HEAT 1 och PULL indikeras i röd text. Infällt visar en korrekt monterade glas glödtråd redo för uppvärmning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 3
    Figur 3: representativa bilder av en vävnad-derived HIO injiceras med FITC-dextran. (A) bild visar placeringen av glas microcapillary strax före införande i HIO och Mikroskop. (B) Brightfield bild av en vävnad-härledda mänskliga intestinal organoids efter Mikroskop av FITC-dextran. Observera att fluorescens signalen är uppenbara även utan användning av ett specifikt filter set. Denna färg hjälpmedel Mikroskop precision. 3 X förstoring vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

    Figure 4
    Figur 4: Live imaging arbetsflöde. (A) skärmdump illustrera stegen för att ange parametrarna Mikroskop, hitta HIOs på bilden och spara positionen för scenen för varje HIO att avbildas. (B) pre imaging inställningar för att fånga FITC kanalen med jämna mellanrum på respektive befattning som anges i A. (C) efter imaging export av DV formatdata filer som TIFF-bilder med en TIFF-bild per HIO per tidpunkt.Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

    Figure 5
    Figur 5: representativa resultat. (A) stamceller-derived human intestinal organoids (HIO) microinjected med 2 mg/mL FITC-dextran (4 kDa) avbildas i 20 timmar. HIOs var också microinjected med PBS (kontroll) eller Clostridium difficile toxin TcdA (12,8 ng/µL) eller behandlats med 2 mM EGTA tillsätts med de externa kultur media. 4 X förstoring. (B) handlingen i genomsnittlig normaliserad FITC intensitet över tid i HIOs behandlas med PBS (kontroll), TcdA eller EGTA. Felstaplar representera S.E.M. och n = 11 HIOs (kontroll), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Discussion

    Detta protokoll fastställs en general-purpose metod för Mikroskop hPSC-derived HIOs och vävnad-derived intestinal organoids och mätning av epiteliala barriären permeabilitet i realtid. Vi har också visat vår inställning till analys och tolkning av de data som genereras med hjälp av dessa metoder. Med tanke på växande antagandet av intestinal organoids modellsystem16,20,21,28 och den långvariga intressen tarmbarriären permeabilitet som en fysiologiskt relevanta funktionella resultatet3,4,5,6, vi räknar med att andra som arbetar inom detta område kommer att kunna tillämpa och bygga vidare på dessa metoder.

    I området i närheten finns det flera steg som är avgörande för tillämpningen av denna teknik. Tillgång till högkvalitativa hPSC- eller vävnad härledda HIO vävnad bör fastställas innan omfattande experimenterande med Mikroskop. HIO Makrostrukturell kan vara heterogen, med variation i både storlek och form, även om vävnad identitet och cellulära morfologi är mycket reproducerbara när utnyttja etablerad metodik för att generera HIOs24. Sfäriska HIOs bestående av en enda halvtransparent lumen och mäter cirka 1 mm i diameter är idealiska för Mikroskop och mätning av luminala fluorescens i realtid. I vissa fall misslyckas Mikroskop, vilket leder till kollaps av HIO eller uppenbara läckage av injicerade material. Misslyckade HIOs kan tas bort från kulturen väl efter användarens gottfinnande använder en standard mikropipett. Överväga objektiv som är tillgänglig på en tänkbar plattform när du väljer HIOs för Mikroskop och imaging. I allmänhet 2-4 X objektiv är idealisk för att fånga komplett HIO fluorescerande signalen, även ett 10 X-objektiv kan användas om strömsnål linser inte är tillgänglig eller om de tillgängliga HIOs är < 1 mm i diameter. Tänkbar mjukvaran måste tillåta automatisk avskiljning av fluorescerande bilder på definierade punkter över tid.

    Flera ändringar i detta protokoll är möjligt för att passa de experimentella krav. Exempelvis resultaten av tester av barriär kan vara beroende av föreningarna i användning43 molekylär storlek och det kan vara lämpligt att testa dextran preparat med varierande molekylvikt. Brightfield avbildning kan dessutom utföras utöver fluorescens imaging som en indikator på den övergripande strukturella integriteten av vävnad25. När du utför Mikroskop levande bakterier25,28,31,32,33,44, det kan vara nödvändigt att lägga till penicillin och streptomycin eller gentamicin till HIO kultur media före eller efter Mikroskop. Utsidan av microcapillary kommer att kontamineras vid fyllning med bakteriekultur fjädring och detta kan överföras till HIO media. Växelvis, Mikroskop kan utföras på HIOs upphängd i extracellulär matrix (t.ex. Matrigel) utan media, att lägga till media efter Mikroskop är klar. Detta kan begränsa förorening till extracellulära matrix och externa ansikte av HIO. När du planerar mikrobiell tillväxt analyser, kan man behöva ta antibiotika i media efter 1-2 h för att undvika bromsa eller förhindra tillväxt av microinjected organismer.

    Slutligen är inser att inte alla forskare kommer att ha tillgång till mikroskopi utrustning lämpar sig för in vitro- imaging, det viktigt att påpeka att de procedurer som beskrivs i detta protokoll för datainsamling fluorescens kan tillämpas på bilder tagna vid fasta tidpunkter använder standard epifluorescerande mikroskopi utan automatiserad bild fånga eller miljökontroll. Exempel på detta tillvägagångssätt kan hittas i betänkandena av Leslie och Huang et al. 25, som undersökte C. difficile toxin aktivitet i hPSC-derived intestinal organoids och Karve och Pradan o.a. 44, som undersökte epiteliala barriären permeabilitet i liknande hPSC-derived intestinal organoids microinjected med levande E. coli. Manuell manövrering av bildåtergivningsutrustning kan resultera i större variation och svårigheter i normalisera fluorescerande signalen. När utför manuell avbildning av FITC-dextran injiceras HIOs är det väsentligt att upprätthålla en fast förstoring, fluorescerande excitation intensitet och exponeringstider i hela experimentet att undvika snedvridande fluorescerande intensitet mätningarna.

    Disclosures

    Författarna har ingen konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter för att avslöja.

    Acknowledgments

    Författarna vill tacka Drs. Stephanie Spohn och Basel Abuaita för många användbara diskussionerna om organoid Mikroskop. JRS stöds av Intestinal Stem Cell Consortium (U01DK103141), ett forskningssamarbete projekt finansierat av det nationella institutet för Diabetes och mag och njure sjukdomar (NIDDK) och nationella institutet för allergi och smittsamma sjukdomar (NIAID). JRS och VBY stöds av NIAID romanen, alternativ modellsystem för inlåtande sjukdomar (NAMSED) consortium (U19AI116482). DRH stöds mekanismer av mikrobiell patogenes utbildning bidraget från det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (NIAID, T32AI007528) och klinisk och translationell Science award till Michigan Institutet för klinisk och hälsa Forskning (UL1TR000433).

    Komplett datafiler och data analys-kod som används i detta manuskript finns på https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) Bioworld 405200081
    Cell matrix solution (Matrigel) Corning 354230
    Deltavision RT live cell imaging system GE Life Sciences 29065728 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
    Camera GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
    softWoRx Imaging software GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
    Biosafety cabinet Labconco Cell Logic+ http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
    1X PBS Life Technologies 10010-023
    Advanced DMEM-F12 Life Technologies 12634-010 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    B27 supplement (50X) Life Technologies 17504044 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    L-glutamine (100X) Life Technologies 25030-081 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    HEPES buffer Life Technologies 15630080 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Manipulator Narshge UM-3C
    Micromanipulator Narshge UM-1PF
    Pipette Holder Narshge UP-1 Alternate to Xenoworks pipette holder
    Magnetic stand Narshge GJ-1
    Dissecting scope Olympus SX61 Recommended scope, although other models are likely compatible
    Olympus IX71 Fluorescent microscope Olympus IX71 Included with Deltavision system
    CoolSNAP HQ2 Photometrics 29065728 Included with Deltavision system
    Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein R&D Systems 8619-GT-020
    EGF R&D Systems 236-EG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    R-spondin 1 R&D Systems 4645-RS Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Noggin R&D Systems 6057-NG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Mineral oil Sigma-Aldrich M8410
    FITC-dextran (4 kDa) Sigma-Aldrich 46944
    Micropipette puller Sutter Instruments P-30
    Nunc Lab-Tek II Chamber Slides ThermoFisher Scientific 154526PK
    Glass filaments WPI TW100F-4
    Micropipette holder Xenoworks BR-MH2 Preferred device
    Analog Tubing kit Xenoworks BR-AT
    1/16 in clear ferrule Xenoworks V001104
    1-1.2 mm O-ring Xenoworks V300450

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Standring, S., Borley, N. Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).
    2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).
    3. Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest. 84, 282-291 (2004).
    4. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
    5. Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).
    6. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target? Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).
    7. Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat. Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).
    8. Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. Intestinal permeability tests in coeliac disease. Clin Lab. 47, 143-150 (2001).
    9. Salles Teixeira, T. F., et al. Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls. Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).
    10. Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).
    11. Donato, R. P., et al. Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells. Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).
    12. Balimane, P. V., Chong, S. Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique. Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).
    13. Vidyasagar, S., MacGregor, G. Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability. Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).
    14. Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).
    15. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
    16. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
    17. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).
    18. Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids. Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).
    19. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
    20. Aurora, M., Spence, J. R. HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue. Dev Biol. 420, 230-238 (2016).
    21. Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).
    22. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
    23. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).
    24. McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).
    25. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
    26. Leslie, J. L., Young, V. B. A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions. Anaerobe. 37, 25-28 (2016).
    27. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).
    28. Hill, D. R., Spence, J. R. Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).
    29. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).
    30. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
    31. Engevik, M. A., et al. Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).
    32. Forbester, J. L., et al. Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells. Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).
    33. Engevik, M. A., et al. Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).
    34. Bancroft, J., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. , Churchill Livingstone. (2008).
    35. Kennedy, S., Oswald, N. PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
    36. Kurien, B., Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
    37. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
    38. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
    39. Winston, W. Microsoft excel data analysis and business modeling. , Pearson Education. (2016).
    40. R Core Team. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2017).
    41. Rosenbaum, S. Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , Wiley. (2016).
    42. Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).
    43. Vojdani, A. For the assessment of intestinal permeability, size matters. Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).
    44. Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli. PLoS One. 12, e0178966 (2017).

    Tags

    Utvecklingsbiologi fråga 130 human intestinal organoids Mikroskop epiteliala barriären permeabilitet enteroids 3D vävnadsodling in vitro- imaging
    Realtid mätning av epiteliala barriären permeabilitet i Human Intestinal Organoids
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., … More

    Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (130), e56960, doi:10.3791/56960 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter