Summary
本协议描述了在人体肠道 organoids 中采用荧光显微镜和活细胞显微镜进行药物治疗后 real-time 上皮屏障通透性的测量。
Abstract
通过定向分化, 通过活检或从多能干细胞产生的肠道组织的3D 培养取得了进展, 导致了成熟的肠道黏膜的体外模型。利用这些新兴的模型系统将需要适应为2D 文化系统和动物开发的工具和技术。在这里, 我们描述了一项技术, 测量上皮屏障通透性的人肠道 organoids 在 real-time。这是通过注射荧光标记的葡聚糖和成像在倒置显微镜, 装有 epifluorescent 过滤器完成。肠 organoids 屏障通透性的实时测量有助于人类肠道上皮组织中的高分辨率时间数据的生成, 虽然这种技术也可以应用于固定的 timepoint 成像方法。这项协议是很容易适应的测量上皮屏障渗透性后, 接触到药理剂, 细菌产品或毒素, 或活微生物。在稍加修改的情况下, 本协议还可以作为肠道 organoids 注射的一般入门读物, 使用者可以选择在注射后附加或替代的下游应用补充本协议。
Introduction
肠上皮形成一个有选择性的屏障, 介导的养分定向运输, H2O, 离子和废物, 同时尽量减少非特异性扩散介导的其他粒子之间的交换管腔和间充质组织或血液供应1,2。小肠上皮屏障的非特异性通透性一直被认为是健康和疾病的关键功能参数3,4,5,6, 它反映了通过细胞空间扩散小分子穿过上皮细胞。上皮屏障通透性的测量可以进行动物模型7和人类患者的8通过摄入果糖, 其中没有特定的运输在胃肠道, 并随后收集外周血中果糖浓度的测定。交替摄入的屏障功能标记, 如荧光标记碳水化合物也可用9,10。这种方法已经适应了肠道上皮细胞培养生长在 Transwell 支持11, 一种简化的方法, 允许更大的实验控制, 但也被批评为一个可怜的预测者的在体内渗透性由于缺乏分化的上皮亚型和组织结构12。使用室代表还另一种方法, 并允许测量的上皮屏障功能在整个肠道黏膜前体内13。此技术的应用通常受组织可用性和条件13,14的限制。因此, 新的方法, 平衡重复性和吞吐量与生理相关性是必要的。
最近的发展, 在体外器官分化已导致采用3D 组织培养模型系统作为一个复杂的平台, 以综述的动力学复杂性组织15,16,17 ,18,19,20,21,22,23。特别是, 人类多能干细胞 (hPSC) 衍生的人类肠道 organoids (HIOs)19,24已成为一个可重现和实验性的模型系统, 用于研究宿主-微生物相互作用和上皮屏障动力学25,26,27,28。同样, 人体组织衍生的 organoids (也称为 enteroids) 可以从一个简单的活检程序, 并可作为一个听话的系统来研究人体生理和疾病15,29,30。注射人体肠道 organoids 允许交付实验化合物25或活微生物25,31,32,33至顶端上皮化腔的表面。莱斯利和黄et al.25最近采用了这种技术来测量 HIOs 微量与荧光素异硫氰酸酯 (FITC) 标记为葡聚糖后暴露于细菌毒素的屏障渗透性。
本议定书的目的是作为一个指南的测量上皮屏障通透性 hPSC 衍生 HIOs 和组织衍生 HIOs 使用荧光显微镜。稍加修改, 它也可以作为一个一般的底漆, 注射 HIOs 与实验化合物。使用者可以在注射后附加或替代的下游应用补充本协议。
Protocol
正常, 去除人类成人肠道组织是从已故器官捐献者通过生命的礼物, 密歇根州。人类 ES 细胞系 H9 (NIH 注册 #0062) 是从 WiCell 研究所获得的。这项工作中使用的所有人体组织都是从非活体捐赠者那里获得的, 是去除的, 并得到了密歇根大学 IRB (协议号 HUM00093465 和 HUM00105750) 的批准。
1. 微量设置
- 获取材料表中列出的材料。
- 在生物安全柜中放置微、解剖范围和光源。在实验前用70% 乙醇或其他消毒剂清洗微注射装置。避免长期接触含有漂白剂的消毒剂, 这可能会腐蚀微注射设备。
注意: 一个完整的微量程序集的示例如图 1所示。 - 定位解剖范围, 使眼片可以通过在盾牌的安全柜中的进入端口使用。
- 另外, 使用具有正气流系统的干净的工作台代替具有显微镜接入点的生物安全柜。
- 根据制造商的说明, 在显微镜的右侧装配微, 并进行调整, 以便可以轻松地达到和调整控制。微应安装在铁盘上或以其他方式稳定。
注意: 左撇子用户可能希望将微放在解剖范围的左侧。 - 将微支架安装到微臂上, 并将模拟油管插入微支架。
- 用大约 5-7 毫升的无菌矿物油填充10毫升玻璃注射器。
- 使用口锁机构将10毫升的含矿物油的玻璃注射器连接到模拟油管的开口端。将玻璃注射器放在解剖范围的左侧, 与微。
- 轻轻地压低注射器, 通过油管推动矿物油。将大约10滴矿物油从微持有者的尖端冲出, 并在培养皿或类似容器中收集并丢弃。
注: 此步骤将从油管中除去所有空气, 并在每次微注射前进行。
2. 显微注射的制备
- 注射前24小时:
- 用 re-suspending FITC 葡聚糖制备 FITC 葡聚糖溶液, 在无菌 PBS 或盐水中浓度为2毫克/毫升。准备 #62 的总容量; 250 µL。
注: 可使用高或低浓度的 FITC 葡聚糖, 范围从大约 0.1-10 毫克/毫升。调整 FITC 葡聚糖的浓度以适应下游的成像应用。 - 设置化文化在4或8井玻璃室幻灯片或其他文化船适合实况显微镜, 与 4-6 HIOs 每井, 嵌入50µL 细胞基质溶液和培养 EGF, 脑袋和 R-Spondin (ENR) 生长因子媒体19 ,24。在 real-time 成像分析过程中, 注意 organoids 均匀地 (大约5毫米) 的空间, 以避免在单个显微镜场中捕获多个 HIOs。有关 HIO 文化和维护的完整指南, 请参阅 McCraken et al.24。
注: 本协议是利用干细胞衍生的 HIOs 和代表性的结果 (见下文) 证明了这种组织培养模型的使用。然而, 同样的协议很容易适应组织衍生肠上皮 organoids15,29。组织衍生 HIOs 通常小于 PSC 衍生的 HIOs 和缺乏支持的间充质侧细胞结构15,29,30。注射组织衍生 HIOs 可能需要更大程度的技术能力和经验。利用组织衍生的 HIOs 获得的上皮屏障通透性数据的程度与 hPSC 衍生的 HIOs 是未知的。 - 孵育 HIOs 在标准细胞培养孵化器在42° c 和 5% CO2在微注射之前。
- 用 re-suspending FITC 葡聚糖制备 FITC 葡聚糖溶液, 在无菌 PBS 或盐水中浓度为2毫克/毫升。准备 #62 的总容量; 250 µL。
- 注射前30分钟, 打开生物安全柜, 将玻璃防护罩提升至最佳工作高度。
- 从生物安全柜中取出所有不必要的物品。杂波增加了在密闭空间工作时溢漏或其他事故的风险。
- 用70% 乙醇或其它消毒剂喷洒和彻底清洁工作表面。用纸巾擦拭干净。
- 检查附着在微量上的玻璃注射器中的矿物油水平。如果剩余的矿物油少于3毫升, 拧开注射器, 在生物安全柜内重新填充, 小心避免引入气泡。不要填充超过7毫升。
- 打开灯照亮解剖范围。调整目镜的个人舒适性。
- 将微定位到解剖范围的右侧。使用磁性支架将微固定在铁板上。将磁立场切换到 OFF 位置, 以调整微的位置, 并通过将磁性支架设置到 ON 位置来将支架固定在铁板上。
- Microcapillary 安装
- 从制造商提供的存储容器中检索单个 1 mm 的玻璃灯丝。
- 将玻璃纤维通过微拉拔器的铜加热线圈的中心插入。
注意: 有关准备微拉出器的指南, 请参见图 2 。 - 位置的灯丝, 使铜加热线圈大约在中间的玻璃灯丝。这将确保拉拔器产生两个可用的注射针头从每个玻璃灯丝。
- 先拧紧顶夹, 确保玻璃灯丝在缺口树丛内固定, 以防止破损。
- 在拧紧底部夹具之前, 将拉拔臂延伸至其最大垂直位置。
注意: 这一步是必不可少的。没有充分延长拉拔臂将导致不规则分离的两个部分的玻璃灯丝。 - 检查加热和牵引机构的设置。
注: 铜卷将保持极热几分钟。被拉扯的玻璃灯丝将被提到作为 ' microcapillary ' 从这点向前在协议。
注: 玻璃 microcapillary 非常锋利, 非常脆。小心处理。
注: 在微注射系统上安装 microcapillary 时, 要注意避免接触锐端。这将减少污染的机会, 并保留微注射的罚款点。未正确保护 microcapillary 会导致玻璃纤维在注射过程中不稳定或破损。
- 定位微, 使 microcapillary 在解剖范围的玻璃阶段被指向, 而不触及这个表面。
- 找到一个无菌塑料表面 (文化板盖子的底部工作完美), 并把它放在显微镜阶段直接在 microcapillary 针的解剖范围的阶段。
- 将 microcapillary 的尖端放在观察区的中心, 并确保在1.5X 放大倍数下透过显微镜的目镜观察它是可见的。
- 使用微控制, 慢慢推进微臂和 microcapillary 向无菌塑料文化盖, 直到尖端几乎没有接触塑料表面和尖端的 microcapillary 打破自由。
注: 瞄准最小的可能的断裂, 允许流体从玻璃纤维的流动, 以便最小化损伤对 HIO 在注射期间。 - microcapillary 远离无菌表面, 以尽量减少意外破裂的机会, 然后再继续。
- 通过压低玻璃注射器, 通过油管推动矿物油, 检查 microcapillary 的流动。如果 microcapillary 的末端已经打开, 你会看到一小滴矿物油从 microcapillary 的尖端出现, 几秒钟后。如果不发生此情况, 请重复前面的步骤和重新。
3. 无菌显微注射
注: 一旦 microcapillary 已准备好, 安装, 并测试, 开始 microinjecting HIOs。图 3说明了已成功注射 FITC 葡聚糖的组织衍生 HIO。
- 用注射材料填充 microcapillary。将玻璃 microcapillary 的尖端浸入 FITC 葡聚糖注射液悬浮液中, 小心避免 microcapillary 的尖端与管子的两侧或底部断裂。一旦 microcapillary 的尖端被淹没在溶液中, 拉回矿物油注射器绘制约10µL 的 FITC 葡聚糖悬浮液进入 microcapillary。
注: 建议使用1.5 毫升或0.5 毫升的注射解决方案/文化管, 因为这些将是最容易访问的安装 microcapillary。或者, 注射解决方案可以从无菌的培养皿或无菌膜, 这可能减少锐受伤的机会, 限制需要保持在接近 microcapillary 的管。如果悬浮液高度粘稠, 或者 microcapillary 的开口非常小, 则可能需要几秒钟的时间来填充 microcapillary。不要在塑料微注射管中抽取微注射悬浮液, 因为这可能会污染整个注射系统。 - 停止填充 microcapillary 当微注射悬浮填料填补了90% 的长度的玻璃 microcapillary。在从微注射溶液中取出 microcapillary 之前, 先压低注射器, 以确保 microcapillary 的尖端不含空气。
注意: 如果检查的 microcapillary 显示的空气袋, 空和填写。 - 从细胞培养箱中取出 HIO 培养板, 并将其转移到微量的生物安全柜中。
- 从生物安全柜内的 HIO 培养基上取下盖子, 并将第一井放在显微镜台上, 以便在最低的放大倍数设置下通过示波器的目镜清晰地看到。
- 转动微臂, 使 microcapillary 在 HIO 的文化中有一个角度和 #62; 45 °相对于显微镜阶段。这是最容易完成的, 手动转动微臂组件在其水平轴, 在水平微臂支持满足垂直立场, 因为精细控制 (黑色表盘) 的范围有限运动.将 microcapillary 的尖端置于介质表面上方大约1厘米处 (图 3A) 之上。在图 3B中显示了一个具有代表性的图像, 演示了组织衍生的小肠上皮 organoids 的显微注射。
- 检查玻璃丝和 HIO 的尖端是否通过目镜可见。必要时重新定位。
- 通过顺时针旋转 Z 轴控制旋钮, 缓慢地推进 microcapillary。
注: 判断 microcapillary 尖端的位置, 特别是深度, 需要练习。当刀尖破坏介质表面时, 请注意 microcapillary 尖端的轻微视觉失真。
注意: 小心避免 over-filling HIO, 因为这会导致化爆裂。作为一个经验法则, HIO 体积的任何可见扩展意味着它是停止的时候了。成熟 HIO 腔的平均容积约为1µL, 但可能相差很大。自动注射器泵可用于代替手动注射器, 以便对注射量进行精细控制。
- 使用上面介绍的方法重新填充 microcapillary。
注: 如果针尖在注射过程中的任何一点断裂, 请勿尝试继续注射。根据下面的说明更改提示。
注意: 不要在尖端附近处理 microcapillary。microcapillary 的细微点非常锋利, 很容易刺穿手套和皮肤。使用谨慎, 并注意所有的动作, 处理 microcapillary 使用的机械手, 从来没有放在 microcapillary 和 HIO 文化的点之间的手。在 microcapillary 含有传染性物质或毒素的针头上立即寻求医疗治疗。
注: 在某些情况下, 它可能难以直观确认成功的 HIO 微注射。使用高浓度的 FITC 葡聚糖可提高透明微注射悬浮液的可见度。
4. HIOs 的药理治疗
- 要测试的化合物交付到顶端上皮, 重在无菌 PBS 含有2毫克/毫升 FITC-葡聚糖和 microinject 进入 HIO 腔如上所述 (第3节)。在代表性实验中, 重难辨梭菌毒素 TcdA 在 12.8 ng/µL 的 PBS 中含有 FITC 葡聚糖。
- 要测试送到侧室的化合物, 用含有2毫米乙二醇二 (β-氨基乙基醚)-n、n、n、n-乙酸酸 (EGTA) (正控制) 的新介质取代外部培养基, 仅 PBS 汽车 (负控制), 或其他实验性化合物后注射 FITC 葡聚糖。
注: 药物化合物、毒素或其他制剂的应用剂量和时间可能会因实验问题而异。
5. 微量 Organoids 的现场成像
- 在注射后立即开始实时成像。将培养皿转移到具有37° c 和 21% O2和 5% CO2的带有自动活细胞成像系统的加湿腔室的荧光显微镜。关闭环境室并启动成像过程。
- 从桌面启动图像分析软件 (例如, softWoRx)。单击 "文件" 并选择 "获取 (解决 3D)" 以初始化成像和显微镜控制软件。
- 设置励磁/发射到 FITC (475 nm excitation/523 nm 发射), 设置传输功率为 5%, 镜头到4X。将曝光时间设置为0.025 毫秒 (图 4A)。
注意: 曝光时间应变化以适应荧光信号的强度。一般而言, FITC 荧光信号只会减少。因此, 为了确保最大的灵敏度, 应调整初始曝光时间, 使记录的荧光信号刚好低于相机和成像软件的饱和点。 - 使用与显微镜相连的数字控制器, 在4X 放大倍数下找到 HIOs。将 HIO 居中显示在查看字段中 (图 4A)。
- 单击工具栏上的 "查看", 然后选择 "点列表" 以显示新窗口。单击 "标记点" 以将舞台的当前位置存储在点列表中 (图 4A)。
- 重复步骤5.4 和 5.5, 直到记录所有 HIOs 的位置。使用记事本或数字记录, 记下分配给每个程序显微镜位置的唯一 ID 号以及在该位置捕获的图像。图像文件将用这个 ID 号标记, 在数据收集完成后, 将图像 id 号与特定的 HIOs 和处理相关联是很重要的。
- 要设置自动图像收集, 请单击工具栏中的 "文件" 和 "实验"。用日期或其他唯一名称命名实验。
- 通过遍历每个选项选项卡来设置图像集合的参数, 如图 4B所示。
- 联合国检查 "Z 切片" 下的标签 "切片"。
- 在 "通道" 选项卡下, 输入左上 "解析 3D" 窗口中的参数。若要节省时间, 第一行将在选中左侧的框时自动填充。
- 在 "时间推移" 选项卡下, 检查标记为 "时间推移" 的方框, 并输入标记为 "时间失效" 的行中图像与在标记为 "总时间" 的行中的实验总时间之间的时间间隔。软件将自动计算时间点的数量。
- 在 "点" 选项卡下, 选中标有 "访问点列表" 的方框。
- 在工具栏上, 选择 "任务生成器" 后面的 "进程"。
- 在 "任务生成器" 菜单中, 通过导航到5.9 中指定的数据文件夹来添加文件。通过在提示中键入 "*. dv" 来突出显示所有以 "." 结尾的文件。选择全部 (Ctl + A), 然后单击 "添加"。
- 在标记为 "任务" 的部分下单击 +。选择 "导出为..." 并单击 "选项" 选项卡。
- 将 "导出格式" 设置为 "TIFF 图像", 然后选中下面的框添加 "自定义输出文件夹"。这是将导出 TIFF 图像的位置。在 "TIFF 输出类型" 下选择24位 RGB, 然后单击 "完成"。
- 单击 "提交到队列" 以运行导出宏。
注: HIO 组织和培养基可存储为组织学34、PCR35)、西部印迹36或其他下游分析。
6. 后成像分析
- 确保在要用于分析的计算机上安装了 ImageJ37并正常工作。
注: 斐济37是 ImageJ 核心程序的一个替代分布, 将同样适用于此分析。 - 通过从 ImageJ 菜单中选择 "过程" 然后 "批处理", 最后从 "宏" 开始进行批分析。
- 将输入设置为包含在实验时间过程中收集的 TIFF 图像的目录。打开 "thesholdmeasure ijm" ImageJ 宏文件, 或直接将宏代码复制/粘贴到窗口中。单击 "进程" 开始处理文件。
注意: 最小阈值x (setThreshold (x, 255);) 可以设置为任意数字 0-255, 并应进行调整, 以消除背景荧光。建议使用值和 #60; 100。为了根据经验确定适当的阈值, 在一个表示无荧光信号的化的单个图像上运行成像宏。此图像的平均强度可以作为适当设置阈值的指南。对于下面介绍的代表性分析, 阈值设置为 "42"。 - ImageJ 将生成一个大表, 其中包含阈值强度范围内的所有像素区域, 以及阈值强度极限范围内的平均值、中值、最小和最大 (极限) 强度值。将其保存为 CSV 或 XLS。
- 在电子表格39中, 可以通过操作数据表来执行下面的计算, 也可以使用适当的编程语言自动完成对时间强度的更改。本手稿提供了一个在 R 40中编写的示例分析脚本。
注意: 对于每个 HIO, 相对荧光强度可以量化为.
消除时间41 (t1/2) 的 FITC-葡聚糖在 HIO 腔中计算如下:- 首先, 从描述相对荧光强度 (t) 的曲线上计算 "曲线下的区域" (联合自卫队) 为:
- 然后, 将"清除" () 的速率与分布 (
Vd) 的容量一起计算为在t = 0 上的规范化荧光 1:
- 接下来, 将 "消除速率常数" () 定义为:
- 最后, 将 "消除时间" (t1/2) 计算为:
减少的等式因而是:
- 首先, 从描述相对荧光强度 (t) 的曲线上计算 "曲线下的区域" (联合自卫队) 为:
消除时间41 (t1/2) 的 FITC-葡聚糖在 HIO 腔中计算如下:
Vd) 的容量一起计算为在t = 0 上的规范化荧光 1:
Representative Results
HIOs 被区分了从人多能干细胞和培养在细胞矩阵解答前面描述了19,24。经过4周的培养, HIOs 已经扩展到足以允许微注射。HIOs 是微量与 4 kDa FITC 共轭葡聚糖悬浮在 pbs 或 pbs 含有难辨梭菌毒素 TcdA。梭菌是一种机会性胃肠病原体, 在 HIOs25中显示毒素介导的上皮毒性。作为一个积极的控制, EGTA 被添加到 HIO 培养基中的一个子集的 HIOs 注射 PBS 和 FITC 葡聚糖。EGTA 是一个钙合剂, 导致快速 de-polymerization 的肌动蛋白细胞骨架42。FITC 荧光监测实时成像显微镜在一个受控环境室和图像被抓获的10分钟间隔时间。
对成像数据的后期分析显示, FITC 荧光的保留有很大的差异 (图 5)。HIOs 注射 PBS 保留了几乎所有的荧光信号, 目前在t = 0, 但 HIOs 也注射 TcdA 治疗与 EGTA 表现出大幅下降的荧光强度8小时 post-microinjection (图5A.). 所有时间点的所有 HIOs 都量化了成像数据, 以生成一个高分辨率数据集, 表示每个实验条件下荧光强度的相对变化 (图 5B)。通过计算每个治疗组 (表 1) 中 FITC 的平均清除时间 (t1/2 ) 并比较各组之间在t1/2 之间的差异, 来评估上皮通透性的差异使用学生的t测试。控制处理 HIOs 保留了大多数 FITC 荧光信号超过16小时 (t1/2 = 17 ± 0.3 h)。与对照 HIOs (t1/2 = 2.6 ± 0.2 h 相比, EGTA 治疗可显著降低 FITC-葡聚糖的清除时间;P = 1.3 x 10-8)。与先前发布的结果25一致, 微注射 TcdA 明显增加了与对照治疗相关的上皮屏障通透性 (t1/2 = 7.6 ± 0.6 h;P = 5.4 x 10-4)。因此, 外 (EGTA) 和微量 (TcdA) 化合物都能诱发 HIOs 上皮屏障通透性的显著改变。这些结果表明, 广泛的药理作用, 代谢物, 细菌产品, 细胞因子, 生长因子, 和其他化合物的上皮屏障功能, 可以评估使用这种方法。
| 治疗 | 半生命 (h) | 扫描电镜 (h) | 下 95% CI (h) | 上 95% CI (h) | n |
| 控制 | 17.11 | 0。3 | 16.45 | 17.78 | 11 |
| egta | 2.58 | 0.19 | 1.78 | 3.38 | 3 |
| TcdA | 7.56 | 0.63 | 5.93 | 9.18 | 6 |
表 1: 平均消除时间 (t1/2) 中的 FITC 葡聚糖在 HIOs 处理 EGTA 或 TcdA。单位是小时 post-microinjection。
图 1: 用于 HIO 显微注射的微量和微的基本布局.此图显示了用于执行微注射 HIOs 的全套设备。关键组件被标记, 订购信息可以在材料表中找到。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 微拉拔器.铜加热线圈hc, 顶部钳位c1, 底部钳 (c2), 拉拔臂 (pa), 热选择开关 (ht) 由箭头标识。热1和拉的正确设置用红色文本表示。该插页显示了一个正确安装的玻璃灯丝准备加热。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 用 FITC 葡聚糖注射的组织衍生 HIO 的代表性图像(A) 图像, 演示在插入到 HIO 和微注射之前, 玻璃 microcapillary 的位置。(B) 明注射 FITC 葡聚糖后组织衍生的人肠道 organoids 的图像。注意, 即使不使用特定的过滤器集, 荧光信号也很明显。这种着色辅助显微注射精度。3X 放大倍数请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 实时图像处理工作流(A) 屏幕截图, 说明设置显微镜参数所需的步骤, 在幻灯片上查找 HIOs, 并保存每个 HIO 的舞台位置。(B) 前成像设置, 用于在 A. (C) 中指定的每个位置定期捕获 FITC 通道. 将 DV 格式数据文件的后向输出导出为 tiff 图像, 每个时间点每 HIO 一个 tiff 图像。请点击这里查看更大版本的这个数字。
图 5: 代表性结果.(A) 干细胞衍生的人肠道 organoids (HIO) 微量与2毫克/毫升 FITC 葡聚糖 (4 kDa) 成像20小时。HIOs 也微量与 PBS (控制) 或梭菌毒杆菌 TcdA (12.8 ng/µL) 或治疗2毫米 EGTA 添加到外部培养基培养基。4X 放大倍数。(B) 在使用 PBS (控制)、TcdA 或 EGTA 处理的 HIOs 中, 随着时间的推移, 平均归一化 FITC 强度的图。误差线表示 S.E.M. 和n = 11 HIOs (控制)、3 HIOs (EGTA)、6 HIOs (TcdA)。请单击此处查看此图的较大版本.
Discussion
本协议建立了 general-purpose hPSC HIOs 和组织衍生肠 organoids 的显微注射方法, 并实时测量上皮屏障的通透性。我们还展示了我们对使用这些方法生成的数据进行分析和解释的方法。考虑到肠道 organoids 模型系统的越来越多的采用16,20,21,28和对肠道屏障通透性的长期兴趣作为生理相关功能结果3,4,5,6, 我们预计在此字段中工作的其他人将能够应用和构建这些方法。
有几个步骤是关键的应用这项技术。在广泛的显微注射试验之前, 应建立高质量的 hPSC 或组织衍生的 HIO 组织。HIO 的宏观结构可能是不均匀的, 在大小和形状上的变化, 虽然组织认同和细胞形态学是高度可再生的, 当使用建立的方法生成 HIOs24。球形 HIOs 由单一的半透明腔和测量直径约1毫米是理想的显微注射和测量腔荧光在 real-time。在某些情况下, 注射会失败, 导致 HIO 或明显泄漏的注射材料的崩溃。失败的 HIOs 可以使用标准微从用户的判断中删除。当选择 HIOs 进行显微注射和成像时, 请考虑成像平台上可用的物镜。一般来说, 2 4X 物镜是理想的捕捉完整的 HIO 荧光信号, 虽然一个10X 的目标可以使用, 如果低功耗镜头是不可用或如果可用的 HIOs 是和 #60; 1 毫米直径。成像软件必须允许自动捕获的荧光图像在定义点随着时间的推移。
为了适应实验要求, 可以对该协议进行若干修改。例如, 屏障功能测试的结果可能取决于使用43的化合物的分子大小, 并且可以测试不同分子量的葡聚糖制剂。此外, 除了荧光成像外, 明成像还可以作为组织整体结构完整性的指标25进行。当进行活菌的微注射时25,28,31,3233,44, 可能需要添加青霉素和链霉素或庆大霉素对 HIO 培养基在注射之前或之后。microcapillary 的外侧会在细菌培养悬浮液中被污染, 这可能被转移到 HIO 介质。另外, 微注射可以进行 HIOs 悬浮在细胞外基质 (如, 基质) 没有介质, 添加介质后, 注射完成。这可能会限制污染的细胞外基质和外部表面的 HIO。在规划微生物生长试验时, 可能有必要在 1-2 小时后清除培养基中的抗生素, 以避免减慢或防止微量生物体的生长。
最后, 认识到并非所有的研究人员都能获得适合于体外成像的显微设备, 重要的是要指出, 本协议中概述的收集荧光数据的程序可以应用到图像在固定 timepoints 使用标准的 epifluorescent 显微镜, 没有自动图像采集或环境控制。此方法的示例可以在莱斯利和黄et al.的报告中找到25, 在 hPSC 的肠道 organoids 中检查了 C. 难辨性毒素活动, Karve 和 Pradan et al.44, 在类似 hPSC 的肠道 organoids 微量与活的大肠杆菌检查上皮屏障通透性. 人工操作成像设备可能会导致更大的变化和困难的正常化的荧光信号。在执行手动成像 FITC-葡聚糖注射 HIOs, 必须保持固定放大倍数, 荧光激发强度, 和曝光时间在整个实验, 以避免扭曲的荧光强度测量。
Disclosures
作者没有相互竞争的金融利益或其他利益冲突的披露。
Acknowledgments
作者想感谢 Drs. 斯蒂芬妮 Spohn 和巴塞尔 Abuaita 对化微注射的许多有益的讨论。JRS 由肠道干细胞财团 ( U01DK103141 ) 支持 , 这是一个由国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所 ( NIDDK ) 和国立反应和传染性疾病研究所 ( NIAID ) 资助的合作研究项目。JRS 和 VBY 支持的 NIAID 小说, 替代模型系统的肠道疾病 (NAMSED) 联合体 (U19AI116482)。DRH 被支持由国立反应和传染性疾病研究所 ( NIAID , T32AI007528 ) 的微生物病机培训补助金机制 , 以及密歇根临床与健康研究所的临床和转化科学奖研究 (UL1TR000433)。
本手稿中使用的完整数据文件和数据分析代码可在 https://github.com/hilldr/HIO_microinjection。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) | Bioworld | 405200081 | |
| Cell matrix solution (Matrigel) | Corning | 354230 | |
| Deltavision RT live cell imaging system | GE Life Sciences | 29065728 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/ |
| Camera | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
| softWoRx Imaging software | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
| Biosafety cabinet | Labconco | Cell Logic+ | http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262 |
| 1X PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Advanced DMEM-F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| B27 supplement (50X) | Life Technologies | 17504044 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| L-glutamine (100X) | Life Technologies | 25030-081 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| HEPES buffer | Life Technologies | 15630080 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Manipulator | Narshge | UM-3C | |
| Micromanipulator | Narshge | UM-1PF | |
| Pipette Holder | Narshge | UP-1 | Alternate to Xenoworks pipette holder |
| Magnetic stand | Narshge | GJ-1 | |
| Dissecting scope | Olympus | SX61 | Recommended scope, although other models are likely compatible |
| Olympus IX71 Fluorescent microscope | Olympus | IX71 | Included with Deltavision system |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | 29065728 | Included with Deltavision system |
| Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein | R&D Systems | 8619-GT-020 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| R-spondin 1 | R&D Systems | 4645-RS | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| FITC-dextran (4 kDa) | Sigma-Aldrich | 46944 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | 154526PK | |
| Glass filaments | WPI | TW100F-4 | |
| Micropipette holder | Xenoworks | BR-MH2 | Preferred device |
| Analog Tubing kit | Xenoworks | BR-AT | |
| 1/16 in clear ferrule | Xenoworks | V001104 | |
| 1-1.2 mm O-ring | Xenoworks | V300450 |
References
- Standring, S., Borley, N. Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).
- Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest. 84, 282-291 (2004).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target? Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).
- Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat. Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).
- Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. Intestinal permeability tests in coeliac disease. Clin Lab. 47, 143-150 (2001).
- Salles Teixeira, T. F., et al. Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls. Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).
- Donato, R. P., et al. Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells. Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).
- Balimane, P. V., Chong, S. Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique. Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).
- Vidyasagar, S., MacGregor, G. Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability. Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).
- Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).
- Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids. Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- Aurora, M., Spence, J. R. HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue. Dev Biol. 420, 230-238 (2016).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).
- McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
- Leslie, J. L., Young, V. B. A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions. Anaerobe. 37, 25-28 (2016).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).
- Hill, D. R., Spence, J. R. Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Engevik, M. A., et al. Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).
- Forbester, J. L., et al. Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells. Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).
- Engevik, M. A., et al. Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).
- Bancroft, J., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. , Churchill Livingstone. (2008).
- Kennedy, S., Oswald, N. PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
- Kurien, B., Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Winston, W. Microsoft excel data analysis and business modeling. , Pearson Education. (2016).
- R Core Team. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2017).
- Rosenbaum, S. Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , Wiley. (2016).
- Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).
- Vojdani, A. For the assessment of intestinal permeability, size matters. Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).
- Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli. PLoS One. 12, e0178966 (2017).
