نقدم هنا منهجية لتحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية المكونة للدم أثناء التطور الجنيني مورين. أن نجمع بين مؤشر فرز الخلايا المفردة من منطقة الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس الجنينية مع خلية غشائي ثقافة المشارك وزرع لتوصيف الخصائص المظهرية وإمكانات engraftment السلائف المكونة للدم واحد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية الجنينية المكونة للدم باستخدام مؤشر وحيد الخلية الفرز جنبا إلى جنب مع الخلية البطانية مكانة ثقافة المشارك
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد حدت القدرة على دراسة نشأة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) أثناء التطور الجنيني ندرة HSC السلائف في الجنين المبكر وعدم وجود فحوصات وظيفيا تحديد إمكانات طويلة الأجل انجرافتمينت مولتيلينيجي الفردية السلائف HSC المفترضة. هنا، يمكننا وصف المنهجية التي تمكن من عزل وتوصيف السلائف HSC المصادق عليه وظيفيا على مستوى الخلية الواحدة. أولاً، فنحن نستخدم فهرس الفرز لكتالوج المعلمة المظهرية دقيقة لكل خلية تم فرزها على حدة، باستخدام مزيج من العلامات المظهرية لإثراء للسلائف HSC مع علامات إضافية لتحليل تجريبي. ثانيا، كل خلية فرز الفهرس مثقف يشترك مع ستروما مكانة الأوعية الدموية من المنطقة (AGM) الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس، الذي يدعم النضوج غير انجرافتينج HSC السلائف إلى HSC الوظيفية مع انجرافتمينت مولتيلينيجي وطويلة الأمد المحتملة في فحوصات الزرع. هذه المنهجية يمكن ارتباط الخصائص المظهرية السلائف هيموجينيك الاستنساخ مع إمكاناتها الفنية انجرافتمينت أو خصائص أخرى مثل الشخصية النسخي، توفير وسيلة لتحليل مفصل للسلائف HSC التنمية على مستوى الخلية الواحدة.
المقدمة
وقد كشفت الدراسات الاستنساخ التباين في خصائص engraftment الطويلة الأجل هسكس الكبار، توفير نظرة ثاقبة جديدة HSC الأنواع الفرعية والتغييرات في السلوك HSC أثناء الشيخوخة1. ومع ذلك، كانت دراسات مماثلة من هسكس الجنينية وسلائفها أكثر تحديا. تنشأ أثناء التطور الجنيني المبكر، هسكس من سكان السلائف المعروفة بالبطانة هيموجينيك في عملية عابرة المشار إليها بطانية للمرحلة الانتقالية المكونة للدم2. لم يتم الكشف عن HSC الأولى، تعرف بقدرتها على توفير انجرافتمينت مولتيلينيجي قوية وطويلة الأمد بعد زرع الأعضاء إلى المستفيدين الكبار مشروطة، حتى بعد يوم الجنينية 10.5 (E10.5) في الجنين مورين، في الترددات المنخفضة جداً3 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) بمركز أبحاث فريد هاتشينسون السرطان.
1-إعداد مونولاييرس AGM-المفوضية الأوروبية للثقافة المشتركة
- 24 ساعة قبل تشريح AGM والفرز، جعل AGM-المفوضية الأوروبية ثقافة الإعلام وتصفية تعقيم.
- إضافة الجيلاتين 0.1% في الماء (100 ميليلتر في البئر) لكل بئر من صفيحة 96-جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل 15 دقيقة Aspirate الجيلاتين وترك اللوحة في غطاء زراعة الأنسجة مع غطاء إزالة حتى الآبار جافة.
-
ننأى AGM-المفوضية الأوروبية مونولاييرس ولوحة للوحات 96-جيدا.
ملاحظة: الحفاظ على الجمعية العمومية-المفوضية الأوروبية، أعدت كما هو موض....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 1A تخطيطي للتصميم التجريبي. بعد تشريح الأنسجة ف-Sp/الجمعية العمومية وتجميع وفصل في كولاجيناز، أنها هي ملطخة بالأجسام المضادة إلى هاء-كادهيرين وأبكر للفرز الفهرس. يتم إثراء HSC تمهيدي في الخلايا التي تم فرزها في أبكر VE-كادهيرين+عالية (الشكل 1B). غيرها من الأجسام المضادة مترافق fluorochrome يمكن إدراجها لتحليل أثر رجعي المعلمات المظهرية الإضافية، التي سجلت أثناء الفرز الفهرس لكل خلية. في هذه التجر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
دراسة نشأة HSC أثناء التطور الجنيني يتطلب وسائل للكشف عن HSC المحتملة في السلائف هيموجينيك حتى الآن تفتقر إلى اختصاص لتوفير إعادة تشكيل المكونة للدم مولتيلينيجي طويلة الأجل في زرع المستفيدين الكبار. في هذا البروتوكول، نقدم مقايسة الاستنساخ السلائف هيموجينيك الجنينية stromal ثقافة المشارك في مكانة الأوعية الدموية ECs من الجمعية العمومية، الذي يدعم نضوج السلائف إلى HSC، مع تحليل وظيفي اللاحقة في فحوصات الزرع. إدراج فهرس الفرز تصاريح تحليل استعادي معلمات المظهرية لتوصيف خصائص HSC قبل حسب تعريف السطح علامات المدرجة في المقاي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
نود أن نشكر بيرغر أندرو، دوزونو ستايسي ورادين ريان في فريد هتشينسون التدفق الخلوي نواة للمساعدة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية. وأيد هذا العمل منح المعاهد الوطنية للصحة نهلبي UO1 #HL100395، تبعية #HL099997 منحة التعاونية، ونيدك منحة #RC2DK114777. براندون هادلاند معتمد من قبل مؤسسة الوقوف عصير الليمون أليكس والأمل هيونداي في "مؤسسة العجلات".
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| وسائط ثقافة <قوية>AGM-EC < / قوية > | |||
| < قوية > مواد لزراعة الخلايا البطانية < / قوية > | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | استخدم لفصل الجيلاتين أحادي الطبقات AGM-EC |
| 0.1٪ في تقنيات | الخلايا الجذعية | المائية 7903 | استخدم للالتصاق بالطبقات الأحادية AGM-EC بالبلاستيك |
| ألواح زراعة الأنسجة ذات 96 بئر | Corning | 3599 | تستخدم للزراعة المشتركة للطبقات الأحادية AGM-EC المستنسخة المصنفة الفهرسة |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | استخدم للتشريح وتلوين FACS |
| زجاجات ترشيح 500 مل | Fisher Scientific | 9741202 | تستخدم لتصفية معقمة وسائط الثقافة البطانية |
| < قوية >AGM-EC (500 مل) < / قوية> | |||
| إيسكوف Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 مل |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 مل |
| بنسلين ستربتومايسين | جيبكو | 15140-122 | 5 مل |
| هيبارين | سيجما | H3149 | 50 مجم مذاب في 10 مل ل-جلوتامين |
| (200 مل) | تقنيات الخلايا الجذعية | 7100 | 5 مل |
| ميتوجين بطانة (ECGS) | ألفا إيسار | J64516 (BT-203) | أضف 10 مل من الوسائط لإذابة وإضافة |
| <مواد قوية > لفرز مؤشر AGM < / قوي > | |||
| كولاجيناز (0.25٪) | الخلايا الجذعية | 7902 | استخدم لتفكك الأنسجة الجنينية |
| حقنة 3 مل | BD Biosciences | 309657 | تستخدم لتعقيم محاليل الأجسام المضادة للتصفية ل FACS |
| 0.22 & micro; مرشح M الذي يحركه حقنة | Millipore | SLGP033RS | يستخدم لتعقيم محاليل الأجسام المضادة لأنبوب |
| 5 مل مع غطاء مصفاة | الخلية Corning | 352235 | استخدم لإزالة كتل الخلايا قبل FACS |
| DAPI (محضر كمخزون 1 مجم / مل في H2O) | يستخدم | 268298 | لاستبعاد الخلايا الميتة من فرز |
| CD16 / CD32 المضاد للفأر (كتلة FCR) | BD Biosciences | 553141 | يستخدم لمنع التلوين غير المحدد لمستقبلات Fc |
| < قوية > الأجسام المضادة لفرز مؤشر AGM < / قوي > | |||
| مضاد للفأر CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | تلطيخ |
| الفئران IgG1 كابا التحكم في النمط المماثل ، PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | التحكم في النمط المتشاوي ل CD144 PE-Cyanine7 |
| المضاد للفأر CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | تلطيخ |
| الفئران IgG2b التحكم في النمط المتنظير ، PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | التحكم في النمط النظيري ل CD201 PerCP-eFluor710 |
| المضاد للفأر CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | تلطيخ |
| الفئران IgG1 التحكم في النمط المتنظير ، PE | BD Biosciences | 553925 | التحكم في النمط المتشاوي ل CD41 PE |
| المضاد للفأر CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | تلطيخ |
| الفئران IgG2b كابا التحكم في النمط النظيري ، FITC | eBioscience | 11-4031-81 | التحكم في النمط المتشاوي ل CD45 FITC |
| < قوي > AGM الوسائط الخالية من المصل (10 مل) < / قوي > | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 مل |
| عامل الخلايا الجذعية المؤتلف للفئران (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 مل (100 مجم / مل مخزون) التركيز النهائي 100 نانوغرام / مل |
| مؤتلف FLT3 Ligand البشري (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 مل (100 مجم / مل مخزون) التركيز النهائي 100 نانوغرام / مل |
| ثثرة الدم البشري المؤتلف (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 مل (100 مجم / مل مخزون) التركيز النهائي 20 نانوغرام / مل |
| مؤتلف الفئران إنترلوكين -3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 مل (مخزون 100 مجم / مل) التركيز النهائي 20 نانوغرام / مل |
| <قوي > مواد لتلوين الخلايا المستزرعة المشتركة < / قوي > | |||
| 96 لوحة بئر ، V-bottom | Corning | 3894 | استخدم لتحليل FACS |
| <الأجسام المضادة القوية> لتحليل المستنسخة المصنفة بالمؤشر المزروعة بشكل مشترك مع الخلايا البطانية < / قوية > | |||
| مضادة للفأر CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | تلطيخ |
| الفئران IgG2b التحكم في النمط المنظور كابا ، PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | التحكم في النمط المتشاوي ل CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| مضاد للفأر CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | تلطيخ |
| الفئران IgG2b التحكم في النمط المنظوري ، PE | eBioscience | 12-4031-81 | التحكم في النمط المتنظير ل CD201 PE |
| المضاد للفأر Ly-6A / E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | تلطيخ |
| الفئران IgG2a كابا التحكم في النمط النظيري ، APC | eBioscience | 17-4321-81 | التحكم في النمط المتشابه ل Ly-6A / E |
| APC المضاد للفأر F4 / 80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | تلطيخ |
| الفئران IgG2a كابا التحكم في النمط النظيري ، FITC | eBioscience | 11-4321-41 | التحكم في النمط النظيري ل F4 / 80 FITC |
| المضاد للفأر Ly-6G / C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | تلطيخ |
| الفئران IgG2b كابا التحكم في النمط المنظوى ، FITC | BD Biosciences | 556923 | التحكم في النمط النظيري ل Ly-6G / C و CD3 FITC |
| مواد لحقن وريد الذيل للزرع< / قوي> | |||
| 1/2 مل محاقن الأنسولين مع إبر 29G 1/2 " | BD Biosciences | 309306 | استخدامها لحقن وريد الذيل للزرع |
| <الأجسام المضادة القوية> لتحليل الدم المحيطي بعد الشفاف < / القوي > | |||
| المضاد للفأر Ly-6G / C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | تلطيخ |
| الفئران IgG2b kappa التحكم في النمط النظيري ، التحكم في النمط النظيري PerCP | Biolegend | 400629 ل Ly-6G / C PerCP | |
| Anti-mouse F4 / 80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | تلطيخ |
| التحكم في النمط النظيري للفئران IgG2a ، PE | eBioscience | 12-4321-80 | التحكم في النمط المتشاوي ل F4 / 80 PE |
| المضاد للفأر CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | تلطيخ |
| مضاد للفأر CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | تلطيخ |
| الفئران IgG2a كابا التحكم في النمط النظيري ، APC | BD Biosciences | 553932 | التحكم في النمط المتشاحي ل CD19 APC |
| المضاد للفأر CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | تلطيخ |
| الفئران IgG2a التحكم في النمط النظيري كابا ، PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | التحكم في النمط المتشابه ل CD45.1 PE-Cyanine7 |
| المضاد للفأر CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | تلطيخ |
| الفئران IgG2a التحكم في النمط المتشاوي كابا ، APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | التحكم في النمط المتنظير ل CD45.2 APC-eFluor780 |
| <قوي> المعدات< / قوي> | |||
| BD FACSAria II مع برنامج DIVA | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II مع قارئ الألواح | BD Biosciences | ||
| الدم | Fisher Scientific | S17040 | لعد الخلايا |
| ماصة متعددة القنوات | فيشر Scientific | 14-559-417 | ل الاستغناء عن |
| الخلايا برنامج تحليل FACS | FlowJo / BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
المراجع
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
