Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية الجنينية المكونة للدم باستخدام مؤشر وحيد الخلية الفرز جنبا إلى جنب مع الخلية البطانية مكانة ثقافة المشارك

Published: May 8, 2018 doi: 10.3791/56973
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, University of Washington School of Medicine

Summary

نقدم هنا منهجية لتحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية المكونة للدم أثناء التطور الجنيني مورين. أن نجمع بين مؤشر فرز الخلايا المفردة من منطقة الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس الجنينية مع خلية غشائي ثقافة المشارك وزرع لتوصيف الخصائص المظهرية وإمكانات engraftment السلائف المكونة للدم واحد.

Abstract

وقد حدت القدرة على دراسة نشأة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) أثناء التطور الجنيني ندرة HSC السلائف في الجنين المبكر وعدم وجود فحوصات وظيفيا تحديد إمكانات طويلة الأجل انجرافتمينت مولتيلينيجي الفردية السلائف HSC المفترضة. هنا، يمكننا وصف المنهجية التي تمكن من عزل وتوصيف السلائف HSC المصادق عليه وظيفيا على مستوى الخلية الواحدة. أولاً، فنحن نستخدم فهرس الفرز لكتالوج المعلمة المظهرية دقيقة لكل خلية تم فرزها على حدة، باستخدام مزيج من العلامات المظهرية لإثراء للسلائف HSC مع علامات إضافية لتحليل تجريبي. ثانيا، كل خلية فرز الفهرس مثقف يشترك مع ستروما مكانة الأوعية الدموية من المنطقة (AGM) الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس، الذي يدعم النضوج غير انجرافتينج HSC السلائف إلى HSC الوظيفية مع انجرافتمينت مولتيلينيجي وطويلة الأمد المحتملة في فحوصات الزرع. هذه المنهجية يمكن ارتباط الخصائص المظهرية السلائف هيموجينيك الاستنساخ مع إمكاناتها الفنية انجرافتمينت أو خصائص أخرى مثل الشخصية النسخي، توفير وسيلة لتحليل مفصل للسلائف HSC التنمية على مستوى الخلية الواحدة.

Introduction

وقد كشفت الدراسات الاستنساخ التباين في خصائص engraftment الطويلة الأجل هسكس الكبار، توفير نظرة ثاقبة جديدة HSC الأنواع الفرعية والتغييرات في السلوك HSC أثناء الشيخوخة1. ومع ذلك، كانت دراسات مماثلة من هسكس الجنينية وسلائفها أكثر تحديا. تنشأ أثناء التطور الجنيني المبكر، هسكس من سكان السلائف المعروفة بالبطانة هيموجينيك في عملية عابرة المشار إليها بطانية للمرحلة الانتقالية المكونة للدم2. لم يتم الكشف عن HSC الأولى، تعرف بقدرتها على توفير انجرافتمينت مولتيلينيجي قوية وطويلة الأمد بعد زرع الأعضاء إلى المستفيدين الكبار مشروطة، حتى بعد يوم الجنينية 10.5 (E10.5) في الجنين مورين، في الترددات المنخفضة جداً3 . خلال تنميتها، يجب أن يخضع للسلائف إلى HSC (قبل-HSC) الناشئة عن البطانة هيموجينيك النضج قبل الحصول على خصائص HSC الكبار التي تسمح بكفاءة انجرافتمينت في زرع فحوصات4،5 , 6-التعتيم دراسة أصل HSC نادرة، العديد من فروعه المكونة للدم مع محمر، سبق اكتشاف إمكانات النقوي، واللمفاوية قبل ظهور HSC من HSC قبل7،8. وهكذا، التمييز بين ما قبل HSC من فروعه الأخرى المكونة للدم يتطلب أساليب كلونالي عزل الخلايا وتزويدهم بإشارات كافية نضج بهم إلى HSC، للكشف عن خصائصها engraftment في فحوصات الزرع.

وقد وصف عدد من النهج التي تسمح بالكشف عن ما قبل HSC بنضج السابقين فيفو أو في فيفو إلى HSC. السابقين فيفو أساليب تعتمد على ثقافة أنسجة الجنينية، مثل منطقة الجمعية العمومية، حيث يتم الكشف عن HSC الأولى في التنمية9. بناء على هذه الأساليب، البروتوكولات التي تدرج في الانفصال، الفرز، وإعادة تجميع الأنسجة AGM سمحت توصيف السكان تم فرزها تحتوي على السلائف HSC أثناء التطوير من E9.5 إلى E11.5 في الفقرة-الابهري سبلانتشنوبليورا (فس)/AGM المناطق4،،من510؛ ومع ذلك، هذه النهج غير قابلة للتحليل الفائق من السلائف على مستوى الخلية الوحيدة المطلوبة لتحليل الاستنساخ. وبالمثل، في فيفو النضوج بزرع في الفئران حديثي الولادة، حيث المكروية يفترض أن يكون أكثر مناسبة لدعم المراحل المبكرة من السلائف HSC، كما مكن دراسات للسكان تم فرزها من كيس ألمح والجمعية العمومية/ ف س (س ف هو منطقة السلائف إلى العمومية) مع خصائص HSC السابقة، ولكن هذه الأساليب أيضا تفشل في توفير منصة قوية لواحد خلية تحليل11،12.

وأظهرت دراسات من رافي وآخرون ستروما Akt تنشيط الخلية غشائي (الجماعة الأوروبية) التي يمكن أن توفر الركازة متخصصة لدعم الكبار HSC الذاتي تجديد في المختبر13،،من1415. قررنا مؤخرا أن EC تنشيط Akt المستمدة من منطقة الجمعية العمومية (AGM-الاتحاد الأوروبي) يوفر مكانة مناسبة في المختبر لنضوج السلائف هيموجينيك، معزولة في أقرب وقت E9 في التنمية، إلى HSC انجرافتينج الكبار، فضلا عن اللاحقة الذاتي تجديد ولدت HSC16. ونظرا لأن هذا النظام يستخدم ثقافة المشارك 2-الأبعاد بسيطة، أنها القابلة للتكييف وفقا لتحليل الاستنساخ من إمكانات HSC السلائف هيموجينيك فردية منعزلة.

ونحن قد أبلغت مؤخرا نهجاً للاعتداء إمكانات HSC السلائف هيموجينيك الاستنساخ عن طريق الجمع بين فهرس الفرز السلائف هيموجينيك الفردية من الأجنة موريني مع ثقافة المشارك AGM-المفوضية الأوروبية والتحليل الوظيفي اللاحقة في زرع فحوصات17. فهرس الفرز هو طريقة لتنشيط fluorescence الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) تلك السجلات (فهارس) كافة المعلمات المظهرية (أيمبعثر إلى الأمام (منتدى التعاون الأمني-أ)، الجانب مبعثر (SSC-أ)، الفلورية المعلمات) لكل خلية تم فرزها على حدة مثل هذه أن هذه يمكن الربط بين ميزات أثر رجعي للتحليل الوظيفي اللاحقة بعد الفرز. برنامج نظام مراقبة الأصول الميدانية السجلات كل المعلومات المظهرية لكل خلية والموقف/بئر لوحة 96-البئر الذي تم وضعه. هذا الأسلوب قد استخدم أناقة سابقا لتحديد عدم التجانس في HSC الكبار، وتحديد المعلمات المظهرية زيادة إثراء لمجموعة فرعية انجرافتينج طويلة الأجل من HSC، والربط بين معلمات المظهرية من HSC النسخي خصائص في الوحيدة الخلية مستوى18،19. هنا، نحن نقدم منهجية مفصلة لهذا النهج التي تمكن من تحديد المعلمات المظهرية فريدة من نوعها، ونسب الاشتراكات من قبل-HSC خلال المراحل الأولى من التنمية الجنينية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) بمركز أبحاث فريد هاتشينسون السرطان.

1-إعداد مونولاييرس AGM-المفوضية الأوروبية للثقافة المشتركة

  1. 24 ساعة قبل تشريح AGM والفرز، جعل AGM-المفوضية الأوروبية ثقافة الإعلام وتصفية تعقيم.
  2. إضافة الجيلاتين 0.1% في الماء (100 ميليلتر في البئر) لكل بئر من صفيحة 96-جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل 15 دقيقة Aspirate الجيلاتين وترك اللوحة في غطاء زراعة الأنسجة مع غطاء إزالة حتى الآبار جافة.
  3. ننأى AGM-المفوضية الأوروبية مونولاييرس ولوحة للوحات 96-جيدا.
    ملاحظة: الحفاظ على الجمعية العمومية-المفوضية الأوروبية، أعدت كما هو موضح سابقا16، في اجتماع الجمعية العمومية العادية-المفوضية الأوروبية ثقافة وسائل الإعلام. للاتساق، ينبغي تجميد حالما يتم الحصول على إعداد كافية (عادة مرور 1-3) والمستخدمة في عدد مرور محددة (عادة مرور 5-12) لإجراء تجارب عليها ثقافة المشارك خطوط الخلايا AGM-المفوضية الأوروبية. خطوط الخلايا AGM-المفوضية الأوروبية مشتقة من C57BL/6J (CD45.2) الجمعية العمومية. انظر الجدول للمواد اللازمة لجميع وسائل الإعلام التراكيب.
    1. نضح وسائل الإعلام من ثقافة AGM-المفوضية الأوروبية في قارورة2 75 سم وإضافة 5 مل برنامج تلفزيوني. نضح برنامج تلفزيوني، وإضافة حل التربسين 3 مل (انظر الجدول للمواد).
    2. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2-4 دقائق حتى يتم رفع معظم خلايا خارج اللوحة. إضافة 7 مل AGM-المفوضية الأوروبية ثقافة الإعلام وبيبيت 8-10 مرات ماصة 10 مل إعداد تعليق الخلايا المفردة، ونقل إلى أنبوب 15 مل.
    3. تدور على 300 غرام x لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية، وإعادة تعليق في 10 مل AGM-المفوضية الأوروبية ثقافة الإعلام وتقدير عدد الخلايا مع هيموسيتوميتير. تمييع الخلايا بتركيز 1 × 105 خلايا/مل في وسائط الثقافة AGM-المفوضية الأوروبية.
  4. إضافة 100 ميليلتر AGM-المفوضية الأوروبية تعليق خلية (1 × 104 خلايا) إلى كل من صفيحة 96-جيدا جيلاتينيزيد جيدا. مكان في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة استنبات الأنسجة بين عشية وضحاها للسماح للجمعية العمومية-المفوضية الأوروبية إرفاق وتشكل من أحادي الطبقة المتلاقية.
    ملاحظة: بالتساوي توزيع الخلايا اللحمية AGM-الجماعة الأوروبية حتى لا يكون هناك فرط محدودة أو خلية التثاقل لثقافة التعاون الأمثل.
  5. إعداد أحادي الطبقة AGM-المفوضية الأوروبية للثقافة المشارك في اجتماع الجمعية العمومية.
    1. في صباح اليوم التالي، إعداد وسائل الإعلام الحرة المصل الجمعية العمومية.
    2. استخدام ماصة الأقنية 12-كذلك، قم بإزالة وسائط الثقافة AGM-المفوضية الأوروبية من الجمعية العمومية-الجماعة الأوروبية وإضافة 200 ميليلتر/بئر AGM خالية من المصل وسائل الإعلام دون السيتوكينات تغسل أي الوسائط التي تحتوي على المصل المتبقية.
    3. قم بإزالة الوسائط وإضافة 200 ميليلتر/بئر AGM خالية من المصل وسائل الإعلام مع السيتوكينات. العمل بسرعة عند إزالة وإضافة وسائل الإعلام لكي لا مساومة فيه الطبقة غشائي؛ مثلاً، إزالة وإعادة إضافة صف واحد وسائل الإعلام في وقت واحد. وضع لوحات 96-جيدا في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية حتى على استعداد لفرز الخلايا الجنينية.

2-إعداد تعليق خلية واحدة من الأنسجة الجنينية مورين

  1. تشريح العمومية من ماتينجس موقوت.
    1. قم بإعداد فواصل ماتينجس لتوليد الأنسجة الجنينية للسن المطلوب.
    2. حصاد الأجنة من الإناث الحوامل في أيام 9.5 إلى 11.5 وظيفة كويتوم (dpc)، حسب المرحلة التي بلغتها قبل-HSC يتم تحليلها.
      ملاحظة: يتم حصادها الأنسجة الجنينية من الفئران C57BL/6J (CD45.2) كالموصوفة سابقا ونظموا الضبط سميط على أساس عدد16. وركزنا على تحليل للسكان من منطقة AGM الجنينية وسلفه، ف-Sp، بين E9.5 إلى E11.5، استناداً إلى التدريج سميط.
    3. تشريح العمومية من الأجنة20.
      ملاحظة: قد تم بروتوكولات مفصلة للتشريح للجمعية العمومية من الأجنة مورين نشرتها20آخرين. وبدلاً من ذلك، يمكن أيضا تحليل كيس ألمح أو أنسجة أخرى يزعم أن يكون النشاط التمهيدية-HSC بهذا الأسلوب.
  2. ننأى بتشريح الأنسجة الجنينية.
    1. جمع الأنسجة تشريح في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل برنامج تلفزيوني مع 10% FBS على الجليد. خطورة تسوية الأنسجة ونضح برنامج تلفزيوني/FBS وثم أضف 1 مل كولاجيناز 0.25% والمكان فورا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
    2. أضف 1 مل PBS/10% FBS وبيبيت حوالي 20-30 مرة مع تلميح ماصة 1 مل للحصول على تعليق خلية مفردة. إضافة مل 8 إضافية من PBS/10% FBS وخلايا أجهزة الطرد المركزي في 300 غرام x للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.

3-جسم تلطيخ الخلايا الجنينية مورين

  1. إعداد المخزن المؤقت حظر لتلطيخ جسم.
    1. إضافة 10 ميكروغرام/مل المضادة الماوس CD16/CD32 (Fc مستقبلات (FcR) كتلة) و 1 ميكروغرام/مل DAPI (1 ملغ/مل الأسهم في ح2س) إلى 1 مل برنامج تلفزيوني مع 10% FBS.
    2. رسم في حقنه 3 مل وتمر من خلال مرشح حقنه ميكرومتر 0.22 تعقيم. إعادة تعليق بيليه الخلية من الأنسجة الجنينية مورين منفصلان (من الخطوة 2.2.2) في 500 ميليلتر حجب المخزن المؤقت واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
  2. إعداد مزيج الأجسام المضادة17.
    1. إضافة كتلة FcR ميكروغرام/مل 10 إلى 1 مل برنامج تلفزيوني مع 10% FBS و 10 ميليلتر من كل الأجسام المضادة-هاء-كادهيرين مترافق fluorochrome (CD144، انظر الجدول للمواد)، والأجسام المضادة مترافق fluorochrome-أبكر (CD201، انظر الجدول للمواد). استخدام إضعاف نهائي 1: 100 من الأجسام المضادة ما لم يتبين خلاف ذلك بناء على توصيات الشركة المصنعة أو وفقا للمعايرة.
      ملاحظة: يتم استخدام هذا المزيج جسم لتعريف البوابات للفرز، كما هو موضح أدناه (الخطوة 4، 2). الفرز استناداً إلى التعبير المشترك عن VE-كادهيرين وأبكر يمكن إثراء كبير لجزء الخلايا المشتقة من الجمعية العمومية التي تحتوي على HSC السلائف النشاط، كما هو موضح سابقا17.
    2. إضافة أجسام مترافق fluorochrome إضافية لمزيد من التحليل المظهرية السلائف فرادى فرز الفهرس.
      ملاحظة: هذه الأجسام المضادة لا بالضرورة تستخدم لتعريف البوابات للفرز. في هذا البروتوكول عينة، أدرجنا PE مترافق مكافحة--CD41 جسم وجسم CD45 المضادة مترافق FITC لتحليل التعبير النسبي لهذه العلامات المكونة للدم، التي تتطور خلال ظهور HSC قبل من البطانة هيموجينيك4 5، ،،من1617. علامات أخرى من الفائدة يمكن إدراجها كالمطلوب. عينات ملطخة بضوابط جسم مترافق fluorochrome ايستب تستخدم لتعريف البوابات السلبية والإيجابية للتحليل.
    3. وضع مزيج الأجسام المضادة في حقنه 3 مل وتمر من خلال مرشح حقنه ميكرومتر 0.22 تعقيم. إضافة 500 ميليلتر من مزيج الأجسام المضادة إلى تعليق خلية في المخزن المؤقت لحظر، ماصة مزيج، واحتضان على الجليد لمالا يقل عن 15-20 دقيقة.
  3. تغسل الخلايا الملون.
    1. إضافة FBS PBS/10% 8 مل. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لبيليه 5 دقيقة، أسبيراتي، وإعادة تعليق الخلية مع 1 مل PBS/10% FBS.
    2. إزالة كتل الخلية بواسطة بيبيتينج تعليق خلية عن طريق خلية ميكرومترات 35 مصفاة cap في أنبوب 5 مل. أغسل مصفاة الخلية مع إضافية 3 مل PBS/10% FBS. الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام x لمدة 5 دقائق ونضح وإعادة تعليق في 500 ميليلتر PBS/10% FBS ووضع على الجليد حتى نظام مراقبة الأصول الميدانية.

4-فهرس الفرز السلائف هيموجينيك واحد إلى 96-الآبار مع ستروما AGM-المفوضية الأوروبية للثقافة المشتركة

  1. إعداد الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية لوضع لوحة ومحاذاة للفرز إلى لوحات 96-جيدا وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. حدد وضع خلية مفردة، وفهرس الفرز الوضع في البرنامج لإعدادات قناع الطهارة القصوى وتمكينا للحصول على فهرس معلمات لكل خلية تم فرزها.
  2. الحصول على عينة خلايا من جسم ملون عينات لتعيين غيتس للفرز.
    1. تحميل نموذج خلية الملون على الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية واكتساب الخلايا في أدنى معدل التدفق. ارسم آيات منتدى التعاون الأمني بالتعاون بين بلدان الجنوب-أ وحدد بوابة يحتوي على خلايا ذات أحجام مختلفة (الشكل 1B) (الذي يستند إلى ملاحظة أن يتم تحديد نشاط HSC قبل في الخلايا من ملفات تعريف مختلفة الحجم في الجمعية العمومية17). الرسم في الآيات منتدى التعاون الأمني-أ ث منتدى التعاون الأمني والتعاون بين بلدان الجنوب-بايات SSC-ث، وحدد غيتس لاستبعاد doublets. ثم ارسم منتدى التعاون الأمني-بايات DAPI بوابة الخلايا الحية (السلبية ل DAPI) (الشكل 1B).
    2. ارسم PECy7 (أو فلوروتشرومي ذات الصلة لوصمة عار VE-كادهيرين) مقابل بيركب (أو فلوروتشرومي ذات الصلة لوصمة عار أبكر). بوابة الخلايا التي إيجابية لهاء-كادهيرين (التي تشمل عدد سكانها مختلطة خلايا بطانية، فضلا عن فروعه المكونة للدم و HSC قبل من العمومية) والتي تحتوي على تعبير أبكر عالية (الذي يثري ل HSC قبل من ف-Sp/الجمعية العمومية17). هذا هو بوابة النهائي الذي سيتم استخدامه لفهرسة فرز الخلايا المفردة في الخطوة 4، 3 (الشكل 1B).
    3. ارسم فلوروتشروميس إضافية تستخدم لتلطيخ.
      ملاحظة: اعتماداً على يتدنى تحليلها، بوابات إضافية يمكن تعيين أساس في الكشف عن علامات أخرى لتلطيخ الخلايا. ومع ذلك، فهرس الفرز تمكن تسجيل الفلورية المعلمات من أجل كل خلية تم فرزها مثل أنه يمكن تحليل هذه المعلمات أثر رجعي. وهكذا، لا النابضة الإضافية غير الضرورية عند هذه النقطة. جميع الأجهزة نظام مراقبة الأصول الميدانية، ينبغي أن تستخدم عينات ملطخة بالأجسام المضادة الوحيدة لضبط التعويض، لحساب الفائض في انبعاث فلوروتشروميس المتداخلة، ومع ايستب مراقبة الأجسام المضادة، لتلوين الخلفية وتحديد بوابات السلبية/الإيجابية.
  3. فهرس فرز الخلايا الجمعية العمومية.
    1. ضع لوحة 96-كذلك أعد مع ستروما AGM-المفوضية الأوروبية في اجتماع الجمعية العمومية العادية خالية من المصل وسائل الإعلام مع السيتوكينات (من الخطوة 1.5.3) في كتلة لوحة آلة فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. تحميل العينة والبدء في الحصول على عينة. حدد وضع خلية مفرد الفرز الفهرس وتبدأ الخلايا سورتينجسينجلي إلى 96-الآبار الفردية. استخدام أدنى معدل التدفق لتقليل إجهاد القص في الخلايا الجنينية.
    2. تأكد من أن يتم تسجيل كافة الأحداث أثناء الفرز الفهرس. وهذا سيمكن تعداد العدد الكلي للخلايا التي تم تحليلها في بوابة الفرز النسبي إلى 96 تم فرزها للفرد رقم الفعلي-الآبار، كما سيتم فرز ليس كافة الأحداث المسجلة للآبار.
    3. مرة واحدة تم فرز الخلايا لصفيحة 96-جيدا كامل، ضع اللوحة في حاضنة استنبات الأنسجة في 37 درجة مئوية في 5% CO2. كرر لوحات إضافية المطلوبة للتجربة.
    4. ثقافة المشارك على حدة فرز الخلايا في 96-الآبار التي تحتوي على الجمعية العمومية-المفوضية الأوروبية (من الخطوة 4، 3) لمدة تصل إلى 7 أيام (5 أيام لخلايا فرز من الأجنة E11-11.5، 6 أيام من E10-10.5 الأجنة، 7 أيام من الأجنة E9-9.5). تصور المستعمرات المكونة للدم من مختلف الأحجام ومورفولوجيس مع مجهر مقلوب في 100 X التكبير (الشكل 2) بعد فترة الثقافة المشتركة.
      ملاحظة: لا تحتاج وسائل الإعلام إلى تغيير ثقافة المشارك في الفترة. فرز هيموجينيك قد دمج في البداية في طبقة AGM-المفوضية الأوروبية مع مورفولوجيا مثل المفوضية الأوروبية السلائف ولا يمكن أن يكون في البداية الموقر من ستروما AGM-المفوضية الأوروبية (الشكل 2A). ومع ذلك، التالية 24-48 ساعة في الثقافة المشتركة، صغيرة، تقريب الخلايا المكونة للدم، أو قد يتم الكشف عن مجموعات من الخلايا. في نهاية الثقافة المشارك (5-7 أيام)، يمكن تصور مستعمرات فردية من الخلايا المكونة للدم في مجموعة فرعية من 96-الآبار التي تلقت خلية تم فرزها مع إمكانات الاستنساخ المكونة للدم. إذا كان بصريا آبار التفتيش تحتوي على أكثر من مستعمرة منفصلة، ثم تستبعد هذه العينة من تحليل المتلقين للمعلومات لاستبعاد العينات التي قد تلقت أكثر من خلية واحدة فرز كل بئر.

5-تحليل للاستنساخ ذرية المكونة للدم بعد ثقافة المشارك

  1. حصاد الحيوانات المستنسخة من كل 96-جيدا لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
    1. قوة بيبيت فصل الخلايا المكونة للدم من طبقات غشائي باستخدام ماصة الأقنية مع 200 ميليلتر ماصة نصائح. حاول أن لا ننأى بالطبقة غشائي. إزالة 100 ميليلتر (~ 50% من أفراد العينة) لتحليل المظهرية من ذرية المكونة للدم من نظام مراقبة الأصول الميدانية.
    2. نقل إلى لوحة الخامس-أسفل 96-جيدا والطرد المركزي في ز 300 x لمدة 2 دقيقة بيليه الخلايا. قم بإزالة الوسائط التي يسددها وسائل الإعلام من اللوحة مع حركة سريعة واحدة بينما هو مقلوب اللوحة (نفض الغبار لوحة).
    3. ضع 100 ميليلتر الخلايا المتبقية في لوحة 96-جيدا الأصلي في استخدام إينكوباتورفور 37 درجة مئوية في مقايسة engraftment اللاحقة (الخطوة 6).
  2. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة المناسبة لتحليل المكونة للدم.
    1. إعادة تعليق الكريات الخلية في كل من 96-جيدا الخامس-قاع جيدا مع 50 ميليلتر من FBS PBS/2% التي تحتوي على كتلة FcR 10 ميكروغرام/مل و 1 ميكروغرام/مل DAPI. احتضان لوحة عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. إضافة 50 ميليلتر من FBS PBS/2% التي تحتوي على 10 ميكروغرام/مل FcR كتلة ومزيج الأجسام المضادة لتحليل HSC المحتوية على PE-Cyanine7-مترافق مكافحة-هاء-كادهيرين، بيركب مترافق مكافحة-CD45 وأبكر المضادة مترافق PE، Sca1 المضادة مترافق APC و Gr1 المضادة مترافق FITC و مكافحة--F4/80 (كل جسم في تمييع النهائي 1: 100، ما لم يبين خلاف ذلك استناداً إلى توصيات الشركة المصنعة أو وفقا للمعايرة). احتضان لوحة عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  3. إزالة الأجسام المضادة غير منضم مع تخفيف متسلسلة وتحليل الخلايا.
    1. إضافة 200 ميليلتر/PBS/2% FBS وكذلك أجهزة الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 2 دقيقة بيليه الخلايا. ثم نفض الغبار لوحة لتجاهل المادة طافية وإضافة 200 ميليلتر PBS/2% FBS لكل خلية بيليه والطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 2 دقيقة بيليه الخلايا.
    2. فليك لوحة لتجاهل المادة طافية وإضافة 50 ميليلتر/بئر PBS/2% FBS للتحليل. الشروع في تحليل الخلايا باستخدام سيتوميتير تدفق مزودة بقارئ لوحة نظام مراقبة الأصول الميدانية.
      ملاحظة: الحصول على كمية ثابتة من الخلايا (مثلاً، 35 ميليلتر من ميليلتر 50 مجموع المستخدمة لإعادة تعليق) لتعداد مجموعات فرعية ذرية المكونة للدم.
  4. تحليل بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية لكل بئر يحتوي على ذرية المكونة للدم على الشاشة للمستعمرات التي تحتوي على HSC المحتملة (الشكل 3).
    1. بوابة أولاً السكان CD45 الإيجابية التي سلبية بالنسبة لعلامات النقوي Gr1 و F480. بوابة ليس خارج الخلايا التي لا تزال تعبر عن مستويات منخفضة من هاء-كادهيرين. خلايا من طبقة AGM-المفوضية الأوروبية التي تعطلت خلال موسم الحصاد للمستعمرات المكونة للدم هي CD45 السلبية والإيجابية VE-كادهيرين.
    2. بوابة CD45+كاد VE-/منخفضةGr1 الخلايا F4/80– –كذلك على المجموعة الفرعية التي تعبر عن مستويات عالية من أبكر و Sca1 (الشكل 3 ألف -ج).
      ملاحظة: في دراسات سابقة، المستعمرات التي تفتقر إلى الخلايا مع CD45+كاد VE-/منخفضةGr1–Sca1–F4/80مرحباأبكرمرحبا النمط الظاهري (الشكل 3D) تكاثر أخفقت في تقديم الكشف انجرافتمينت مولتيلينيجي الدم الطرفية في الفئران المشععة المستفيدة17 (البيانات لا تظهر)؛ وهكذا، تحتاج لم تدرج هذه المستعمرات في تحليل زرع اللاحقة في الخطوة 6.

6-تحليل خصائص Engraftment استنساخ الفردية والارتباط مع الخصائص المظهرية توضيحها بفهرس الفرز

  1. اليوم (إذا أمكن) أو علقت صباح اليوم عقب تحليل المظهرية في الخطوة 5، إعادة الخلايا المتبقية 100 ميليلتر من كل 96-كذلك تحتوي على مستعمرات المكونة للدم بعد ثقافة المشارك (من الخطوة 5، 1) بيبيتينج قوية باستخدام تلميح ماصة 200 ميليلتر.
  2. إعداد وإضافة الخلايا الإنقاذ من نخاع العظام كلها من سلالة كونجينيك B6. سخل-بتبركبيبكب/BoyJ (B6 CD45.1) الفئران البالغين16،17.
    1. عد الخلايا المنواه نخاع العظام في حل الأتراك تحت هيموسيتوميتير. مخفف بتركيز من 5 × 105 المنبسطة خلايا/مل في برنامج تلفزيوني مع 2% FBS.
    2. إضافة 100 ميليلتر من خلايا نخاع العظام الإنقاذ (5 × 104) لكل بئر يحتوي على ذرية المكونة للدم لتحليل الزرع ومزيج من بيبيتينج.
  3. زرع ذرية استنساخ الفردية إلى سلالة واحدة كونجينيك مستلم دكت المشع B6. سخل-بتبركبيبكب/BoyJ (B6 CD45.1) الكبار الماوس.
    1. دكت تشعيع نفس العدد من الفئران B6 CD45.1 كالعدد من الحيوانات المستنسخة لحقن فردياً ذرية نسخة واحدة (باستخدام كجي 1,000 من مصدر السيزيوم).
    2. رسم 200 تعليق خلية الإجمالي ميليلتر (وهذا يشمل الخلايا من استنساخ وكذلك خلايا نخاع العظام الإنقاذ B6 CD45.1 5 × 104 ) في محقن الأنسولين ½ مل بإبرة نصف بوصة 29 زاي.
    3. تشعيع B6 CD45.1 المستفيدين الكبار ح 2-24 قبل الحقن القاتلة.
    4. استخدام ريسترينير ماوس بلاستيكية التي تسمح بالوصول الذيل، حقن عن طريق الوريد ذيل 200 ميليلتر وحدة التخزين التي تحتوي على خلايا من كل استنساخ و 5 × 104 B6 CD45.1 خلايا نخاع العظام الكبار الإنقاذ للمساعدة في بقاء المتلقية.
    5. الإذن العلامة ووزن الفئران المستفيدة، والتحقق من صحتها الوزن على فترات منتظمة (مثلاً، 3-4 مرات/الأسبوع بعد التشعيع/زرع، أو في إجراءات التشغيل الموحدة المؤسسية الفردية) لضمان صحة جيدة.
  4. القيام بتحليل للدم المحيطي انجرافتمينت على فترات منتظمة (مثلاً، 2، 16، 24 أسبوعا) بعد زرع الأعضاء.
    1. إزالة 50-100 ميليلتر من الدم عن طريق التسييل الرجعية-المداري أو أسلوب آخر من ترك الدم المعتمدة أخلاقيا.
    2. أضف 3 مل تحلل المخزن المؤقت (16.6 ز NH4Cl، ز 2 ناكو يدتا3 و 74.4 مجم ل 2 ح2س) إلى الدم واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لأدنى 5 أسبيراتي وتعليق إعادة بيليه مع 2 مل PBS/2% FBS. الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
    3. تعليق إعادة بيليه مع 150 ميليلتر PBS/2% FBS التي تحتوي على 10 ميكروغرام/مل FcR كتلة و 1 ميكروغرام/مل DAPI، والاستغناء عن 1/3 لوحدة التخزين التي تحتوي أيضا على 50 ميليلتر ايستب ضوابط للمانحين والنسب، 1/3 لجسم 50 ميليلتر تتضمن أيضا للجهات المانحة وايستب ضوابط للنسب ، و 1/3 لبئر الذي يحتوي على 50 ميليلتر أضداد للكشف عن كل من الجهات المانحة والنسب.
      ملاحظة: الأجسام المضادة للكشف عن انجرافتمينت مولتيلينيجي: مترافق APCeFluor780 CD45.2 المضادة، Pe-Cyanine7-مترافق مكافحة--CD45.1، فيتك مترافق مكافحة-CD3 و PE مترافق مكافحة-F4/80، بيركب مترافق مكافحة-Gr1 المضادة مترافق APC-CD19، أو ضوابط ايستب ذات الصلة.
    4. تحديد الحيوانات المستنسخة مع انجرافتمينت طويلة الأجل بتقييم مساهمة الدم المحيطي من نظام مراقبة الأصول الميدانية على مر الزمن CD45.2 (المانحين)-مشتقة الخلايا المكونة للدم النقوي (إيجابية Gr1 و/أو F4/80)، ب-الخلية (CD19 الإيجابية)، وخلايا T (CD3 الإيجابية) (الشكل 4A -ب).
      ملاحظة: يمكن أيضا أن تحلل engraftment المكونة للدم قبل CD45.2 (المانحين)-المستمدة مساهمة السكان المكونة للدم من الأنسجة المقطوع من نخاع العظم والطحال والغدة الصعترية، والصفاق، أو بعد زرع خلايا نخاع العظام الثانوي في الفئران B6 CD45.1 لتحليل خصائص engraftment المسلسل17.
  5. ربط خصائص كل استنساخ المظهرية حسبما تقرره مؤشر أولى وحيد الخلية الفرز مع خصائصه انجرافتمينت. باستخدام برمجيات تحليل تدفق، تحميل المعلمات الفرز لكل خلية فرز الفهرس (يرتبط إلى 96-البئر التي تم فرزها). خريطة البيانات الفنية على قطع تدفق لتقييم الخصائص المظهرية للخلايا المفردة صلتها بالإخراج الفنية الخاصة بها (على سبيل المثال، انجرافتمينت مولتيلينيجي وطويلة الأجل) (الشكل 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1A تخطيطي للتصميم التجريبي. بعد تشريح الأنسجة ف-Sp/الجمعية العمومية وتجميع وفصل في كولاجيناز، أنها هي ملطخة بالأجسام المضادة إلى هاء-كادهيرين وأبكر للفرز الفهرس. يتم إثراء HSC تمهيدي في الخلايا التي تم فرزها في أبكر VE-كادهيرين+عالية (الشكل 1B). غيرها من الأجسام المضادة مترافق fluorochrome يمكن إدراجها لتحليل أثر رجعي المعلمات المظهرية الإضافية، التي سجلت أثناء الفرز الفهرس لكل خلية. في هذه التجربة التمثيلية من الجمعية العمومية E11، ملطخة أيضا الخلايا CD45 المضادة مترافق FITC والأجسام المضادة CD41 المضادة مترافق PE. ويلاحظ عدم التجانس داخل السكانعالية أبكر VE-كادهيرين+لهذه العلامات الخاصة المكونة للدم (الشكل 1)، تمشيا مع أسينتشروني المعروفة في التنمية المكونة للدم في هذه المرحلة5.

بعد فهرس فرز الخلاياعالية AGM واحد أبكر VE-كادهيرين+إلى 96-الآبار الفردية يحدث AGM المفوضية الأوروبية تتضمن في وسائل الإعلام خالية من المصل في الجمعية العمومية والسيتوكينات، وتشكيل مستعمرة. في البداية، إدماج أبكر VE-كادهيرين+عالية تم فرزها AGM الخلايا في طبقة AGM-المفوضية الأوروبية قبل أن تبدأ حتى الجولة وتشكيل المجموعات المكونة للدم (الشكل 2A، يظهر هنا من الخلايا التي تم فرزها من جنينا مورين المعدلة وراثيا معربا عن التجارة والنقل تحت Ly6a المروج21، لتمييزها عن ستروما AGM-الجماعة الأوروبية). بعد 5-7 أيام للثقافة المشتركة، يمكن اكتشاف مستعمرات من مختلف الأحجام ومورفولوجيس بالتفتيش مع مجهر مقلوب (الشكل 2)، يظهر هنا من تجربة ممثل، 6 أيام بعد الفرز من الجمعية العمومية E11.

يتم إجراء التحليل التالي، المظهرية بنظام مراقبة الأصول الميدانية على نصف ذرية كل خليةعالية أبكر VE-كادهيرين+التي شكلت مستعمرة المكونة للدم. تعتبر المستعمرات التي تحتوي على الخلايا مع النمط الظاهري HSC VE-كادهيرين-/منخفضةGr1–CD45 F4/80–+Sca1مرحباأبكرمرحبا (الشكل 3). وهنا نعرض شارك الثقافة أربع مستعمرات مختلفة التي تم الحصول عليها بعد فرز مؤشر أبكر E11 AGM VE-كادهيرين+ارتفاع الخلايا، ثلاثة تحتوي على نسب مختلفة من HSC المظهرية مع سائر أنواع الخلايا أكثر تمايزاً (الشكل 3 ألف –ج)، والرابع تفتقر الخلايا مع HSC النمط الظاهري (3D الشكل). عدد المستعمرات لوحظ في عدد من الخلايا مطلي والنسبة المئوية التي أدت إلى مستعمرات الخلايا الجذعية انجرافتابل تختلف حسب العمر الجنينية وإجراء الفرز. هاء-كادهيرين-/منخفضةGr1–CD45 F4/80–+Sca1مرحباأبكرمرحبا E11 AGM استنساخ ولدت المستعمرات 15 53 ± من أصل 192 الخلايا مطلي مع ± 5% 1.3% من الخلايا 192 توليد مطلي استنساخ التي انجرافتيد منذ فترة طويلة مصطلح (يعني ± التنمية المستدامة لتجارب 3).

ترتبط النمط الظاهري مع engraftment المحتملة، النصف المتبقي من الذرية لكل خليةعالية أبكر VE-كادهيرين+التي شكلت مستعمرة المكونة للدم التي تحتوي على الخلايا مع النمط الظاهري HSC الكشف عنها بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية (مثلاً، المستعمرات ممثلة في الشكل 3 ألف–ج) هو زرع المشع (1,000 كجي) كونجينيك الكبار الفئران السلالة (B6 CD45.1) جنبا إلى جنب مع جرعة من الخلايا الإنقاذ من نخاع B6 CD45.1. يؤكد انجرافتمينت مولتيلينيجي الطويلة الأجل لكل استنساخ عقب مساهمة المانحين (CD45.2) النقوي (Gr1 و F4/80)، ب-الخلية (CD19)، ومقصورة تي خلية (CD3) من الدم المحيطي على مر الزمن (الشكل 4 أ). على الرغم من أن معظم المستعمرات التي تحتوي على الخلايا مع النمط الظاهري HSC الكشف عنها بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية تقدم engraftment طويلة الأجل، زرع ضروري لتأكيد انجرافتمينت مولتيلينيجي الوظيفية كبعض الحيوانات المستنسخة تفقد انجرافتمينت على مر الزمن (الشكل 4 باء)، أو عرض خصائص engraftment فريدة مثل انجرافتمينت اللمفاوية متحيزة (البيانات لا تظهر). حالما يتم تحديد إمكانات HSC الوظيفية لكل استنساخ أبكر VE-كادهيرين+عالية ، وهذا يرتبط العودة إلى فهرس استنساخ هذا الفرز المعلمات لتحديد خصائصها المظهرية دقيقة. في هذا المثال، نرى أن أكدت وظيفيا HSC قبل استنساخ (النقاط الحمراء) غير متجانسة في التعبير عنها من CD41 و CD45، يتفق مع التعبير دينامية أنشئت هذه العلامات أثناء نضج HSC قبل أن HSC (الشكل 4). مولتيلينيجي engraftment بعد زرع الأعضاء (غير HSC هيموجينيك الحيوانات المستنسخة، والنقاط الزرقاء) أيضا غير المتجانسة ل CD41 و CD45، استنساخ تشكيل المستعمرات المكونة للدم لكن أما تفتقر إلى إمكانات HSC بفحص المظهرية أو غياب طويل الأجل، على الرغم من أن التعبير عن مجموعة فرعية مقارنة مستويات أعلى من CD41 HSC قبل النسخ، التي أساسا CD41منخفضة. غالباً ما تكون الحيوانات المستنسخة التي لا تشكل مستعمرات المكونة للدم (استنساخ غير هيموجينيك، والنقاط الخضراء الخفيفة) CD41-/منخفضةCD45-، التي يرجح أن تعكس غير هيموجينيك VE-كادهيرين+أبكر خلايا بطانيةعالية .

Figure 1
رقم 1: نظرة عامة على البروتوكول وتحليل تدفق الممثل الخلوي لفهرس الفرز من خلايا مفردة. (أ) التمثيل التخطيطي للبروتوكول. (ب) التدفق الخلوي تحليل ينتابها E11 AGM الخلايا تظهر استراتيجية النابضة لفهرس الفرز أبكر VE-كادهيرين+الخلاياعالية أثري لما قبل-HSC (تحليل مع برمجيات تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية). وتمثل الأرقام في كل بوابة عن النسبة المئوية للخلايا. (ج) تحليل الخلوي تبين CD41 و CD45 تدفق تلطيخ داخل السكانعالية أبكر VE-كادهيرين+. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تكوين المستعمرات المكونة للدم خلال ثقافة المشارك AGM-المفوضية الأوروبية- (أ) الوقت الفاصل بين التصوير أبكر VE-كادهيرين+الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ مرتبةعاليةمن Ly6a-بروتينات فلورية خضراء الأجنة المعدلة وراثيا21 مثقف شارك في اجتماع الجمعية العمومية العادية-الجماعة الأوروبية. تظهر أشرطة مقياس في ميكرومتر في اليسار أسفل كل صورة. المستعمرات الممثل (ب) شكلت من هاء-كادهيرين+أبكرارتفاع مؤشر فرز الخلايا المفردة بعد 6 أيام الثقافة شارك في الجمعية العمومية--المفوضية الأوروبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تدفق التحليل الخلوي لذرية الخلاياعالية أبكر المستمدة من الجمعية العمومية E11 VE-كادهيرين+واحد عقب ثقافة المشارك في اجتماع الجمعية العمومية العادية-الجماعة الأوروبية. النابضة للخلايا ذات إمكانات HSC تظهر كمجموعة فرعية هو هاء-كادهيرين-/منخفضةGr1–F4/80– (اللوحة اليمنى)، CD45+ (الفريق الأوسط)، و Sca1مرحباأبكرمرحبا (اللوحة اليمنى). (أ) مستعمرة تمثيلية تتكون من عدد السكان متجانسة من الخلايا بالنمط الظاهري HSC. (ب–ج) الممثل المستعمرات التي تحتوي على مزيج خلايا بالنمط الظاهري HSC وأكثر أنواع الخلايا المتمايزة. (د) مستعمرة تمثيلية تتكون من الخلايا التي تفتقر إلى النمط الظاهري HSC. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تحليل engraftment الدم المحيطي من ذرية استنساخ الفردية بعد ثقافة المشارك AGM-المفوضية الأوروبية والارتباط مع فهرس فرز المعلمات. (أ) engraftment المستمدة من المانحين CD45.2 الدم النقوي (Gr1 و F4/80)، ب-الخلية (CD19)، وخلايا T (CD3) مجموعات فرعية من مستلم ممثل (B6 CD45.1) زرع مع ذرية من فرادى E11 VE-كادهيرين+أبكرعالية استنساخ أثر الثقافة المشارك AGM-المفوضية الأوروبية. (ب) المستمدة من المانحين CD45.2 الدم انجرافتمينت على مر الزمن بعد زرع الأعضاء ذرية الفردية استنساخ أبكر E11 VE-كادهيرين+عالية بعد ثقافة المشارك AGM-المفوضية الأوروبية. الارتباط CD41 (ج) والتعبير CD45 لكل فهرس فرز أبكر VE-كادهيرين+عالية استنساخ مع إمكاناتها HSC التالية AGM-المفوضية الأوروبية المشارك ثقافة تستند إلى engraftment مولتيلينيجي وطويلة الأجل في زرع المقايسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

دراسة نشأة HSC أثناء التطور الجنيني يتطلب وسائل للكشف عن HSC المحتملة في السلائف هيموجينيك حتى الآن تفتقر إلى اختصاص لتوفير إعادة تشكيل المكونة للدم مولتيلينيجي طويلة الأجل في زرع المستفيدين الكبار. في هذا البروتوكول، نقدم مقايسة الاستنساخ السلائف هيموجينيك الجنينية stromal ثقافة المشارك في مكانة الأوعية الدموية ECs من الجمعية العمومية، الذي يدعم نضوج السلائف إلى HSC، مع تحليل وظيفي اللاحقة في فحوصات الزرع. إدراج فهرس الفرز تصاريح تحليل استعادي معلمات المظهرية لتوصيف خصائص HSC قبل حسب تعريف السطح علامات المدرجة في المقايسة. وهكذا يقدم هذا النهج ميزة على غيرها من الطرق التي تعتمد على الفرز الجزء الأكبر من السكان السلائف مع المستندة إلى aggregation إعادة HSC فحوصات4،،من510، مما يتيح كفاءة الكشف عن علامات محتملة من قبل-HSC في الوقت نفسه تقديم معلومات عن مستوى التعبير النسبي من علامات السطحية لكل خلية فردية. باستخدام هذه المنهجية، على سبيل المثال، كنا سابقا ذكرت أنه، بالإضافة إلى استخدام أبكر لإثراء للسكان قبل HSC في مراحل مختلفة من التنمية، تعريف التعبير المتوسط ليجند الشق Dll4 كذلك يتدنى للاستنساخ هاء-كادهيرين+أبكر+ السلائف مع HSC المحتملة، بينما Dll4 السلبية السلائف أبكر VE-كادهيرين++ هيموجينيك غالباً يفتقر إلى HSC المحتملة17.

وهناك ميزة أخرى لهذا الأسلوب هو القدرة على الشاشة لإمكانات HSC فورا عقب الثقافة المشتركة استناداً إلى الكشف عن ذرية المكونة للدم مع النمط الظاهري (VE-كادهيرين-/منخفضةGr1–CD45 F4/80–+Sca1 مرحباأبكرمرحبا) الذي يرتبط مع انجرافتمينت مولتيلينيجي وطويلة الأجل. هذا يلغي الحاجة إلى زرع المستعمرات التي تفتقر إلى ذرية المكونة للدم مع هذا النمط الظاهري HSC، كما لا توفر هذه المستعمرات engraftment طويلة الأجل في فحوصات الزرع. وعلاوة على ذلك، المعلومات الأولية المميزة HSC قبل محتملة من السلائف هيموجينيك تفتقر إلى إمكانات HSC فور الثقافة المشتركة، دون الحاجة إلى انتظار النتائج من فحوصات انجرافتمينت طويلة الأجل، مفيدة، على سبيل المثال، في سرعة فحص علامات المرشح HSC-السلائف. مع ذلك، يوفر الترابط بين البيانات المظهرية مع انجرافتمينت طويلة الأجل بعد زرع أفكاراً قيمة إضافية إلى اختلافات خصائص engraftment الدقيقة لاستنساخ HSC قبل. وجدنا، على سبيل المثال، أن الاستنساخ قبل HSC من منطقة ف-Sp/الجمعية العمومية بين E9.5 و E11.5 كامنة فريدة تثير B1a و B2-الخلايا الليمفاوية، بينما إمكانيات B1a-اللمفاويات قاصرة عن الكبار HSC17. وعلاوة على ذلك، نحن الكشف عن تطور في خصائص engraftment HSC قبل استنساخ بين E9.5 و E11.5 مع سابق HSC السابقة مما يدل انحراف نسبي تجاه B1a البريتوني الآيات B2-اللمفاويات انجرافتمينت وأقل إمكانية التجديد الذاتي قوية على أساس في زرع الثانوي فحوصات17.

في حين أن هذا البروتوكول يوفر نهجاً قيماً لتوضيح خصائص فريدة من الاستنساخ HSC السلائف، هناك بعض القيود التي يجب الاعتراف. على الرغم من أن الكشف عن ذرية مع HSC المظهرية بنظام مراقبة الأصول الميدانية عقب ثقافة المشارك AGM-المفوضية الأوروبية يرتبط عموما إلى engraftment مولتيلينيجي طويلة الأجل، تقديم بعض المستعمرات مع هذا النمط الظاهري فقط engraftment قصيرة الأجل أو انجرافتمينت تعاني من نقص في واحد أو أكثر الأنساب المكونة للدم (الشكل 4 باء؛ والبيانات لا تظهر). وهكذا، يبقى زرع معيار الذهب في التحقق من صحة HSC الوظيفية. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يمكن استبعاد أن بعض الاختلافات في خصائص انجرافتمينت من قبل-HSC استنساخ، بدلاً من التي تعكس الاختلافات الجوهرية الخلية في هيموجينيك السلائف المحتملة، قد تنشأ نتيجة التقلبات العشوائية خلال ثقافة المشارك AGM-الجماعة الأوروبية في نفس الوقت في الآيات الذاتي تجديد المقررات التمايز، حسب HSC قبل النضج إلى HSC وتشهد انقسامات الخلية. والواقع أن هذا قد جزئيا حساب التباين الملحوظ مورفولوجيا مستعمرة والنمط الظاهري للخلايا التي تم إنشاؤها من الحيوانات المستنسخة HSC قبل الفردية (مثلاً، الشكل 3 ألف–ج)، وقد يؤدي التقليل من قبل-HSC يتم الكشف عن هذا التحليل لم يكن استنساخ HSC قبل كل شيء المحتملة قبل جيل HSC الوظيفية بعد ثقافة المشارك AGM-المفوضية الأوروبية. ومع ذلك، القدرة على التمييز بين استنساخ هيموجينيك متميزة وظيفيا بالتعبير عنها التفاضلية من العلامات المظهرية الفريدة (مثل Dll417) ممكنة بهذا الأسلوب يوفر وسيلة لتحديد الفئات السكانية الفرعية السلائف هيموجينيك مع الاختلافات الخلية الجوهرية الكامنة.

وبناء على هذا البروتوكول الأساسي، عدد من التطبيقات الموسعة يمكن تضمين إلى مزيد من الدراسة إمكانية المكونة للدم من السلائف هيموجينيك الاستنساخ أثناء التطوير. بعد استخدام الأجسام المضادة للكشف عن علامات السطحية، التعبير عن علامات fluorescence في الأجنة المعدلة وراثيا (مثلاً.، Ly6aالتجارة والنقل-21 أو بروتينات فلورية خضراء Runx1-22 المعرب عنها في هيموجينيك البطانة/قبل-HSC) يمكن أن تكون إدراج فهرس الفرز السلائف هيموجينيك. بالإضافة إلى فحوصات الزرع بعد ثقافة المشارك AGM-المفوضية الأوروبية للكشف عن HSC قبل المفترضة، يمكن أيضا تقييم ذرية لإمكانات النسب المكونة للدم استناداً إلى الثانوية في المختبر فحوصات، مثل الثقافة في OP9 أو OP9-Dl1 للكشف عن الخلية ب ور المحتملة23، أو مستعمرة كلونوجينيك تشكل معبراً في ميثيلسيلولوسي للكشف عن إمكانات اريثرومييلويد. في الواقع، بعض من استنساخ هيموجينيك غير HSC (مثلاً، الشكل 3D) يرجح أن تمثل multipotent موروث، موروث اريثرومييلويد، أو المتكفل خلية تي وب الموصوفة سابقا التي تسبق وتكون مستقلة عن التنمية HSC 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28، وهذا التحليل يمكن زيادة تسهيل الدراسات الاستنساخ هذه الموجات متميزة للسلائف المكونة للدم. وأخيراً، يمكن الجمع بين فهرس الفرز من قبل-HSC مع غيرها من التحليلات المصب مثل خلية مفردة الجيش الملكي النيبالي-التسلسل، للربط بين الخصائص المظهرية مع التشكيلات النسخي العالمية النامية HSC السلائف. بالإجمال، هذا البروتوكول يوفر طريقة لتحليل قوية هيماتوبويسيس الاستنساخ من السلائف هيموجينيك الجنينية التي ينبغي أن توفر رؤى جديدة في التنمية HSC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نود أن نشكر بيرغر أندرو، دوزونو ستايسي ورادين ريان في فريد هتشينسون التدفق الخلوي نواة للمساعدة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية. وأيد هذا العمل منح المعاهد الوطنية للصحة نهلبي UO1 #HL100395، تبعية #HL099997 منحة التعاونية، ونيدك منحة #RC2DK114777. براندون هادلاند معتمد من قبل مؤسسة الوقوف عصير الليمون أليكس والأمل هيونداي في "مؤسسة العجلات".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGM-EC culture media
Materials for culture of endothelial cells
TrypLE Express Gibco 12605-028 Use to dissociate AGM-EC monolayers
Gelatin 0.1% in water StemCell Technologies 7903 Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic
96-well tissue culture plates Corning 3599 Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-144 Use for dissection and FACS staining
500 ml filter bottles Fisher Scientific 9741202 Use to sterile filter Endothelial media
AGM-EC culture media (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 12440-053 400 mls
Hyclone Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH30088.03 100 mls
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 5 mls
Heparin Sigma H3149 50 mg dissolved in 10 mls media
L-glutamine (200 mM) StemCell Technologies 7100 5 mls
Endothelial Mitogen (ECGS) Alfa Aesar J64516 (BT-203) Add 10 mls media to dissolve and add
Materials for AGM index sort
Collagenase (0.25%) StemCell Technologies 7902 Use for dissociation of embryonic tissues
3ml syringe BD Biosciences 309657 Use to sterile filter antibody solutions for FACS
0.22 µM syringe-driven filter Millipore SLGP033RS Use to sterile filter antibody solutions for FACS
5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap Corning 352235 Use to remove cell clumps prior to FACS
DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) Millipore 268298 Use to exclude dead cells from sort
anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) BD Biosciences 553141 Use to block non-specific staining to Fc receptors
Antibodies for AGM index sort
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 eBioscience 25-1441-82 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4301-81 Isotype control for CD144 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 eBioscience 46-2012-80 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 eBioscience 46-4031-80 Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710
Anti-mouse CD41 PE BD Biosciences 558040 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE BD Biosciences 553925 Isotype control for CD41 PE
Anti-mouse CD45 FITC eBioscience 11-0451-85 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4031-81 Isotype control for CD45 FITC
AGM-serum free media (10mls)
X-Vivo 20 Lonza 04-448Q 10 mls
recombinant murine stem cell factor (SCF) Peprotech 250-03 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) Peprotech 300-19 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
recombinant murine interleukin-3 (IL3) Peprotech 213-13 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
Materials for Staining co-cultured cells
96 well plate, V-bottom Corning 3894 Use for FACS analysis
Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-0451-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 eBioscience 35-4031-80 Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-mouse CD201 (EPCR) PE eBioscience 12-2012-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4031-81 Isotype control for CD201 PE
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC eBioscience 17-5981-83 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC eBioscience 17-4321-81 Isotype control for Ly-6A/E APC
Anti-mouse F4/80 FITC eBioscience 11-4801-81 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4321-41 Isotype control for F4/80 FITC
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC BD Biosciences 553127 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC BD Biosciences 556923 Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC
Materials for tail vein injection for transplant
1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles BD Biosciences 309306 Use for tail vein injection for transplantation
Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP Biolegend 108426 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP Biolegend 400629 Isotype control for Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PE eBioscience 12-4801-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4321-80 Isotype control for F4/80 PE
Anti-mouse CD3 FITC BD Biosciences 555274 Staining
Anti-mouse CD19 APC BD Biosciences 550992 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC BD Biosciences 553932 Isotype control for CD19 APC
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 eBioscience 25-0453-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4321-81 Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 eBioscience 47-0454-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 eBioscience 47-4321-80 Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II with DIVA software BD Biosciences
BD FACSCanto II with plate reader BD Biosciences
Haemocytometer Fisher Scientific S17040 For counting cells
Multi-channel pipette Fisher Scientific 14-559-417 For dispensing cells
FACS analysis software FlowJo/BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
  2. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  3. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
  4. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  5. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
  6. Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
  7. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  8. Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
  9. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  10. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  11. Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
  12. Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
  13. Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
  14. Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
  15. Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
  16. Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
  17. Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
  18. Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  19. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
  20. Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
  22. Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
  23. Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
  24. Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
  25. Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
  26. Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
  27. Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
  28. Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).

Tags

علم الأحياء التنموي، 135 قضية، الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC)، HSC قبل، الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس المنطقة (AGM)، هيماتوبويسيس الجنينية، وفهرس الفرز، خلية مفردة، تحليل الاستنساخ، زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم
تحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية الجنينية المكونة للدم باستخدام مؤشر وحيد الخلية الفرز جنبا إلى جنب مع الخلية البطانية مكانة ثقافة المشارك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hadland, B. K., Varnum-Finney, B.,… More

Hadland, B. K., Varnum-Finney, B., Nourigat-Mckay, C., Flowers, D., Bernstein, I. D. Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture. J. Vis. Exp. (135), e56973, doi:10.3791/56973 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter