Summary
Här presenterar vi metod för klonal analys av hematopoetiska stamceller prekursorer under murina embryonal utveckling. Vi kombinerar index sortering av enstaka celler från regionen embryonala aorta-gonad-mesonephros med endotelceller samtidig kultur och transplantation att karakterisera de fenotypiska egenskaper och engraftment potential av enda hematopoetisk prekursorer.
Abstract
Möjligheten att studera hematopoetiska stamceller (HSC) genesis under fosterutvecklingen har begränsats av sällsynthet av HSC prekursorer i det tidiga embryot och avsaknaden av analyser som funktionellt identifiera Multilinjärt engraftment långsiktig potential för enskilda förmodad HSC prekursorer. Här, beskriver vi metodik som möjliggör isolering och karakterisering av funktionellt validerade HSC prekursorer på enstaka cellnivå. Först, vi använder index sortering för att katalogisera exakt fenotypiska parametern för varje individuellt sorterade cell, med en kombination av fenotypiska markörer för att berika för HSC prekursorer med ytterligare markörer för experimentell analys. Andra, varje index-sorterade cell är samtidig odlade med vaskulär nisch stroma från regionen aorta-gonad-mesonephros (AGM), som stöder mognaden av icke-implantation HSC prekursorer till funktionella HSC med Multilinjärt, långsiktig engraftment potential i transplantation-analyser. Denna metod möjliggör korrelation av fenotypiska egenskaper av klonala hemogenic prekursorer med sin funktionella engraftment potential eller andra egenskaper såsom transkriptionell profil, att tillhandahålla ett sätt för detaljerad analys av HSC föregångare utveckling på enstaka cellnivå.
Introduction
Klonal studier visat heterogenitet i långsiktiga engraftment egenskaperna för vuxna Förenta, vilket ger nya insikter om HSC subtyper och förändringar i HSC beteende under åldrande1. Liknande studier av embryonala Förenta och deras prekursorer har dock mer utmanande. Under tidig embryonal utveckling, Förenta uppstår från en population av prekursorer som kallas hemogenic endotelet i en övergående process avses som den endothelial hematopoetiska övergång2. Den första HSC, definieras av deras förmåga att tillhandahålla robust, långsiktiga Multilinjärt engraftment efter transplantation i konditionerat vuxna mottagare, inte upptäcks förrän efter embryonala dag 10.5 (E10.5) i murina embryot, på mycket låg frekvens3 . Under deras utveckling, måste prekursorer till HSC (pre-HSC) som härrör från hemogenic endotelet genomgå mognad innan förvärva egenskaperna för vuxna HSC som möjliggör effektiv engraftment i transplantation analyser4,5 , 6. skymmer studiet av sällsynta HSC ursprung, en mängd hematopoetiska progenitorceller med erytroid, myeloisk och lymfatisk potential upptäcks redan före uppkomsten av HSC från pre-HSC7,8. Således kräver skilja pre-HSC från andra hematopoetiska progenitorceller metoder klonalt isolera cellerna och förse dem med signalerna som är tillräcklig för deras mognad till HSC, upptäcka deras engraftment boenden i transplantation analyser.
Ett antal metoder har beskrivits som gör det möjligt för detektion av pre-HSC av antingen ex vivo eller in-vivo mognad till HSC. Ex vivo metoder har berodde på kultur av embryonala vävnader, såsom årsstämman regionen, där den första HSC upptäcks i utveckling9. Bygga på dessa metoder, protokoll som inkorporerar dissociation, har sortering och förnyad aggregering av årsstämman vävnader tillåtet karakterisering av sorterade populationer som innehåller HSC prekursorer under utvecklingen från E9.5 till E11.5 i den para-aorta Splanchnopleuraen (P-Sp) / AGM regioner4,5,10; dessa metoder är dock inte mottaglig för hög genomströmning analys av prekursorer till den enda cell-nivå som krävs för klonal analys. Likaså i vivo mognad av transplantation till nyfödda möss, där mikromiljö antas vara mer lämplig för stöd av tidigare stadier av HSC prekursorer, har också möjliggjort studier av sorterade populationer från gulesäcken och AGM / P-Sp (P-Sp är regionen föregångare till årsstämman) med egenskaper av pre-HSC, men dessa metoder också misslyckas med att tillhandahålla en robust plattform för single cell analys11,12.
Studier från Rafii et al. visade att Akt-aktiverade endotelceller (EG) stroma kan ge en nisch substrat för stöd av vuxna HSC självförnyelse in vitro-13,14,15. Vi bestämde nyligen att Akt-aktiverat EG härrör från regionen AGM (AGM-EG) ger en lämpliga in vitro- nisch för mognaden av hemogenic prekursorer, isolerade så tidigt som E9 i utveckling till vuxen-implantation HSC, samt den efterföljande självförnyelse genererade HSC16. Med tanke på att detta system använder en enkel 2-dimensionella samtidig kultur, är det lätt anpassningsbar för klonal analys av individuellt isolerade hemogenic prekursorer HSC potential.
Vi har nyligen rapporterat en strategi till assay HSC potential av klonala hemogenic prekursorer genom att kombinera index sortering av enskilda hemogenic prekursorer från murina embryon med AGM-EG samtidig kultur och efterföljande funktionell analys vid transplantation analyser17. Index sortering är en läge av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) som spelar (index) alla fenotypiska parametrar (dvsframåt scatter FSC-A-side scatter (SSC-A), fluorescens parametrar) av varje individuellt sorterade cell så att dessa funktioner kan korreleras retroaktivt till efterföljande funktionell analys efter sortering. FACS programvaran registrerar både fenotypisk information för varje cell och position/väl av den plattan med 96 brunnar där den placerades. Denna teknik har tidigare elegant används för att identifiera heterogenitet i vuxen HSC, bestämma fenotypiska parametrar som ytterligare berika för långsiktig implantation delmängden av HSC, och korrelera fenotypiska parametrar för HSC med transkriptionell boenden på singeln cell nivå18,19. Här, tillhandahåller vi detaljerad metod för denna strategi som möjliggör identifiering av unika fenotypiska parametrar och härstamning bidrag av pre-HSC under tidiga stadierna av fosterutvecklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) för Fred Hutchinson Cancer Research Center.
1. beredning av AGM-EG enskiktslager för samtidig kultur
- 24 h före årsstämman dissektion och sortera, göra AGM-EG kulturmassmedia och filter sterilisera.
- Tillsätt 0,1% gelatin i vatten (100 µL per brunn) till varje brunn av en plattan med 96 brunnar och odla i rumstemperatur i 15 min. Aspirera gelatin och lämna plattan i en vävnadskultur huva med locket tas bort tills brunnarna är torra.
-
Separera de AGM-EG enskiktslager och plattan till 96 brunnar.
Obs: Upprätthålla AGM-EG, förberedda som tidigare beskrivits16, i AGM-EG kultur media. För konsekvens, bör AGM-EG cellinjer frusna så snart tillräckligt antal erhålls (allmänt passage 1-3) och används på en definierad passage nummer (allmänt passage 5-12) för samtidig kultur experiment. AGM-EG cellinjer härleds från C57BL/6J (CD45.2) stämman. Se Tabell för material för alla media kompositioner.- Sug ut media från AGM-EG kulturen i en 75 cm2 kolv och tillsätt 5 mL PBS. Aspirera PBS och Lägg till 3 mL trypsin lösning (se Tabell för material).
- Inkubera vid 37 ° C i 2-4 min tills de flesta celler lyfta från plattan. Tillsätt 7 mL AGM-EG kulturmassmedia och Pipettera 8 - 10 gånger med 10 mL pipett att förbereda enstaka celler fjädring och överföra till en 15 mL tub.
- Snurra på 300 x g i 5 min, ta bort supernatanten, återsuspendering i 10 mL AGM-EG kultur media och uppskatta antalet cell med en hemocytometer. Späd cellerna till en koncentration av 1 x 105 celler/mL i AGM-EG kultur media.
- Tillsätt 100 µL AGM-EG cellsuspension (1 x 104 celler) till varje brunn av en gelatinized plattan med 96 brunnar. Plats i en 37 ° C, 5% CO2 vävnadsodling inkubator över natten för att tillåta AGM-EG att bifoga och bilda en konfluenta enskiktslager.
Obs: Distribuera jämnt AGM-EG stromaceller så det finns begränsat överväxt eller cell klumpar för optimal samtidig kultur. -
Förbereda de AGM-EG enskiktslager för årsstämman samtidig kultur.
- Följande morgon, Förbered stämman serumfritt.
- Med hjälp av en 12-väl flerkanalspipett, ta bort AGM-EG kulturmassmedia från AGM-EG och tillsätt 200 µL per brunn av årsstämman serumfritt medium utan cytokiner att tvätta ut eventuella kvarvarande serum-innehållande media.
- Ta bort materialet och tillsätt 200 µL per brunn AGM serumfritt medier med cytokiner. Arbeta snabbt när du tar bort och lägger till media så att den endothelial lagret inte äventyras; t.ex., ta bort och lägger till media en rad i taget. Placera de 96 brunnar i en vävnadskultur inkubator vid 37 ° C tills de embryonala cellerna är redo för sortering.
2. beredning av enda cellsuspension från murina embryonala vävnader
-
Dissekera årsstämman från tidsinställda parningar.
- Ställa in tidsinställda parningar för att skapa embryonala vävnader av önskad ålder.
- Skörda embryon från dräktiga honor vid 9,5 till 11,5 dagar post intravenösa (dpc), beroende på stadium av pre-HSC ska analyseras.
Obs: Embryonala vävnader skördas från C57BL/6J (CD45.2) möss som tidigare beskrivits och exakt stegvis utifrån somite räkna16. Vi har fokuserat på analys av populationer från embryonala AGM regionen och dess föregångare, P-Sp, mellan E9.5 till E11.5, baserat på somite iscensättning. - Dissekera årsstämman från embryon20.
Obs: Detaljerade protokoll för dissektion av årsstämman från murina embryon har varit publicerade av andra20. Gulesäcken eller andra vävnader som påstods ha pre-HSC aktivitet kan alternativt också analyseras genom denna metod.
-
Separera dissekerade embryonala vävnader.
- Samla in dissekerade vävnader i en 15 mL koniska rör innehållande 10 mL PBS med 10% FBS på is. Tyngdkraften bosätta sig vävnader, aspirera PBS/FBS och sedan lägga till omedelbart 1 mL av 0,25% kollagenas och plats i ett vattenbad på 37 ° C i 25 min.
- Tillsätt 1 mL PBS/10% FBS och Pipettera ca 20 - 30 gånger med en 1 mL pipett tips till en enda cell suspension. Lägg till ytterligare 8 mL av PBS/10% FBS och centrifugera celler vid 300 x g i 5 min. Tag bort supernatanten.
3. antikropp färgning av murina embryonala celler
-
Förbereda det blockerande buffert för antikropp färgning.
- Lägga till 10 µg/mL antimus CD16/CD32 (Fc receptor (FcR) block) och 1 µg/mL DAPI (1 mg/mL lager i H2O) till 1 mL PBS med 10% FBS.
- Rita i en 3 mL spruta och passerar genom ett 0,22 µm spruta filter att sterilisera. Återsuspendering cellpelleten från dissocierade murina embryonala vävnader (från steg 2.2.2) i 500 µL blockerande buffert och inkubera på is för 5 min.
- Förbereda den antikropp mix17.
- Lägg till 10 µg/mL FcR block 1 ml PBS med 10% FBS och 10 µL av varje fluorokrom-konjugerad antikropp anti-VE-Cadherin (CD144, se Tabell av material) och fluorokrom-konjugerad anti-EPCR antikropp (CD201, se Tabell för material). Använd en slutlig spädning 1: 100 av antikroppar om inget annat anges baseras på tillverkarens rekommendationer eller enligt titreringar.
Obs: Denna antikropp kombination används för att definiera grindar för sortering, som beskrivs nedan (steg 4.2). Sortera baserat på samtidig uttrycket av VE-Cadherin och EPCR möjliggör betydande berikning för del av AGM-derived celler som innehåller HSC föregångare aktivitet, som tidigare beskrivits17. - Lägga till ytterligare fluorokrom-konjugerade antikroppar för ytterligare fenotypiska analys av enskilda index-sorterade prekursorer.
Obs: Dessa antikroppar inte nödvändigtvis används för att definiera grindar för sortering. I detta exempel protokoll, har vi inkluderat PE-konjugerad anti-CD41 antikropp och FITC-konjugerad anti-CD45 antikropp att analysera relativa uttrycket av dessa hematopoetiska markörer, som utvecklas under framväxten av pre-HSC från hemogenic endotelet4 ,5,16,17. Andra markörer för intresse kan ingå som önskat. Prover som färgas med fluorokrom-konjugerad isotypen antikropp kontroller används för att definiera negativa och positiva grindar för analys. - Utarbeta antikropp mixen i en 3 mL spruta och passerar genom ett 0,22 µm spruta filter att sterilisera. Tillsätt 500 µL av antikropp mixen att cellsuspensionen i blockerande buffert, pipett att blanda, och inkubera på is för minst 15-20 min.
- Lägg till 10 µg/mL FcR block 1 ml PBS med 10% FBS och 10 µL av varje fluorokrom-konjugerad antikropp anti-VE-Cadherin (CD144, se Tabell av material) och fluorokrom-konjugerad anti-EPCR antikropp (CD201, se Tabell för material). Använd en slutlig spädning 1: 100 av antikroppar om inget annat anges baseras på tillverkarens rekommendationer eller enligt titreringar.
-
Tvätta de färgade cellerna.
- Lägg till 8 mL PBS/10% FBS. Centrifugera cellerna vid 300 x g för 5 min, aspirera och resuspendera cellen pellet med 1 mL PBS/10% FBS.
- Ta bort cellen klumpar genom pipettering cellsuspensionen genom en 35 μm cell SIL mössa på en 5 mL tub. Tvätta cell silen med ytterligare 3 mL PBS/10% FBS. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 min, aspirera, återsuspendering i 500 µL PBS/10% FBS och placera på is tills FACS.
4. Index sortering av enstaka Hemogenic prekursorer till 96-brunnarna med AGM-EG Stroma för samtidig kultur
- Förbereda FACS maskinen för plattan läge och justera för sortering till 96 brunnar enligt tillverkarens anvisningar. Välj enstaka cell-läge och index sortering mode i programvaran för maximal renhet mask inställningar och för att möjliggöra förvärv av index parametrar för varje sorterad cell.
-
Förvärva ett urval av celler från antikroppen målat prover för att ställa in utfärda utegångsförbud för sortering.
- Ladda färgade cellen provet på FACS maskinen och förvärva celler med den lägsta flödeshastigheten. Rita FSC-A verser SSC-A och välj en grind som innehåller celler av varierande storlek (figur 1B) (som bygger på observationen att pre-HSC aktivitet identifieras i celler av olika storlek profiler i årsstämman17). Rita FSC-A verser FSC-W och SSC-A verser SSC-W och välj grindar att utesluta midjekort jacka. Sedan rita FSC-A verser DAPI till gate levande celler (negativ för DAPI) (figur 1B).
- Rita PECy7 (eller den relevanta fluorokrom för VE-Cadherin fläcken) kontra PerCP (eller den relevanta fluorokrom för EPCR fläcken). Gate celler som är positiva för VE-Cadherin (som inkluderar en blandad befolkning av endotelceller och hematopoetiska progenitorceller samt pre-HSC från årsstämman) och som har hög EPCR uttryck (som berikar för pre-HSC från P-Sp/AGM17). Detta är den sista porten som används för att indexera sortera enstaka celler i steg 4,3 (figur 1B).
- Rita ytterligare fluorokromer används för färgning.
Obs: Beroende på subpopulationen som skall analyseras, ytterligare grindar kan anges baserat på upptäckt av andra markörer som ingår för färgning celler. Men gör index sortering inspelning av fluorescerande parametrar för varje sorterad cell så att dessa parametrar kan analyseras retrospektivt. Således är ingen ytterligare gating nödvändigt vid denna punkt. För alla FACS uppställningar, bör prover som färgas med enda antikroppar användas att justera ersättning, hänsyn till spridningseffekter i utsläppet av överlappande fluorokromer och med isotypen kontroll antikroppar, att redogöra för bakgrundsfärgning och avgöra negativ/positiv grindar.
-
Index sortera AGM cellerna.
- Placera en plattan med 96 brunnar tillagade med AGM-EG stroma i AGM serum-fria medier med cytokiner (från steg 1.5.3) i plattan block av FACs sortering maskinen. Ladda provet och börja prov förvärv. Välj index sortering/single cell-läge och börja sortingsingle celler till enskilda 96-brunnar. Använd det lägsta flödet för att minimera skjuvspänningen på embryonala celler.
- Se till att alla händelser registreras under index sorteringen. Detta aktiverar uppräkning av det totala antalet celler som analyseras i stadsporten sortering i förhållande till de faktiska antal sorterade till enskilda 96-brunnarna, som inte alla händelser som registreras ska sorteras till brunnar.
- När cellerna har sorterats till en hela plattan med 96 brunnar, placera plattan i en vävnadskultur inkubator vid 37 ° C på 5% CO2. Upprepa för extra plåtar krävs per experiment.
- Samtidig kultur individuellt sorterade celler i 96-brunnar innehållande AGM-EG (från steg 4,3) för upp till 7 dagar (5 dagar för cellerna sorteras från E11-11,5 embryon, 6 dagar från E10-10.5 embryon, 7 dagar från E9-9,5 embryon). Visualisera hematopoetiska kolonier i olika storlekar och morfologier med ett inverterat Mikroskop vid 100 gångers förstoring (figur 2B) efter perioden samtidig kultur.
Obs: Media behöver inte ändras under perioden samtidig kultur. Sorterade hemogenic prekursorer kan inledningsvis integrera AGM-EG lagret med en EG-liknande morfologi och initialt inte kan särskiljas från AGM-EG stroma (figur 2A). Dock följande 24-48 h i samtidig kultur, små, rundade hematopoetiska celler eller kluster av celler kan upptäckas. I slutet av samtidig kultur (5-7 dagar), kan enskilda kolonier av hematopoetiska celler visualiseras i en delmängd av de 96-brunnar som fick en sorterad cell med klonal hematopoetiska potential. Om visuellt inspekterade brunnar innehåller mer än en distinkt koloni, då detta prov är uteslutet från nedströms analys att utesluta prover som kan ha fått mer än en cell sorterade per brunn.
5. analys av klonala hematopoetiska avkomma efter samtidig kultur
-
Skörda kloner från varje 96-väl för FACS analys.
- Kraftfullt Pipettera att separera hematopoetiska celler från endotel lager med hjälp av en flerkanalspipett med 200 µL pipettspetsar. Försök inte att separera endothelial lagret. Ta bort 100 µL (~ 50% av provet) för fenotypisk analys av hematopoetiska avkomma av FACS.
- Överföring till en plattan med 96 brunnar i V-botten och centrifugera 300 x g i 2 min till pellet cellerna. Ta bort mediet genom att snärta media från plattan med en enda snabb rörelse medan plattan är inverterad (svep plattan).
- Placera de återstående 100 µL cellerna i den ursprungliga plattan med 96 brunnar i en 37 ° C incubatorfor användning i efterföljande engraftment analysen (steg 6).
-
Inkubera cellerna med lämpliga antikropparna för hematopoetiska analys.
- Återsuspendering cell pellets i varje brunn av en 96-väl V-botten med 50 µL av PBS/2% FBS som innehåller 10 µg/mL FcR block och 1 µg/mL DAPI. Inkubera plattan vid 4 ° C i 5 min.
- Tillsätt 50 µL av PBS/2% FBS som innehåller 10 µg/mL FcR blocket och en antikropp mix för HSC analys som innehåller PE-Cyanine7-konjugerad anti-VE-Cadherin, PerCP-konjugerad anti-CD45, PE-konjugerad anti-EPCR, APC-konjugerad anti-Sca1 och FITC-konjugerad anti-Gr1 och anti-F4/80 (varje antikropp 1: 100 slutlig spädning såvida inget annat anges baserat på tillverkarens rekommendationer eller enligt titreringar). Inkubera plattan vid 4 ° C i minst 20 min.
-
Avlägsna obunden antikropp med sekventiell utspädningar och analysera cellerna.
- Tillsätt 200 µL per brunn PBS/2% FBS och centrifugera vid 300 x g i 2 min till pellet cellerna. Svep sedan, plattan för att avlägsna supernatanten och tillsätt 200 µL PBS/2% FBS till varje cellpelleten och centrifugera 300 x g i 2 min till pellet celler.
- Svep med platta för att avlägsna supernatanten och tillsätt 50 µL per brunn PBS/2% FBS för analys. Fortsätt att analysera celler av FACS använder en flödescytometer utrustad med en spektrofotometer.
Obs: Skaffa en fast volym av celler (t.ex., 35 µL av de totalt 50 µL används för resuspension) att räkna upp delmängder av hematopoetiska avkomma.
-
Analysera FACS data för varje brunn innehållande hematopoetiska avkomma till skärmen för kolonier som innehåller HSC potentiella (figur 3).
- Gate först CD45 positiva befolkningen som är negativa för myeloiska markörer Gr1 och F480. Inte gate ut celler som uttrycker fortfarande låga nivåer av VE-Cadherin. Celler från det AGM-EG lagret som störs under skörd av hematopoetiska kolonier är VE-Cadherin positiva och CD45 negativa.
- Utfärda utegångsförbud för CD45+VE-Cad- / lågGr1–F4/80– celler ytterligare på den delmängd som uttrycker höga nivåer av EPCR och Sca1 (figur 3A -C).
Observera: I tidigare studier, kolonier saknar celler med CD45+VE-Cad- / lågGr1–F4/80–Sca1HejEPCRHej fenotyp (figur 3D) reproducibly underlåtit att lämna detekterbara Multilinjärt perifert blod engraftment i bestrålade mottagarens möss17 (inga data anges); Dessa kolonier behöver således inte ingå i den efterföljande transplantation analysen i steg 6.
6. analys av Engraftment egenskaper hos enskilda kloner och korrelation med fenotypiska egenskaper klarlagd av Index sortering
- Dag (om möjligt) eller morgonen efter fenotypiska analysen i steg 5, tillfälligt åter de resterande 100 µL cellerna från varje 96 brunnar innehållande hematopoetiska kolonier efter samtidig kultur (från steg 5.1) av kraftig pipettering med en 200 µL pipettspetsen.
-
Förbereda och lägga till rescue celler från hela benmärg av congenic stam B6. SJL-PtprcenPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) vuxna möss16,17.
- Räkna kärnförsedda benmärgsceller i turkarna lösning under en hemocytometer. Späd till en koncentration på 5 x 105 nucleated celler/mL i PBS med 2% FBS.
- Tillsätt 100 µL av rescue benmärgsceller (5 x 104) till varje brunn innehållande hematopoetiska avkomma för transplantation analys och blanda genom pipettering.
-
Transplantera avkomma av enskilda kloner till en enda dödligt bestrålade mottagare congenic-stam B6. SJL-PtprcenPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) vuxen mus.
- Dödligt bestråla samma antal B6 CD45.1 möss som antalet kloner att individuellt injicera avkomma av en enda klon (med 1.000 cGy från en Cesium källa).
- Dra 200 totala µL cellsuspension som (Detta inkluderar celler från klon samt 5 x 104 B6 CD45.1 rescue benmärgsceller) i en ½ mL insulinspruta med 29 G ½ tum nål.
- Dödligt bestråla B6 CD45.1 vuxna mottagare 2-24 h före injektion.
- Använda en plast mus fasthållning som gör att svansen tillgång, injicera via svans ven 200 µL volymen som innehåller både från varje klon och 5 x 104 B6 CD45.1 benmärg från vuxna rescue celler till stöd i mottagarens överlevnad.
- Öra tagg och väga mottagarens möss och kontrollera sin vikt/hälsa regelbundet (t.ex., 3 - 4 gånger / veckan post bestrålning/transplantation, eller per enskilda institutionella standardrutiner) att säkerställa god hälsa.
-
Utför analys av perifert blod engraftment med jämna mellanrum (t.ex., 2, 16, 24 veckor) efter transplantation.
- Ta bort 50-100 µL blod via retro-orbital blöda eller ett annat etiskt godkända blod uthyrning metod.
- Lägga till 3 mL lyseringsbuffert (16,6 g NH4Cl, 2 g NaHCO3 och 74,4 mg EDTA till 2 L H2O) i blod och odla i rumstemperatur i 5 min. Centrifugera vid 300 x g för 5 min. Aspirera och resuspendera pelleten med 2 mL PBS/2% FBS. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
- Resuspendera pelleten med 150 µL PBS/2% FBS som innehåller 10 µg/mL FcR blocket och 1 µg/mL DAPI, och fördela 1/3 av volymen till en väl innehållande 50 µL isotypen kontroller för givare och härstamning, 1/3 till en väl innehållande 50 µL antikropp för givare och isotypen kontroller för härstamning , och 1/3 till en brunn innehållande 50 µL antikroppar för att upptäcka både givare och härstamning.
Obs: Antikroppar för påvisande av Multilinjärt engraftment: APCeFluor780-konjugerad anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-konjugerad anti-CD45.1, FITC-konjugerad anti-CD3 PE-konjugerad anti-F4/80, PerCP-konjugerad anti-Gr1 och APC-konjugerad anti-CD19, eller relevanta isotypen kontroller. - Identifiera kloner med långsiktiga engraftment genom bedömning av perifert blod bidrag av FACS över tiden av CD45.2 (givare)-härrör hematopoetiska celler till myeloisk (Gr1 eller F4/80 positiv), B-cell (CD19 positiv) och T-cell (CD3-positiva) (figur 4A -B).
Obs: Hematopoetiska engraftment kan också analyseras genom CD45.2 (givare)-härrör bidrag till hematopoetiska befolkningar från vävnader som skördats från benmärg, mjälte, tymus och bukhinnan eller efter sekundära transplantation av benmärgsceller i B6 CD45.1 möss att analysera seriell engraftment boenden17.
- Korrelera varje clone fenotypiska egenskaper som bestäms av inledande enda cell index sortering med dess engraftment egenskaper. Med mjukvara Flödesanalys kan du överföra parametrar för sortering för varje index-sorterade cell (korrelerade till 96-brunnen som det var sorterade). Funktionella kartdata på flöde tomter att utvärdera enstaka celler fenotypiska egenskaper som de hänför sig till deras funktionella produktionen (till exempel långsiktiga, Multilinjärt engraftment) (figur 4 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar en schematisk bild av experimentell design. När P-Sp/AGM vävnader är dissekeras, poolade och dissocierade i kollagenas, är de färgade med antikroppar mot VE-Cadherin och EPCR för sortering av index. Pre-HSC är berikad med celler sorterade på VE-Cadherin+EPCRhöga (figur 1B). Andra fluorokrom-konjugerade antikroppar kan ingå att retrospektivt analysera ytterligare fenotypiska parametrar, som registreras för varje cell under index sortering. I detta representativa experiment från E11 AGM, är cellerna också fläckade FITC-konjugerad anti-CD45 och PE-konjugerad anti-CD41 antikroppar. Heterogenitet inom VE-Cadherin+EPCRhög befolkningen för dessa hematopoetiska-specifika markörer observeras (figur 1 c), förenlig med den kända communityn i hematopoetiska utveckling på denna etapp5.
Efter index sortering av enstaka VE-Cadherin+EPCRhög AGM celler till enskilda 96-brunnar innehållande AGM-EG i AGM serum-fria medier och cytokiner, koloni formation uppstår. Inledningsvis, integrera sorterade VE-Cadherin+EPCRhög AGM celler i AGM-EG lagret innan de börjar att runda upp och bilda hematopoetiska kluster (figur 2A, visas här från cellerna sorteras från ett transgena murina embryo uttrycker GFP under den Ly6a promotor21, att skilja dem från AGM-EG stroma). Efter 5-7 dagars samtidig kultur, kan kolonier av olika storlekar och morfologier upptäckas genom inspektion med ett inverterat Mikroskop (figur 2B), visas här från ett representativt experiment, 6 dagar efter sortering från E11 årsstämman.
Nästa, fenotypiska analys av FACS utförs på hälften av avkomman av varje VE-Cadherin+EPCRhög cell som har bildat en hematopoetisk koloni. Kolonier som innehåller celler med HSC fenotyp identifieras som VE-Cadherin- / lågGr1–F4/80–CD45+Sca1HejEPCRHej (figur 3). Här visar vi fyra olika kolonier erhålls efter kultur tillsammans med index-sorterade E11 AGM VE-Cadherin+EPCRhög celler, tre som innehåller olika proportioner av fenotypiska HSC med andra mer differentierade celltyper (figur 3A –C), och fjärde saknar celler med HSC fenotyp (figur 3D). Antalet kolonier observerats per antal celler pläterade och procentsatsen som resulterade i engraftable stamceller kolonierna varierar beroende på embryonala ålder och sortera utförs. VE-Cadherin- / lågGr1–F4/80–CD45+Sca1HejEPCRHej E11 AGM kloner genererade 53 ± 15 kolonier av 192 celler pläterad med 5% ± 1,3% 192 celler guldpläterade genererar kloner som rekonstituerades länge sikt (medelvärde ± SD för 3 experiment).
För att korrelera fenotypen med engraftment potentiella, den återstående hälften av avkomman av varje VE-Cadherin+EPCRhög cell som har bildat en hematopoetisk koloni som innehåller celler med HSC fenotyp upptäcks av FACS (t.ex., den kolonierna representerade i figur 3A–C) transplanteras till bestrålade (1.000 cGy) vuxen congenic stam (B6 CD45.1) möss tillsammans med en dos av rescue celler från B6 CD45.1 märg. Långsiktiga Multilinjärt engraftment bekräftas för varje klon av efter givaren (CD45.2) bidrag till myeloisk (Gr1 och F4/80), B-cell (CD19) och T-cell (CD3) fack av perifert blod över tiden (figur 4A). Även om de flesta kolonier som innehåller celler med HSC fenotyp upptäcks av FACS ger långsiktiga engraftment, är transplantation nödvändigt att bekräfta funktionella Multilinjärt engraftment eftersom vissa kloner förlora engraftment över tiden (figur 4B) eller Visa unika engraftment egenskaper såsom lymfoida-partisk engraftment (inga data anges). När varje VE-Cadherin+EPCRhög klon funktionella HSC potential bestäms, korreleras detta tillbaka till att clone index sorteringsparametrar för att identifiera dess exakta fenotypiska egenskaper. I det här exemplet ser vi som bekräftade funktionellt pre-HSC kloner (röda prickar) är heterogena i deras uttryck av CD41 och CD45, konsekvent med etablerade dynamiska uttryck av dessa markörer under pre-HSC mognad till HSC (figur 4 c). Kloner bildar hematopoetiska kolonier men antingen saknar HSC potential av fenotypiska screening eller avsaknad av långsiktiga, Multilinjärt engraftment efter transplantation (icke-HSC hemogenic kloner, blå prickar) är också heterogena för CD41 och CD45, även om en delmängd express jämfört högre nivåer av CD41 med pre-HSC kloner som är primärt CD41låg. Kloner som inte bildar hematopoetiska kolonier (icke-hemogenic kloner, ljus gröna prickar) är huvudsakligen CD41- / lågCD45-, som återspeglar sannolikt icke-hemogenic VE-Cadherin+EPCRhög endotelceller.
Figur 1: översikt över protokollet och representativa flödescytometri Flödesanalys för index sortering av enstaka celler. (A) Schematisk bild av protokollet. (B) flöde flödescytometri analys av dissocierade E11 AGM celler visar Usenets strategi för index sortering av VE-Cadherin+EPCRhög celler berikad för pre-HSC (analys med FACS analysprogramvara). Siffrorna i varje gate representerar procentandelen celler. (C) Flow flödescytometri analys visar CD41 och CD45 färgning inom VE-Cadherin+EPCRhög befolkningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bildandet av hematopoetiska kolonier under årsstämman-EG samtidig kultur. (A) Time-lapse avbildning av VE-Cadherin+EPCRhögGFP+ sorterade celler från Ly6a-GFP transgena embryon21 Co odlade på årsstämman-EG. Skala barer i µm visas i nedre vänstra hörnet av varje bild. (B) representativa kolonier bildas från VE-Cadherin+EPCRhög index-sorterade enstaka celler efter 6 dagar kultur tillsammans på årsstämman-EG. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Flow flödescytometri analys av avkomman av en enstaka E11 AGM-derived VE-Cadherin+EPCRhög celler efter samtidig kultur AGM-EG Gating för celler med HSC potential visas som den delmängd som är VE-Cadherin- / lågGr1–F4/80– (till vänster) CD45+ (mellersta panel), och Sca1HejEPCRHej (höger panel). (A) representativa koloni som består av en homogen population av celler med HSC fenotypen. (B–C) Representativa kolonier som innehåller en blandning av celler med HSC fenotyp och mer differentierade celltyper. (D) representativa koloni som består av celler som saknar den HSC-fenotypen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: analys av perifert blod engraftment avkommor av enskilda kloner efter årsstämman-EG samtidig kultur och korrelation med index sorteringsparametrar. (A), donator CD45.2-derived perifert blod engraftment av myeloisk (Gr1 och F4/80), B-cell (CD19) och T-cell (CD3) grupper från en representativ mottagare (B6 CD45.1) transplanteras med avkomma av enskilda E11 VE-Cadherin+EPCRhög klon efter årsstämman-EG samtidig kultur. (B), donator CD45.2-derived perifert blod engraftment över tid efter transplantation av avkomman av enskilda E11 VE-Cadherin+EPCRhög kloner efter årsstämman-EG samtidig kultur. (C) korrelation av CD41 och CD45 uttryck för varje index sorterat VE-Cadherin+EPCRhög klon med dess HSC potential följande årsstämman-EG samtidig kultur baserat på långsiktiga, Multilinjärt engraftment i transplantation assay. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studien av HSC genesis under fosterutvecklingen nödvändiggör medel för att upptäcka HSC potential i hemogenic prekursorer ännu saknar behörighet att tillhandahålla långsiktiga Multilinjärt hematopoetiska beredning i transplanterade vuxna mottagare. I detta protokoll presenterar vi en klonal analys av embryonala hemogenic prekursorer av stromal samtidig kultur på vaskulär nisch ECs från årsstämman, som stöder mognaden av prekursorer till HSC, med efterföljande Funktionalanalys i transplantation analyser. Införlivandet av index sortering tillstånd retrospektiv analys av fenotypiska parametrar att karakterisera egenskaper för pre-HSC som definieras av ytmarkörer ingår i analysen. Detta tillvägagångssätt ger således en fördel gentemot andra metoder som förlitar sig på bulk sortering av föregångare populationer med re-aggregation-baserade HSC analyser4,5,10, möjliggör effektiv screening för potentiella markörer för pre-HSC medan på samma gång ge information om den relativa uttryck yta markörer för varje enskild cell. Användningen av denna metod, till exempel rapporterat vi tidigare att, utöver användning av EPCR att berika för pre-HSC populationer i olika stadier av utveckling, mellanliggande uttryck av Notch liganden Dll4 definieras en subpopulation av klonala VE-Cadherin+EPCR+ prekursorer med HSC potential, medan Dll4 negativa VE-Cadherin+EPCR+ hemogenic prekursorer mestadels saknade HSC potentiella17.
En annan fördel med denna metod är möjligheten att skärmen för HSC potential omedelbart efter samtidig kultur baserat på detektion av hematopoetiska avkomma med en fenotyp (VE-Cadherin- / lågGr1–F4/80–CD45+Sca1 HejEPCRHej) som är korrelerad med långsiktiga, Multilinjärt engraftment. Detta eliminerar behovet att transplantera kolonierna sakna hematopoetiska avkomma med denna HSC fenotyp, eftersom dessa kolonier inte ger långsiktiga engraftment transplantation analyser. Dessutom är inledande information skilja potentiella pre-HSC från hemogenic prekursorer saknar HSC potential omedelbart efter samtidig kultur, utan att behöva invänta resultaten från långsiktiga engraftment analyser, användbar, till exempel i snabbt screening kandidat markörer för HSC-prekursorer. Korrelationen av fenotypiska data med långsiktiga engraftment efter transplantation ger dock ytterligare värdefulla insikter i variationer av pre-HSC kloner exakt engraftment egenskaper. Vi hittade, till exempel att klonal pre-HSC från P-Sp/AGM regionen mellan E9.5 och E11.5 har unika potential att ge upphov till både B1a och B2-lymfocyter, medan B1a-lymfocyter potential är bristfällig i vuxen HSC17. Dessutom upptäckt vi en evolution i egenskaperna engraftment i pre-HSC kloner mellan E9.5 och E11.5 med tidigare pre-HSC visar en relativ snedställning mot peritoneal B1a verser B2-lymfocyter engraftment och mindre robust självförnyelse potential baserat på sekundära transplantation-analyser17.
Medan detta protokoll ger en värdefull strategi för att belysa de unika egenskaperna hos klonal HSC prekursorer, finns det vissa begränsningar som måste erkännas. Även om detektion av avkomma med HSC fenotypiska av FACS efter årsstämman-EG samtidig kultur är generellt korrelerad till långsiktiga Multilinjärt engraftment, ger några kolonier med denna fenotyp endast kortsiktiga engraftment eller engraftment bristfällig i en eller flera hematopoetiska härstamningar (figur 4B, data som inte visas). Således återstår transplantation guldmyntfoten i validera funktionella HSC. Vidare, det kan inte uteslutas att några av skillnaderna i engraftment boenden för pre-HSC kloner, snarare än reflekterande cell-inneboende skillnader i hemogenic föregångare potential, kan leda från stokastiska variationer under årsstämman-EG samtidig kultur i självförnyelse verser är differentiering beslut, som pre-HSC samtidigt förfaller till HSC och genomgår celldelningar. Faktiskt, detta kan delvis konto för kolonin morfologi observerade heterogenitet och fenotyp av celler som genereras från enskilda pre-HSC kloner (t.ex., figur 3A–C), och kan leda till en underskattning av pre-HSC av denna analys om inte alla potentiella pre-HSC kloner upptäcks av generation av funktionella HSC efter årsstämman-EG samtidig kultur. Men ger förmågan att särskilja funktionellt distinkta hemogenic kloner av deras differentiell uttryck av unika fenotypiska markörer (t.ex Dll417) aktiveras med denna metod en möjlighet att identifiera subpopulations av hemogenic prekursorer med inneboende cell-inneboende skillnader.
Bygga på detta grundläggande protokoll, kan ett antal utökade applikationer ingå att ytterligare studera hematopoetiska potential av klonala hemogenic prekursorer under utveckling. Utöver användning av antikroppar för påvisande av ytmarkörer, uttryck av fluorescens markörer i transgena embryon (t.ex., Ly6a- GFP21 eller Runx1 -GFP22 uttryckt i hemogenic endotelet/pre-HSC) kan vara införlivade för index sortering av hemogenic prekursorer. Utöver transplantation analyser efter årsstämman-EG samtidig kultur för att upptäcka förmodad pre-HSC, kan avkomma också bedömas för hematopoetiska härstamning potential baserat på sekundära in vitro- analyser, såsom kultur på OP9 eller OP9-Dl1 upptäcka B - och T-cell potentiella23eller clonogenic kolonibildande analyser i metylcellulosa att upptäcka erythromyeloid potential. Faktiskt, några icke-HSC hemogenic Klonerna anfaller (t.ex., figur 3D) sannolikt representerar multipotenta progenitorceller, erythromyeloid progenitorceller, eller T - och B-cell föräldraparets tidigare beskrivits som föregår och är oberoende av HSC utveckling 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28, och denna analys kan ytterligare underlätta klonal studier av dessa olika vågor av hematopoetisk prekursorer. Slutligen, index sortering av pre-HSC kan kombineras med andra nedströms analyser såsom enda cell RNA-sekvensering, korrelera fenotypiska egenskaper med global transkriptionell profiler för utveckla HSC prekursorer. Sammantaget ger detta protokoll en metod för robust analys av klonala blodbildning från embryonala hemogenic prekursorer som bör ge nya insikter i HSC utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Andrew Berger, Stacey Dozono och Brian Raden i Fred Hutchinson Flow flödescytometri kärna för hjälp med FACS. Detta arbete stöds av nationella institut för hälsa NHLBI UO1 bidraget #HL100395, tillhörande Collaborative Grant #HL099997 och NIDDK bevilja #RC2DK114777. Brandon Hadland stöds av Alexs lemonad stå Foundation och Hyundai Hope på hjul Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
References
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
- Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
- Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
- Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
- Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
- Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
- Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
- Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
- Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
- Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
- deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
- Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
- Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
- Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
- Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
- Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
- Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).
