Summary
Aquí presentamos la metodología para el análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas durante el desarrollo embrionario de ratón. Combinación de índice de clasificación de las células de la región aorta-gónada-mesonefros embrionaria con cocultivo de células endoteliales y trasplante para caracterizar las propiedades fenotípicas y el potencial de engraftment de precursores hematopoyéticos individuales.
Abstract
La capacidad de estudiar la génesis de células madre hematopoyéticas (HSC) durante el desarrollo embrionario ha sido limitada por la rareza de los precursores HSC en el embrión y la falta de ensayos que identifican funcionalmente el potencial a largo plazo del engraftment del multilineage de los supuestos precursores HSC. Aquí, describimos la metodología que permite el aislamiento y caracterización de precursores HSC funcionalmente validados a nivel unicelular. En primer lugar, utilizamos índice de clasificación para catalogar el parámetro fenotípico precisa de cada célula individualmente seleccionada, utilizando una combinación de marcadores fenotípicos para enriquecer de precursores HSC con marcadores adicionales para análisis experimental. En segundo lugar, cada célula ordenadas de índice es co cultivada con estroma nicho vascular de la región de aorta-gónada-mesonefros (AGM), que apoya la maduración de los precursores de HSC no engrafting funcional HSC con el engraftment del multilineage, a largo plazo potencial en ensayos de trasplante. Esta metodología permite la correlación de propiedades fenotípicas de precursores hemogenic clonal con su potencial de funcional engraftment u otras propiedades como perfil transcripcional, proporcionar un medio para el análisis detallado del precursor HSC desarrollo a nivel unicelular.
Introduction
Estudios clonales han revelado heterogeneidad en las propiedades a largo plazo del engraftment de adultos HSCs, proporcionar la nueva penetración en subtipos de HSC y cambios en el comportamiento HSC durante envejecimiento1. Sin embargo, estudios similares de HSCs embrionarias y sus precursores han sido más difícil. Durante el desarrollo embrionario temprano, HSCs surgen de una población de precursores conocido como endotelio hemogenic en un proceso transitorio que se refiere como endoteliales hematopoyético transición2. El primer HSC, definido por su capacidad para proporcionar engraftment del multilineage robusto, a largo plazo después del trasplante en recipientes adultos condicionados, no se detectan hasta después del día embrionario 10.5 (E10.5) en el embrión murino, en muy baja frecuencia3 . Durante su desarrollo, precursores de HSC (pre-HSC) derivados de endotelio hemogenic deben sufrir maduración antes de adquirir las propiedades de HSC adultos que permiten la eficiente injerto en trasplante ensayos4,5 , 6. oscurecimiento el estudio del origen HSC rara, una multitud de progenitores hematopoyéticos con eritroides, potencial mieloide y linfoide ya se detectan antes de la aparición de HSC de pre-HSC7,8. Así, la distinción pre-HSC de otros progenitores hematopoyéticos exige métodos clonally aislar células y les proporcione las señales suficientes para su maduración a HSC, para detectar sus propiedades engraftment en los ensayos de trasplante.
Ha descrito una serie de enfoques que permiten la detección de pre-HSC por maduración en vivo o ex vivo a HSC. Métodos ex vivo han dependido de la cultura de los tejidos embrionarios, como la región AGM, donde el primer HSC se detectan en el desarrollo9. Basándose en estos métodos, protocolos que incorporan la disociación, clasificación y la agregación de tejidos AGM han permitido la caracterización de poblaciones ordenadas que contienen precursores HSC durante el desarrollo de E9.5 en E11.5 en los para-aórticos Splanchnopleura (P-Sp) / AGM regiones4,5,10; sin embargo, estos planteamientos no son susceptibles de análisis de alto rendimiento de precursores a nivel unicelular para análisis clonal. Del mismo modo, en vivo la maduración de transplante en ratones recién nacidos, donde el microambiente se presume que es más conveniente para el apoyo de las anteriores etapas de precursores HSC, ha permitido estudios de poblaciones ordenadas desde el saco vitelino y AGM / P-Sp (P-Sp es la región del precursor a la AGM) con características de pre-HSC, pero estos métodos también proporcionan una sólida plataforma para el solo, no de la célula análisis11,12.
Estudios de Rafii et al demostraron que estroma Akt activa la célula endotelial (CE) puede proporcionar un substrato de nicho para el apoyo de adultos HSC auto-renovación en vitro13,14,15. Recientemente se determinó que Akt activa CE derivada de la región AGM (AGM-CE) proporciona un nicho adecuado en vitro para la maduración de precursores hemogenic, aislado desde E9 en desarrollo, a HSC engrafting adulto, así como la posterior auto renovación de HSC generado16. Dado que este sistema emplea una simple cultura de CO 2-dimensional, es fácilmente adaptable para análisis clonal del potencial HSC de precursores hemogenic individualmente aislados.
Recientemente hemos reportado un acercamiento al análisis del potencial HSC de precursores hemogenic clonal combinando índice clasificación de individuales hemogenic precursores de embriones murinos con cocultivo AGM-CE y posterior análisis funcional en el trasplante ensayos de17. Índice de clasificación es un modo de activar la fluorescencia de la célula clasificación (FACS) que registra (índices) todos parámetros fenotípicos (es decir, parámetros de fluorescencia de forward scatter (FSC-A), lado scatter (SSC-A),) de cada célula individual ordenado tal que estos características pueden correlacionarse retrospectivo para posterior análisis funcional tras la clasificación. Software de FACS registra tanto información fenotípica cada celda y la posición/de la placa de 96 pozos en que se colocó. Esta técnica se ha utilizado anteriormente con elegancia para identificar heterogeneidad en HSC adultos, determinar parámetros fenotípicos que más enriquecen para el subconjunto engrafting a largo plazo de HSC y correlacionan los parámetros fenotípicos de HSC con transcripcional propiedades a la sola célula nivel18,19. Aquí, ofrecemos una metodología detallada de este enfoque que permite la identificación de parámetros fenotípicos únicos y las contribuciones de linaje de pre-HSC durante etapas tempranas del desarrollo embrionario.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) del Fred Hutchinson Cancer Research Center.
1. preparación de monocapas de AGM-EC para el cocultivo
- 24 h antes de la disección de la AGM y tipo, hacer medios de cultivo EC AGM y filtro de esterilización.
- Agregar 0.1% de gelatina en agua (100 μL/pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos e incubar a temperatura ambiente durante 15 min aspirar la gelatina y dejar la placa en una campana de cultivo de tejidos con la tapa quitada hasta que los pozos están secos.
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Disociar las monocapas de AGM-CE y placa para placas de 96 pocillos.
Nota: Mantenga el AGM-EC, preparado como se describió anteriormente16, en medios de cultivo de AGM-CE. Para consistencia, líneas celulares de AGM-CE deben congeladas tan pronto como un número suficiente se obtiene (generalmente 1-3 de paso) y usadas en un número de paso definido (generalmente paso 5-12) para los experimentos de la cultura. Líneas celulares de AGM-CE derivan de C57BL/6J (CD45.2) AGM. Vea la Tabla de materiales para todas las composiciones de los medios de comunicación.- Aspire los medios de comunicación de la cultura de AGM-CE en un matraz de2 75 cm y añadir 5 mL de PBS. Aspire PBS y añadir 3 mL de solución de tripsina (véase Tabla de materiales).
- Incubar a 37 ° C durante 2-4 minutos hasta que la mayoría de las células está levantando la placa. Agregar 7 mL de medios de cultivo EC AGM y pipeta de 8 - 10 veces con una pipeta de 10 mL para preparar la suspensión de células individuales y transferir a un tubo de 15 mL.
- Centrifugado a 300 x g durante 5 minutos, quite el sobrenadante, resuspender en medios de cultivo de 10 mL AGM-CE y estimar el número de células con un hemocitómetro. Diluir las células a una concentración de 1 x 105 células/mL en medios de cultivo de AGM-CE.
- Añadir 100 μl AGM-CE suspensión de la célula (1 x 104 células) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos gelatinizada. Lugar a 37 ° C, 5% CO2 incubadora de cultivo de tejidos durante la noche para permitir que el AGM-EC conectar y formar una monocapa confluente.
Nota: Distribuir uniformemente el AGM-CE las células del estroma hay proliferación limitada o célula de aglutinación para el cocultivo óptima. -
Preparar la monocapa de AGM-EC para el cocultivo AGM.
- A la mañana siguiente, preparar los medios de comunicación AGM libre de suero.
- Usando una pipeta multicanal de 12 pozos, retire los medios de cultivo EC AGM AGM-CE y agregar 200 μL/pocillo de AGM libre de suero los medios de comunicación sin citoquinas para lavar cualquier material residual que contiene el suero.
- Retirar los medios de comunicación y añadir 200 μL/pocillo de medios libres de suero AGM con citoquinas. Trabajar con rapidez al retirar y añadir los medios de comunicación para que no se comprometa la capa endotelial; por ejemplo, quite y vuelva a agregar una fila de medios a la vez. Coloque las placas de 96 pozos en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C hasta que están listas para la clasificación de las células embrionarias.
2. preparación de la suspensión de la célula de tejidos embrionarios murinos
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Diseccionar el AGM de apareamientos cronometrado.
- Establecer cruzamientos programado para la generación de tejidos embrionarios de la edad deseada.
- Cosecha los embriones de las hembras embarazadas en 9.5 a 11.5 días post coitum (dpc), dependiendo de la etapa de pre-HSC a analizar.
Nota: Los tejidos embrionarios se cosechan de ratones C57BL/6J (CD45.2) como descrito anteriormente y justamente escenificada somite basado en cuenta16. Nos hemos centrado en el análisis de las poblaciones de la región embrionaria de la AGM y su precursor, el P-Sp, entre E9.5 en E11.5, basado en la puesta en escena somite. - Diseccionar el AGM de los embriones de20.
Nota: Protocolos detallados para la disección de la AGM de embriones murinos han sido publicados por otros20. Por otra parte, saco vitelino u otros tejidos pretendidas tener pre-HSC actividad podrían también analizarse por este método.
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Disociar los tejidos embrionarios disecados.
- Recoger los tejidos disecados en un tubo cónico de 15 mL que contiene 10 mL de PBS con 10% FBS en el hielo. Asentarse los tejidos, aspirar el PBS/FBS y luego inmediatamente añada 1 mL de colagenasa 0,25% y el lugar en un baño de agua de 37 ° C durante 25 minutos.
- Añadir 1 mL de SBF PBS/10% y pipeta unos 20 - 30 veces con una pipeta de 1 mL para obtener una suspensión unicelular. Agregar un adicional 8 mL de SBF PBS/10% y centrifugar las células a 300 x g por 5 min descarte el sobrenadante.
3. anticuerpo tinción de las células embrionarias murinas
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Preparar la solución amortiguadora de bloqueo para la tinción de anticuerpo.
- Añadir 10 μg/mL contra ratón CD16/CD32 (Fc bloque del receptor (FcR)) y DAPI (stock de 1 mg/mL de H2O) de 1 μg/mL a 1 mL de PBS con 10% FBS.
- Elaborar en una jeringa de 3 mL y pasar por un filtro de jeringa 0,22 μm esterilizar. Resuspenda el precipitado de células de los tejidos embrionarios murinos disociados (del paso 2.2.2) en 500 μl de bloqueo tampón e incubar en hielo durante 5 minutos.
- Preparar la mezcla de anticuerpos17.
- Añadir bloque de FcR de 10 μg/mL a 1 mL de PBS con 10% FBS y 10 μl de cada anticuerpo de anti-VE-cadherina conjugado con fluorocromo (CD144, ver la Tabla de materiales) y anticuerpos anti-EPCR conjugado con fluorocromo (CD201, ver la Tabla de materiales). Utilizar una dilución final de 1: 100 de anticuerpos a menos que se indique lo contrario en base a las recomendaciones del fabricante o de acuerdo con valoraciones.
Nota: Esta combinación de anticuerpo se utiliza para la definición de puertas para la clasificación, como se describe a continuación (paso 4.2). Clasificación basada en la expresión conjunta de VE-cadherina y EPCR permite enriquecimiento importante para la parte de las células derivadas de AGM con actividad del precursor HSC, como se describió anteriormente17. - Añadir anticuerpos conjugados con fluorocromo adicionales para su posterior análisis fenotípico de precursores individuales ordenados por índice.
Nota: Estos anticuerpos no necesariamente sirven para la definición de puertas para la clasificación. En este protocolo de muestra, incluimos conjugado con PE anti-CD41 y el anticuerpo anti-CD45 conjugado con FITC para analizar la expresión relativa de estos marcadores hematopoyéticos, que evolucionan durante la aparición de pre-HSC de endotelio hemogenic4 ,5,16,17. Otros marcadores de interés pueden ser incluidos como deseado. Muestras teñidas con controles de anticuerpos de isotipo conjugado con fluorocromo se utilizan para definir puertas negativas y positivas para el análisis. - Elaborar la mezcla de anticuerpos en una jeringa de 3 mL y pasar por un filtro de jeringa 0,22 μm esterilizar. Añadir 500 μl de la mezcla de anticuerpos a la suspensión de células en solución amortiguadora de bloqueo, pipeta para mezclar e incubar en hielo durante al menos 15-20 min.
- Añadir bloque de FcR de 10 μg/mL a 1 mL de PBS con 10% FBS y 10 μl de cada anticuerpo de anti-VE-cadherina conjugado con fluorocromo (CD144, ver la Tabla de materiales) y anticuerpos anti-EPCR conjugado con fluorocromo (CD201, ver la Tabla de materiales). Utilizar una dilución final de 1: 100 de anticuerpos a menos que se indique lo contrario en base a las recomendaciones del fabricante o de acuerdo con valoraciones.
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Lavar las células.
- Añadir 8 mL PBS/10% FBS. Centrifugar las células a 300 x g por 5 min, aspirado y vuelva a suspender la célula pellet con 1 mL PBS/10% FBS.
- Quitar grupos de célula por pipetear la suspensión de células a través de una tapa de filtro de célula 35 μm en un tubo de 5 mL. Lave el filtro de la celda con un adicional 3 mL PBS/10% FBS. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 minutos, aspirar, vuelva a suspender en 500 μl PBS/10% FBS y coloque en hielo hasta el FACS.
4. Índice de clasificación de precursores Hemogenic solo a 96-pocillos con estroma AGM-CE para el cocultivo
- Preparar la máquina de FACS para modo de placa y alinear para clasificar a las placas de 96 pocillos según las instrucciones del fabricante. Seleccione modo unicelular y el índice de clasificación el modo en el software para la configuración de máscara de pureza máxima y permitir la adquisición de parámetros de índice para cada celda seleccionada.
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Tomar una muestra de células del anticuerpo teñido muestras para establecer puertas para la clasificación.
- Carga la muestra de células teñidas en la máquina de FACS y adquirir las células en el caudal más bajo. Trama de la FSC-A versos SSC-A y seleccionados una puerta que incluye células de tamaño variable (figura 1B) (que se basa en la observación que actividad de pre-HSC se identifica en las células de los perfiles de diferentes tamaños en la AGM17). Trama de la FSC-A versos W de FSC y SSC-A versos SSC-W y seleccione puertas excluir dobletes. Luego trama de la FSC-A versos DAPI a células vivas (negativas para DAPI) la puerta (figura 1B).
- Parcela PECy7 (o el fluorocromo correspondiente para la mancha VE-cadherina) versus PerCP (o el fluorocromo correspondiente para la mancha EPCR). Células de la puerta que son positivas para el VE-cadherina (que incluye una población mixta de células endoteliales así como progenitores hematopoyéticos y pre-HSC de la AGM) y que tiene alta expresión de EPCR (que enriquece para pre-HSC de P-Sp/AGM17). Esta es la puerta final que se utilizará al índice tipo las células en el paso 4.3 (figura 1B).
- Parcela fluorocromos más utilizados para la tinción.
Nota: Dependiendo de la subpoblación a analizar, puertas adicionales pueden establecerse basándose en la detección de otros marcadores incluidos para la tinción de las células. Sin embargo, el índice de clasificación permite la grabación de los parámetros fluorescentes para cada celda seleccionada tal que estos parámetros se pueden analizar retrospectivamente. Así, ningún control adicional es necesario en este punto. Para todas las configuraciones de FACS, muestras teñidas con anticuerpos solo deben utilizarse para ajustar la compensación, para tener en cuenta para el derrame en la emisión de superposición fluorocromos con anticuerpos de control de isotipo, cuenta para tinción de fondo y determinar puertas de positivo/negativo.
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Índice de ordenar las celdas AGM.
- Coloque una placa de 96 pocillos con el estroma AGM-CE en medios sin suero AGM con citoquinas (del paso 1.5.3) en el bloque de la placa de la máquina de clasificación de FACs. Carga de la muestra y comenzar la adquisición de la muestra. Seleccionar el modo de índice individual clasificación celular y comenzar las células sortingsingle a 96-pocillos individuales. Utilice la tasa más baja de la flujo para minimizar el estrés de cizalla sobre las células embrionarias.
- Asegúrese de que todos los eventos se registran durante la clasificación del índice. Esto permitirá la enumeración del número total de células analizadas en la puerta de clasificación comparada con el actuales número clasificados individual 96 pozos, como no todos los eventos registrados se ordenarán a los pozos.
- Una vez que las células han sido ordenadas a una toda placa de 96 pocillos, colocar la placa en una incubadora a 37 ° C en 5% CO2de cultivo de tejidos. Repita para las placas adicionales requeridas por el experimento.
- Células en cultivo Co clasificado individualmente en los pozos de 96 que contienen AGM-CE (de paso 4.3) durante 7 días (5 días para las células ordenadas de embriones E11-11.5, 6 días a partir de embriones E10-10.5, 7 días a partir de embriones E9-9.5). Visualizar colonias hematopoyéticas de diferentes tamaños y morfologías con un microscopio invertido con 100 aumentos (figura 2B) después del período de la cultura.
Nota: Los medios de comunicación no necesitan ser cambiado durante el período de la cultura. Clasificados hemogenic precursores pueden integrar inicialmente en la capa de AGM-CE con una morfología similar a CE y no pueden distinguirse inicialmente estroma AGM-CE (figura 2A). Sin embargo, siguiente 24-48 h en cocultivo, pequeña, redondeadas de células hematopoyéticas o racimos de células pueden detectarse. Al final de la cultura (5-7 días), se pueden visualizar colonias individuales de células hematopoyéticas en el subconjunto de 96-pozos que recibió de una célula ordenada con potencial hematopoyético clonal. Si visualmente inspeccionados pocillos contienen más de una colonia distinta, entonces en este ejemplo se excluye de análisis aguas abajo para excluir las muestras que han sido más de una célula ordenada por pozo.
5. Análisis de progenie hematopoyética Clonal tras cultura Co
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Cosecha de clones de cada uno de 96 pocillos para el análisis FACS.
- Vigorosamente la pipeta para disociar las células hematopoyéticas de las capas endoteliales utilizando una pipeta multicanal con puntas de pipeta de 200 μl. Trate de no disociar la capa endotelial. Saque 100 μl (~ 50% de la muestra) para el análisis fenotípico de progenie hematopoyética por FACS.
- Transferencia a una placa de 96 pocillos fondo V y centrifugar a 300 x g durante 2 minutos para que sedimenten las células. Quitar los medios de comunicación por sacudiendo los medios de comunicación de la placa con un solo movimiento rápido mientras que se invierte la placa (placa de la película).
- Colocar las células μl 100 restantes en la placa de 96 pocillos original en un uso de incubatorfor de 37 ° C en el ensayo de engraftment posterior (paso 6).
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Incubar las células con los anticuerpos adecuados para análisis hematopoyético.
- Vuelva a suspender los pellets de células en cada pozo un 96-well V-fondo con 50 μl de FBS PBS/2% que contiene el bloque de FcR de 10 μg/mL y 1 μg/mL DAPI. Incubar la placa a 4 ° C durante 5 minutos.
- Añadir 50 μl de FBS PBS/2% que contiene 10 μg/mL FcR bloque y una mezcla de anticuerpos para el análisis HSC que contienen conjugado con PE-Cyanine7 anti-VE-cadherina, conjugado con PerCP anti-CD45 conjugado con PE anti-EPCR, conjugado con APC anti-Sca1 y conjugado con FITC anti-Gr1 y anti-F4/80 (cada anticuerpo a dilución final de 1: 100 salvo indicación en contrario basada en las recomendaciones del fabricante o según valoraciones). Incubar la placa a 4 ° C durante al menos 20 minutos.
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Retirar el anticuerpo no unido con diluciones secuenciales y analizar las células.
- Agregar 200 μL/pocillo PBS/2% FBS y centrifugar a 300 x g durante 2 minutos para que sedimenten las células. A continuación, parpadeará placa para descartar el sobrenadante y añadir 200 μL PBS/2% FBS a cada pellet celular y centrifugar a 300 x g durante 2 minutos para que sedimenten las células.
- Placa para descartar el sobrenadante y añadir 50 μL/pocillo PBS/2% FBS para el análisis de la película. Proceder a analizar las células por FACS usando un citómetro de flujo equipado con un lector de placas.
Nota: Adquirir un volumen fijo de células (por ejemplo, 35 μl de la total 50 μl utilizados para re-suspensión) para enumerar los subconjuntos de progenie hematopoyética.
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Analizar los datos FACS para cada pocillo que contenga progenie hematopoyética a pantalla para las colonias que contienen HSC potenciales (figura 3).
- Puerta en primer lugar la población de CD45 positivo negativo para los marcadores mieloides Gr1 y F480. No de la puerta hacia fuera de las células que todavía expresan bajos niveles de VE-cadherina. Las células de la capa de AGM-CE que se interrumpen durante la cosecha de colonias hematopoyéticas son CD45 negativo y positivo de VE-cadherina.
- Puerta de CD45+VE-Cad- / bajoGr1 células de F4/80– –más lejos en el subconjunto que expresan altos niveles de EPCR y Sca1 (Figura 3A -C).
Nota: en estudios anteriores, las colonias que carecen de células CD45+VE-Cad- / bajoGr1––de F4/80 Sca1HolaEPCRHola fenotipo (figura 3D) reproducible no detectable engraftment del multilineage de sangre periférica de ratones receptores irradiados17 (datos no mostrados); así, estas colonias no necesitan ser incluidas en el análisis subsecuente del trasplante en el paso 6.
6. Análisis de propiedades de Engraftment de Clones individuales y la correlación con las características fenotípicas aclados por índice de clasificación
- El día de (si es posible) o la mañana siguiente el análisis fenotípico en el paso 5, resuspendidas las restantes células de 100 μl de cada 96 pocillos que contienen colonias hematopoyéticas después de cocultivo (del paso 5.1) mediante pipeteo vigoroso utilizando una pipeta de 200 μl.
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Preparar y añadir las células rescate de toda la médula ósea de congenic cepa B6. SJL-PtprcunaPepcb/BoyJ (CD45.1 B6) ratones adultos16,17.
- Contar las células nucleadas de la médula en la solución de turcos en un hemocitómetro. Diluir hasta una concentración de 5 x 105 nucleated células/mL en PBS con 2% FBS.
- Añadir 100 μl de células de médula ósea de rescate (5 x 104) a cada pocillo que contenga progenie hematopoyética para análisis de trasplante y mezclar mediante pipeteo.
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Trasplante de progenie de clones individuales en una única letalmente irradiados congenic receptora cepa B6. SJL-PtprcunaPepcbratón adulto /BoyJ (CD45.1 B6).
- Letalmente irradiar la misma cantidad de ratones B6 CD45.1 como el número de clones para inyectar individualmente la progenie de una sola copia (con 1.000 cGy de una fuente de cesio).
- Sacar 200 μL total suspensión (esto incluye las células del clon, así como células de médula ósea de rescate 5 x 104 CD45.1 B6) en una jeringa de insulina de ½ mL con aguja 29 G 1/2 pulgada.
- Irradiado letalmente antes de 2-24 h recipientes adultos CD45.1 B6 inyectable.
- Mediante un limitador de ratón de plástico que permite el acceso de la cola, inyectar por el volumen de 200 μL de vena de cola que contiene las células de cada clon y 5 x 104 B6 CD45.1 adulto rescate las células médula ósea para ayudar en la supervivencia del receptor.
- Etiqueta del oído y pesan los ratones receptores y comprobar su peso y de salud a intervalos regulares (por ejemplo, 3 - 4 veces / semana post trasplante de irradiación, o por los procedimientos de operación estándar institucionales) para asegurar la buena salud.
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Realizar análisis del engraftment de la sangre periférica a intervalos regulares (por ejemplo, 2, 16, 24 semanas) después del trasplante.
- Quitar 50-100 μl de sangre por sangrado retro-orbital o cualquier otro método de dejar sangre éticamente aprobado.
- Añadir 3 mL de tampón de lisis (16,6 g de NH4Cl, 2 g de NaHCO3 y 74,4 mg EDTA 2 L H2O) a la sangre e incubar a temperatura ambiente durante 5 min centrifugar a 300 x g durante 5 min aspirado y resuspender el sedimento con 2 mL PBS/2% FBS. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
- Resuspender el sedimento con 150 μL PBS/2% FBS que contiene 10 μg/mL FcR bloque y 1 μg/mL DAPI y dosificación 1/3 del volumen a un bien que contiene controles de isotipo μl 50 donantes y linaje, 1/3 a un anticuerpo de 50 μl que contiene bien controles donantes e isotipo linaje y 1/3 a un pozo que contienen 50 μl anticuerpos para detectar donantes y linaje.
Nota: Los anticuerpos para la detección del engraftment del multilineage: conjugado con APCeFluor780 anti-CD45.2, conjugado con Pe-Cyanine7 anti-CD45.1, conjugado con FITC anti-CD3, conjugado con PE anti-F4/80, conjugado con PerCP anti-Gr1 y conjugado con APC anti-CD19, o controles de isotipo correspondiente. - Identificar clones con el engraftment a largo plazo mediante la evaluación de la contribución de sangre periférica por la FACS en el tiempo de CD45.2 (donante)-derivados de células hematopoyéticas mieloides (Gr1 o F4/80, positivo), células B (CD19 positivos) y células T (CD3 positivos) (Figura 4A de -B).
Nota: Engraftment hematopoyético puede ser analizado también por CD45.2 (donante)-derivado contribución a poblaciones hematopoyéticas tejidos cosechados de médula ósea, bazo, timo y peritoneo, o después de secundaria el trasplante de células de médula ósea en B6 CD45.1 ratones para analizar propiedades de engraftment serie17.
- Correlacionar propiedades fenotípicas de cada clon según lo determinado por el índice inicial unicelular clasificación con las propiedades del engraftment. Usando software de análisis de flujo, cargar parámetros de clasificación para cada celda ordenadas de índice (correlacionado con los 96 pocillos que se clasificó). Mapa funcionales datos en diagramas de flujo para evaluar las propiedades fenotípicas de las células que afectan a su rendimiento funcional (por ejemplo, a largo plazo, del multilineage engraftment) (figura 4).
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Representative Results
Figura 1A se muestra un esquema del diseño experimental. Una vez tejidos P-Sp/AGM son disecados, agrupados y disociados en la colagenasa, se mancharon con anticuerpos contra VE-cadherina y EPCR para clasificar el índice. Pre-HSC están enriquecidos en células ordenadas en VE-cadherina+EPCRalta (figura 1B). Otros anticuerpos conjugados con fluorocromo puede incluidas analizar retrospectivamente los parámetros fenotípicos adicionales, que se registran para cada celda durante la clasificación del índice. En este experimento representativo de E11 AGM, las células también se tiñen con anticuerpos anti-CD41 conjugado con PE y anti-CD45 conjugado con FITC. Heterogeneidad dentro de la poblaciónalta VE-cadherina+EPCR para estos marcadores hematopoyéticos específicos se observa (figura 1), consistente con la conocida asincronía en el desarrollo hematopoyético en esta etapa5.
Siguiendo la clasificación de índice de VE-cadherina+EPCRalta AGM células a 96-pocillos individuales con AGM-CE en medios libres de suero AGM y citoquinas, formación de la Colonia ocurre. Inicialmente, ordenadas células AGMalta VE-cadherina+EPCR integrarán la capa de AGM-CE antes de que comiencen a reunir y formar racimos hematopoyéticos (figura 2A, muestra aquí de células ordenadas de un embrión murino transgénico expresando GFP bajo la Ly6a promotora21, distinguir entre el estroma AGM-CE). Después de 5-7 días de cocultivo, colonias de diversos tamaños y morfologías pueden detectarse por inspección con un microscopio invertido (figura 2B), que se muestra a continuación de un experimento representativo, 6 días después de ordenar de AGM E11.
Siguiente análisis fenotípico por FACS se realiza en la mitad de la progenie de cada célulaalta VE-cadherina+EPCR que ha formado una colonia hematopoyética. Colonias que contienen células con fenotipo HSC se identifican como VE-cadherina- / bajoGr1–CD45 F4/80–+Sca1HolaEPCRHola (figura 3). A continuación, os mostramos cuatro colonias diferentes obtenidas siguiendo Co cultura de Índice clasificado E11 AGM VE-cadherina+EPCRalta células, tres que contienen diferentes proporciones de HSC fenotípica con otros tipos de células más diferenciadas (Figura 3A –C), y la cuarta falta de células con fenotipo HSC (figura 3D). El número de colonias observado por número de células plateadas y el porcentaje que dio lugar a colonias de células madre engraftable varía dependiendo de la edad embrionaria y la clase realizada. VE-cadherina- / bajoGr1–CD45 F4/80–+Sca1HolaEPCRHola E11 AGM clones generados 53 ± 15 colonias de 192 células plateadas con 5 ± 1,3% de las 192 células plateado generar clones que engrafted largo término (media ± SD de 3 experimentos).
Para correlacionar el fenotipo con el engraftment potenciales, la otra mitad de la progenie de cada celdaalta VE-cadherina+EPCR que se ha formado una colonia hematopoyética que contiene células con fenotipo HSC por FACS (p. ej., el las colonias representadas en la Figura 3A–C) se trasplanta a irradiados (1.000 cGy) adultos congenic ratones de cepa (CD45.1 B6) junto con una dosis de rescate de células de médula CD45.1 B6. El engraftment del multilineage a largo plazo se confirma para cada clon siguiendo la contribución de donantes (CD45.2) y la mieloide (Gr1 F4/80), células B (CD19) y células T (CD3) compartimiento de la sangre periférica en el tiempo (Figura 4A). Aunque mayoría de las colonias que contienen células con fenotipo HSC por FACS proporciona engraftment de largo plazo, el trasplante es necesario confirmar el engraftment del multilineage funcional como algunos clones de pérdida de injerto con el tiempo (Figura 4B) o Mostrar propiedades únicas del engraftment como engraftment linfoide parcial (datos no mostrados). Una vez que se determina el potencial funcional de HSC de cada clonalta VE-cadherina+EPCR, esto se correlaciona volver al índice de ese clon parámetros para identificar sus características fenotípicas precisa de clasificación. En este ejemplo, vemos que funcionalmente confirmado clones pre-HSC (puntos rojos) son heterogéneos en su expresión de CD41 y CD45, consistente con la expresión dinámica establecida de estos marcadores durante la maduración del pre-HSC a HSC (figura 4). Los clones formando colonias hematopoyéticas pero cualquier falta potencial HSC por cribado fenotípico o por ausencia de largo plazo, del multilineage injerto después del trasplante (HSC no hemogenic clones, puntos azules) también son heterogéneos para CD41 y CD45, Aunque un subconjunto expresar niveles más altos de CD41 comparan con clones de pre-HSC, que son principalmente CD41baja. Los clones que no formaron colonias hematopoyéticas (hemogenic no clones, luz puntos verdes) son predominantemente CD41- / bajoCD45-, que probablemente reflejan no hemogenic VE-cadherina+EPCRalta las células endoteliales.
Figura 1: Descripción general de protocolo y análisis de citometría de flujo representativo para la clasificación de índice de solo células de. (A) representación esquemática del protocolo. (B) flujo cytometry análisis de disociado E11 AGM células mostrando bloquea estrategia para clasificar el índice de VE-cadherina+EPCRalto células enriquecidas para pre-HSC (análisis con software de análisis FACS). Números en cada puerta representan el porcentaje de células. (C) flujo cytometry análisis CD41 y CD45 coloración dentro de la poblaciónalta VE-cadherina+EPCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: formación de colonias hematopoyéticas durante el co-cultivo de AGM-EC. (A) la proyección de imagen Time-lapse de las células GFP+ clasificadoaltaEPCR VE-cadherina+de Ly6a-GFP embriones transgénicos21 Co cultivadas en AGM-CE. Barras de escala en μm se muestran en la parte inferior izquierda de cada imagen. Colonias representativas (B) forman de VE-cadherina+EPCRalto Índice clasificado las células después de 6 días Co cultura en AGM-CE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Flujo cytometry análisis de la progenie de un derivado de AGM E11 VE-cadherina+EPCRalta células después de co-cultivo en AGM-CE. Que bloquean las células con potencial HSC se muestra como el subconjunto que es VE-cadherina- / bajoGr1–F4/80– (panel izquierdo), CD45+ (panel central) y Sca1HolaEPCRHola (panel derecho). (A) representante de Colonia que consta de una población homogénea de células con el fenotipo HSC. (CdeB–) Colonias representativas que contienen una mezcla de células con el fenotipo HSC y más tipos de células diferenciadas. (D) Colonia representativas consisten en las células que carecían el fenotipo HSC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: análisis del engraftment de la sangre periférica de la progenie de clones individuales tras AGM-CE Co cultura y correlación con índice de parámetros de clasificación. (A) engraftment de sangre periférica de donantes CD45.2 derivado de mieloide (Gr1 y F4/80), de células B (CD19) y subconjuntos de células T (CD3) de un recipiente representativo (CD45.1 B6) trasplantados con progenie de individual E11 VE-cadherina+EPCRalta clon después de co-cultivo AGM-CE. (B) derivados de CD45.2 de donantes de sangre periférica engraftment con el tiempo después del trasplante de la progenie de individuales E11 VE-cadherina+EPCRalta clones después de co-cultivo AGM-CE. (C) correlación de CD41 y expresión de CD45 para cada índice ordenado VE-cadherina+EPCRalto clon con su potencial HSC siguientes AGM-CE Co cultura basada en el engraftment a largo plazo, del multilineage en ensayo de trasplante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El estudio de la génesis de la HSC durante el desarrollo embrionario requiere medios para detectar posible precursores de hemogenic aún falta la competencia para proporcionar a largo plazo del multilineage reconstitución hematopoyética en recipientes adultos trasplantados de HSC. En este protocolo, presentamos un ensayo clonal de precursores hemogenic embrionario por co-cultivo stromal vascular nicho ECs de la Junta General, que apoya la maduración de los precursores de HSC, con posterior análisis funcional en los ensayos de trasplante. Incorporación del índice de clasificación permite el análisis retrospectivo de los parámetros fenotípicos para caracterizar las propiedades de pre-HSC según la definición de marcadores de superficie incluyen en el ensayo. Así, este enfoque proporciona una ventaja sobre otros métodos que se basan en a granel clasificación de poblaciones precursor de re-aggregation basado en HSC ensayos4,5,10, lo que permite la eficiente detección de posibles marcadores de pre-HSC mientras que al mismo tiempo proporciona información sobre el nivel de expresión relativa de marcadores de superficie de cada célula individual. Utilizando esta metodología, por ejemplo, previamente informó que, además del uso de EPCR para enriquecer las poblaciones pre-HSC en diferentes etapas de desarrollo, intermedia expresión del ligando de Notch Dll4 más definido una subpoblación de clonal Precursores EPCR+ +de VE-cadherina con HSC potencial, mientras que Dll4 negativo precursores EPCR VE-cadherina++ hemogenic sobre todo carecían de HSC potencial17.
Otra ventaja de este método es la capacidad para detectar potencial HSC inmediatamente después de la cultura basan en la detección de progenie hematopoyética con un fenotipo (VE-cadherina- / bajoGr1–CD45 F4/80–+Sca1 HolaEPCRHola) que se correlaciona con el engraftment del multilineage, a largo plazo. Esto elimina la necesidad de trasplante de colonias falta progenie hematopoyética con este fenotipo HSC, como estas colonias no proporcionan engraftment de largo plazo en los ensayos de trasplante. Además, es útil, por ejemplo, en información inicial distinguir posibles pre-HSC de precursores hemogenic falta potencial HSC inmediatamente después de la cultura, sin necesidad de esperar los resultados de ensayos a largo plazo de engraftment, rápidamente detección de marcadores de candidato de HSC-precursores. Sin embargo, la correlación de datos fenotípicos con injerto a largo plazo después del trasplante proporciona información valiosa adicional en las variaciones de las propiedades del engraftment precisa de pre-HSC clones. Encontramos, por ejemplo, pre-HSC clonal de la región P-Sp/AGM entre E9.5 y E11.5 tienen el potencial único para dar lugar a B1a y linfocitos B2, mientras que linfocitos B1a potencial es deficiente en adultos HSC17. Además, hemos detectado una evolución en las propiedades del engraftment del pre-HSC clones entre E9.5 y E11.5 con pre-HSC anterior demostrando una relativa inclinación hacia el engraftment de versos B2 linfocitos B1a peritoneal y menos potencial de autorenovación robusto basado en sobre el trasplante secundario ensayos de17.
Este protocolo proporciona un valioso enfoque para dilucidar las propiedades únicas de precursores HSC clonales, existen algunas limitaciones que deben ser reconocidos. Aunque la detección de progenie con HSC fenotípica por FACS después de co-cultivo AGM-CE se correlaciona generalmente a largo plazo del multilineage engraftment, algunas colonias con este fenotipo proporcionan sólo a corto plazo engraftment o deficientes de engraftment en uno o más linajes hematopoyéticos (Figura 4B; datos no mostrados). Así, el trasplante sigue siendo el estándar de oro para validar funcional HSC. Además, no se puede descartar que algunas de las diferencias en las propiedades del engraftment de pre-HSC clones, en lugar de que refleja las diferencias intrínsecas de la célula de hemogenic potencial precursor, puede resultar de la variabilidad estocástica en co-cultivo AGM-CE en los versos de auto-renovación decisiones de diferenciación, como pre-HSC simultáneamente madurando a HSC y sometidos a las divisiones de célula. De hecho, esto puede en parte representan la heterogeneidad observada de la morfología de las colonias y el fenotipo de las células que se generan a partir de clones individuales pre-HSC (p. ej., Figura 3A–C) y puede resultar en una subestimación de pre-HSC por Este ensayo, si no todo potencial pre-HSC clones son detectados por generación de HSC funcional después de co-cultivo AGM-CE. Sin embargo, la capacidad de distinguir funcionalmente distintas hemogenic clones por su expresión diferencial de marcadores fenotípicos únicos (como Dll417) permitido por este método proporciona un medio para identificar las subpoblaciones de los precursores de la hemogenic con diferencias de célula-intrínsecas inherentes.
Basándose en este protocolo básico, un número de aplicaciones extendidas se puede incluir a profundizar el estudio potencial hematopoyético de hemogenic clonal de precursores durante el desarrollo. Más allá del uso de anticuerpos para la detección de marcadores de superficie, expresión de marcadores de fluorescencia en embriones transgénicos (por ej., Ly6a- GFP21 o Runx1 -GFP22 expresado en hemogenic endotelio/pre-HSC) puede ser incorporado para la clasificación de índice de precursores hemogenic. Además de ensayos de trasplante después de co-cultivo AGM-CE para detectar supuesto pre-HSC, progenie puede también evaluarse potencial linaje hematopoyético basado en secundaria en vitro ensayos, tales como el cultivo en OP9 o OP9-Dl1 para detectar células T y B potencial23o clonogenic formadoras ensayos en metilcelulosa para detectar potencial erythromyeloid. De hecho, algunos de los clones de hemogenic no-HSC (p. ej., figura 3D) representan probablemente progenitores multipotentes, erythromyeloid progenitores, o progenitores de células T y B que anteceden y son independientes del desarrollo de HSC describen previamente 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28y este análisis pueden facilitar más estudios clonales de las distintas ondas de precursores hematopoyéticos. Finalmente, el índice de clasificación de pre-HSC puede combinarse con otros análisis posteriores como unicelular secuenciación del RNA, correlacionar propiedades fenotípicas con los perfiles transcripcionales globales de desarrollo de precursores HSC. En conjunto, este protocolo proporciona un método para el análisis de la hematopoyesis clonal de precursores hemogenic embrionaria que deben proporcionar nuevas penetraciones en el desarrollo de HSC.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Andrew Berger, Stacey Dozono y Brian Raden en el Fred Hutchinson flujo Cytometry núcleo de asistencia con FACS. Este trabajo fue apoyado por la beca de los institutos nacionales de salud NHLBI UO1 #HL100395, auxiliares Collaborative Grant #HL099997 y NIDDK conceden #RC2DK114777. Brandon Hadland es apoyado por el Alex Lemonade Stand Foundation y Hyundai Hope sobre ruedas Fundación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
References
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