Summary
Her presenterer vi metodikk for klonal analyse av blodkreft stamcelletransplantasjon forløpere under murine embryonale utviklingen. Vi kombinerer indeks sortering av enkeltceller fra embryonale aorta-gonad-mesonephros-regionen med endothelial celle co kultur og transplantasjon som karakteriserer fenotypiske egenskaper og engraftment potensialet i enkelt blodkreft forløpere.
Abstract
Muligheten til å studere blodkreft stem cell (HSC) genesis under embryonale utviklingen har vært begrenset av sjeldenhet av HSC forløpere i tidlig embryo og mangel på analyser som funksjonelt identifiserer langsiktige multilineage engraftment potensialet i individuelle antatte HSC prekursorer. Her beskriver vi metodikk som gjør at isolering og karakterisering av funksjonelt validert HSC forløpere på enkeltcelle nivå. Først bruke vi indeksen sortering for å katalogisere presis fenotypiske parameteren for hver individuelt sorterte celle, med en kombinasjon av fenotypiske markører for å berike for HSC forløpere med ekstra markører for eksperimentanalyse. Andre er hver indeks-sortert celle co kulturperler med vaskulær nisje stroma fra aortabuen-gonad-mesonephros (GF) regionen, som støtter modning av ikke-engrafting HSC forløpere til funksjonelle HSC med multilineage, langsiktige engraftment i transplantasjon analyser. Denne metoden gjør det mulig for korrelasjon av fenotypiske for klonal hemogenic forløpere med sine funksjonelle engraftment potensial eller andre egenskaper som transcriptional profil, sørge for detaljert analyse av HSC forløper utvikling på enkeltcelle nivå.
Introduction
Klonal undersøkelser avdekket heterogenitet i egenskapene for langsiktige engraftment for voksen HSCs, gir ny innsikt i HSC subtyper og endringer i HSC virkemåte under aldring1. Men har lignende studier av embryonale HSCs og deres forløpere vært mer utfordrende. Under embryonale utviklingen, HSCs oppstå fra en populasjon av prekursorer kjent som hemogenic endotelet i en forbigående prosess referert til som den endothelial blodkreft overgang2. Den første HSC definert av deres evne til å gi robust, langsiktig multilineage engraftment etter transplantasjon i betinget voksen mottakere, oppdages ikke før etter embryonale dag 10.5 (E10.5) i murine embryo, på veldig lav frekvens3 . I løpet av deres utvikling, må forløpere til HSC (pre-HSC) som oppstår fra hemogenic endotelet gjennomgå modning tidligere å erverve egenskaper for voksen HSC som gir mulighet for effektiv engraftment i transplantasjon analyser4,5 , 6. skjule studiet av sjeldne HSC opprinnelse, en rekke blodkreft progenitors med erythroid, myelogen og lymfoide potensialet er allerede oppdaget før fremveksten av HSC pre-HSC7,8. Dermed krever skille pre-HSC fra andre blodkreft progenitors metoder å isolere clonally cellene og gi dem signaler tilstrekkelig for deres modning til HSC å oppdage engraftment egenskapene i transplantasjon analyser.
Flere tilnærminger har blitt beskrevet som tillater for påvisning av pre-HSC av ex vivo eller i vivo modningsprosess for HSC. Ex vivo metoder har avhengig kultur embryonale vev, som generalforsamlingen regionen, hvor den første HSC oppdages i utvikling9. Bygge på disse metodene, protokoller som innlemme dissosiasjon, har sortering og ny samling av generalforsamlingen vev tillatt karakterisering av sorterte populasjoner som inneholder HSC forløpere under utviklingen fra E9.5 til E11.5 i para-aorta splanchnopleura (P-Sp) / generalforsamlingen regioner4,5,10; men er disse ikke mottakelig for høy gjennomstrømming analyse av prekursorer på enkeltcelle nivå kreves for klonal analyse. Tilsvarende i vivo modning av transplantasjon i nyfødte mus, hvor microenvironment antas å være mer egnet til støtte for tidligere stadier av HSC forløpere, har aktivert studier av sorterte befolkningsgrupper fra eggeplomme sac og generalforsamlingen / P-Sp (P-Sp er regionen forløperen til generalforsamlingen) med karakteristikker av pre-HSC, men disse metodene også mislykkes å gi en solid plattform for enkelt celle analyse11,12.
Studier fra Rafii et al. vist at Akt-aktivert endothelial celle (EC) stroma kan gi en nisje substrat for støtte av voksen HSC selvtillit fornyelse i vitro13,14,15. Vi har nylig funnet ut at Akt-aktivert EC avledet fra regionen generalforsamling (GF-EC) gir en egnet i vitro nisje for modning av hemogenic forløpere, isolert så tidlig som E9 i utvikling, til voksen-engrafting HSC, samt den etterfølgende selvtillit fornyelse genererte HSC16. Gitt at dette systemet bruker en enkel 2-dimensjonal co kultur, er det lett tilpasses klonal analyse av HSC potensialet i individuelt isolert hemogenic prekursorer.
Vi har nylig rapportert en tilnærming til analysen HSC potensialet i klonal hemogenic forløpere ved å kombinere indeks sortering av personlige hemogenic prekursorer fra murine embryo med AGM-EC co kultur og påfølgende funksjonell analyse i transplantasjon Søk17. Indeks sortering er en modus av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) som poster (indekser) alle fenotypiske parametere (dvs.frem xy (FSC-A), siden xy (SSC-A), fluorescens parametere) av hver individuelt sorterte celle slik at disse funksjoner kan samsvares ettertid med påfølgende funksjonell analyse etter sortering. FACS programvaren registrerer både fenotypiske informasjon for hver celle og posisjon/vel i 96-brønnen platen der den ble plassert. Denne teknikken har tidligere blitt elegant brukt til å identifisere heterogene i voksen HSC, bestemme fenotypiske parametere som ytterligere berike for langsiktig engrafting delsettet med HSC og relatere fenotypiske parametere av HSC med transcriptional egenskaper ved singelen celle nivå18,19. Her gir vi detaljerte metodikk i denne tilnærmingen som gjør ID unik fenotypiske parametere og avstamning bidrag av pre-HSC i tidlige stadier av embryonale utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Fred Hutchinson Cancer Research Center.
1. utarbeidelse av AGM-EC Monolayers for co kultur
- 24 timer før generalforsamlingen disseksjon og Sorter gjøre AGM-EC kultur medier og filteret sterilisere.
- Legg 0,1% gelatin i vannet (100 µL/vel) hver brønn av en 96-brønns plate og ruge ved romtemperatur i 15 min. leveringstanken gelatin og la platen i vev kultur hette med lokk fjernet til brønnene er tørre.
-
Distansere AGM-EC monolayers og plate til 96-brønns plater.
Merk: Opprettholde generalforsamlingen-EF, utarbeidet som beskrevet tidligere16, i AGM-EC kultur medier. For konsistens, bør AGM-EC cellelinjer være frossen så snart tilstrekkelig antall er oppnådd (vanligvis passering 1-3) og brukt en definert passasje nummer (vanligvis passasje 5-12) co cellekulturer eksperimenter. AGM-EC linjer er avledet fra C57BL/6J (CD45.2) generalforsamlingen. Se Tabellen for materiale for alle medier komposisjoner.- Sug opp media fra AGM-EC kulturen i en 75 cm2 bolle og tilsett 5 mL PBS. Sug opp PBS og legge 3 mL trypsin løsningen (se Tabell for materiale).
- Ruge på 37 ° C i 2-4 min til de fleste cellene er løfting av platen. Legge til 7 mL av AGM-EC kultur medier og Pipetter 8 - 10 ganger med en 10 mL pipette forberede enkeltceller suspensjon, og overføre til en 15 mL tube.
- Spinn på 300 x g i 5 min, fjerne nedbryting, nytt avbryte 10 mL AGM-EC kultur medier og anslå hvor cellen med en hemocytometer. Fortynne cellene til en konsentrasjon av 1 x 105 celler/mL i AGM-EC kultur medier.
- Tilsett 100 µL AGM-EC celle suspensjon (1 x 104 celler) hver brønn av en gelatinized 96-brønns plate. Sted i en 37 ° C, 5% CO2 vev kultur inkubator overnatting tillate AGM-EU å feste og danne en confluent monolayer.
Merk: Distribuere jevnt AGM-EC stromal celler så det er begrensede overvekst eller celle clumping for optimal co kultur. -
Forberede AGM-EC monolayer generalforsamlingen co kultur.
- Neste morgen, utarbeide generalforsamlingen serum-free media.
- Bruker en 12-vel flerkanals pipette, fjerne AGM-EC kultur medier fra AGM-EU og legge 200 µL/godt av generalforsamlingen serum-frie medier uten cytokiner å vaske ut noen gjenværende serum inneholder medier.
- Fjern media og legge 200 µL/vel av generalforsamlingen serum-free media med cytokiner. Arbeide raskt når fjerne og legge til media slik at endothelial laget ikke er svekket; f.eksfjerne og legge nytt media én rad om gangen. Plass 96-brønns platene i en vev kultur inkubator på 37 ° C til embryonale celler er klar for sortering.
2. forberedelse for en enkeltcelle suspensjon fra Murine Embryonic vev
-
Dissekere generalforsamlingen fra tidsbestemt parring.
- Sette opp tidsbestemte parring for generering av embryonale vev av ønsket alder.
- Høste embryoer fra gravide kvinner på 9.5 til 11,5 dager innlegget coitum (PPC), avhengig av scenen av pre-HSC som skal analyseres.
Merk: Embryonale vev høstes fra C57BL/6J (CD45.2) mus som beskrevet tidligere og nøyaktig trinnvis basert på somite antall16. Vi har fokusert på analyse av befolkninger fra embryonale AGM-regionen og dets forløper, P-Sp, mellom E9.5 til E11.5, basert på somite oppsetning. - Dissekere generalforsamlingen embryoer-20.
Merk: Detaljert protokoller for Disseksjon av generalforsamlingen fra murine embryo har blitt publisert av andre20. Plommesekken eller andre vev som er påstått å ha pre-HSC aktivitet kan eventuelt også analyseres av denne metoden.
-
Distansere dissekert embryonale vev.
- Samle dissekert vev i et 15 mL konisk rør som inneholder 10 mL PBS med 10% FBS på is. Tyngdekraften bosette vev, Sug opp PBS/FBS og deretter legge umiddelbart 1 mL av 0,25% collagenase og sted i en 37 ° C vannbad for 25 min.
- Legge til 1 mL av PBS/10% FBS og Pipetter ca 20 - 30 ganger med 1 mL pipette tips å få en enkeltcelle suspensjon. Legge til en ekstra 8 mL PBS/10% FBS og sentrifuger cellene på 300 x g for 5 min. kast nedbryting.
3. antistoff flekker Murine embryonale celler
-
Forberede blokkerer bufferen antistoff flekker.
- Legge til 10 µg/mL anti-musen CD16/CD32 (Fc reseptor (FcR) blokk) og 1 µg/mL DAPI (1 mg/mL stock i H2O) i 1 mL PBS med 10% FBS.
- Trekke i 3 mL sprøyte og passerer gjennom et 0.22 µm sprøyte filter å sterilisere. Nytt suspendere celle pellet fra avstand murine embryonic vev (fra trinn 2.2.2) i 500 µL blokkering buffer og ruge på is 5 min.
- Forberede antistoff blanding17.
- Legge til 10 µg/mL FcR blokk 1 mL PBS med 10% FBS og 10 µL hver fluorochrome-konjugerte anti-VE-Cadherin antistoff (CD144, se Tabellen for materiale) og antistoff-fluorochrome-konjugerte anti-EPCR (CD201, se Tabellen for materiale). Bruk en 1: 100 siste fortynning av antistoffer ikke annet angis basert på produsentens anbefalinger eller etter titrations.
Merk: Denne antistoff kombinasjonen brukes til å definere gates sortering, som beskrevet nedenfor (trinn 4.2). Sortering basert på co uttrykk for VE-Cadherin og EPCR gir betydelig berikelse for del av AGM-avledet celler som inneholder HSC forløper aktivitet, som beskrevet tidligere17. - Legge til ekstra fluorochrome-konjugerte antistoffer for videre fenotypiske analyse av individuelle indeks-sortert prekursorer.
Merk: Disse antistoffene er ikke nødvendigvis brukt for å definere portene for sortering. I denne eksempel protokollen, har vi inkludert PE-konjugerte anti-CD41 antistoffer og FITC-konjugerte anti-CD45 antistoff analysere den relative uttrykket for disse blodkreft markører, som utvikles under fremveksten av pre-HSC fra hemogenic endotelet4 ,5,16,17. Andre markører av interesse kan inkluderes som ønsket. Eksempler med fluorochrome-konjugerte isotype antistoff kontroller brukes til å definere negative og positive portene for analyse. - Utarbeide antistoff blandingen i en 3 mL sprøyte og passerer gjennom et 0.22 µm sprøyte filter å sterilisere. Legg til 500 µL av antistoff miksen celle suspensjon i blokkering buffer, pipette å blande, og ruge på is minst 15-20 min.
- Legge til 10 µg/mL FcR blokk 1 mL PBS med 10% FBS og 10 µL hver fluorochrome-konjugerte anti-VE-Cadherin antistoff (CD144, se Tabellen for materiale) og antistoff-fluorochrome-konjugerte anti-EPCR (CD201, se Tabellen for materiale). Bruk en 1: 100 siste fortynning av antistoffer ikke annet angis basert på produsentens anbefalinger eller etter titrations.
-
Vask farget cellene.
- Legge til 8 mL PBS/10% FBS. Sentrifuge cellene på 300 x g for 5 min leveringstanken og å suspendere cellen pellets med 1 mL PBS/10% FBS.
- Fjerne celle klumper av pipettering celle suspensjon gjennom en 35 μm celle sil cap på en 5 mL tube. Vask celle silen med en ytterligere 3 mL PBS/10% FBS. Sentrifuge cellene på 300 x g i 5 min, Sug opp, nytt avbryte 500 µL PBS/10% FBS og plasser på is til FACS.
4. indeks sortering av enkelt Hemogenic prekursorer 96-brønner med AGM-EC Stroma for co kultur
- Forberede FACS maskinen for plate modus og justere for sortering i 96-brønnen platene ifølge instruksjonene fra produsenten. Velg enkeltcelle modus og indeks sortering modus i programvaren for maksimal renhet maske innstillinger og aktivere oppkjøpet av indeksparametere for hver sorterte celle.
-
Erverve celler fra antistoffer farget prøver å sette porter for sortering.
- Last farget celle prøven på FACS maskinen og skaffe cellene på laveste flow rate. Plot FSC-A-vers SSC-en og velg en gate som inneholder celler med ulik størrelse (figur 1B) (som er basert på observasjon at pre-HSC aktivitet identifiseres i cellene i forskjellig størrelse profiler i generalforsamlingen17). Plot FSC-A vers FSC-W og SSC-A vers SSC-W, og velg gates utelate doublets. Deretter tegner FSC-A vers DAPI til gate lever celler (negativ for DAPI) (figur 1B).
- Plot PECy7 (eller den aktuelle fluorochrome for VE-Cadherin flekken) kontra PerCP (eller den aktuelle fluorochrome for EPCR flekken). Gate celler som er positivt for VE-Cadherin (som inkluderer en blandet befolkning av endotelceller som blodkreft progenitors og pre-HSC fra generalforsamlingen) og som har høy EPCR uttrykk (som beriker for pre-HSC P-Sp/AGM17). Dette er det endelige gate som brukes til å indeksere Sorter enkeltceller i trinn 4.3 (figur 1B).
- Tegne inn ekstra fluorochromes som brukes til farging.
Merk: Avhengig av subpopulasjon som skal analyseres, flere porter kan angis basert på deteksjon av andre indikatorer inkludert for farging celler. Men gjør indeksen sortering opptak av fluorescerende parameterne for hver sorterte celle slik at disse parametrene kan analyseres ettertid. Dermed er ingen ytterligere gating nødvendig på dette punktet. For alle FACS oppsett, bør prøver med enkelt antistoffer brukes til å justere kompensasjon, til ringvirkninger i utslipp av overlappende fluorochromes, og med isotype kontroll antistoffer, utgjør bakgrunnen flekker og bestemme negativ/positiv portene.
-
Indeks sortere generalforsamlingen cellene.
- Plass en 96-brønns plate med AGM-EC stroma i generalforsamlingen serum-frie medier med cytokiner (fra trinn 1.5.3) i plate blokken av FACs sortering maskinen. Belaste prøven og begynne prøven oppkjøp. Velg modus for søkeindeksering sortering/enkelt celle og begynne sortingsingle celler personlige 96-brønner. Bruk laveste infusjonshastigheten for å minimere skjæring stress på embryonale celler.
- Kontroller at alle hendelser registreres under indeks sorteringen. Dette vil aktivere opplisting av antall celler analysert i sortering porten i forhold til de faktiske tall sortert til individuell 96-brønnene, som ikke alle hendelser registrert sorteres brønner.
- Når cellene er sortert til en hel 96-brønns tallerken, plass platen i en vev kultur inkubator på 37 ° C satt til 5% CO2. Gjenta for flere plater må etter eksperiment.
- Co kultur individuelt sortert celler i 96-brønner som inneholder AGM-EC (fra trinn 4.3) for opp til 7 dager (5 dager for cellene sortert fra E11-11.5 embryo, 6 dager fra E10-10.5 embryo, 7 dager fra E9-9.5 embryo). Visualisere blodkreft kolonier av ulike størrelser og morphologies med en invertert mikroskopet på 100 X forstørrelse (figur 2B) etter co kultur periode.
Merk: Media trenger ikke endres under co kultur perioden. Sortert hemogenic prekursorer utgangspunktet kan integrere AGM-EC laget med en EC-lignende morfologi og kan ikke skilles opprinnelig fra AGM-EC stroma (figur 2A). Imidlertid følgende 24-48 timer i co kultur, liten, avrundet blodkreft cellene eller klynger av celler kan oppdages. På slutten av co kultur (5-7 dager), kan personlige kolonier av blodkreft cellene visualiseres i delsettet 96-brønner som fikk sorterte cellen med klonal blodkreft potensial. Hvis visuelt inspisert brønner inneholder flere forskjellige kolonien, så dette eksemplet er utelukket fra nedstrøms analyse utelate prøver som har mottatt mer enn én celle sortert per brønn.
5. analyse av klonal blodkreft avkom etter co kultur
-
Høste kloner fra hver 96-brønnen for FACS analyse.
- Kraftig Pipetter å dissociate blodkreft cellene fra endothelial lag med en flerkanals pipette med 200 µL pipette-spisser. Prøv ikke å distansere endothelial laget. Fjerne 100 µL (~ 50% av utvalget) for fenotypiske analyse av blodkreft avkom av FACS.
- Overføre til en 96-brønns V-bunnplaten og sentrifuge 300 x g i 2 minutter til pellets cellene. Fjerne media ved å sveipe media fra platen med én rask bevegelse mens platen er invertert (bla platen).
- Plass de resterende 100 µL cellene i den originale 96-brønns platen i en 37 ° C incubatorfor bruk i etterfølgende engraftment analysen (trinn 6).
-
Inkuber cellene med passende antistoffer for blodkreft analyse.
- Nytt suspendere celle pellets i hver brønn til 96-brønns V-bunn med 50 µL av PBS/2% FBS inneholder 10 µg/mL FcR blokk og 1 µg/mL DAPI. Inkuber platen ved 4 ° C i 5 minutter.
- Legge til 50 µL av PBS/2% FBS inneholder 10 µg/mL FcR blokker og en antistoff blanding for HSC analyse som inneholder PE-Cyanine7-konjugerte anti-VE-Cadherin, PerCP-konjugerte anti-CD45, PE-konjugerte anti-EPCR, APC-konjugerte anti-Sca1 og FITC-konjugerte anti-Gr1 og anti-F4/80 (hver antistoff på 1: 100 siste fortynning med mindre annet er angitt basert på anbefalingene fra produsenten eller ifølge titrations). Inkuber platen ved 4 ° C i minst 20 min.
-
Fjern ubundet antistoff med sekvensiell fortynninger og analysere cellene.
- Legge til 200 µL/godt PBS/2% FBS og sentrifuger 300 x g i 2 minutter til pellets cellene. Deretter Bla plate å forkaste nedbryting og legge 200 µL PBS/2% FBS til hver celle pellets og sentrifuge 300 x g i 2 minutter til pellets celler.
- Bla platen forkaste nedbryting og legge til 50 µL/vel PBS/2% FBS for analyse. Fortsett å analysere celler av FACS ved hjelp av en flyt cytometer utstyrt med en plate-leser.
Merk: Kjøpe en fast mengde celler (f.eks, 35 µL av den totale 50 µL brukes for re-oppheng) til å nummerere delsettene blodkreft Progeny.
-
Analysere FACS dataene for hver brønn som inneholder blodkreft avkom til skjermen for kolonier som inneholder HSC potensielle (Figur 3).
- Gate først CD45 positiv befolkningen som er negativt for myelogen markører Gr1 og F480. Ikke gate ut celler som uttrykker fortsatt lave nivåer av VE-Cadherin. Celler fra AGM-EC laget som er forstyrret under innhøstingen av blodkreft koloniene er VE-Cadherin positive og CD45 negative.
- Gate CD45+VE-Cad- / lavGr1-F4/80- celler videre delsettet som uttrykker høye nivåer av EPCR og Sca1 (figur 3A -C).
Merk: I tidligere studier, kolonier mangler celler med CD45+VE-Cad- / lavGr1-F4/80-Sca1HeiEPCRHei fenotypen (figur 3D) reproduserbar kunne gi synlig multilineage perifert blod engraftment i bestrålt mottaker mus17 (data ikke vist). disse kolonier trenger dermed ikke inkluderes i den påfølgende transplantasjon analysen i trinn 6.
6. analyse av Engraftment egenskaper av personlige Clones og sammenheng med fenotypiske egenskaper belyst av indeks sortering
- Dag (hvis mulig) eller morgenen etter fenotypiske analyse i trinn 5, nytt suspendert resterende 100 µL cellene fra hver 96-brønnen som inneholder blodkreft koloniene etter co kultur (fra trinn 5.1) av energisk pipettering bruker et 200 µL pipette tips.
-
Forberede og legge til unnsetning celler fra hele benmargen av congenic stamme B6. SJL-PtprcenPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) voksen mus16,17.
- Telle kjerne bein margtransplantasjon celler i Turks løsningen under en hemocytometer. Fortynne til en konsentrasjon av 5 x 105 nucleated celler/mL i PBS med 2% FBS.
- Legg 100 µL redning bein margtransplantasjon celler (5 x 104) hver brønn som inneholder blodkreft avkom for transplantasjon analyse og bland av pipettering.
-
Transplantasjon avkom av personlige kloner i én bestrålt drepende mottaker congenic belastning B6. SJL-PtprcenPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) voksen mus.
- Drepende irradiate samme antall B6 CD45.1 mus som antall kloner å injisere individuelt avkom av en enkel klone (med 1000 cGy fra en Cesium kilde).
- Trekke 200 µL total-celle suspensjon (Dette inkluderer celler fra klone og 5 x 104 B6 CD45.1 hjelpe bein margtransplantasjon celler) i en ½ mL insulinsprøyte med en 29 G ½ tommers nål.
- Drepende irradiate B6 CD45.1 voksen mottakere 2-24 h før injeksjon.
- Bruker en plast mus restrainer som gir hale tilgang, injisere via hale blodåre 200 µL volumet som inneholder både celler fra hver klone og 5 x 104 B6 CD45.1 voksen benmarg redning celler å hjelpe mottakeren overlevelse.
- Øre tag og veie mottaker musene, og kontrollere sin vekt/helse regelmessig (f.eks3 - 4 ganger / uke post bestråling/transplantasjon, eller per individuelle institusjonelle standard operasjonsprosedyrer) å sikre god helse.
-
Utføre analyse av perifert blod engraftment regelmessig (f.eks2, 16, 24 uker) etter transplantasjon.
- Fjerne 50-100 µL av blod via retro-orbital utfallende eller en annen etisk godkjent blod la metode.
- Legge 3 mL lyseringsbuffer (16,6 g NH4Cl, 2 g NaHCO3 og 74.4 mg EDTA 2 L H2O) til blod og ruge ved romtemperatur for 5 min. sentrifuge på 300 x g for 5 min. leveringstanken og å utsette pellets med 2 mL PBS/2% FBS. Sentrifuge 300 x g i 5 min.
- Nytt utsette pellets med 150 µL PBS/2% FBS med 10 µg/mL FcR blokk og 1 µg/mL DAPI og dispensere 1/3 av volumet til et godt med 50 µL isotype kontroller for giver og linje, 1/3 til et godt inneholder 50 µL antistoff for giver og isotype kontroller for linjen , og 1/3 til et godt som inneholder 50 µL antistoffer til å oppdage både giver og avstamning.
Merk: Antistoffer for gjenkjenning av multilineage engraftment: APCeFluor780-konjugerte anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-konjugerte anti-CD45.1, FITC-konjugerte anti-CD3, PE-konjugerte anti-F4/80, PerCP-konjugerte anti-Gr1 og APC-konjugerte anti-CD19, eller relevante isotype kontroller. - Identifisere kloner med langsiktige engraftment ved å vurdere perifert blod bidrag av FACS over tid av CD45.2 (giveren)-avledet blodkreft cellene myelogen (Gr1 og/eller F4/80 positiv), B-celle (CD19 positiv) og T-celle (CD3 positiv) (figur 4A -B).
Merk: Blodkreft engraftment kan også analyseres ved CD45.2 (giveren)-avledet blodkreft bestander bidrag fra vev høstet fra benmargen, milt, thymus og peritoneum, eller etter videregående transplantasjon av benmarg celler i B6 CD45.1 mus analysere føljetong engraftment egenskaper17.
- Relatere hver klone fenotypiske egenskaper som bestemmes av første enkeltcelle indeks sortering med engraftment egenskaper. Bruker flyt analyseprogramvare, laste opp Skjemasorteringsparametere for hver indeks-sortert celle (korrelert til 96-brønnen som det ble sortert). Funksjonell kartdata på flyt tomter å evaluere fenotypiske egenskapene for enkeltceller i forhold til sine funksjonelle utgang (for eksempel langsiktige, multilineage engraftment) (figur 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser en skjematisk av eksperimentell design. Når P-Sp/AGM vev dissekert, samlet og avstand i collagenase, er de farget med antistoffer mot VE-Cadherin og EPCR for indeks sortering. Pre-HSC er beriket i celler sortert på VE-Cadherin+EPCRhøy (figur 1B). Andre fluorochrome-konjugerte antistoffer kan inkluderes ettertid analysere flere fenotypiske parametere, som er registrert for hver celle i indeksen sortering. I dette representant eksperimentet fra E11 generalforsamlingen, er cellene også farget med FITC-konjugerte anti-CD45 og anti-CD41 PE-konjugerte antistoffer. Heterogenitet i VE-Cadherin+EPCRhøy befolkningen i disse blodkreft-spesifikke markørene er observert (figur 1 c), forenlig med den kjente asynchrony i blodkreft utvikling på dette stadiet5.
Etter indeks sortering av VE-Cadherin+EPCRhøy generalforsamlingen enkeltceller personlige 96-brønner med AGM-EC i generalforsamlingen serum-frie medier og cytokiner, koloni formasjon oppstår. Først integrere sortert VE-Cadherin+EPCRhøy generalforsamlingen celler AGM-EC laget før de begynner å runde opp og danne blodkreft klynger (figur 2A, vist her fra celler sortert fra en transgene murine embryoet uttrykke GFP under Ly6a promoter21, å skille dem fra det AGM-EC stroma). Etter 5-7 dager co kultur, kan kolonier av ulike størrelser og morphologies oppdages ved inspeksjon med en invertert mikroskopet (figur 2B), vist her fra en representant eksperiment, 6 dager etter sortering fra E11 generalforsamlingen.
Neste, fenotypiske analyse av FACS utføres på halvparten av avkommet fra hver VE-Cadherin+EPCRhøy celle som har dannet en blodkreft koloni. Kolonier som inneholder celler med HSC fenotypen identifiseres som VE-Cadherin- / lavGr1-F4/80-CD45+Sca1HeiEPCRHei (Figur 3). Her viser vi fire forskjellige koloniene innhentet etter co kultur av indeks-sortert E11 generalforsamlingen VE-Cadherin+EPCRhøy celler, tre som inneholder forskjellige andelen fenotypiske HSC med andre mer differensiert celletyper (figur 3A -C), og fjerde mangler celler med HSC fenotypen (figur 3D). Antall kolonier observert per antall celler belagt og prosenten som resulterte i engraftable stilk cellen kolonier varierer avhengig av embryonale alder og sorteringen utføres. VE-Cadherin- / lavGr1-F4/80-CD45+Sca1HeiEPCRHei E11 generalforsamlingen kloner genererte 53 ± 15 kolonier av 192 celler belagt med 5% ± 1,3% 192 cellene belagt generere kloner som engrafted lang begrepet (gjennomsnittlig ± SD for 3 eksperimenter).
Til relatere fenotypen med engraftment potensielle, den resterende halvdelen av avkommet fra hver VE-Cadherin+EPCRhøy celle som har dannet en blodkreft koloni som inneholder celler med HSC fenotypen oppdaget av FACS (f.eksden kolonier i figur 3A-C) er transplanted til bestrålt (1000 cGy) voksen congenic belastning (B6 CD45.1) mus med en dose av redning celler fra B6 CD45.1 benmarg. Langsiktig multilineage engraftment er bekreftet for hver klone etter donor (CD45.2) bidrag til myelogen (Gr1 og F4/80), B-celle (CD19) og T-celle (CD3) kupé av perifert blod over tid (figur 4A). Selv om de fleste kolonier som inneholder celler med HSC fenotypen oppdaget av FACS gir langsiktige engraftment, er transplantasjon nødvendig for å bekrefte funksjonelle multilineage engraftment som noen kloner miste engraftment over tid (figur 4B) eller vise Unik engraftment egenskaper som lymfoid-partisk engraftment (data ikke vist). Når funksjonelle HSC potensialet av hver VE-Cadherin+EPCRhøy Klon bestemmes, er dette korrelert til at klone indeks sortering parametere for å identifisere sine presise fenotypiske egenskaper. I dette eksemplet ser vi at funksjonelt bekreftet pre-HSC kloner (røde prikker) er heterogene i deres uttrykk for CD41 og CD45, samsvar med etablerte dynamisk uttrykk for disse markørene under pre-HSC modningsprosess for HSC (figur 4C). Kloner danner blodkreft kolonier men enten mangler HSC potensial fenotypiske screening eller fravær av langsiktig, multilineage engraftment etter transplantasjon (ikke-HSC hemogenic kloner, blå prikker) er også heterogene CD41 og CD45, Selv om et delsett express sammenlignet høyere nivåer av CD41 med pre-HSC kloner, som er hovedsakelig CD41lav. Kloner som ikke danne blodkreft kolonier (ikke-hemogenic kloner, lys grønne prikker) er hovedsakelig CD41- / lavCD45-, noe som sannsynligvis gjenspeiler ikke-hemogenic VE-Cadherin+EPCRhøy endotelceller.
Figur 1: oversikt over protokoll og representant flyt cytometri analyse for indeksen sortering av single celler. (A) skjematisk fremstilling av protokollen. (B) flyt cytometri analyse av dissosiert E11 generalforsamlingen celler viser gating strategi for indeksen sortering av VE-Cadherin+EPCRhøy celler beriket for pre-HSC (analyse med FACS analyseprogramvare). Tallene i hver gate representerer prosent av celler. (C) Flow cytometri analyse viser CD41 og CD45 flekker i befolkningen VE-Cadherin+EPCRhøy . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: dannelsen av blodkreft koloniene under AGM-EC co kultur. (A) tidsinnstilt bildebehandling VE-Cadherin+EPCRhøyGFP+ sortert celler fra Ly6a-GFP transgene embryo21 co kultivert på AGM-EC. Skala barer i µm vises nederst til venstre i hvert bilde. (B) representant kolonier dannet fra VE-Cadherin+EPCRhøy indeks-sortert enkeltceller etter 6 dager co kultur på AGM-EC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Flow cytometri analyse av avkommet fra en enkelt E11 AGM-avledet VE-Cadherin+EPCRhøy celler etter co kultur på AGM-EC. Gating for celler med HSC potensial vises som delsettet er VE-Cadherin- / lavGr1-F4/80- (venstre panel), CD45+ (midtre panelet), og Sca1HeiEPCRHei (høyre panel). (A) representant koloni bestående av en homogen populasjon av celler med HSC fenotypen. (B-C) Representant kolonier som inneholder en blanding av celler med HSC fenotypen og mer differensierte celletyper. (D) representant koloni bestående av celler mangler HSC fenotypen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: analyse av perifert blod engraftment Progeny personlige kloner etter AGM-EC co kultur og sammenheng med indeks sortering parametere. (A) Donor CD45.2-avledet perifert blod engraftment av myelogen (Gr1 og F4/80), B-celle (CD19) og T-celle (CD3) delsett fra en representant mottaker (B6 CD45.1) transplantert med avkom av personlige E11 VE-Cadherin+EPCRhøy klone etter AGM-EC co kultur. (B) Donor CD45.2-avledet perifert blod engraftment over tid etter transplantasjon av avkom av personlige E11 VE-Cadherin+EPCRhøy kloner etter AGM-EC co kultur. (C) korrelasjon av CD41 og CD45 uttrykk for hver indeks sortert VE-Cadherin+EPCRhøy klone med HSC potensial følgende AGM-EC co kultur basert på langsiktige, multilineage engraftment i transplantasjon analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet av HSC genesis under embryonale utviklingen nødvendiggjør måte å oppdage HSC i hemogenic forløpere ennå manglet kompetanse til å gi langsiktig multilineage blodkreft rekonstituering i transplantert voksen mottakere. I denne protokollen presenterer vi en klonal analysen av embryonale hemogenic prekursorer av stromal co kultur på vaskulær nisje ECs fra generalforsamlingen, som støtter modning av forløpere til HSC, med påfølgende funksjonell analyse i transplantasjon analyser. Innlemmelse av indeks sortering tillatelser retrospektiv analyse av fenotypiske parametere for å karakterisere egenskaper for pre-HSC som definert av overflate markører inkludert i analysen. Denne tilnærmingen gir dermed en fordel over andre metoder som bruker bulk sortering av forløperen populasjoner med re-aggregation-baserte HSC analyser4,5,10, muliggjør effektiv screening for potensielle markører av pre-HSC samtidig gir informasjon om den relative uttrykk overflate markører for hver celle. Med denne metoden, for eksempel rapporterte tidligere vi at i tillegg til EPCR å berike for pre-HSC bestander på ulike stadier av utviklingen, middels uttrykk for hakk ligand Dll4 definert en subpopulasjon av klonal VE-Cadherin+EPCR+ forløpere med HSC potensial, mens Dll4 negative VE-Cadherin+EPCR+ hemogenic forløpere hovedsakelig manglet HSC potensielle17.
En annen fordel med denne metoden er evnen å skjermen for HSC potensielle umiddelbart etter co kultur basert på deteksjon av blodkreft avkom med en fenotypen (VE-Cadherin- / lavGr1-F4/80-CD45+Sca1 HeiEPCRHei) som er korrelert med langsiktige, multilineage engraftment. Dette eliminerer behovet å transplantere kolonier mangler blodkreft avkom med denne HSC fenotype, som disse koloniene ikke gir langsiktige engraftment i transplantasjon analyser. Videre er innledende informasjon skille potensielle pre-HSC fra hemogenic forløpere mangler HSC potensial umiddelbart etter co kultur, uten behovet å avvente resultater fra langvarig engraftment analyser, nyttig, for eksempel i raskt screening kandidat angir HSC-prekursorer. Men gir korrelasjon av fenotypiske data med langsiktige engraftment etter transplantasjon mer verdifull innsikt i varianter av egenskapene nøyaktig engraftment av pre-HSC kloner. Vi fant, for eksempel at klonal pre-HSC fra P-Sp/AGM regionen mellom E9.5 og E11.5 har unike potensiale til å gi opphav til både B1a og B2-lymfocytter, mens B1a-lymfocytt potensialet er mangelfull i voksen HSC17. Videre oppdaget vi en evolusjon i egenskapene engraftment av pre-HSC kloner mellom E9.5 og E11.5 med tidligere pre-HSC demonstrere en relative skew mot peritoneal B1a vers B2-lymfocytt engraftment og mindre robust selvtillit fornyelse potensial basert Søk17på sekundære transplantasjon.
Denne protokollen gir en verdifull tilnærming for å belyse de unike egenskapene til klonal HSC forløpere, finnes det noen begrensninger som må erkjennes. Selv om påvisning av avkom med HSC fenotypiske av FACS etter AGM-EC co kultur er generelt korrelert til langsiktig multilineage engraftment, gi noen kolonier med denne fenotypen bare kortsiktige engraftment eller engraftment mangelfull i én eller flere blodkreft linjene (figur 4B, data ikke vist). Derfor forblir transplantasjon gullstandarden i validere funksjonelle HSC. Videre, det kan ikke utelukkes at noen av forskjellene i engraftment egenskaper av pre-HSC kloner, snarere enn gjenspeiler celle-iboende forskjeller i hemogenic forløper potensial, kan skyldes Stokastisk variasjon under AGM-EC co kultur i selvtillit fornyelse vers differensiering avgjørelser, som pre-HSC samtidig modnes til HSC og gjennomgår celledelinger. Faktisk dette kan delvis kontoen for den observerte heterogeniteten kolonien morfologi og fenotypen av celler generert fra personlige pre-HSC kloner (f.eks figur 3A-C), og kan resultere i en undervurdering av pre-HSC av Denne analysen om ikke alle potensielle pre-HSC kloner oppdages av generasjon av funksjonelle HSC etter AGM-EC co kultur. Men gir evnen til å skille funksjonelt forskjellige hemogenic kloner av deres differensial gjengivelsen av unike fenotypiske markører (for eksempel Dll417) aktiveres av denne metoden et middel til å identifisere subpopulasjoner av hemogenic forløpere med iboende celle-iboende forskjeller.
Bygge på denne grunnleggende protokollen, kan en rekke utvidede programmer inkluderes å lære blodkreft potensialet i klonal hemogenic forløpere under utvikling. Utover bruken av antistoffer til å søke etter overflate markører, uttrykk for fluorescens markører i transgene embryoer (f.eks., Ly6a- GFP21 eller Runx1 -GFP22 uttrykt i hemogenic endotelet/pre-HSC) kan innebygd indeks sortering av hemogenic prekursorer. I tillegg til transplantasjon analyser etter AGM-EC co kultur for å oppdage mulige pre-HSC, kan avkom også bli vurdert for blodkreft avstamning potensielle basert på sekundære i vitro analyser, for eksempel kultur på OP9 eller OP9-Dl1 for å oppdage B - og T-celle potensielle23eller clonogenic koloni danner analyser i methylcellulose å oppdage erythromyeloid potensial. Faktisk noen av de ikke-HSC hemogenic Klonene (f.eks figur 3D) sannsynligvis representerer multipotent progenitors, erythromyeloid progenitors, eller T - og B-celle progenitors tidligere beskrevet som forut og er uavhengige av HSC utvikling 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28og denne analysen kan ytterligere forenkle klonal studier av disse forskjellige bølger av blodkreft forløpere. Til slutt, indeks sortering av pre-HSC kan kombineres med andre nedstrøms analyser som enkelt celle RNA-sekvensering, å korrelere fenotypiske egenskaper med globale transcriptional profiler utvikle HSC prekursorer. Til sammen inneholder denne protokollen en metode for robust analyse av klonal hematopoiesis fra embryonale hemogenic prekursorer som bør gi romanen innsikt i HSC utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Andrew Berger, Stacey Dozono og Brian Raden i Fred Hutchinson Flow cytometri kjernen for hjelp med FACS. Dette arbeidet ble støttet av den nasjonale institutter for helse NHLBI UO1 grant #HL100395, tilknyttede samarbeidende Grant #HL099997, og NIDDK gir #RC2DK114777. Brandon Hadland støttes av Alex's Lemonade Stand Foundation og Hyundai Hope på hjul fundament.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
References
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
- Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
- Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
- Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
- Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
- Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
- Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
- Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
- Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
- Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
- deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
- Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
- Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
- Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
- Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
- Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
- Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).
