Summary
Nous présentons ici la méthodologie pour l’analyse clonale de cellules souches hématopoïétiques précurseurs au cours du développement embryonnaire murin. Nous combinons indice tri des cellules individuelles de la région d’aorte-gonades-mésonéphros embryonnaire avec co-culture de cellules endothéliales et la transplantation pour caractériser les propriétés phénotypiques et le potentiel de prise de greffe des précurseurs hématopoïétiques unique.
Abstract
La possibilité d’étudier la genèse des cellules souches hématopoïétiques (CSH) durant le développement embryonnaire a été limitée par la rareté des précurseurs de l’HSC dans l’embryon précoce et le manque de tests qui fonctionnellement identifier le potentiel à long terme de la prise de greffe multilignée de précurseurs HSC putatifs individuels. Nous décrivons ici la méthodologie permettant l’isolement et la caractérisation des précurseurs d’HSC fonctionnellement validés au niveau de la cellule unique. Tout d’abord, nous utilisons indice tri pour cataloguer le paramètre phénotypique précis de chaque cellule individuellement trié, en utilisant une combinaison de marqueurs phénotypiques d’enrichir des précurseurs de l’HSC avec des marqueurs supplémentaires pour l’analyse expérimentale. Deuxièmement, chaque cellule index-triées est co cultivée avec le stroma vasculaire niche de la région aorte-gonades-mésonéphros (AGA), qui prend en charge la maturation des précurseurs des HSC non-faire une exception HSC fonctionnelle avec greffe multilignée, à long terme potentiel dans essais de transplantation. Cette méthodologie permet la corrélation des propriétés phénotypiques des précurseurs hemogenic clonale avec leur potentiel fonctionnel de greffe ou d’autres propriétés telles que profil transcriptionnel, fournissant un moyen pour l’analyse détaillée des précurseurs de l’HSC développement à l’échelle de la cellule unique.
Introduction
Clonales études ont révélé une hétérogénéité dans les propriétés à long terme de greffe de CSH adultes, donnant un aperçu nouveau en sous-types HSC et changements dans le comportement HSC au cours du vieillissement1. Toutefois, des études similaires de CSH embryonnaires et de leurs précurseurs ont été plus difficile. Au début du développement embryonnaire, CSH proviennent d’une population de précurseurs connus hemogenic l’endothélium dans un processus transitoire visé à comme l’endothélium hématopoïétiques transition2. Le premier HSC, défini par leur capacité à fournir la greffe multilignée robuste, à long terme, suite à une transplantation en conditionné bénéficiaires adultes, ne sont pas détectées jusqu’après jour embryonnaire 10,5 (E10.5) chez l’embryon de souris, à très basse fréquence3 . Au cours de leur développement, précurseurs des HSC (pre-HSC) découlant de l’endothélium hemogenic doivent être soumis à maturation avant d’acquérir les propriétés de HSC adulte qui permettent une prise de greffe efficace en transplantation essais4,5 , 6. obscurcissant l’étude d’origine rare de HSC, une multitude de progéniteurs hématopoïétiques avec érythroïdes, potentiel myéloïde et lymphoïde sont déjà détectés avant l’émergence du HSC de pre-HSC7,8. Distinguer pré-HSC des autres progéniteurs hématopoïétiques requiert donc des méthodes pour isoler par clonage des cellules et de leur fournir les signaux suffisants pour leur maturation à HSC, de détecter leurs propriétés de greffe lors d’essais de transplantation.
Plusieurs approches ont été décrits qui permettait de détecter des pré-HSC de maturation en vivo ou ex vivo de HSC. Ex vivo méthodes ont compté sur la culture des tissus embryonnaires, telles que la région de l’AGM, où le premier HSC sont décelées dans développement9. S’appuyant sur ces méthodes, protocoles qui incorporent la dissociation, tri et re-agrégation des tissus AGM ont permis la caractérisation des populations triées contenant des précurseurs de l’HSC au cours du développement de E9.5 à E11.5 dans le para-aortique splanchnopleura (P-Sp) / AGM régions4,5,10; Cependant, ces approches ne sont pas disposés à haut débit analyse des précurseurs au niveau de la cellule unique requis pour l’analyse clonale. De même, in vivo la maturation par greffe sur des souris nouveau-nées, où le microenvironnement est censé mieux convenir à l’appui des premiers stades des précurseurs de l’HSC, a également permis des études de populations triées du sac vitellin et AGM / P-Sp (P-Sp est la région de précurseur à l’AGA) présentant des caractéristiques de pre-HSC, mais ces méthodes aussi ne parviennent pas à fournir une plate-forme robuste simple cellule analyse11,12.
Études de Mustafa et coll. ont démontré que cette stroma Akt-lancée de cellules endothéliales (EC) peut fournir un substrat de niche pour le soutien des adultes HSC autorenouvellement in vitro13,14,,15. Nous avons récemment déterminé que ce Akt-activé, dérivé de la région de l’Assemblée générale annuelle (AGM-EC) prévoit une niche adapté en vitro la maturation des précurseurs hemogenic, isolé dès E9 dans le développement, à faire une exception adulte HSC, ainsi que la suite l’auto-renouvellement de généré HSC16. Étant donné que ce système utilise une simple culture CO 2 dimensions, il est facilement adaptable pour analyse clonale du potentiel HSC des précurseurs hemogenic isolés individuellement.
Nous avons récemment rapporté une approche pour analyser le potentiel HSC des précurseurs hemogenic clonale en combinant indice tri des précurseurs chimiques individuels hemogenic embryons murins avec co-culture AGM-EC et les analyses fonctionnelles en transplantation des analyses de17. Index de tri est un mode de fluorescence-lancée de cellules triant (FACS) qui enregistre (index) tous les paramètres phénotypiques (c'est-à-direavant dispersion (FSC-A), côté scatter (SSC-A), fluorescence paramètres) de chaque cellule individuellement trié tel que ces caractéristiques peuvent être rétrospectivement corrélés ultérieures analyse fonctionnelle après tri. FACS logiciel enregistre les deux informations phénotypiques pour chaque cellule et la position/puits de la plaque à 96 puits dans lequel il a été placé. Cette technique a déjà été élégamment utilisée pour identifier l’hétérogénéité adulte HSC, déterminer les paramètres phénotypiques encore enrichissent pour le sous-ensemble après à long terme de HSC et corrèlent phénotypiques paramètres de HSC avec transcription Propriétés sur le single cell niveau18,19. Ici, nous fournissons une méthodologie détaillée de cette approche qui permet l’identification des paramètres phénotypiques uniques et les contributions de la lignée de pre-HSC durant les premiers stades du développement embryonnaire.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) du Fred Hutchinson Cancer Research Center.
1. préparation des AGM-EC monocouches de co-culture
- 24 h avant la dissection de l’AGA et trier, faire AGA-ce milieux de culture et filtre stériliser.
- Ajouter 0,1 % de gélatine dans l’eau (100 µL/puits) dans chaque puits d’une plaque 96 puits et incuber à température ambiante pendant 15 min. aspirer les feuilles de gélatine et laisser la plaque sous une hotte de culture tissulaire avec le couvercle retiré jusqu'à ce que les puits sont à secs.
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Dissocier les monocouches de AGM-EC et plaque pour plaques 96 puits.
Remarque : Maintenir l’AGA-EC, préparée comme décrite précédemment16dans les milieux de culture AGM-ce. Par souci de cohérence, les lignées de cellules AGM-EC devraient être congelées dès qu’un nombre suffisant est obtenu (généralement le passage 1-3) et utilisées dans un certain nombre de passage défini (généralement le passage 5-12) pour des expériences de culture mixte. Lignées cellulaires AGM-EC sont dérivées de C57BL/6J (CD45.2) Assemblée générale annuelle. Consultez la Table des matières pour toutes les compositions de médias.- Aspirer les médias de la culture de l’Assemblée générale annuelle-EC dans une fiole de2 75 cm et ajouter 5 mL de PBS. Aspirer les PBS et ajouter 3 mL de solution de trypsine (voir Table des matières).
- Incuber à 37 ° C pendant 2-4 min jusqu'à ce que la plupart des cellules sont soulever la plaque. Ajouter 7 mL de milieu de culture de AGM-EC et pipette 8 - 10 fois avec une pipette de 10 mL pour préparer la suspension de cellules individuelles et transférer dans un tube de 15 mL.
- Filer à 300 x g pendant 5 min, retirez le surnageant, remettre en suspension dans 10 mL de milieu de culture AGM-ce et estimer le nombre de cellules avec un hémocytomètre. Diluer les cellules à une concentration de 1 x 105 cellules/mL dans les milieux de culture AGM-EC.
- Ajouter 100 µL AGM-EC cellule de suspension (1 x 104 cellules) dans chaque puits d’une plaque de 96 puits gélatinisée. Place dans un 37 ° C, 5 % CO2 vitroplants incubateur durant la nuit pour permettre à l’Assemblée générale annuelle-EC joindre et former une monocouche confluente.
NOTE : Répartir uniformément le cellules stromales AGM-EC donc il n’y a limité la prolifération ou la cellule s’agglutiner pour co-culture optimale. -
Préparer la monocouche AGM-EC co-culture AGM.
- Le lendemain matin, préparer les milieux sans sérum AGM.
- À l’aide d’une pipette multicanaux 12 puits, retirez le support de culture de AGM-ce de l’AGM-EC et ajouter 200 µL/puits de médias AGM sans sérum sans cytokines laver par tout média résiduels contenant du sérum.
- Retirez le support et ajouter 200 µL/puits des médias AGM sans sérum avec les cytokines. Travailler rapidement en retirant et en ajoutant le support pour que la couche endothéliale n’est pas compromise ; par exemple, supprimer et rajouter une ligne de médias à la fois. Placer les plaques de 96 puits dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules embryonnaires sont prêts pour le tri.
2. préparation de la Suspension de la cellule unique de tissus embryonnaires murines
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Disséquer l’AGA dans chronométré de culture.
- Mis en place des accouplements chronométré pour générer des tissus embryonnaires de l’âge désiré.
- Récolte des embryons de femelles gravides à 9,5 à 11,5 jours post coitum (dpc), selon le stade de pre-HSC à analyser.
Remarque : Les tissus embryonnaires sont récoltées de souris C57BL/6J (CD45.2), comme décrit précédemment et précisément mis en scène somite basé sur comte16. Nous avons mis l’accent sur l’analyse des populations de la région embryonnaire de l’AGA et son précurseur, le P-Sp, entre E9.5 à E11.5, basé sur la mise en scène du somite. - L’Assemblée générale annuelle du20embryons de disséquer.
Remarque : Les protocoles détaillés pour la dissection de l’AGM d’embryons murins ont été publiées par d’autres20. Alternativement, sac vitellin ou autres tissus était censées avoir pré-HSC activité pourraient également être analysés par cette méthode.
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Dissocier les tissus embryonnaires disséqués.
- Recueillir les tissus disséqués dans un tube conique 15 mL contenant 10 mL de PBS avec 10 % BF sur la glace. Gravité régler les tissus, aspirer le PBS/FBS et puis immédiatement ajouter 1 mL de collagénase de 0,25 % et la place dans un bain-marie à 37 ° C pendant 25 min.
- Ajouter 1 mL de PBS/10% FBS et pipette de 20 - 30 fois avec une pointe de pipette de 1 mL pour obtenir une suspension de cellules du même. Ajoutez 8 mL de PBS/10% FBS supplémentaire et centrifugeuse de cellules à 300 g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
3. anticorps coloration des cellules embryonnaires murines
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Préparer le tampon de blocage pour la coloration des anticorps.
- Ajoute 1 mL de PBS avec 10 % de 10 µg/mL anti-souris CD16/CD32 (bloc de récepteur (FcR) Fc) et 1 µg/mL DAPI (stock 1 mg/mL H2O) FBS.
- Dresser dans une seringue de 3 mL et passer à travers un filtre de seringue 0,22 µm pour stériliser. Resuspendre le culot cellulaire des tissus murins embryonnaires dissociées (de l’étape 2.2.2) dans le blocage de 500 µL de tampon et incuber sur glace pendant 5 min.
- Préparer le mélange d’anticorps17.
- Ajoutez le bloc de FcR de 10 µg/mL à 1 mL de PBS avec 10 % FBS et 10 µL de chaque anticorps anti-VE-cadhérine fluorochrome-conjuguées (CD144, voir la Table des matières) et les anticorps anti-EPCR fluorochrome-conjuguées (CD201, voir la Table des matières). Utiliser une dilution finale 1/100 d’anticorps sauf indication contraire basé sur les recommandations du fabricant ou selon les titrages.
Remarque : Cette combinaison d’anticorps est utilisée pour définir les portes pour le tri, comme décrit ci-dessous (étape 4.2). Tri basé sur la co-expression de la VE-cadhérine et EPCR permet un enrichissement significatif pour la partie de cellules dérivées d’AGM contenant l’activité précurseur HSC, comme décrit précédemment17. - Ajouter d’autres anticorps fluorochrome-conjuguées pour analyse phénotypique des précurseurs d’index-triées individuels.
Remarque : Ces anticorps ne sont pas nécessairement utilisés pour la définition de gates pour le tri. Dans ce protocole d’échantillonnage, nous avons inclus des anticorps anti-CD41 PE conjugué et anticorps anti-CD45 FITC conjugué pour analyser l’expression relative de ces marqueurs hématopoïétiques, qui évoluent au cours de l’émergence des pré-HSC d’endothélium hemogenic4 ,5,16,17. Autres marqueurs d’intérêt peuvent être inclus comme vous le souhaitez. Échantillons colorés avec contrôles anticorps conjugué fluorochrome isotype sont utilisés pour définir des portes négatives et positives pour l’analyse. - Dresser le mélange d’anticorps dans une seringue de 3 mL et passer à travers un filtre de seringue 0,22 µm à stériliser. Ajouter 500 µL du mélange anticorps à la suspension de cellules dans un tampon bloquant, pipette pour mélanger et incuber sur glace pendant au moins 15-20 min.
- Ajoutez le bloc de FcR de 10 µg/mL à 1 mL de PBS avec 10 % FBS et 10 µL de chaque anticorps anti-VE-cadhérine fluorochrome-conjuguées (CD144, voir la Table des matières) et les anticorps anti-EPCR fluorochrome-conjuguées (CD201, voir la Table des matières). Utiliser une dilution finale 1/100 d’anticorps sauf indication contraire basé sur les recommandations du fabricant ou selon les titrages.
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Laver les cellules colorées.
- Ajoutez 8 mL PBS/10% FBS. Centrifuger les cellules à 300 g pour 5 min, aspirer et remettre en suspension les cellules à pellets avec 1 mL PBS/10% FBS.
- Enlever les amas de cellules en pipettant également, la suspension cellulaire en établissant un plafond de crépine de cellule μm 35 sur un tube de 5 mL. Lavez le tamis cellulaire avec un autre 3 mL PBS/10% FBS. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min, aspirer, remettre en suspension dans 500 µL PBS/10% FBS et placer sur la glace jusqu'à FACS.
4. indice tri des précurseurs Hemogenic unique à 96 puits avec le Stroma AGM-EC pour co-culture
- Préparer la machine FACS pour le mode de la plaque et aligner le tri aux plaques de 96 puits selon les instructions du fabricant. Sélectionnez le mode de cellule unique et indice tri mode dans le logiciel pour les paramètres du masque pureté maximale et permettre l’acquisition des paramètres d’index de chaque cellule triée.
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Acquérir un échantillon de cellules de l’anticorps teinté d’échantillons pour définir des portes pour le tri.
- Charger l’échantillon de cellules colorées sur la machine de FACS et d’acquérir des cellules au débit le plus bas. Tracer les versets FSC-a SSC-A et sélectionnez un portail qui contient des cellules de taille variable (Figure 1 b) (qui est basé sur l’observation que l’activité pré-HSC est identifiée dans les cellules des profils de taille différente à l' AGM17). Tracer des versets FSC-a FSC-W et SSC-A versets SSC-W, puis sélectionnez portes d’exclure les doublets. Tracer ensuite FSC-a versets DAPI à la porte des cellules vivantes (négatifs pour DAPI) (Figure 1 b).
- Reporter les PECy7 (ou le fluorochrome concerné pour la tache de la VE-cadhérine) contre PerCP (ou le fluorochrome concerné pour la tache EPCR). La porte des cellules qui sont positifs pour la VE-cadhérine (qui comprend une population mixte de cellules endothéliales ainsi que les progéniteurs hématopoïétiques et pré-HSC de l’AGA) et qui ont une expression EPCR élevée (qui enrichit pour pre-HSC du P-Sp/AGM17). C’est la porte finale qui sera utilisée pour trier des cellules individuelles à l’étape 4.3 (Figure 1 b) de l’index.
- Parcelle de terrain supplémentaires fluorochromes utilisés pour la coloration.
NOTE : Selon la sous-population à analyser, portes supplémentaires peuvent être définies selon la détection d’autres marqueurs inclus pour la coloration des cellules. Cependant, indice tri y permet l’enregistrement des paramètres fluorescents pour chaque cellule trié tels que ces paramètres peuvent être analysés a posteriori. Ainsi, aucun processus de blocage supplémentaire n’est nécessaire à ce stade. Pour toutes les configurations de FACS, échantillons colorées avec les anticorps unique doivent servir à régler la compensation, pour tenir compte des retombées dans l’émission de fluorochromes qui se chevauchent et avec des anticorps de contrôle isotype, pour tenir compte de la coloration de fond et de déterminer négatif/positif gates.
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Indice de trier les cellules AGM.
- Posez une plaque à 96 puits préparée avec le stroma AGM-EC dans les médias AGM sans sérum avec les cytokines (de l’étape 1.5.3) dans le bloc de la plaque de la machine de tri de FACs. Charge l’exemple et commencer l’acquisition de l’échantillon. Sélectionnez le mode de tri/single cell index et commencer sortingsingle cellules de 96-puits individuels. Utiliser le débit le plus bas pour minimiser les contraintes de cisaillement sur les cellules embryonnaires.
- S’assurer que tous les événements sont enregistrés pendant le tri d’index. Cette initiative permettra d’énumération du nombre total de cellules analysées dans la porte de tri relative aux 96 triés pour chaque nombre réels-puits, que pas tous les événements enregistrés seront triés à Herbert George wells.
- Une fois que les cellules ont été triés à une ensemble plaque 96 puits, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C, fixé à 5 % de CO2à culture de tissus. Répétez pour plaques supplémentaires requis par l’expérience.
- Cellules de co-culture individuellement trié à 96 puits contenant des AGM-EC (de l’étape 4.3) jusqu'à 7 jours (5 jours pour les cellules triés d’embryons E11-11,5, 6jours E10-10,5 embryons, de 7 jours à partir d’embryons E9-9,5). Visualiser les colonies hématopoïétiques de différentes tailles et morphologies avec un microscope inversé au grossissement X 100 (Figure 2 b) après la période de culture mixte.
NOTE : Les médias n’a pas à être changé pendant la période de culture mixte. Tri hemogenic précurseurs peuvent intégrer au départ de la couche de AGM-EC avec une morphologie de type EC et ne peut pas être initialement distingué de stroma AGM-EC (Figure 2 a). Toutefois, suivant 24-48 h en co-culture, petite, arrondies des cellules hématopoïétiques ou amas de cellules peuvent être détectées. À la fin de co-culture (5-7 jours), des colonies de cellules hématopoïétiques peuvent être visualisées dans le sous-ensemble de 96 puits ayant reçu une cellule triée avec potentiel hématopoïétique clonale. Si visuellement inspectés puits contiennent plus d’une colonie distincte, alors cet échantillon est exclu de l’analyse en aval d’exclure les échantillons ayant subi plusieurs cellules triées par puits.
5. analyse clonale progéniture hématopoïétiques suite co-culture
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Récolte de clones de 96 puits chacun pour l’analyse des FACS.
- Vigoureusement pipette de dissocier les cellules hématopoïétiques de couches endothéliales à l’aide d’une pipette multicanaux avec pointes de pipette 200 µL. Essayez de ne pas dissocier la couche endothéliale. Retirer 100 µL (environ 50 % de l’échantillon) pour une analyse phénotypique de la progéniture hématopoïétique de FACS.
- Transférer sur une plaque de fond en V 96 puits et centrifuger à 300 x g pendant 2 min granuler les cellules. Retirez le support effleurement des médias de la plaque avec un seul mouvement rapide tandis que la plaque est inversée (mettez la plaque).
- Placer le reste des 100 cellules µL dans la plaque à 96 puits originale dans une utilisation incubatorfor de 37 ° C dans l’essai de greffe ultérieure (étape 6).
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Incuber les cellules avec les anticorps appropriés pour l’analyse hématopoïétique.
- Remettre en suspension les granules cellulaires dans chaque puits de 96 puits V fond avec 50 µL de FBS PBS/2% contenant le bloc de FcR de 10 µg/mL et 1 µg/mL DAPI. Incuber les plaques à 4 ° C pendant 5 min.
- Ajouter 50 µL de FBS PBS/2% contenant le bloc de FcR de 10 µg/mL et un mélange d’anticorps pour l’analyse de l’HSC contenant PE-Cyanine7-conjugué anti-VE-cadhérine, PerCP-conjugué anti-CD45, PE-conjugué anti-EPCR, APC conjugué anti-Sca1 et conjugué FITC anti-Gr1 et anti-F4/80 (chaque anticorps à une dilution au 1/100 final sauf indication contraire fondée sur les recommandations du fabricant, ou selon les titrages). Incuber les plaques à 4 ° C pendant au moins 20 min.
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Éliminer les anticorps non lié avec dilution séquentielle et d’analyser les cellules.
- Ajouter 200 µL/puits PBS/2% FBS et centrifuger à 300 x g pendant 2 min granuler les cellules. Ensuite, balayez plaque pour éliminer le surnageant et ajouter 200 µL PBS/2% FBS chaque culot cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 2 min granuler des cellules.
- Feuilleter la plaque pour éliminer le surnageant et ajouter 50 µL/puits PBS/2% FBS pour analyse. Continuer d’analyser les cellules par FACS à l’aide d’un cytomètre en flux équipé d’un lecteur.
NOTE : Acquérir un volume fixe de cellules (par exemple, 35 µL de la 50µl totale utilisée pour la remise en suspension) pour énumérer les sous-ensembles de la progéniture hématopoïétique.
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Analyser les données de FACS pour chaque cupule contenant la progéniture hématopoïétique pour dépister les colonies qui contiennent HSC potentiel (Figure 3).
- Porte tout d’abord la population positive CD45 qui est négative pour les marqueurs myéloïdes Gr1 et F480. Porte pas les cellules qui expriment encore des niveaux faibles de la VE-cadhérine. Les cellules de la couche de AGM-EC qui sont perturbées pendant la récolte des colonies hématopoïétiques sont VE-cadhérine positif et négatif de CD45.
- Porte de CD45+VE-Cad- / lowGr1 cellules F4/80– –plus loin sur le sous-ensemble qui expriment des niveaux élevés de EPCR et Sca1 (Figure 3 a -C).
Remarque : dans les études antérieures, les colonies dépourvu de cellules avec CD45+VE-Cad- / lowGr1––de F4/80 Sca1SalutEPCRSalut phénotype (Figure 3D) façon reproductible n’a pas détectable greffe de sang périphérique multilignée souris irradiées de destinataire17 (données non présentées) ; ainsi, ces colonies ne doivent pas être inclus dans l’analyse de transplantation ultérieure à l’étape 6.
6. analyse des propriétés de la greffe de Clones individuels et corrélation avec les propriétés phénotypiques élucidées par le tri de l’Index
- Le jour de (si possible) ou le matin suivant l’analyse phénotypique à l’étape 5, remis en suspension le reste des 100 cellules µL de chaque 96 puits contenant des colonies hématopoïétiques après culture mixte (de l’étape 5.1) par pipetage vigoureux à l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL.
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Préparer et ajouter des cellules de sauvetage de toute la moelle osseuse de la souche congéniques B6. SJL-PtprcunPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) chez la souris adulte16,17.
- Compter les cellules nucléées de moelle osseuse en solution de Turcs sous un hémocytomètre. Diluée à une concentration de 5 x 105 nucléées cellules/mL dans du PBS contenant 2 % FBS.
- Ajouter 100 µL de cellules de moelle osseuse de sauvetage (5 x 10,4) dans chaque cupule contenant hématopoïétique progéniture pour l’analyse de la transplantation et la composition de pipetage.
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Transplanter la progéniture des clones individuels dans une souche unique congéniques destinataire mortellement irradiés B6. SJL-PtprcunPepcb/BoyJ (CD45.1 B6) souris adulte.
- Mortellement irradient le même nombre de souris B6 CD45.1 que le nombre de clones d’injecter individuellement les descendants d’un seul clone (à l’aide de 1 000 cGy provenant d’une source de césium).
- Tirage 200 µL de la suspension cellulaire totale (y compris les cellules du clone et cellules de moelle osseuse de 5 x 104 CD45.1 B6 sauvetage) dans une seringue à insuline ½ mL avec une aiguille de ½ pouce de 29 G.
- Mortellement irradient B6 CD45.1 bénéficiaires adultes 2 à 24 heures avant d’injection.
- À l’aide d’une drisse de souris en plastique qui permet d’accéder de la queue, injecter par le volume de 200 µL de veine de queue contenant les cellules de chaque clone et cellules 5 x 104 CD45.1 B6 la moelle osseuse adulte sauvetage pour aider à la survie de destinataire.
- Étiquette d’oreille et peser les souris bénéficiaires et vérifier leur poids/santé à intervalles réguliers (par exemple, 3 - 4 fois / semaine post irradiation/transplantation, ou par des modes opératoires normalisés institutionnels) pour assurer la bonne santé.
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Effectuer une analyse de prise de greffe de sang périphérique à intervalles réguliers (par exemple, 2, 16, 24 semaines) suite à une transplantation.
- Enlever 50-100 µL de sang via la rétro-orbitaire saigner ou toute autre méthode de laisser de sang approuvés sur le plan éthique.
- Ajouter 3 mL de tampon de lyse (16,6 g NH4Cl, 2 g de NaHCO3 et 74,4 mg EDTA à 2 L H2O) au sang et incuber à température ambiante pendant 5 min. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. aspirer et Resuspendre le culot avec 2 mL PBS/2% FBS. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
- Resuspendre le culot avec 150 µL PBS/2% BF 10 µg/mL FcR bloc conteneur et 1 µg/mL DAPI et verser 1/3 du volume d’un bien contenant 50 µL isotype des contrôles pour les donateurs et la lignée, 1/3 à un anticorps de 50 µL contenant bien pour les donateurs et isotype contrôles pour lineage et 1/3 dans une cupule contenant 50 µL anticorps pour détecter les pays donateurs et lignée.
Remarque : Les anticorps pour la détection de prise de greffe multilignée : APCeFluor780 conjugué anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-conjugué anti-CD45.1, conjugué FITC anti-CD3, PE-conjugué anti-F4/80, PerCP-conjugué anti-Gr1 et APC conjugué anti-CD19, ou contrôles pertinents isotype. - Identifier des clones avec greffe à long terme en évaluant l’apport de sang périphérique de FACS au fil du temps de CD45.2 (donateur)-dérivé des cellules hématopoïétiques myéloïdes (Gr1 et/ou F4/80 positif), cellules B (CD19 positif) et la cellule T (CD3 positifs) (Figure 4 a -B).
NOTE : Prise de greffe hématopoïétique peut également être analysé par CD45.2 (donateur)-dérivé contribution aux populations hématopoïétiques tissus récoltés de la moelle osseuse, rate, thymus et le péritoine, ou à la suite secondaire de transplantation de cellules de moelle osseuse chez des souris B6 CD45.1 pour analyser les propriétés de greffe série17.
- Corrélation entre les caractéristiques phénotypiques de chaque clone tel que déterminé par l’indice initial seule cellule Tri avec ses propriétés de greffe. À l’aide du logiciel d’analyse de flux, télécharger des paramètres de tri pour chaque cellule index-triées (en corrélation avec le 96 puits à laquelle il a été trié). Carte des données fonctionnelles sur les parcelles de flux pour évaluer les propriétés phénotypiques des cellules individuelles en ce qui concerne leur sortie fonctionnelle (par exemple, à long terme, multilignée greffe) (Figure 4).
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Representative Results
Figure 1 a montre une représentation schématique du plan expérimental. Une fois que les tissus P-Sp/AGM sont disséqués, mis en commun et dissociées dans collagènase, elles sont tachées avec anticorps anti-VE-cadhérine et EPCR pour le tri des index. Pre-HSC sont plus riches en cellules triées à la VE-cadhérine+EPCRélevé (Figure 1 b). Autres anticorps conjugués fluorochrome peuvent être incluses pour analyser rétrospectivement phénotypiques paramètres supplémentaires, qui sont enregistrées pour chaque cellule au cours de l’indice de tri. Dans cette expérience représentative de E11 AGA, les cellules sont aussi tachées conjugué FITC anti-CD45 et anticorps anti-CD41 PE-conjugués. L’hétérogénéité dans la populationélevée EPCR VE-cadhérine+pour ces marqueurs spécifiques hématopoïétique est observée (Figure 1), conforme à l’asynchronie connu en développement hématopoïétique à cette étape5.
Suite index tri des VE-cadhérine+EPCRhaute AGM monocellules à 96-puits individuels contenant AGM-EC dans un milieu sans sérum AGM et cytokines, formation de colonies se produit. Au départ, triée VE-cadhérine+EPCRhaute AGM cellules intègrent la couche AGM-EC avant de commencer à rassembler et former des grappes hématopoïétiques (Figure 2 a, montré ici des cellules triées à partir d’un embryon murin transgénique exprimant la GFP en vertu de la Ly6a promoteur21, pour les distinguer du stroma AGM-EC). Après 5-7 jours de culture mixte, colonies de différentes tailles et morphologies peuvent être détectées par une inspection avec un microscope inversé (Figure 2 b), montrée ici d’une expérience représentative, 6 jours après tri de E11 AGA.
Prochaine analyse phénotypique par FACS est effectuée sur la moitié de la descendance de chaque cellulehaute EPCR VE-cadhérine+, qui a formé une colonie hématopoïétique. Colonies contenant des cellules avec le phénotype HSC sont identifiées comme étant de la VE-cadhérine- / lowGr1–CD45 F4/80–+Sca1SalutEPCRSalut (Figure 3). Nous démontrons ici quatre différentes colonies obtenues suite co-culture d’index-triées E11 AGA VE-cadhérine+EPCRhaute cellules, trois contenant différentes proportions de HSC phénotypique avec les autres types de cellules plus différenciées (Figure 3 a –C), et le quatrième dépourvu de cellules avec le phénotype HSC (Figure 3D). Le nombre de colonies observées par le nombre de cellules plaqués et le pourcentage qui a donné lieu à des cellules souches engraftable colonies varie en fonction de l’âge embryonnaire et le tri effectué. VE-cadhérine- / lowGr1–CD45 F4/80–+Sca1SalutEPCRSalut E11 AGM clones généré 53 ± 15 colonies hors 192 cellules plaqués avec 5 % ± 1,3 % des 192 cellules génératrices plaqué clones implanté depuis longtemps terme (moyenne ± écart-type pour 3 expériences).
Pour établir une corrélation entre le phénotype avec greffe potentielle, l’autre moitié de la descendance de chaque cellulehaute EPCR VE-cadhérine+qui s’est formé une colonie hématopoïétique contenant des cellules avec phénotype HSC détecté par FACS (p. ex., les colonies représentées dans la Figure 3 a–C) est transplanté à la souris de souche (B6 CD45.1) adulte congéniques irradiées (1 000 cGy) avec une dose de cellules de sauvetage de moelle CD45.1 B6. À long terme multilignée prise de greffe est confirmé pour chaque clone par suite des contributions de donateurs (CD45.2) au myéloïde (Gr1 et F4/80), lymphocytes B (CD19) et compartiment de la cellule T (CD3) du sang périphérique au fil du temps (Figure 4 a). Même si la plupart des colonies contenant des cellules avec le phénotype HSC détecté par FACS une greffe à long terme, transplantation est nécessaire pour confirmer la greffe multilignée fonctionnelle comme certains clones perdent prise de greffe au fil du temps (Figure 4 b), ou afficher propriétés uniques de greffe comme greffe lymphoïdes biaisée (données non présentées). Une fois que le potentiel HSC fonctionnel de chaque clone dehaute +VE-cadhérine EPCR est déterminé, c’est en corrélation Retournez à de ce clone paramètres pour identifier ses caractéristiques phénotypiques précis de tri. Dans cet exemple, nous voyons que fonctionnellement confirmé pre-HSC clones (points rouges) sont hétérogènes dans leur expression de CD41 et CD45, compatibles avec une expression dynamique établie de ces marqueurs durant la maturation du pré-HSC à HSC (Figure 4). Clones formant des colonies hématopoïétiques mais un manque potentiel HSC par dépistage phénotypique ou par absence de longue durée, prise de greffe multilignée TRANSPLATATION (non-HSC hemogenic clones, points bleus) sont aussi hétérogènes pour CD41 et CD45, Bien qu’un sous-ensemble express des niveaux plus élevés de CD41 comparativement à pré-HSC clones, qui sont principalement CD41faible. Les clones qui ne forment pas de colonies hématopoïétiques (clones non-hemogenic, légers points verts) sont principalement CD41- / lowCD45-, qui reflètent probablement non-hemogenic VE-cadhérine+EPCRélevée des cellules endothéliales.
Figure 1 : vue d’ensemble du protocole et analyse en cytométrie en flux représentant indice dans le tri de simples cellules. (A) Représentation schématique du protocole. (B) écoulement cytometry analyse dissociés E11 AGA des cellules montrant gating stratégie indice dans le tri des VE-cadhérine+EPCRhaut cellules enrichies pour pre-HSC (analyse avec logiciel d’analyse de FACS). Nombres dans chaque porte représentent le pourcentage de cellules. (C) Flow cytometry analyse montrant CD41 et CD45 coloration au sein de la populationélevée EPCR VE-cadhérine+. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Formation de colonies hématopoïétiques au cours de la co-culture AGM-EC. (A) Time-lapse imagerie de cellules GFP+ trihauteEPCR VE-cadhérine+du Ly6a-GFP embryons transgéniques21 co cultivées sur AGA-EC. Barres d’échelle en µm s’affichent en bas à gauche de chaque image. (B) colonies représentatives forment de VE-cadhérine+EPCRhaut index-triées monocellules après que 6 jours co-culture sur AGA-EC. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse d’écoulement cytometry de la progéniture d’un dérivé E11 AGA VE-cadhérine+EPCRhaute monocellules suite co-culture sur AGA-EC. Blocage pour les cellules ayant un potentiel HSC est montré comme le sous-ensemble qui est VE-cadhérine- / lowGr1–F4/80– (panneau de gauche), CD45+ (panneau central) et Sca1SalutEPCRSalut (panneau de droite). (A) représentant colonie composée d’une population homogène de cellules avec le phénotype HSC. B–(C) Colonies représentatives contenant un mélange de cellules avec le phénotype HSC et plus des types de cellules différenciées. (D) colonie représentatif composé de cellules dépourvues du phénotype HSC. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : analyse de prise de greffe de sang périphérique de la progéniture des clones individuels suite co-culture AGM-EC et corrélation avec des index de paramètres de tri. (A), à la greffe donneur CD45.2 dérivés du sang périphérique de myéloïde (Gr1 et F4/80), lymphocytes B (CD19) et sous-ensembles de la cellule T (CD3) d’un bénéficiaire représentatif (B6 CD45.1) transplantés avec descendants d’individuel E11 VE-cadhérine+EPCRhaute clone suite co-culture AGM-EC. (B) circulants dérivés CD45.2 donneur de greffe au fil du temps après une transplantation de la progéniture des cloneshaute E11 VE-cadhérine+EPCR individuels suite co-culture AGM-EC. (C) corrélation du CD41 et CD45 expression pour chaque index soit trié VE-cadhérine+EPCRhaut clone avec son potentiel d’HSC suivant AGM-EC co culture fondée sur la prise de greffe à long terme, multilignée dans test de la transplantation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’étude de la genèse de la HSC durant le développement embryonnaire nécessite des moyens pour détecter les potentiels des précurseurs hemogenic manque encore la compétence pour fournir à long terme multilignée reconstitution hématopoïétique chez les receveurs adultes transplantés HSC. Dans ce protocole, nous présentons un test clonal des hemogenic embryonnaires précurseurs par co-culture stromal sur niche vasculaire ECs de l’AGA, qui favorise la maturation des précurseurs des HSC, avec analyse fonctionnelle lors d’essais de transplantation. Incorporation des index de tri permet l’analyse rétrospective des paramètres phénotypiques pour caractériser les propriétés de pre-HSC tel que défini par les marqueurs de surface inclus dans l’essai. Cette approche fournit donc un avantage sur les autres méthodes qui s’appuient sur en vrac, tri des populations précurseur avec re-aggregation basé sur HSC essais4,5,10, activation efficace de dépistage des marqueurs potentiels des pré-HSC tout en même temps fournissant des informations sur le niveau de l’expression relative de marqueurs de surface pour chaque cellule individuelle. En utilisant cette méthode, par exemple, nous avons déjà indiqué que, outre l’utilisation des EPCR pour enrichir pour les populations de pre-HSC à différents stades de développement, intermédiaire expression du ligand encoche Dll4 définie une sous-population de clonale Précurseurs EPCR+ +VE-cadhérine avec HSC potentiel, tandis que Dll4 négatif des précurseurs hemogenic EPCR VE-cadhérine++ pour la plupart n’avaient pas de HSC potentiels17.
Un autre avantage de cette méthode est la possibilité pour dépister le potentiel HSC immédiatement après co-culture basée sur la détection de hématopoïétique progéniture avec un phénotype (VE-cadhérine- / lowGr1–CD45 F4/80–+Sca1 SalutEPCRSalut) qui est en corrélation avec la prise de greffe à long terme, multilignée. Ceci élimine la nécessité de transplanter des colonies manque hématopoïétique progéniture avec ce phénotype HSC, comme ces colonies ne fournissent pas de prise de greffe à long terme dans des essais de transplantation. En outre, les informations initiales distinguer potentiel pré-HSC des précurseurs hemogenic manque potentiel d’HSC suit immédiatement la co-culture, sans avoir besoin d’attendre les résultats des essais à long terme de greffe, sont utiles, par exemple, dans rapidement dépistage des marqueurs de candidats de HSC-précurseurs. Cependant, la corrélation des données phénotypiques avec greffe à long terme après la transplantation offre supplémentaire précieux des variations des propriétés précises greffe de clones de pre-HSC. Nous avons trouvé, par exemple, cette pré-HSC clonale de la région de P-Sp/AGM entre E9.5 et E11.5 ont uniques susceptibles de donner lieu à la fois B1a et B2-lymphocytes, tandis que potentiel B1a-lymphocyte est déficient en adulte HSC17. En outre, nous avons détecté une évolution dans les propriétés de la prise de greffe pré-HSC clones entre E9.5 et E11.5 avec pré-HSC antérieur démontrant une inclinaison relative vers péritonéale B1a versets B2-lymphocyte greffe et moins robuste autorenouvellement potentiel basé sur la transplantation secondaire essais17.
Alors que ce protocole prévoit une approche utile pour élucider les propriétés uniques des précurseurs d’HSC clonales, il existe certaines limitations qui doivent être reconnues. Bien que la détection de la progéniture avec HSC phénotypique par FACS suite co-culture AGM-EC est généralement corrélée au greffe multilignée à long terme, certaines colonies avec ce phénotype fournissent seulement prise de greffe à court terme ou déficients de greffe en un ou plusieurs lignées hématopoïétiques (Figure 4 b; données non présentées). Par conséquent, la transplantation reste l’étalon-or dans la validation fonctionnelle HSC. En outre, il n’est pas exclu que certaines différences dans les propriétés de la prise de greffe du pre-HSC clones, plutôt reflétant des différences intrinsèques cellules en hemogenic potentiel de précurseur, peut résulter de variabilité stochastique au cours de la co-culture AGM-EC dans les versets de l’auto-renouvellement décisions de différenciation, comme pré-HSC sont simultanément, échéant à HSC et subissant des divisions cellulaires. En effet, cela pourrait en partie expliquer l’hétérogénéité observée de la morphologie des colonies et le phénotype des cellules produit de clones individuels pre-HSC (p. ex.,Cde la Figure 3 a–) et peut entraîner une sous-estimation des pré-HSC par ce dosage sinon tout potentiel pre-HSC clones sont détectés par génération de HSC fonctionnelle suite co-culture AGM-EC. Toutefois, la capacité de distinguer des clones hemogenic fonctionnellement distinctes par leur expression différentielle de marqueurs phénotypiques uniques (par exemple Dll417) activée par cette méthode fournit un moyen d’identifier les sous-populations de précurseurs de hemogenic avec différences inhérentes de cellule intrinsèques.
S’appuyant sur ce protocole de base, un certain nombre d’applications étendues peut être inclus à étudier davantage le potentiel hématopoïétique des précurseurs hemogenic clonale au cours du développement. Au-delà de l’utilisation d’anticorps pour la détection de marqueurs de surface, expression des marqueurs de la fluorescence dans les embryons transgéniques (e.g., Ly6a- GFP21 ou GFP Runx1 -22 , exprimée en hemogenic l’endothélium/pre-HSC) peut être constituée en indice tri des précurseurs de l’hemogenic. En plus des essais de transplantation suite co-culture AGM-EC pour détecter putatif pre-HSC, progéniture peut aussi être portée par potentiel lignée hématopoïétique basé sur secondaire in vitro tests, tels que la culture sur OP9 ou OP9-Dl1 pour détecter les cellules B et T potentiel23ou colonie clonogéniques formant des dosages en méthylcellulose pour détecter le potentiel d’erythromyeloid. En effet, certains des clones non-HSC hemogenic (par exemple, la Figure 3D) représentent probablement cellules souches multipotentes, progéniteurs erythromyeloid, ou les progéniteurs des cellules T et B qui précèdent et sont indépendants du développement HSC décrit précédemment 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28et ce dosage peuvent faciliter davantage les études clonales de ces vagues distinctes des précurseurs hématopoïétiques. Enfin, indice tri des pré-HSC est cumulable avec d’autres analyses en aval comme seule cellule RNA-sequencing, de corréler les propriétés phénotypiques avec les profils de transcriptional globales de développer des précurseurs HSC. Au total, ce protocole fournit une méthode pour l’analyse robuste de l’hématopoïèse clonale de précurseurs embryonnaires hemogenic qui devraient fournir de nouveaux aperçus de développement de HSC.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Andrew Berger, Stacey Dozono et Brian Raden INSEREE dans le Fred Hutchinson Flow Cytometry d’assistance avec FACS. Ce travail a été soutenu par l’instituts nationaux de santé NHLBI UO1 grant #HL100395, auxiliaires Collaborative Grant #HL099997 et NIDDK accordent #RC2DK114777. Brandon Hadland est supporté par l’Alex Lemonade Stand Fondation et Hyundai Hope sur roues Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
References
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