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Developmental Biology

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

Published: May 8, 2018 doi: 10.3791/56973
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, University of Washington School of Medicine

Summary

Hier präsentieren wir Methodik zur klonalen Analyse von Hämatopoetischen Stammzellen Vorläufer während der murinen embryonalen Entwicklung. Wir kombinieren Index sortieren einzelner Zellen aus der embryonalen Aorta-Gonade-Wachstum-Region mit Endothelzellen Kokulturen und Transplantation der phänotypischen Eigenschaften und Engraftment Potenzial der einzelnen hämatopoetischen Vorläufer zu charakterisieren.

Abstract

Die Fähigkeit, Hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Genesis während der Embryonalentwicklung wurde begrenzt durch die Seltenheit der HSC-Vorstufen in der frühe Embryo und das Fehlen von Assays, die funktionell das langfristige multilineage Engraftment Potenzial identifizieren einzelne vermeintliche HSC-Vorläufer. Hier beschreiben wir die Methodik, die die Isolierung und Charakterisierung von funktionell validierten HSC-Vorläufer der Ebene der einzelnen Zelle ermöglicht. Erstens verwenden wir Index Sortierung den präzise phänotypischen Parameter jeder einzeln sortierten Zelle Katalog mit einer Kombination aus phänotypische Markierungen für HSC-Vorstufen mit zusätzlichen Markern für die experimentelle Analyse zu bereichern. Zweitens ist jeder Index sortiert Zelle Co kultiviert mit vaskulären Nische Stroma aus der Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Region, die die Reifung der nicht Einpflanzen HSC Vorläufer des funktionalen HSC mit multilineage, langfristige Engraftment Potenzial in unterstützt Transplantation-Assays. Diese Methodik ermöglicht die Korrelation der phänotypischen Eigenschaften von klonalen Hemogenic Vorstufen mit ihrem funktionalen Engraftment oder andere Eigenschaften wie transkriptionellen Profil, was ein Mittel für die detaillierte Analyse des HSC Vorläufer Entwicklung auf der Ebene der einzelnen Zelle.

Introduction

Klonale Untersuchungen ergaben Heterogenität in den langfristigen Engraftment Eigenschaften des Erwachsenen HSCs, neue Einblicke in HSC-Subtypen und Änderungen im HSC Verhalten während der Alterung1. Jedoch ähnliche Studien der embryonalen HSCs und deren Vorstufen schwieriger gewesen. Während der frühen Embryonalentwicklung HSCs ergeben sich aus einer Bevölkerung von Vorläuferstoffen gemäß Hemogenic Endothel in einem vorübergehenden Prozess bekannt als die endotheliale hämatopoetischen Übergang2. Die ersten HSC, definiert durch ihre Fähigkeit, stabile, langfristige multilineage Engraftment nach Transplantation in konditionierten Erwachsenen Empfänger werden nicht erkannt, erst nach embryonalen Tag 10.5 (E10.5) in der murinen Embryo bei sehr niedrigen Frequenz3 . Während ihrer Entwicklung müssen Vorläufer des HSC (Pre-HSC) aus Hemogenic Endothel unterziehen Reifung vor dem Immobilienerwerb von Erwachsenen HSC die ermöglichen effiziente Engraftment Transplantation Assays4,5 , 6. verdeckt das Studium der seltenen HSC Herkunft, eine Vielzahl von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit erythroiden, myeloischen und lymphatischen Potenzial werden schon vor der Entstehung des HSC von Pre-HSC7,8erkannt. Pre-HSC von anderen hämatopoetischen Vorläuferzellen zu unterscheiden erfordert daher Methoden klonal Zellen zu isolieren und Ihnen mit den Signalen ausreichend für ihre Reifung, HSC, um ihre Engraftment Eigenschaften in Transplantation Assays zu erkennen.

Eine Reihe von Ansätzen sind beschrieben worden, die für den Nachweis von Pre-HSC von ex-Vivo oder in Vivo Reifung, HSC ermöglichen. Ex-Vivo -Methoden sind angewiesen, auf die Kultur der embryonalen Gewebe, wie z. B. der AGM-Region, wo die ersten HSC in Entwicklung9erkannt werden. Aufbauend auf diese Methoden, Protokolle, die die Dissoziation zu integrieren haben sortieren und Re-Aggregation von AGM Geweben die Charakterisierung der sortierten Populationen mit HSC Vorläufer bei der Entwicklung von E9.5 zu E11.5 in der Para-aortalen zulässig Splanchnopleura (P-Sp) / AGM Regionen4,5,10; Allerdings sind diese Ansätze nicht zugänglich Hochdurchsatz-Analyse der Vorläufer der Ebene der Einzelzelle für klonale Analyse erforderlich. In ähnlicher Weise in Vivo Reifung durch Transplantation in Neugeborene Mäuse, wo der Mikroumgebung vermutlich besser geeignet für die Unterstützung der früheren Phasen des HSC Vorstufen, ermöglichten auch Studien der sortierten Bevölkerungen aus dem Dottersack und AGM / P-Sp (P-Sp ist die Vorläufer-Region zur Hauptversammlung) mit Merkmalen der Pre-HSC, aber diese Methoden auch scheitern, eine robuste Plattform für einzelne Zelle Analyse11,12.

Studien von Rafii Et Al. haben gezeigt, dass dieser Akt aktiviert Endothelzellen (EG) Stroma eine Nische Substrat für die Unterstützung von Erwachsenen HSC Selbsterneuerung in-vitro-13,14,15bieten kann. Wir entschlossen vor kurzem, dass Akt aktiviert EG abgeleitet aus der AGM-Region (AGM-EC) eine geeignete in-vitro- Nische für die Reifung der Hemogenic Vorläufer bietet, so früh wie E9 in Entwicklung, für die Erwachsenen Einpflanzen HSC sowie die anschließende isoliert Selbsterneuerung der generierten HSC16. Angesichts der Tatsache, dass dieses System eine einfache 2-dimensionale kokultur beschäftigt, ist es leicht anpassbar für klonale Potenzialanalyse der HSC einzeln isolierten Hemogenic Grundstoffe.

Vor kurzem haben wir ein Konzept für die HSC-Potenzial der klonalen Hemogenic Vorstufen assay durch die Kombination von Index Sortierung der einzelnen Hemogenic Vorstufen aus murinen Embryonen mit AGM-EG Kokulturen und anschließenden Funktionsanalyse in der Transplantation berichtet. 17Tests. Index zu sortieren ist eine Art der Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS), die Datensätze (Indizes) alle phänotypischen Parameter (d.h., forward Scatter (FSC-A), Side Scatter (SSC-A), Fluoreszenz Parameter) jeder einzeln sortierten Zelle so, dass diese Funktionen können rückwirkend mit anschließenden Funktionsanalyse nach Sortierung korreliert werden. FACS-Software zeichnet sowohl phänotypische Informationen für jede Zelle und die Position/gut von den 96-Well-Platte, in die sie gestellt wurde. Diese Technik wurde bisher elegant zur erkennen Heterogenität in Erwachsenen HSC, phänotypische Parameter, die weiter für die langfristige anwachsen Teilmenge der HSC zu bereichern, und phänotypischen Parameter des HSC mit transkriptionelle korrelieren Eigenschaften auf die einzelne Zelle Ebene18,19. Hier bieten wir detaillierte Methode dieses Ansatzes, die Identifikation der einzigartigen phänotypischen Parameter und Abstammung Beiträge von Pre-HSC in frühen Phasen der Embryonalentwicklung ermöglicht.

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Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des Fred Hutchinson Cancer Research Center genehmigt.

1. Vorbereitung der AGM-EG Monolagen kokultur

  1. 24 h vor der Hauptversammlung Dissektion und Art, machen AGM-EG-Kultur, Medien und Filter zu sterilisieren.
  2. 0,1 % Gelatine in Wasser (100 µL/Well) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min. Absaugen die Gelatine und lassen die Platte in einer Gewebekultur-Haube mit den Deckel entfernt, bis der Brunnen trocken sind.
  3. Die AGM-EG Monolagen und Platte für 96-Well Platten zu distanzieren.
    Hinweis: Pflegen Sie die AGM-EG, als zuvor beschriebenen16in AGM-EG Kulturmedien vorbereitet. Aus Gründen der Kohärenz sollte AGM-EG-Zell-Linien eingefroren, sobald ausreichende Zahl (in der Regel Durchgang 1-3) erzielt werden und bei einer definierten Passagenanzahl (in der Regel Durchgang 5-12) für kokultur Experimente verwendet werden. AGM-EG Zelllinien stammen aus C57BL/6J (CD45.2) AGM. Sehen Sie die Tabelle der Materialien für alle Medien-Kompositionen.
    1. Aspirieren Sie die Medien aus der AGM-EG-Kultur in einem 75 cm2 Kolben und 5 mL PBS. Aspirieren PBS, und fügen Sie 3 mL Trypsin-Lösung (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Inkubation bei 37 ° C für 2-4 min bis die meisten Zellen aus der Platte heben sind. Hinzugeben Sie 7 mL AGM-EG-Kultur, Medien und pipettieren 8-10 mal mit einer 10 mL-Pipette Einzelzellen Aussetzung vorbereiten, und übertragen Sie auf eine 15 mL Tube.
    3. Drehen mit 300 X g für 5 min, Entfernen des Überstands wieder aussetzen in 10 mL AGM-EG Kulturmedien und schätzen Sie die Anzahl von Zellen mit einem Hemocytometer. Verdünnen Sie die Zellen zu einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/mL in Kulturmedien AGM-EG.
  4. Geben Sie in jedes verkleisterte 96-Well-Platte 100 µL AGM-EG Zellsuspension (1 x 10-4 -Zellen). Platz in einem 37 ° C, 5 % CO2 Gewebekultur Inkubator Übernachtung um die AGM-EG zu befestigen und bilden eine konfluierende Monolage zu ermöglichen.
    Hinweis: Gleichmäßig zu verteilen, die AGM-EG Stromazellen Zellen so gibt es begrenzte Überwucherung oder Zelle für optimale kokultur Verklumpung.
  5. Kokultur AGM AGM-EG Monolage vorbereiten.
    1. Bereiten Sie am nächsten Morgen die AGM serumfreie Medien.
    2. Mit einer 12-Well Mehrkanal-Pipette, entfernen Sie die AGM-EG Nährmedien aus der AGM-EG und 200 µL/Well AGM serumfreie Medien ohne Zytokine zum Auswaschen alle verbleibenden Serum-haltigen Medien.
    3. Entfernen Sie den Datenträger, und fügen Sie 200 µL/Well AGM serumfreie Medien mit Zytokinen. Arbeiten Sie schnell, wenn entfernen und Hinzufügen von Medien, so dass die endotheliale Schicht nicht beeinträchtigt wird; z. B.entfernen und erneut hinzufügen Medien eine Zeile zu einem Zeitpunkt. Legen Sie die 96-Well-Platten in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C, bis die embryonalen Zellen bereit sind für die Sortierung.

2. Vorbereitung des einzigen Zellsuspension aus murinen embryonalen Gewebe

  1. Die Hauptversammlung von zeitgesteuerten Paarungen zu sezieren.
    1. Zeitgesteuerte Paarungen für die Erzeugung von embryonalen Gewebe das gewünschte Alter eingerichtet.
    2. Ernte-Embryonen aus trächtige Weibchen bei 9,5 bis 11,5 Tage Post Coitum (Dpc), abhängig von der Phase der Pre-HSC analysiert werden.
      Hinweis: Embryonale Gewebe werden von Mäusen C57BL/6J (CD45.2) wie zuvor beschrieben und präzise inszenierten basierend auf Somiten Graf16geerntet. Wir haben auf Analyse der Bevölkerung von der embryonalen AGM-Region und sein Vorläufer, der P-Sp, zwischen E9.5, E11.5, basierend auf Somiten Inszenierung.
    3. Die Hauptversammlung von Embryonen20zu sezieren.
      Hinweis: Ausführliche Protokolle für die Zerlegung des AGM aus murinen Embryonen wurden von anderen20veröffentlicht. Alternativ könnte Dottersack oder anderen Geweben Pre-HSC-Aktivität haben angeblich auch mit dieser Methode analysiert werden.
  2. Die seziert embryonalen Gewebe zu distanzieren.
    1. Sammeln der seziert Gewebe in einem 15 mL konische Röhrchen mit 10 mL PBS mit 10 % FBS auf Eis. Schwerkraft Gewebe zu begleichen, Aspirieren der PBS/FBS, und dann sofort 1 mL 0,25 % Kollagenase und Platz im Wasserbad 37 ° C für 25 min.
    2. Fügen Sie 1 mL PBS/10% FBS und pipettieren ca. 20 - 30 Mal mit eine 1 mL Pipette Tipp um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Fügen Sie eine zusätzliche 8 mL PBS/10% FBS und Zentrifuge Zellen bei 300 X g für 5 min. Überstands verwerfen.

3. Antikörper Färbung der murinen embryonalen Zellen

  1. Bereiten Sie die blockierenden Puffer für Antikörper Färbung.
    1. Fügen Sie 10 µg/mL Anti-Maus CD16/CD32 (Fc-Rezeptor (FcR) Block) und 1 µg/mL DAPI (1 mg/mL Brühe in H2O) zu 1 mL PBS mit 10 % FBS.
    2. In einer 3 mL Spritze erstellt und durchlaufen einen 0,22 µm Spritze Filter zu sterilisieren. Wieder aussetzen der Zelle Pellet aus dem dissoziierten murinen embryonalen Gewebe (aus Schritt 2.2.2) in 500 µL blocking-Puffer und inkubieren Sie für 5 min auf Eis.
  2. Bereiten Sie die Antikörper-Mix-17.
    1. 1 mL PBS mit 10 % 10 µg/mL FcR Block hinzufügen FBS und 10 µL jeder Fluorochrom-konjugierten Anti-VE-Cadherin-Antikörper (CD144, siehe die Tabelle der Materialien) und Fluorochrom-konjugierten Anti-EPCR Antikörper (CD201, siehe die Tabelle der Materialien). Verwenden Sie eine 1: 100 Endverdünnung von Antikörpern, sofern nicht anders angegeben basierend auf den Empfehlungen des Herstellers oder nach Titrationen.
      Hinweis: Diese Antikörper-Kombination dient zur Definition von Toren für die Sortierung, wie unten (Schritt 4.2) beschrieben. Sortierung anhand des Co Ausdrucks der VE-Cadherin und EPCR ermöglicht deutliche Bereicherung für den Teil der AGM-abgeleitete Zellen mit HSC Vorläufer Aktivität, wie zuvor beschrieben17.
    2. Fügen Sie zusätzliche Fluorochrom-konjugierten Antikörpern zur weiteren phänotypische Analyse der einzelnen Index sortiert Vorstufen.
      Hinweis: Diese Antikörper sind nicht notwendigerweise verwendet für Tore für die Sortierung zu definieren. In diesem Beispiel Protokoll haben wir aufgenommen, PE-konjugierten Anti-CD41 Antikörper und FITC-konjugierten Anti-CD45 Antikörper zu den relativen Ausdruck dieser hämatopoetischen Marker zu analysieren, die während der Entstehung des Pre-HSC aus Hemogenic Endothel4 entwickeln ,5,16,17. Andere Marker von Interesse können wie gewünscht werden. Proben mit Fluorochrom konjugiert Isotype Antikörper Steuerelemente befleckt werden verwendet, um negative und positive Tore für die Analyse zu definieren.
    3. Zeichnen Sie den Antikörper-Mix in einer 3 mL Spritze und durchlaufen Sie einen 0,22 µm Spritze Filter zu sterilisieren. Die Zellsuspension in blocking-Puffer, Pipette zu mischen, und inkubieren Sie für mindestens 15-20 min auf Eis fügen Sie 500 µL des Antikörper-Mix hinzu.
  3. Waschen Sie die gefärbten Zellen.
    1. 8 mL PBS/10% FBS hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 5 min, aufziehen und wieder aussetzen der Zelle mit 1 mL PBS/10% FBS pellet.
    2. Entfernen Sie Zelle Klumpen durch pipettieren der Zellsuspension durch eine 35 μm Zelle Sieb Obergrenze für eine 5 mL-Tube. Waschen Sie die Zelle Sieb mit einem zusätzlichen 3 mL PBS/10% FBS. Die Zellen bei 300 X g für 5 min zentrifugieren, Aspirieren, erneut aussetzen in 500 µL PBS/10% FBS und auf Eis legen, bis FACS.

4. Index Sortierung der einzelnen Hemogenic Vorstufen bis 96-Brunnen mit AGM-EG Stroma für kokultur

  1. Vorbereiten der FACS-Maschine für Platte-Modus und richten Sie für die Sortierung, 96-Well-Platten nach den Anweisungen des Herstellers. Wählen Sie einzelne Zellenmodus und Index sortieren Modus in der Software für maximale Reinheit Maskeneinstellungen und Übernahme der Indexparameter für jede sortierte Zelle zu ermöglichen.
  2. Erwerben Sie eine Probe von Zellen aus der Antikörper gefärbten Proben um Tore für die Sortierung festzulegen.
    1. Die gefärbten Zellprobe auf dem FACS-Rechner zu laden und Zellen mit den niedrigsten Volumenstrom zu erwerben. Plot-FSC-A Verse SSC-A und wählen Sie ein Tor, das Zellen unterschiedlicher Größe (Abbildung 1 b) enthält (basiert auf der Beobachtung, dass Pre-HSC-Aktivität in den Zellen unterschiedlicher Größe Profile in der Hauptversammlung17erkannt wird). Plot-FSC-A Verse FSC-W und SSC-A Verse SSC-W, und wählen Sie Tore, Dubletten auszuschließen. Dann Plotten FSC-A Verse DAPI zu lebenden Zellen (negativ für DAPI) Tor (Abbildung 1 b).
    2. Plot-PECy7 (oder der relevanten Fluorochrom für den VE-Cadherin-Fleck) im Vergleich zu PerCP (oder der relevanten Fluorochrom für den EPCR Fleck). Tor-Zellen, die positiv für VE-Cadherin (beinhaltet eine gemischte Bevölkerung von Endothelzellen sowie hämatopoetischen Vorläuferzellen und Pre-HSC von der GV) und die hohe EPCR Ausdruck (die für Pre-HSC aus P-Sp/AGM17bereichert). Dies ist das letzte Tor, das zum Sortieren einzelner Zellen im Schritt 4.3 (Abbildung 1 b) index verwendet wird.
    3. Plotten Sie zusätzliche Fluorochromes zum Färben verwendet.
      Hinweis: Abhängig von der Teilgesamtheit analysiert werden, zusätzliche Tore basiert auf dem Nachweis von anderen Markern für die Färbung von Zellen enthalten einstellbar. Index Sortierung ermöglicht jedoch die Aufnahme der fluoreszierenden Parameter für die einzelnen sortierten Zellen so, dass diese Parameter im Nachhinein analysiert werden können. Somit ist keine zusätzliche Anspritzung notwendig an dieser Stelle. Für alle FACS-Setups sollten Proben befleckt mit einzelnen Antikörper verwendet werden, anpassen Entschädigung, um Spillover in der Emission von überlappenden Fluorochromes und mit Isotype Kontrolle Antikörper Hintergrundfärbung abzurechnen und bestimmen negativ/positiv-Tore.
  3. Index sortiert die AGM-Zellen.
    1. Legen Sie eine 96-Well-Platte mit der AGM-EG-Stroma in AGM serumfreie Medien mit Zytokinen (aus Schritt 1.5.3) in der Platte Block FACs-Sortiermaschine vorbereitet. Laden Sie die Probe und beginnen Sie Probe Erwerb. Wählen Sie Index sortieren/einzelne Zellenmodus und beginnen Sie Sortingsingle Zellen zu einzelnen 96 Wells. Verwenden Sie die niedrigste Durchfluss Schubspannung auf embryonale Zellen zu minimieren.
    2. Stellen Sie sicher, dass alle Ereignisse, während der Index sortieren aufgezeichnet werden. Dies ermöglicht Enumeration von der Gesamtzahl der Zellen in der sortierschleuse bezogen auf die tatsächliche Anzahl sortierten zu einzelnen 96-Brunnen, analysiert, da nicht alle Ereignisse erfasst, Brunnen in Ordnung gebracht werden.
    3. Sobald die Zellen für eine gesamte 96-Well-Platte sortiert haben, platzieren Sie die Platte in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C auf 5 % CO2festgelegt. Wiederholen Sie für zusätzliche Platten pro Experiment benötigt.
    4. Kokultur individuell sortiert Zellen in 96-Brunnen mit AGM-EG (aus Schritt 4.3) für bis zu 7 Tage (5 Tage für Zellen sortiert aus E11-11.5 Embryonen, 6 Tage ab E10-10.5 Embryonen, 7 Tage ab E9-9.5 Embryonen). Mit Ablauf der kokultur hematopoietic Kolonien in verschiedenen Größen und Morphologien mit einem inversen Mikroskop bei 100 X Vergrößerung (Abb. 2 b) zu visualisieren.
      Hinweis: Die Medien muss nicht während der kokultur Periode geändert werden. Sortiert Hemogenic Vorstufen können zunächst in die AGM-EG-Schicht mit einer EG-ähnliche Morphologie zu integrieren und nicht ursprünglich von AGM-EG Stroma (Abbildung 2A) unterschieden werden. Jedoch folgenden 24-48 h in kokultur, kleinen, runden hämatopoetische Zellen oder Gruppen von Zellen können erkannt werden. Am Ende der kokultur (5-7 Tage) können einzelne Kolonien von blutbildenden Zellen in der Teilmenge von 96 Wells visualisiert werden, die eine sortierte Zelle mit klonale hämatopoetische Potenzial erhalten. Visuell inspizierte Brunnen enthalten mehr als eine unterschiedliche Kolonie, wenn in diesem Beispiel ist ausgeschlossen von nachgelagerten Analyse Proben ausschließen, die mehr als eine Zelle pro Bohrloch sortiert erhalten zu haben.

5. Analyse der klonale hämatopoetische Nachkommen nach kokultur

  1. Klone von jeweils 96-Well für FACS Analyse zu ernten.
    1. Kräftig pipettieren hämatopoetische Zellen von endothelialen Schichten mit einer Mehrkanal-Pipette mit 200 µL Pipettenspitzen distanzieren. Versuchen Sie nicht, die endotheliale Schicht zu distanzieren. Entfernen Sie 100 µL (~ 50 % der Stichprobe) für phänotypische Analyse der hämatopoetischen Nachkommen durch FACS.
    2. Übertragen auf eine 96-Well-V-Boden-Platte und Zentrifugieren bei 300 X g für 2 min zu die Zellen zu Pellets. Entfernen Sie das Medium durch die Medien von der Platte mit einer einzigen, schnellen Bewegung zu streichen, während die Platte ist invertiert (flick Platte).
    3. Legen Sie die restlichen 100 µL Zellen in der ursprünglichen 96-Well-Platte in einem 37 ° C Incubatorfor Einsatz in den nachfolgenden Engraftment Assay (Schritt 6).
  2. Inkubieren Sie die Zellen mit den entsprechenden Antikörpern für hämatopoetische Analyse.
    1. Wieder aussetzen der Zelle Pellets in jede Vertiefung eine 96-Well V-Boden mit 50 µL PBS/2% FBS mit 10 µg/mL FcR Block und 1 µg/mL DAPI. Inkubieren Sie die Platte bei 4 ° C für 5 min.
    2. Fügen Sie 50 µL PBS/2% FBS 10 µg/mL FcR Block mit einem Antikörper-Mix für die HSC-Analyse mit PE-Cyanine7-konjugierten Anti-VE-Cadherin, PerCP-konjugierten Anti-CD45, PE-konjugierten Anti-EPCR, APC-konjugierten Anti-Sca1 und FITC-konjugierten Anti-Gr1 und Anti-F4/80 (jeder Antikörper bei 1: 100 Endverdünnung sofern nicht anders angegeben, basieren auf den Empfehlungen des Herstellers oder nach Titrationen). Inkubieren Sie die Platte bei 4 ° C für mindestens 20 min.
  3. Entfernen Sie ungebundenen Antikörper mit sequentiellen Verdünnungen und analysieren Sie die Zellen zu.
    1. Fügen Sie 200 µL/Well PBS/2% FBS und Zentrifuge bei 300 X g für 2 min zu die Zellen zu Pellets. Dann streichen Sie Platte um den überstand verwerfen und jede Zelle Pellet 200 µL PBS/2% FBS hinzu und Zentrifugieren bei 300 X g für 2 min, pellet-Zellen.
    2. Streichen Sie Platte überstand verwerfen und 50 µL/Well PBS/2% FBS zur Analyse hinzufügen. Fahren Sie mit Zellen durch FACS mit einem Durchflusszytometer, ausgestattet mit einem Teller-Lesegerät zu analysieren.
      Hinweis: Ein bestimmtes Volumen der Zellen (z.B. 35 µL der insgesamt 50 µL für Resuspension verwendet) zu erwerben, die Teilmengen der hämatopoetischen Nachkommen aufzuzählen.
  4. Analysieren Sie die FACS-Daten für jedes gut mit hämatopoetischen Nachkommen zum Bildschirm für die Kolonien, die HSC potenzielle (Abbildung 3) enthalten.
    1. Tor zunächst CD45 positiven Bevölkerung negativ für myeloischer Marker Gr1 und F480. Nicht aus Zellen, die immer noch geringe Mengen an VE-Cadherin express gate. Zellen aus der AGM-EG-Schicht, die bei der Ernte der hematopoietic Kolonien gestört werden sind VE-Cadherin Positive und negative CD45.
    2. CD45 Tor+VE-CAD-- / lowGr1–– F4/80 Zellen weiter auf die Teilmenge, die hohe EPCR und Sca1 express (Abbildung 3A -C).
      Hinweis: In früheren Studien, Kolonien, die Zellen mit CD45 fehlt+VE-CAD-- / lowGr1––F4/80 Sca1HalloEPCRHallo Phänotyp (Abbildung 3D) reproduzierbar nicht nachweisbar multilineage peripherem Blut Engraftment bestrahlten Empfänger Mäuse17 (Daten nicht gezeigt); Daher müssen diese Kolonien in der anschließenden Transplantation Analyse in Schritt 6 nicht aufgenommen werden.

6. Analyse der Engraftment Eigenschaften der einzelnen Klone und Korrelation mit phänotypischen Eigenschaften aufgeklärt durch Index sortieren

  1. Der Tag der (wenn möglich) oder am Morgen nach der phänotypische Analyse in Schritt 5, suspendiert erneut die restlichen 100 µL Zellen von jeder 96-Well mit hämatopoetischen Kolonien Kokulturen (aus Schritt 5.1), indem Sie kräftig Pipettieren mit einer PIPETTENSPITZE 200 µL.
  2. Bereiten Sie zu und Rettung Zellen aus ganze Knochenmark Congenic Sorte B6. SJL-PtprceinePepcb/BoyJ (B6 CD45.1) Erwachsenen Mäusen16,17.
    1. Kernhaltigen Knochenmarkzellen in Türken-Lösung unter einer Hemocytometer zu zählen. Verdünnte zu einer Konzentration von 5 x 105 kernhaltigen Zellen/mL in PBS mit 2 % FBS.
    2. 100 µL der Rettung Knochenmarkzellen (5 x 104) in jede Vertiefung mit hämatopoetischen Nachkommen für die Transplantation Analyse und Mischen von pipettieren.
  3. Nachkommen der einzelnen Klone zu einem einzigen letal bestrahlten Empfänger Congenic Stamm B6 zu verpflanzen. SJL-PtprceinePepcb/BoyJ (B6 CD45.1) Erwachsenen Maus.
    1. Letal bestrahlen Sie die gleiche Anzahl von B6 CD45.1 Mäuse als die Anzahl der Klone, Nachkommen von einem einzigen Klon (über 1.000 cGy aus einer Cäsium-Quelle) individuell zu injizieren.
    2. Zeichnen Sie 200 µL Gesamt Zellsuspension (Dies schließt Zellen vom Klon sowie 5 x 104 B6 CD45.1 Rettung Knochenmarkzellen) in eine ½ mL Insulin Spritze mit einer Nadel 29 G ½ Zoll.
    3. Letal bestrahlen Sie B6 CD45.1 Erwachsenen Empfänger 2-24 h vor der Injektion.
    4. Mit einem Kunststoff Maus Restrainer, der Schweif Zugang ermöglicht, über das Heck Ader 200 µL Volumen mit Zellen von jeder Klon und 5 x 104 B6 CD45.1 Erwachsenen Rettung Knochenmarkzellen Empfänger Überleben unterstützen zu injizieren.
    5. Ohr-Tag und wiegen die Empfänger Mäuse, und überprüfen Sie ihre Gewicht/Gesundheit in regelmäßigen Abständen (z.B.3-4 mal / Woche post Bestrahlung/Transplantation oder pro einzelne institutionelle Standardarbeitsanweisungen) um gute Gesundheit zu gewährleisten.
  4. Analyse des peripheren Blutes Engraftment in regelmäßigen Abständen (z. B.2, 16, 24 Wochen) folgen der Transplantation.
    1. 50-100 µL Blut über Retro-Orbital bluten oder eine andere ethisch zugelassenen Blut-Vermietung-Methode zu entfernen.
    2. Blut 3 mL Lyse Puffer (16,6 g NH4Cl, 2 g Nahco33 und 74,4 mg EDTA, 2 L H2O) hinzu und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min. aufziehen und wieder auszusetzen das Pellet mit 2 mL PBS/2% FBS. 300 X g für 5 min zentrifugieren.
    3. Das Pellet mit 150 µL PBS/2% FBS mit 10 µg/mL FcR Block und 1 µg/mL DAPI wieder anhalten und 1/3 des Volumens auf einem gut mit 50 µL Isotype Steuerelemente für Spender und Abstammung, 1/3, ein gut mit 50 µL Antikörper für Spender und Isotype Steuerelemente für Linie zu verzichten , und 1/3 zu einem Brunnen mit 50 µL Antikörper, die Spender und Linie zu erkennen.
      Hinweis: Antikörper für die Erkennung von multilineage Engraftment: APCeFluor780-konjugierten Anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-konjugierten Anti-CD45.1, FITC-konjugierten Anti-CD3, PE-konjugierten Anti-F4/80, PerCP-konjugierten Anti-Gr1 und APC-konjugierten Anti-CD19, oder relevanten Isotype Kontrollen.
    4. Klone mit langfristigen Engraftment durch die Beurteilung der peripheren Blut Beitrag durch FACS im Laufe der Zeit der CD45.2 (Spender) identifizieren-abgeleitet von blutbildenden Zellen, myeloische (Gr1 und/oder F4/80 positiv), B-Zell (CD19 positiv) und T-Zellen (CD3-positiven) (Abbildung 4A -B).
      Hinweis: Hematopoietic Engraftment kann auch durch CD45.2 (Spender) analysiert werden-Beitrag hämatopoetischen Bevölkerungen von Gewebe aus dem Knochenmark, Milz, Thymus und Bauchfell oder nach sekundären Transplantation von Knochenmarkzellen geerntet abgeleitet in B6 CD45.1 Mäuse, serielle Engraftment Eigenschaften17zu analysieren.
  5. Korrelieren Sie jeder Klon phänotypischen Eigenschaften bestimmt durch anfängliche Einzelzelle Index Sortieren mit seinen Engraftment Eigenschaften. Mit Flow-Analyse-Software, Hochladen Sie Sortierparameter für jeden Index sortiert Zelle (korreliert mit der 96-Well sortiert wurde). Funktionale Kartendaten auf Fluss Parzellen, die phänotypischen Eigenschaften einzelner Zellen zu bewerten, wie sie auf ihre funktionale Ausgabe (z. B. langfristige, multilineage Engraftment) beziehen (Abbildung 4).

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Representative Results

Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung der Versuchsanordnung. Wenn P-Sp/AGM Gewebe seziert, gebündelt und in Kollagenase getrennt, sind sie mit Antikörpern gegen VE-Cadherin und EPCR für die Sortierung von Index gefärbt. Pre-HSC sind angereichert, in den Zellen an der VE-Cadherin+EPCRhoch (Abbildung 1 b) sortiert. Anderen Fluorochrom-konjugierten Antikörpern lassen sich nachträglich analysieren phänotypischen Zusatzparameter, die für jede Zelle bei der Sortierung Index erfasst werden. In diesem repräsentativen Experiment von E11 GV sind die Zellen auch mit FITC-konjugierten Anti-CD45 und PE-konjugierten Anti-CD41 Antikörper gefärbt. Heterogenität in der VE-Cadherin+EPCRhohe Bevölkerung für diese blutbildenden-spezifische Marker wird beobachtet (Abbildung 1), Einklang mit der bekannten Asynchronie in hämatopoetischen Entwicklung auf dieser Stufe5.

Nach Index Sortierung der VE-Cadherin+EPCRhohe AGM Einzelzellen zu einzelnen 96-Brunnen tritt mit AGM-EG in AGM serumfreie Medien und Zytokine, Kolonie Bildung. Sortierte VE-Cadherin+EPCRhohe AGM Zellen zunächst in die AGM-EG-Ebene zu integrieren, bevor sie anfangen zu runden und hämatopoetischen Cluster (Abb. 2A, hier gezeigt von Zellen aus einem transgenen murinen Embryo mit dem Ausdruck GFP sortiert bilden unter den Ly6a Förderer21, zur Unterscheidung von der AGM-EG-Stroma). Nach 5-7 Tagen kokultur können Kolonien in verschiedenen Größen und Morphologien durch Inspektion mit einem inversen Mikroskop (Abb. 2 b), aus einem repräsentativen Experiment, 6 Tage nach Sortierung von E11 GV hier gezeigten erkannt werden.

Nächste, phänotypische Analyse durch FACS wird auf die Hälfte der Nachkommen der einzelnen VE-Cadherin+EPCRhohe Zellen durchgeführt, die eine hämatopoetische Kolonie gebildet hat. Kolonien mit Zellen mit HSC Phänotyp als VE-Cadherin identifiziert werden- / lowGr1––F4/80 CD45+Sca1HalloEPCRHallo (Abbildung 3). Hier zeigen wir, dass vier verschiedene Kolonien erhalten nach Index sortiert E11 AGM VE-Cadherin+EPCRhohen Zellen, drei mit unterschiedlichen Proportionen der phänotypischen HSC mit anderen differenzierten Zelltypen (Abbildung 3A Co Kultur –C), und die vierte fehlt Zellen mit HSC Phänotyp (Abbildung 3D). Die Anzahl der Kolonien pro Anzahl der Zellen überzogen und der Prozentsatz, der engraftable Stammzellen Kolonien führte beobachtet hängt von der embryonalen Alter und Art durchgeführt. VE-Cadherin- / lowGr1––F4/80 CD45+Sca1HalloEPCRHallo E11 AGM Klone generierten 53 ± 15 Kolonien aus 192 Zellen mit 5 % ± 1,3 % der vergoldeten generieren-, die lange pfropfte Klone 192 Zellen überzogen Begriff (Mittelwert ± SD für 3 Versuche).

Um den Phänotyp mit potenziellen Engraftment korrelieren, die andere Hälfte der Nachkommen der einzelnen VE-Cadherin+EPCRhohen Zellen, die eine hämatopoetische Kolonie mit gebildet hat mit HSC Phänotyp erkannt durch FACS Zellen (z. B.die Kolonien in Abbildung 3A–Cvertreten) wird bestrahlt (1.000 cGy) Erwachsene Congenic Belastung (B6 CD45.1) Mäusen zusammen mit einer Dosis von Rettung Zellen aus B6 CD45.1 Knochenmark transplantiert. Langfristige multilineage Engraftment ist für jeden Klon bestätigt, indem Sie Spender (CD45.2) Beitrag zu den myeloischen (Gr1 und F4/80), B-Zell (CD19) und T-Zellen (CD3) Fach des peripheren Blutes im Laufe der Zeit (Abb. 4A). Obwohl die meisten Kolonien mit Zellen mit HSC Phänotyp erkannt durch FACS langfristige Engraftment bereitstellen, ist die Transplantation notwendigen funktionalen multilineage Engraftment bestätigen, da einige Klone Engraftment im Laufe der Zeit (Abbildung 4 b) zu verlieren, oder zeigen Sie einzigartige Engraftment Eigenschaften wie lymphatischen voreingenommen Engraftment (Daten nicht gezeigt). Sobald die HSC Funktionspotenzial von jeder VE-Cadherin+EPCRhohe Klon festgelegt ist, ist dies zurück zu diesem Klon Index Sortierung Parameter, um seinen genauen phänotypische Merkmale identifizieren korreliert. In diesem Beispiel sehen wir, dass bestätigt, dass funktional, dass Pre-HSC-Klone (rote Punkte) sind heterogen in ihrer Expression von CD41 und CD45, Einklang mit etablierten dynamischen Ausdruck dieser Marker während der Reifung der Pre-HSC, HSC (Abbildung 4). Klone hämatopoetische Kolonien aber entweder fehlende HSC-Potenzial bilden, durch phänotypische Screening oder durch Mangel an langfristigen, multilineage Engraftment nach Transplantation (nicht-HSC Hemogenic Klone, blaue Punkte) sind auch für CD41 und CD45 heterogen, Obwohl eine Teilmenge express im Vergleich höhere CD41 mit Pre-HSC-Klone, die in erster Linie CD41niedrigsind. Klone, die keine blutbildende Kolonien (nicht Hemogenic Klone, grüne Lichtpunkte) bilden sind überwiegend CD41- / lowCD45-, die wahrscheinlich nicht Hemogenic VE-Cadherin+EPCRhohe endotheliale Zellen widerspiegeln.

Figure 1
Abbildung 1: Protokoll-Übersicht und repräsentative zytometrie Strömungsanalyse für Index Sortierung einzelner Zellen. (A) schematische Darstellung des Protokolls. (B) Flow Cytometry Analyse der dissoziierten E11 AGM Zellen zeigen gating Strategie Index Sortieren der VE-Cadherin+EPCRhoch Zellen angereichert für Pre-HSC (Analyse mit FACS-Analyse-Software). Zahlen in jedem Tor geben den Prozentsatz der Zellen. (C) Flow Cytometry Analyse zeigt CD41 und CD45 Färbung innerhalb der VE-Cadherin+EPCRhohen Bevölkerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Bildung von blutbildenden Kolonien während AGM-EG kokultur. (A) Zeitraffer Bildgebung der VE-Cadherin+EPCRhohenGFP+ sortiert Zellen aus Ly6a-GFP transgenen Embryonen21 Co kultiviert auf AGM-EG Maßstabsbalken in µm entnehmen Sie bitte links unten auf jedem Bild. (B) repräsentative Kolonien gebildet von VE-Cadherin+hohen Index sortiert Einzelzellen EPCR nach 6 Tagen auf AGM-EG Co Kultur Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Flow Cytometry Analyse der Nachkommen aus einer E11 AGM abgeleitet VE-Cadherin+EPCRhohe Einzelzellen nach kokultur auf AGM-EG Anspritzung für Zellen mit HSC Potenzial gezeigt, wie die Teilmenge, die VE-Cadherin ist- / lowGr1–F4/80– (linken), CD45+ (mittlere Panel), und Sca1HalloEPCRHallo (Rechte Abbildung). (A) repräsentative Kolonie bestehend aus einer homogenen Bevölkerung der Zellen mit dem HSC-Phänotyp. (B–C) Repräsentative Kolonien, die eine Mischung aus Zellen mit dem HSC Phänotyp und mehr differenzierte Zelltypen enthalten. (D) repräsentative Kolonie bestehend aus Zellen fehlt die HSC-Phänotyp. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Analyse der peripheren Blut Engraftment Nachkommen der einzelnen Klone nach AGM-EG Kokulturen und Korrelation mit Sortierung Parameter Index. (A) Spender CD45.2 abgeleitet peripherem Blut Engraftment myeloische (Gr1 und F4/80), B-Zell (CD19) und T-Zellen (CD3) Teilmengen von einem repräsentativen Empfänger (B6 CD45.1) verpflanzt mit Nachkommen der einzelnen E11 VE-Cadherin+EPCRhoch Klon nach kokultur AGM-EG. (B) Spender CD45.2 abgeleitet peripherem Blut Engraftment im Laufe der Zeit nach der Transplantation der Nachkommen der einzelnen E11 VE-Cadherin+EPCRhohe Klone nach kokultur AGM-EG. (C) Korrelation von CD41 und CD45 Ausdruck für jeden Index sortiert VE-Cadherin+EPCRhoch Klonen mit seinem HSC-Potenzial folgende AGM-EG kokultur auf langfristige, multilineage Engraftment in Transplantation Assay basiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die Studie der HSC Genesis während der embryonalen Entwicklung erfordert Mittel, HSC Potenzial in Hemogenic Vorläufer noch fehlt die Kompetenz zur langfristigen multilineage hämatopoetischen Rekonstitution bei transplantierten Erwachsenen Empfängern zur Verfügung stellen zu erkennen. In diesem Protokoll präsentieren wir einen klonalen Assay der embryonalen Hemogenic Vorläufer von Stromazellen kokultur auf vaskuläre Nische ECs aus der Jahreshauptversammlung, die die Reifung der Vorläufer des HSC unterstützt, mit anschließenden Funktionsanalyse in Transplantation Assays. Einbeziehung der Index sortieren Genehmigungen enthalten die retrospektive Analyse von phänotypischen Parametern auf die Eigenschaften der Pre-HSC definiert durch oberflächenmarker im Test. Dieser Ansatz bietet somit einen Vorteil gegenüber anderen Methoden, die auf Masse Sortierung der Vorläufer Populationen mit re-aggregation-basierten HSC-Assays4,5,10, ermöglicht effizientes screening für potentielle Marker der Pre-HSC und gleichzeitig die Bereitstellung von Informationen über die relative Expression der oberflächenmarker für jede einzelne Zelle. Mit dieser Methodik, berichtet zum Beispiel wir zuvor, dass neben dem Einsatz von EPCR für Pre-HSC-Populationen in verschiedenen Stadien der Entwicklung zu bereichern, intermediate Ausdruck des Notch-Liganden Dll4 weiter eine Subpopulation von klonalen definiert VE-Cadherin+EPCR+ Vorstufen mit HSC Potenzial, wohingegen Dll4 negative EPCR VE-Cadherin++ Hemogenic Vorstufen meist fehlte HSC potenzielle17.

Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die Fähigkeit, Bildschirm für HSC Potenzial sofort folgende kokultur auf der Erkennung von hämatopoetischen Nachkommen mit einem Phänotyp basiert (VE-Cadherin- / lowGr1––F4/80 CD45+Sca1 HalloEPCRHallo), korreliert mit langfristigen, multilineage Engraftment. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, Kolonien fehlt hämatopoetische Nachkommen mit diesem HSC-Phänotyp zu verpflanzen, wie diese Kolonien nicht langfristige Engraftment in Transplantation Assays zur Verfügung stellen. Darüber hinaus eignet sich Erstinformation Unterscheidung potenzielle Pre-HSC aus Hemogenic Vorstufen fehlt HSC Potenzial unmittelbar nach kokultur, ohne die Notwendigkeit, Ergebnisse aus langfristigen Engraftment Assays erwarten, z. B. in schnell Screening-Kandidat Marker für HSC-Vorläufer. Die Korrelation der phänotypischen Daten mit langfristigen Engraftment nach Transplantation bietet jedoch zusätzliche wertvolle Einblicke in Variationen der präzise Engraftment Eigenschaften der Pre-HSC-Klone. Wir fanden, z. B. dieser klonalen Pre-HSC aus der P-Sp/AGM-Region zwischen E9.5 und E11.5 haben das einzigartige Potenzial B1a und B2-Lymphozyten entstehen während B1a-Lymphozyten Potenzial in Erwachsenen HSC17mangelhaft ist. Darüber hinaus erkannt wir eine Evolution in den Engraftment Eigenschaften der Pre-HSC Klone zwischen E9.5 und E11.5 mit früheren Pre-HSC demonstriert eine relative Neigung in Richtung peritonealen B1a Verse B2-Lymphozyten Engraftment und weniger robust Selbsterneuerung Potenzial basierte auf sekundären Transplantation assays17.

Dieses Protokoll bietet einen wertvollen Ansatz um die einzigartigen Eigenschaften von klonalen HSC-Vorstufen zu erhellen, gibt es einige Einschränkungen, die bestätigt werden müssen. Obwohl die Erkennung von Nachkommen mit HSC phänotypischen durch FACS nach kokultur AGM-EG in der Regel um langfristige multilineage Engraftment korreliert, bieten einige Kolonien mit diesem Phänotyp nur kurzfristige Engraftment oder Engraftment mangelhaft in einem oder mehreren hämatopoetischen Linien (Abbildung 4 b; Daten nicht gezeigt). So bleibt die Transplantation der Goldstandard in der Validierung von funktionalen HSC. Darüber hinaus werden nicht ausgeschlossen, dass die Unterschiede in den Engraftment Eigenschaften der Pre-HSC-Klone, anstatt reflektiert Zelle-Unterschiede im Hemogenic Vorläufer Potenzial, kann ergeben sich aus stochastischen Variabilität während kokultur AGM-EG in den Versen der Selbsterneuerung sind Differenzierung Entscheidungen, als Pre-HSC gleichzeitig Reifung, HSC und Zellteilungen unterziehen. In der Tat, dies kann teilweise entfallen die beobachteten Heterogenität der Kolonie Morphologie und Phänotyp der Zellen, die aus einzelnen Pre-HSC-Klone (z. B. Abbildung 3A–C) generiert und kann zu einer Unterschätzung des Pre-HSC durch führen dieser Assay, wenn nicht alle möglichen Pre-HSC-Klone werden durch Erzeugung von funktionellen HSC nach AGM-EG kokultur erkannt. Allerdings bietet die Möglichkeit, funktionell unterschiedlichen Hemogenic Klone durch ihre differentielle Expression der einzigartigen phänotypischer Marker (z. B. Dll417) aktiviert, indem diese Methode unterscheiden ein Mittel, um Subpopulationen von Hemogenic Vorstufen mit identifizieren inhärente Zelle-Unterschiede.

Aufbauend auf diesen grundlegenden Protokoll, lassen eine Reihe von erweiterten Anwendungen weiter hämatopoetischen Potenzial der klonalen Hemogenic Vorläufer während der Entwicklung studieren. Über den Einsatz von Antikörpern zum Nachweis von oberflächenmarker, Ausdruck der Fluoreszenz Marker in transgenen Embryonen (zB., Ly6a- GFP21 oder Runx1 -GFP22 ausgedrückt in Hemogenic Endothel/Pre-HSC) kann für Index Sortierung der Hemogenic Vorstufen integriert. Neben der Transplantation Assays nach AGM-EG kokultur um vermeintliche Pre-HSC zu erkennen können Nachkommen auch für hämatopoetischen Linie Potential basierend auf sekundäre in-vitro- Tests, wie Kultur auf OP9 oder OP9-Dl1 B und T-Zellen erkennen beurteilt werden potenzielle23bzw. klonogenen koloniebildenden Assays in Methylcellulose, Erythromyeloid Potenzial zu erkennen. In der Tat, einige der nicht-HSC Hemogenic Klone (z. B. Abbildung 3D) wahrscheinlich multipotente Vorläuferzellen, Erythromyeloid Vorfahren darstellen oder T - und B-Zell-Vorfahren zuvor beschrieben, die vorausgehen und sind unabhängig von HSC-Entwicklung 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28, und dieser Test kann klonale Studien deutliche Wellen der hämatopoetischen Vorläufer weiter erleichtern. Zu guter Letzt Index Sortierung der Pre-HSC mit anderen nachgeschalteten Analysen wie einzelne Zelle RNA-Sequenzierung, phänotypische Eigenschaften korrelieren mit der globale transcriptional profile HSC Vorstufen zu entwickeln kombinierbar. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine Methode für die robuste Analyse der klonale Hämatopoese aus embryonalen Hemogenic Vorstufen, die neue Einblicke in HSC Entwicklung bieten sollte.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir möchten danken Andrew Berger, Stacey Dozono und Brian Raden im Fred Hutchinson Flow Cytometry Kern für Hilfe mit FACS. Diese Arbeit wurde von den nationalen Instituten der Gesundheit NHLBI UO1 Grant #HL100395, unterstützt zusätzliche kollaborative Grant #HL099997 und NIDDK gewähren #RC2DK114777. Brandon Hadland wird von Alex es Lemonade Stand Foundation und Hyundai Hope auf Rädern-Stiftung unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGM-EC culture media
Materials for culture of endothelial cells
TrypLE Express Gibco 12605-028 Use to dissociate AGM-EC monolayers
Gelatin 0.1% in water StemCell Technologies 7903 Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic
96-well tissue culture plates Corning 3599 Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-144 Use for dissection and FACS staining
500 ml filter bottles Fisher Scientific 9741202 Use to sterile filter Endothelial media
AGM-EC culture media (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 12440-053 400 mls
Hyclone Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH30088.03 100 mls
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 5 mls
Heparin Sigma H3149 50 mg dissolved in 10 mls media
L-glutamine (200 mM) StemCell Technologies 7100 5 mls
Endothelial Mitogen (ECGS) Alfa Aesar J64516 (BT-203) Add 10 mls media to dissolve and add
Materials for AGM index sort
Collagenase (0.25%) StemCell Technologies 7902 Use for dissociation of embryonic tissues
3ml syringe BD Biosciences 309657 Use to sterile filter antibody solutions for FACS
0.22 µM syringe-driven filter Millipore SLGP033RS Use to sterile filter antibody solutions for FACS
5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap Corning 352235 Use to remove cell clumps prior to FACS
DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) Millipore 268298 Use to exclude dead cells from sort
anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) BD Biosciences 553141 Use to block non-specific staining to Fc receptors
Antibodies for AGM index sort
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 eBioscience 25-1441-82 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4301-81 Isotype control for CD144 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 eBioscience 46-2012-80 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 eBioscience 46-4031-80 Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710
Anti-mouse CD41 PE BD Biosciences 558040 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE BD Biosciences 553925 Isotype control for CD41 PE
Anti-mouse CD45 FITC eBioscience 11-0451-85 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4031-81 Isotype control for CD45 FITC
AGM-serum free media (10mls)
X-Vivo 20 Lonza 04-448Q 10 mls
recombinant murine stem cell factor (SCF) Peprotech 250-03 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) Peprotech 300-19 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
recombinant murine interleukin-3 (IL3) Peprotech 213-13 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
Materials for Staining co-cultured cells
96 well plate, V-bottom Corning 3894 Use for FACS analysis
Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-0451-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 eBioscience 35-4031-80 Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-mouse CD201 (EPCR) PE eBioscience 12-2012-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4031-81 Isotype control for CD201 PE
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC eBioscience 17-5981-83 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC eBioscience 17-4321-81 Isotype control for Ly-6A/E APC
Anti-mouse F4/80 FITC eBioscience 11-4801-81 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4321-41 Isotype control for F4/80 FITC
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC BD Biosciences 553127 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC BD Biosciences 556923 Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC
Materials for tail vein injection for transplant
1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles BD Biosciences 309306 Use for tail vein injection for transplantation
Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP Biolegend 108426 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP Biolegend 400629 Isotype control for Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PE eBioscience 12-4801-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4321-80 Isotype control for F4/80 PE
Anti-mouse CD3 FITC BD Biosciences 555274 Staining
Anti-mouse CD19 APC BD Biosciences 550992 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC BD Biosciences 553932 Isotype control for CD19 APC
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 eBioscience 25-0453-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4321-81 Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 eBioscience 47-0454-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 eBioscience 47-4321-80 Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II with DIVA software BD Biosciences
BD FACSCanto II with plate reader BD Biosciences
Haemocytometer Fisher Scientific S17040 For counting cells
Multi-channel pipette Fisher Scientific 14-559-417 For dispensing cells
FACS analysis software FlowJo/BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

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References

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 135 Hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Pre-HSC Aorta-Gonade-Wachstum-Region (AGM) embryonale Hämatopoese Index sortieren Einzelzelle klonale Analyse Transplantation hämatopoetischer Stammzellen
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Hadland, B. K., Varnum-Finney, B.,… More

Hadland, B. K., Varnum-Finney, B., Nourigat-Mckay, C., Flowers, D., Bernstein, I. D. Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture. J. Vis. Exp. (135), e56973, doi:10.3791/56973 (2018).

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