Summary
여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.
Abstract
배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 (HSC) 창세기를 공부 하는 능력은 초기 배아에 HSC 선구자의 희귀 한 고 기능의 장기 multilineage engraftment 잠재력을 식별 하는 분석 실험의 부족에 의해 제한 되어 개별 putative HSC 선구자입니다. 여기, 우리가 격리와 단일 세포 수준에서 기능적으로 검증된 HSC 선구자의 방법론을 설명 합니다. 첫째, 우리 활용 개별적으로 정렬 된 각 셀의 정확한 phenotypic 매개 변수 카탈로그 인덱스 정렬 phenotypic 감 적의 조합 실험 분석에 대 한 추가 마커 HSC 선구자에 대 한 풍부 하 게 사용 하 여. 둘째, 각 인덱스 정렬 셀이 공동 지 원하는 multilineage, 장기 engraftment에서 가능성과 기능성 HSC에 HSC 선구자 비 engrafting의 성숙 대동맥-생식-mesonephros (AGM) 지역에서 혈관 틈새 기질과 교양 이식 분석 실험입니다. 이 방법을 수 있도록 그들의 기능적인 engraftment 잠재력 클론 hemogenic 선구자의 phenotypic 속성 또는 HSC 전조의 상세한 분석을 위한 수단을 제공 하는 transcriptional 프로필 등의 다른 속성의 상관 관계 단일 세포 수준에서 개발입니다.
Introduction
클론 연구 노화1동안 HSC 하위 및 HSC 행동의 변화에 새로운 통찰력을 제공 하는 성인 HSCs의 장기 engraftment 속성에서이 밝혀졌다. 그러나, 배아 HSCs의 비슷한 연구와 그들의 선구자 되었습니다 더 많은 도전. HSCs 과도 과정에서 내 피 hemogenic 라고 알려진 선구자의 인구에서 발생 하는 초기 배아 개발 중으로 조 혈 전환2내 피. 강력 하 고, 장기 이식 조건된 성인 받는 사람에 따라 multilineage engraftment를 제공 하는 그들의 능력에 의해 정의 된 첫 번째 HSC 배아 이날 10.5 (E10.5) murine 태아에 매우 낮은 주파수3 이후까지 검색 되지 않습니다. . 그들의 발전 동안 3300 HSC (pre-HSC) hemogenic 피에서 발생 하는 이식 분석 실험4,5 에서 효율적인 engraftment 허용 성인 HSC의 속성을 획득 하기 전에 성숙 겪어야 한다 , 6. 희귀 HSC 기원, 다양 한 erythroid와 조 혈 창시자의 연구를 왜곡 골수성, 림프 잠재력 사전-HSC7,8에서 HSC의 출현 전에 이미 감지는. 따라서, 다른 조 혈 창시자에서 사전-HSC 구별 방법 clonally 세포를 분리 하 여 이식 분석 실험에서 engraftment 속성을 검색 하기 위해 HSC에 그들의 성숙에 대 한 충분 한 신호를 제공 필요 합니다.
다양 한 접근 HSC에 비보 전 또는 vivo에서 성숙 하 여 사전-HSC의 검출을 허용 하는 기술 되었다. 방법을 ex vivo는 첫 번째 HSC 개발9에서 감지 되는 AGM 지역과 같은 배아 조직의 문화에 달려 있었다. 이 방법, 분리, 통합 하는 프로토콜에 정렬, AGM 조직의 재 집계는 허용 파라 대동맥에 E11.5 E9.5에서 개발 하는 동안 HSC 선구자를 포함 하는 정렬 된 인구의 특성 splanchnopleura (P-Sp) / 관련해 지역4,,510; 그러나, 이러한 방법 클론 분석에 필요한 단일 세포 수준에서 일어나 높은 처리량 분석에 순종 하지 않습니다. 마찬가지로, 신생아 쥐에 이식 하 여 성숙 vivo에서 어디는 microenvironment HSC 선구자의 초기 단계 지원을 위해 더 적합 한 것으로 추정 되는 또한 활성화 노른자위 sac 및 AGM에서 정렬 된 인구의 연구 / P-Sp (P-Sp는 AGM에 선구자 지역) 사전-HSC, 하지만이 방법의 특성을 가진 또한 단일에 대 한 강력한 플랫폼을 제공 하는 실패 세포 분석11,12.
Rafii 외 에서 연구 보여주었다 그 내 피 세포 Akt 활성화 (EC) 기질 성인 HSC 자체 갱신 생체 외에서13,,1415의 지원에 대 한 틈새 기질을 제공할 수 있습니다. 우리는 최근 Akt 활성화 EC 관련해 지역 (AGM-EC)에서 파생 된 hemogenic 선구자, E9 성인 engrafting HSC 개발에서 뿐만 아니라 후속 빠르면 절연의 성숙에 대 한 적합 한 생체 외에서 틈새를 제공 한다 결정 생성 된 HSC16의 자체 갱신. 감안할 때이 시스템 사용 간단한 2 차원 공동 문화, 그것은 개별적으로 고립 된 hemogenic 선구자의 HSC 잠재력의 클론 분석을 위해 쉽게 적응.
우리는 최근 클론 hemogenic 선구자의 HSC 잠재력 AGM-EC 공동 문화 및 이식에서 이후의 기능 분석 murine 배아에서 개별 hemogenic 선구자의 인덱스 정렬 결합 하 여 분석 결과에 대 한 접근을 보고 17분석 실험. 인덱스 정렬 세포 형광 활성화의 모드 phenotypic의 모든 매개 변수 (즉, 앞으로 분산형 (FSC-A), 측면 살포 (SSC-A), 형광 매개 변수) 각 개별적으로 정렬된 셀 같은 정렬 (FACS) (인덱스)를 기록 하는이 기능 소급 정렬 다음 후속 기능적 분석 상관 될 수 있다. FACS 소프트웨어 위치/잘 두었다는 96 잘 접시의 각 셀에 대 한 두 phenotypic 정보를 기록 합니다. 이 기술은 이전 우아하게 사용 되었습니다 성인 HSC에서이 확인, 추가 HSC, 장기 engrafting 하위 집합에 대 한 풍부 하 고 연관 HSC의 phenotypic 매개 변수 transcriptional phenotypic 매개 변수 결정 단일 속성 셀 레벨18,19. 여기, 우리는 배아 개발의 초기 단계 동안 독특한 phenotypic 매개 변수 식별 및 사전-HSC의 혈통 기여를 가능 하 게이 방법의 상세한 방법론을 제공 합니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 프레드 허 친 슨 암 연구 센터에 의해 승인 되었습니다.
1. AGM-EC Monolayers 공동 문화에 대 한 준비
- 24 시간 이전에 관련해 해 부 정렬, AGM-EC 문화 미디어와 소독 필터를 확인 합니다.
- 물 (100 µ L/잘)에 0.1% 젤라틴 96 잘 접시의 각 음을 추가 하 고 15 분 Aspirate는 젤라틴에 대 한 실 온에서 품 어 두고 접시 조직 문화 후드에서 뚜껑 우물 건조 될 때까지 제거.
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AGM-EC monolayers 및 96 잘 접시 접시 해리.
참고: 앞에서 설명한16, AGM-EC 문화 미디어에서 준비 관련해 EC 유지 합니다. 일관성을 위해 AGM-EC 셀 라인 최대한 빨리 충분 한 숫자 (일반적으로 통로 1-3) 얻을 수 있습니다 냉동 고 공동 배양 실험에 대 한 정의 통로 번호 (일반적으로 통로 5-12)에 사용 될 해야 합니다. AGM-EC 셀 라인 C57BL/6J (CD45.2) 관련해에서에서 파생 됩니다. 모든 미디어 구성에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.- 75 c m2 플라스 크에 관련해 EC 문화에서 미디어를 발음 하 고 5 mL PBS를 추가 합니다. PBS, 발음 및 추가 3 mL 트립 신 솔루션 ( 재료의 표참조).
- 대부분의 세포는 접시 해제 될 때까지 2-4 분 동안 37 ° C에서 품 어. AGM-EC 문화 미디어와 8-10 시간 단일 세포 현 탁 액을 준비 하 여 15 mL 튜브에 전송 10 mL 피 펫을 피펫으로 7 mL를 추가 합니다.
- 5 분에 대 한 300 x g에서 회전 시키십시오, 제거는 상쾌한, 다시 10 mL AGM-EC 문화 미디어에서 일시 중지 고는 hemocytometer와 휴대폰 번호를 예상. AGM-EC 문화 미디어에 1 x 105 셀/mL의 농도에 세포를 희석.
- 각 잘 gelatinized 96 잘 접시의를 100 µ L AGM-EC 세포 현 탁 액 (1 x 104 의 세포)를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에서 AGM-EC 연결 하 고 confluent 단층을 형성 있도록 하룻밤.
참고: 제한 자라 난 그래서 AGM-EC stromal 세포 또는 셀 최적의 공동 문화에 대 한 응집에 균등 하 게 배포 합니다. -
AGM-EC 단층 관련해 공동 문화에 대 한 준비.
- 다음 아침, AGM 혈 청 자유로운 미디어를 준비 합니다.
- 12 잘 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, AGM-EC에서 AGM-EC 문화 미디어를 제거 하 고 모든 잔여 혈 청에 포함 된 미디어를 cytokines 없이 관련해 혈 청 자유로운 미디어의 200 µ L/잘 추가.
- 미디어를 제거 하 고 cytokines와 관련해 혈 청 자유로운 매체의 200 µ L/잘 추가. 제거 하 고 내 피 층 손상 되지; 미디어를 추가 하는 경우에 신속 하 게 작업 예를 들어, 제거 하 고 다시 한 번에 미디어 한 행을 추가 합니다. 배아 세포 정렬에 대 한 준비가 될 때까지 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에서 96 잘 접시를 놓습니다.
2. Murine 배아 조직에서 단일 세포 현 탁 액의 준비
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타임된 matings에서 AGM를 해 부.
- 원하는 나이의 미 발달 직물을 생성 하기 위한 타임된 matings를 설정 합니다.
- 사전-HSC 분석의 단계에 따라 9.5 11.5 일 게시물 coitum (dpc)에서 임신 여성에서 배아를 수확.
참고: 배아 조직 수확 C57BL/6J (CD45.2) 쥐에서 앞에서 설명한 하 고 정확 하 게 무대에 따라 somite 수16. 우리 인구 배아 관련해 지역에서의 분석에 초점을 맞춘의 선구자, P-Sp, E11.5에 E9.5 사이 및 somite 준비 합니다. - 배아20에서 AGM를 해 부.
참고: murine 배아에서 AGM의 해 부에 대 한 자세한 프로토콜 되었습니다20다른 사람에 의해 출판. 또는, 노 른 자 삭 또는 pre-HSC 활동을 사칭 하는 다른 조직 수 또한 분석이 방법으로.
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해 부 배아 조직 분리
- 해 부 조직 10 mL PBS 10%를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 수집 FBS 얼음에. 중력 조직 정착, PBS/FBS, 발음 하 고 즉시 25 분 동안 37 ° C 물 욕조에 0.25% 콜라 및 장소 1 mL을 추가.
- 약 20-30 배를 단일 세포 현 탁 액 1 mL 피 펫 팁 PBS/10% FBS와 피펫으로의 1 mL를 추가 합니다. PBS/10% FBS의 추가 8 mL을 추가 하 고 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기 셀 삭제는 상쾌한.
3. 항 체 Murine 배아 세포의 얼룩
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항 체 얼룩이 지기에 대 한 블로킹 버퍼를 준비 합니다.
- 추가 10 µ g/mL 안티 마우스 CD16/CD32 (Fc 수용 체 (FcR) 블록)와 1 µ g/mL DAPI (H2O의 주식 1 mg/mL) 1 mL PBS 10 %FBS.
- 3 mL 주사기에 세우 고 소독 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 전달 합니다. 다시 셀 펠 릿 천연된 murine 배아 조직 (단계 2.2.2)에서 500 µ L 차단에서 버퍼링 하 고 5 분 동안 얼음에서 알을 품을 일시 중단 합니다.
- 항 체 혼합17준비.
- 10 µ g/mL FcR 블록 1 mL PBS 10%을 추가 FBS 및 10 µ L의 각 형광 색소 활용 된 안티-VE-Cadherin 항 체 (CD144, 테이블의 자료를 참조) 및 안티-EPCR 형광 색소 활용 된 항 체 (CD201, 테이블의 자료를 참조). Titrations에 따라 또는 제조업체의 권장 사항에 따라 명시 되지 않는 한 항 체의 최종 1: 100 희석을 사용 합니다.
참고:이 항 체 조합이 사용 됩니다 정의 정렬, 게이츠 (4.2 단계) 아래 설명 된 대로. VE Cadherin의 공동 식에 따라 정렬 하 고 EPCR 관련해 파생 셀 포함 하는 앞에서 설명한17HSC 전조 활동의 부분에 대 한 중요 한 농축 수 있습니다. - 개별 인덱스 정렬 선구자의 추가 phenotypic 분석에 대 한 추가 형광 색소 활용 된 항 체를 추가 합니다.
참고:이 항 체 정의 정렬에 대 한 게이츠 반드시 사용 되지 않습니다. 이 샘플 프로토콜에서 우리는 안티-CD41 PE 활용 된 항 체와 hemogenic 내 피4에서에서 사전-HSC의 출현 동안 진화 이러한 조 혈 마커의 상대 식 분석 FITC 활용 된 안티 CD45 항 체를 포함 했다 ,5,,1617. 관심의 다른 표시가 원하는 대로 포함 될 수 있습니다. Isotype 형광 색소 활용 된 항 체 컨트롤과 스테인드 샘플 분석에 대 한 부정적이 고 긍정적인 게이츠를 정의 하는 데 사용 됩니다. - 3 mL 주사기에 항 체 믹스를 인출 하 고 소독 하는 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 전달. 블로킹 버퍼, 혼합, 및 적어도 15-20 분 동안 얼음에서 알을 품을 피펫으로 세포 현 탁 액에 항 체 혼합의 500 µ L를 추가 합니다.
- 10 µ g/mL FcR 블록 1 mL PBS 10%을 추가 FBS 및 10 µ L의 각 형광 색소 활용 된 안티-VE-Cadherin 항 체 (CD144, 테이블의 자료를 참조) 및 안티-EPCR 형광 색소 활용 된 항 체 (CD201, 테이블의 자료를 참조). Titrations에 따라 또는 제조업체의 권장 사항에 따라 명시 되지 않는 한 항 체의 최종 1: 100 희석을 사용 합니다.
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씻으십시오 스테인드 셀.
- 8 mL PBS/10% FBS를 추가 합니다. 5 분, aspirate, 및 셀을 다시 중단 1 mL PBS/10% FBS와 펠 렛에 대 한 300 x g에서 세포를 원심.
- 세포 현 탁 액 5 mL 튜브에 35 μ m 셀 스 트레이너 모자를 통해 pipetting 여 세포 덩어리를 제거 합니다. 추가 3 mL PBS/10% FBS와 셀 여과기를 세척. 5 분 x 300g에 세포를 원심, 발음, 다시 500 µ L에서 PBS/10% FBS, 일시 중지 및 FACS까지 얼음에 장소.
4. 지 공동 문화에 대 한 96-웰 스와 관련해 EC 기질에 단일 Hemogenic 선구자의 정렬
- 플레이트 모드 FACS 기계를 준비 하 고 제조업체의 지침에 따라 96 잘 접시에 정렬 정렬. 단일 셀 모드와 모드 최대 순도 마스크 설정 및 정렬 된 각 셀에 대 한 인덱스 매개 변수의 인수를 사용 하는 소프트웨어를 정렬 하는 인덱스를 선택 합니다.
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정렬에 대 한 게이트를 설정 하는 샘플을 스테인드 항 체에서 세포의 샘플을 획득 합니다.
- FACS 기계에 얼룩진된 셀 샘플을 로드 하 고 최저 유량에 세포를 확보. FSC-A 구절 SSC-A와 선택 플롯 (pre-HSC 활동 관련해17프로 파일 다른 크기의 셀에 식별 되는 관측에 근거) 하는 다양 한 크기 (그림 1B)의 셀을 포함 하는 문. FSC-A 구절 FSC-W와 SSC A 구절 SSC-W, plot 고 게이트 남자 제외를 선택 합니다. FSC-A 구절 DAPI 라이브 셀 (DAPI 네거티브) 게이트를 다음 그림 (그림 1B).
- 대 PerCP (또는 EPCR 얼룩에 대 한 관련 형광 색소) PECy7 (또는 VE Cadherin 얼룩에 대 한 관련 형광 색소)를 플롯 합니다. 문 셀 VE Cadherin (포함 된 내 피 세포와 조 혈 창시자 및 pre-HSC AGM에서의 혼합된 인구)에 대 한 긍정적인 고 높은 EPCR 식 (P-Sp/AGM17에서 사전-HSC를 풍요롭게)입니다. 이것은 마지막 게이트 정렬 단계 4.3 (그림 1B)에서 단일 셀을 색인 하는 데 사용 됩니다.
- 플롯 추가 형광 얼룩에 사용 합니다.
참고: 분석 부분 모집단에 따라 추가 게이츠 설정할 수 있습니다 기반으로 세포를 얼룩이 지기에 대 한 포함 하는 다른 마커 검출에. 그러나, 인덱스 정렬 수 있습니다 각 정렬 된 셀에 대 한 형광 매개 변수의 녹화를 이러한 매개 변수는 소급 분석 될 수 있다. 따라서,이 시점에서 필요 하다 아무 추가 게이팅. 모든 FACS 설정에 대 한 보상, 배경 염색에 대 한 계정 및 결정에 isotype 제어 항 체와 겹치는 형광의 방출에 다른 일에 대 한 계정 조정 샘플 단일 항 체와 스테인드를 사용 네거티브/포지티브 게이트입니다.
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인덱스 정렬 관련해 셀.
- FACs 정렬 기계의 플레이트 블록에서 (1.5.3 단계)에서 cytokines와 관련해 혈 청 자유로운 미디어에 관련해 EC 기질 준비 96 잘 접시를 놓습니다. 샘플을 로드 하 고 샘플 수집을 시작 합니다. 인덱스 정렬/단일 셀 모드를 선택 하 고 개별 96-웰 스에 sortingsingle 셀을 시작. 낮은 흐름 속도 사용 하 여 배아 세포에 전단 응력을 최소화 하기 위해.
- 인덱스 정렬 하는 동안 모든 이벤트가 기록 됩니다 확인 합니다. 이 셀으로 웰 스에 기록 된 모든 이벤트를 정렬 됩니다 정렬 게이트는 실제 번호를 개별 정렬된 96-웰 스에, 상대 분석의 총 수의 열거를 수 있게 된다.
- 일단 셀 전체 96 잘 접시에 정렬 되었습니다, 5% CO2에서 설정 하는 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 실험 당 필요한 추가 번호판에 대 한 반복 합니다.
- 96-웰 스의 공동 문화 개별적으로 정렬 셀 AGM-EC (4.3 단계)에서 최대 7 일 (5 한 일 E10 10.5 배아에서 E9-9.5 배아에서 7 일 E11-11.5 배아에서 정렬 셀) 포함. 공동 문화 기간 후 100 배 확대 (그림 2B)에 거꾸로 현미경으로 다양 한 크기와 형태학의 조 혈 모 식민지를 시각화 합니다.
참고: 미디어 공동 문화 기간 동안 변경 될 필요가 없습니다. 정렬 hemogenic 선구자 수 있습니다 처음 EC와 같은 형태와 관련해 EC 레이어로 통합과 관련해 EC 기질 (그림 2A)에서 처음 구분할 수 없습니다. 그러나, 공동 문화, 작은, 다음 24-48 h 반올림 조 혈 모 세포 또는 세포의 클러스터 검색 될 수 있습니다. 공동 문화 (5-7 일)의 끝에, 조 혈 모 세포의 개별 식민지 96-웰 스 받은 클론 조 혈 잠재력 정렬 된 셀의 하위 집합에 구상 될 수 있다. 시각적으로 검사 우물 하나 이상의 다른 식민지, 포함 경우이 샘플 잘 당 정렬 하는 하나 이상의 셀 받은 샘플을 제외 하려면 다운스트림 분석에서 제외 됩니다.
5. 공동 문화를 따르는 클론 조 혈 자손의 분석
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각 96-잘 FACS 분석에서에서 클론을 수확.
- 적극적으로 피펫으로 200 µ L 피 펫 팁 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 내 피 층에서 조 혈 모 세포를 분리. 내 피 레이어를 분리 하지 마세요. FACS에 의해 조 혈 자손의 phenotypic 분석에 대 한 100 µ L의 샘플 (~ 50%)를 제거 합니다.
- 96-잘 V-하단 플레이트에 전송 및 작은 세포를 2 분 동안 300 x g에서 원심. 접시를 반전 하는 동안 단일 빠른 모션 접시에서 미디어를 터치 하 여 미디어를 제거 (영화 판).
- 나머지 100 µ L 셀 후속 engraftment 분석 결과 (6 단계)에서 사용 하는 37 ° C incubatorfor 원래 96 잘 접시에 놓습니다.
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조 혈 모 분석에 대 한 적절 한 항 체와 세포를 품 어.
- 다시 10 µ g/mL FcR 블록 및 1 µ g/mL DAPI PBS/2% FBS의 50 µ L 96 잘 V-바닥의 각 잘에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. 5 분 동안 4 ° C에서 접시를 품 어.
- 10 µ g/mL FcR 블록 및 HSC 분석 PE Cyanine7 활용 된 안티-VE-Cadherin, PerCP 활용 된 안티-CD45, PE 활용 된 안티-EPCR, APC 활용 된 안티-Sca1, 및 안티-Gr1 FITC 활용에 대 한 항 체 믹스 PBS/2% FBS의 50 µ L을 추가 하 고 안티-f 4/80 (1: 100 최종 희석에서 각 항 체 또는 titrations에 따르면 제조업체의 권고에 따라 명시 되지 않는 한). 적어도 20 분 동안 4 ° C에서 접시를 품 어.
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순차적 희석을 언바운드 항 체를 제거 하 고 세포를 분석.
- 300 x g 2 분 작은 셀에서 200 µ L/잘 PBS/2% FBS와 원심 분리기를 추가 합니다. 그런 다음 접시는 상쾌한 삭제 및 각 셀 펠 릿을 200 µ L PBS/2% FBS 추가 하 고 작은 세포를 2 분 동안 300 x g에서 원심을 터치 합니다.
- 접시는 상쾌한 취소 및 추가 분석을 위해 50 µ L/잘 PBS/2% FBS를 터치 합니다. FACS 교류 cytometer 장착 플레이트 리더를 사용 하 여 셀을 분석을 진행 합니다.
참고: 셀 (예를 들어, 다시 서 스 펜 션에 사용 되는 총 50 µ L의 35 µ L)의 고정된 볼륨 확보 조 혈 자손의 하위 집합 열거.
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조 혈 자손 HSC 잠재적인 (그림 3)를 포함 하는 식민지에 대 한 화면에 포함 된 각 잘 FACS 데이터를 분석 합니다.
- 먼저 게이트 CD45 긍정적인 인구는 Gr1와 F480 골수성 표식에 대 한 부정적 이다. 여전히 VE Cadherin의 저급을 표현 하는 세포 게이트 하지 마십시오. 조 혈 식민지의 수확 동안 중단 되는 AGM-EC 계층에서 세포는 VE Cadherin 긍정 및 부정적인 CD45.
- CD45 게이트+VE Cad-/Gr1-- F4/80 셀 EPCR과 Sca1의 높은 수준을 나타내는 하위 집합에 추가 (그림 3A -C).
참고: 이전 연구, 식민지 CD45 셀 부족에+VE Cad-/Gr1--F4/80 Sca1안녕하세요EPCR안녕하세요 표현 형 (그림 3D) reproducibly 감지를 제공 하는 데 실패 multilineage 주변 혈액 engraftment 조사 받는 사람 마우스17 (데이터 표시 되지 않음); 따라서, 이러한 식민지 6 단계에서 다음 식 분석에 포함 되지 필요.
6. 개별 클론 및 Phenotypic 속성 인덱스 정렬 하 여 해명 Engraftment 속성의 분석
- 하루 (가능한 경우) 또는 다음 5 단계에서 phenotypic 분석 아침 다시 활기찬 pipetting 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 (단계 5.1)에서 공동 문화를 다음 각 96-잘 포함 된 조 혈 식민지에서 나머지 100 µ L 셀 중단.
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준비 하 고 congenic 긴장 b 6의 전체 골 수에서 구조 셀을 추가 합니다. Ptprc SJL는는Pepcb/BoyJ (b 6 CD45.1) 성인 쥐16,17.
- 터키는 hemocytometer 솔루션 nucleated 골 셀을 계산 합니다. 5 x 10의 농도를 희석5 nucleated 세포/mL PBS에와 함께 2 %FBS.
- 각 잘 이식 분석에 대 한 조 혈 자손을 포함 하 게 구조 골 수 세포 (5 x 104) 100 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 혼합.
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단일 치명적 방사능된 받는 사람 congenic 긴장 b 6에 개별 클론의 자손을 이식. Ptprc SJL는는Pepcb/BoyJ (b 6 CD45.1) 성인 마우스.
- 치명적 개별적으로 단일 클론 (세 슘 소스에서 사용 하는 1000 cGy)의 자손을 주입 하는 클론의 수로 b 6 CD45.1 쥐의 동일한 수를 비추는.
- ½ mL 인슐린 주사기에 29 G ½ 인치 바늘 200 µ L 총 세포 현 탁 액을 (5 x 104 b 6 CD45.1 구조 골 세포 뿐만 아니라 세포 복제를 포함)를 그립니다.
- 치명적 B6 CD45.1 성인 받는 사람 2-24 h 이전 주입에 비추는.
- 플라스틱 마우스 restrainer 꼬리 접근 허용을 사용 하 여, 각 클론의 세포와 받는 사람 생존에 도움이 5 x 104 b 6 CD45.1 성인 골 수 구조 셀 모두 포함 하는 꼬리 정 맥 200 µ L 볼륨을 통해 주사.
- 귀 태그 받는 사람 마우스 무게 하 고 정기적으로 그들의 무게/건강 체크 (예를 들어, 3-4 회 / 주 포스트 조사/이식, 또는 개별 기관 표준 운영 절차 당) 건강을 보장 하기 위해.
-
일정 한 간격 (예를 들어, 2, 16, 24 주) 주변 혈액 engraftment의 분석을 수행 다음 이식.
- 복고풍 궤도 도련 또는 다른 윤리적으로 승인 된 혈액 시키는 방법을 통해 혈액의 50-100 µ L을 제거 합니다.
- 혈액 3 mL 세포의 용 해 버퍼 (16.6 g NH4Cl, 2 세대 2 L H2O NaHCO3 및 74.4 mg EDTA)를 추가 하 고 PBS/2% FBS 5 분 원심 분리기 300 x 5 분 Aspirate에 대 한 g와 다시 2 mL와 펠 릿을 일시 중단에 대 한 실 온에서 품 어. 5 분에 대 한 300 x g에서 원심.
- 다시 150 µ L PBS/2% FBS 포함 10 µ g/mL FcR 블록와 1 µ g/mL DAPI, 펠 릿을 일시 중단 하 고 기증자 및 혈통, 혈통에 대 한 기증자와 isotype 컨트롤 잘 포함 50 µ L 항 체를 1/3에 대 한 잘 포함 50 µ L isotype 컨트롤 볼륨의 1/3을 분배 그리고 기증자 계보를 모두 감지 하 50 µ L 항 체를 포함 하는 우물을 1/3.
참고: multilineage engraftment의 검출을 위한 항 체: APCeFluor780 활용 된 안티-CD45.2, Pe Cyanine7 활용 된 안티-CD45.1, FITC 활용 된 안티-CD3, PE 활용 된 안티-F4/80, PerCP 활용 된 안티-Gr1, 그리고 APC 활용 된 안티-CD19, 또는 관련 isotype 제어 합니다. - CD45.2 (기증자)의 시간이 지남에 FACS에 의해 말 초 혈액 기여를 평가 하 여 장기 engraftment 클론 식별-골수성 (Gr1 또는 F4/80 양수), 조 혈 모 세포 파생 B 셀 (CD19 양수), 및 T-셀 (CD3 양성) (그림 4A -B).
참고: 조 혈 engraftment CD45.2 (기증자)에 의해 분석 될 수 있다 또한-파생 조직 골 수, 비장, 흉 선, 및 복 막, 또는 골 수 세포의 2 차 이식 다음 수확에서 조 혈 인구에 기여 B6 CD45.1 직렬 engraftment 속성17분석 하 쥐로.
- 초기 단일 셀 인덱스 engraftment 속성으로 정렬 하 여 결정으로 각 클론의 phenotypic 속성을 연결 하십시오. 흐름 분석 소프트웨어를 사용 하 여 업로드 (96-잘 정렬 된 상관) 각 인덱스 정렬 셀 정렬 매개 변수. 그들의 기능 출력 (예를 들어 장기, multilineage engraftment)과 관련 된 단일 셀의 phenotypic 속성을 평가 하는 흐름 플롯에 기능 데이터 (그림 4C).
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Representative Results
그림 1A 는 실험적인 디자인의 회로도 보여준다. P-Sp/관련해 조직 해 부, 풀링, 그리고 콜라에 해리, 일단 그들은 인덱스 정렬에 대 한 VE Cadherin와 EPCR 항 체와 얼룩이 있습니다. 사전-HSC VE Cadherin+EPCR높은 (그림 1B)에 정렬 셀 농축 됩니다. 다른 형광 색소 활용 된 항 체는 소급 인덱스 정렬 하는 동안 각 셀에 대 한 기록 되는 추가 phenotypic 매개 변수를 분석에 포함 될 수 있습니다. E11 AGM에서 대표적인 실험에서 세포는 또한 FITC 활용 된 안티-CD45와 안티-CD41 PE 활용 된 항 체 얼룩이 진다. 이러한 조 혈 특정 표식에 대 한 VE Cadherin+EPCR높은 인구 내의 (그림 1C), 관찰이 단계5에서 조 혈 모 개발에 알려진된 비동기와 일치.
인덱스는 개별 96-웰 스에 단일 VE Cadherin+EPCR높은 관련해 셀의 정렬에 따라 포함 AGM-EC 관련해 혈 청 무료 미디어 및 cytokines, 식민지 형성에서 발생 합니다. 처음에, 정렬된 VE Cadherin+EPCR높은 관련해 셀에 통합 관련해 EC 레이어 모아 조 혈 클러스터 (그림 2A, GFP를 표현 하는 유전자 변형 murine 배아에서 정렬 셀에서 여기에 표시 된 형성을 시작 하기 전에 아래는 Ly6a 발기인21, AGM-EC 기질을 구분 하기 위해). 5-7 일 후 공동 문화, 다양 한 크기와 형태학의 식민지는 대표적인 실험, 6 일 E11 AGM에서 정렬에서 여기에 표시 된 (그림 2B), 거꾸로 현미경으로 검사 하 여 검색할 수 있습니다.
FACS에 의해 다음, phenotypic 분석 조 혈 식민지를 형성 하고있다 각 VE Cadherin+EPCR높은 세포의 자손의 절반에 수행 됩니다. 식민지 HSC 표현 형을 가진 세포를 포함 하는 VE Cadherin 됨으로-/Gr1--F4/80 CD45+Sca1안녕하세요EPCR안녕 (그림 3). 여기, 우리가 다음 취득의 다른 식민지 4 개 공동 인덱스 정렬 E11 관련해 VE-Cadherin+EPCR높은 셀, 3 다른 분화 세포 유형 (그림 3A와 phenotypic HSC의 다른 비율을 포함의 문화 보기 -C), 4 부족 HSC 표현 형 (그림 3D)와 셀. 도금 하는 전지와 백분율 귀착되 었 다 engraftable 줄기 세포 식민지의 수를 관찰 하는 식민지의 수 배아 나이 및 수행 하는 정렬에 따라 다릅니다. VE Cadherin-/Gr1--F4/80 CD45+Sca1안녕하세요EPCR안녕하세요 E11 관련해 클론 5% ± 1.3 %192 오래 engrafted 그 복제 생성 하는 도금 도금 192 세포에서 생성 된 53 ± 15 식민지 기간 (평균 ± SD 3 실험).
와 상관 관계를 표현 형 engraftment 잠재적인, HSC 형 FACS에 의해 감지와 셀 나머지 절반을 포함 하는 조 혈 식민지 형성은 각 VE Cadherin+EPCR높은 셀의 자손 (예를 들어는 그림 3A-C에서 식민지) B6 CD45.1 골 수에서 구조 셀의 복용량 함께 조사 (1000 cGy) 성인 congenic 긴장 (B6 CD45.1) 쥐에 이식. 장기 multilineage engraftment 골수성 (Gr1 및 f 4/80), 기증자 (CD45.2) 기여에 따라 각 복제에 대 한 확인은 B 셀 (CD19), 및 (그림 4A) 동안 말 초 혈액의 T-세포 (CD3) 구획. HSC 형 FACS에 의해 감지 된 셀을 포함 하는 대부분 식민지 장기 engraftment 제공, 이식 서 일부 클론 (그림 4B), 시간이 지남에 engraftment 잃거나 표시 기능 multilineage engraftment를 확인할 필요는 림프 바이어스 engraftment (데이터 표시 되지 않음) 같은 독특한 engraftment 속성입니다. 각 VE Cadherin+EPCR높은 복제의 기능 HSC 잠재력 결정 되 면이 다시 그 클론의 인덱스의 정확한 phenotypic 특성을 식별 하는 매개 변수를 정렬에 상관 된다. 이 예제에서 우리는 기능 확인 사전-HSC 클론 (빨간 점) CD41 CD45, HSC (그림 4C)를 사전-HSC 성숙 하는 동안 이러한 마커 설립된 동적 표현 일치의 그들의 표정에서 이기종 참조. 클론 phenotypic 심사 또는 장기의 부재 하거나 부족 HSC 잠재력을 하지만 조 혈 식민지를 형성, 이식 (비 HSC hemogenic 클론, 파란색 점) 다음 multilineage engraftment이 있습니다 CD41 및 CD45, 이기종 비록 일부 표현 CD41의 상부 주로 CD41낮은pre-HSC 클론과 비교 합니다. (비 hemogenic 클론, 밝은 녹색 점) 조 혈 모 식민지를 형성 하지 않았다 클론은 주로 CD41-/CD45-는 아마 비 hemogenic VE Cadherin+EPCR높은 내 피 세포를 반영.
그림 1: 프로토콜 개요 및 인덱스의 정렬에 대 한 대표적인 흐름 cytometry 분석 단일 셀. (A) 프로토콜의 도식 적인 표현입니다. (B) 흐름 끊된 E11 AGM의 cytometry 분석 세포 VE Cadherin+EPCR높은 셀 사전-HSC (FACS 분석 소프트웨어로 분석)에 대 한 농축의 인덱스 정렬에 대 한 표시 제어 전략. 각 게이트에서 번호 셀의 비율을 나타냅니다. (C) Flow cytometry 분석 보여주는 CD41 CD45 VE Cadherin+EPCR높은 인구 내의 얼룩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: AGM-EC 공동 문화 중 조 혈 식민지의 형성. VE-Cadherin+EPCR Ly6a-GFP 유전자 변형 태아21 관련해 적에 공동 경작에서높은GFP+ 정렬 셀 (A) 시간 경과 영상 µ M에서 눈금 막대는 각 이미지의 왼쪽 아래에에서 표시 됩니다. (B) 대표적인 식민지에서에서 형성 VE Cadherin+EPCR높은 인덱스 정렬 단일 셀 후 6 일 공동 관련해 적에 문화 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 흐름 관련해 적에 공동 문화를 다음 단일 E11 관련해 파생 VE-Cadherin+EPCR높은 세포의 자손의 cytometry 분석 VE Cadherin은 하위 집합으로 표시 됩니다 HSC 잠재력 셀 게이팅-/Gr1-F4/80- (왼쪽된 패널), CD45+ (중간 패널), 및 Sca1안녕하세요EPCR안녕 (오른쪽 패널). (A) 대표적인 식민지 HSC 표현 형을 가진 세포의 균질 인구의 구성. (CB-) HSC 형와 더 차별화 된 셀 형식 셀의 혼합을 포함 하는 대표적인 식민지. (D) 대표적인 식민지 부족 HSC 표현 형 세포로 구성 된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 매개 변수를 정렬 하는 인덱스와 관련해 EC 공동 문화 및 상관 관계에 따라 개별 클론의 자손의 주변 혈액 engraftment 분석. (A) 주변 혈액 기증자 CD45.2 파생 engraftment 골수성 (Gr1와 f 4/80), B-세포 (CD19), 및 T-세포 (CD3) 하위 집합 대표 받는 (B6 CD45.1)와 자손의 개별 E11 VE-Cadherin+EPCR높은 이식 복제 AGM-EC 공동 문화에 따라. (B) 주변 혈액 기증자 CD45.2 파생 engraftment AGM-EC 공동 문화에 따라 개별 E11 VE Cadherin+EPCR높은 클론의 자손의 이식 후 시간이 지남에. (C) CD41 상관 관계 및 CD45 식 각 인덱스 정렬 VE Cadherin+EPCR높은 대 한 장기, multilineage engraftment 이식 분석 결과에서 기반으로 다음 AGM-EC 공동 문화 HSC 잠재력과 클론. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
배아 개발 HSC 창세기 연구 HSC hemogenic 선구자 아직 이식 성인 받는 사람의 장기 multilineage 조 혈 재구성을 제공 하기 위해 능력 부족에서 가능성을 감지 하는 수단을 필요로 합니다. 이 프로토콜에서 선물이 배아 hemogenic 선구자의 클론 분석 결과 혈관 틈새 ECs stromal 공동 문화 지원 HSC에 선구자의 성숙, AGM에서 이식 분석 실험에서 후속 기능 분석. 허가 정렬 하는 인덱스의 phenotypic 매개 변수 사전-HSC 표면 표식으로 정의 된 속성 특성의 회고전 분석 분석 결과에 포함 됩니다. 이 방법은 효율적인 잠재적인 표식에 대 한 검사 수 있도록 다시 aggregation 기반 HSC 분석 실험4,5,10, 전조 인구의 대량 정렬에 의존 하는 다른 방법에 비해 이점을 제공합니다 사전-HSC 각 개별 셀에 대 한 표면 마커 상대 식 수준에 대 한 정보를 제공 하는 동시에 하면서. 이 방법론을 사용 하 여, 예를 들어 우리가 이전에 보고 된, 개발의 다른 단계에서 사전-HSC 인구에 대 한 풍부 하 게 하는 EPCR 사용 하 여, 뿐만 아니라 중간 식 노치 ligand Dll4의 추가 정의 클론의 부분 모집단 잠재적인, Dll4 VE Cadherin+EPCR+ hemogenic 전 주로 부정적인 반면 HSC와 VE Cadherin+EPCR+ 선구자 HSC 잠재적인17부족.
이 방법의 또 다른 장점은 HSC 잠재력에 대 한 스크린 수는 표현 형으로 조 혈 자손의 검출에 따라 공동 문화 다음 즉시 (VE Cadherin-/Gr1--F4/80 CD45+Sca1 안녕하세요EPCR안녕하세요)는 장기, multilineage engraftment와 상관 된다. 이 이러한 식민지 이식 분석 실험에 장기 engraftment를 제공 하지 않습니다 부족이 HSC 표현 형으로 조 혈 자손 식민지를 이식 하는 필요가 없습니다. 또한, HSC 잠재력 공동 문화, 장기 engraftment 분석 실험에서 결과 기다릴 필요 없이 바로 다음 부족 hemogenic 선구자에서 잠재적인 사전-HSC를 구별 하는 초기 정보 유용, 등에서 빠르게 HSC-선구자의 후보 마커를 상영. 그러나, 다음 이식 장기 engraftment phenotypic 데이터의 상관 관계 추가 귀중 한 통찰력을 사전-HSC 클론의 정확한 engraftment 속성의 유사를 제공 합니다. 우리가 발견, 예를 들어 E9.5와 E11.5 사이의 P-Sp/관련해 지역에서 그 클론 중-HSC 독특한 잠재력이 있다 B1a와 B2-림프 톨, 둘 다에 게 상승 B1a 림프 구 잠재력은 성인 HSC17부족 한 반면. 또한, 우리 감지 진화 E9.5 사이의 E11.5 사전-HSC 클론의 engraftment 속성에서 이전 예약-HSC 강력한 자기 갱신 잠재력 기반 복 막 B1a 구절 B2-림프 구 engraftment 쪽으로 갈수록 상대 스큐 시연 2 차 이식에17분석 실험.
이 프로토콜은 클론 HSC 선구자의 독특한 속성을 명료 하 게 하는 귀중 한 접근을 제공 한다, 인정 해야 하는 몇 가지 제한이 있습니다. FACS AGM-EC 공동 문화를 다음에 의해 phenotypic HSC와 자손의 탐지는 일반적으로 장기 multilineage engraftment를 상관 하 고,이 표현 형으로 일부 식민지 단기 engraftment 또는 하나 이상의 engraftment 결핍만 제공 조 혈 모 계보 (그림 4B; 데이터 표시 되지 않음) 따라서, 이식 검증 기능 HSC 황금 표준 남아 있습니다. 또한, 그것은 배제할 수 없다는 engraftment 속성 사전-HSC의 차이의 일부를 복제, 보다는 오히려 hemogenic에 셀 본질적인 차이 반영 전조 가능성, AGM-EC 공동 문화 중 확률의 변화에서 발생할 수 있습니다. 자체-갱신 구절에서 차별화 의사 결정, 사전-HSC 동시에 HSC에 성숙 되며 세포 분열을 겪고. 사실,이 부분에서 식민지 형태학의 관찰된이 고 개별 사전-HSC 클론 (예를 들어, 그림 3A-C)에서 생성 하는 세포의 표현 형에 대 한 계정 수 있습니다. 그리고 여 사전-HSC의 과소에 발생할 수 있습니다. 이 분석 결과 하지 않을 경우 모든 잠재적인 사전-HSC 클론 기능 HSC AGM-EC 공동 문화를 다음 세대에 의해 검색 됩니다. 그러나이 방법으로 활성화 (Dll417) 같은 독특한 phenotypic 감 적의 그들의 차동 식으로 기능적으로 뚜렷한 hemogenic 클론을 구별할 수 있는 능력와 hemogenic 일어나 모집단을 식별 하는 수단을 제공 하는, 고유한 셀 본질적인 차이입니다.
이 기본 프로토콜에 건물, 다양 한 확장된 응용 프로그램 클론 hemogenic 선구자의 조 혈 잠재력 개발 과정 진학을 포함할 수 있습니다. 마커의 표면 식 형광 마커 유전자 변형 태아에서의 검출을 위한 항 체를 사용 하 여 넘어 (예., Ly6a-GFP21 또는 Runx1-GFP22 hemogenic 내 피/사전-HSC에서 표현) 될 수 있습니다 hemogenic 선구자의 인덱스 정렬에 대 한 통합. 이식 분석 putative 사전-HSC를 감지 하 AGM-EC 공동 문화에 따라, 뿐만 아니라 자손 또한 평가 될 수 있다 보조 생체 외에서 분석 실험, OP9 또는 OP9 Dl1 B 및 T 세포를 감지 하는 문화 등에 따라 조 혈 혈통 잠재력에 대 한 잠재적인23또는 clonogenic 식민지 erythromyeloid 가능성을 감지 하는 스에 분석 실험을 형성. 사실, 일부 비-HSC hemogenic 클론 (예를 들어, 그림 3D)의 가능성이 multipotent 창시자, erythromyeloid 창시자, 또는 T 및 B 세포 창시자 이전 앞 고 HSC 개발의 독립을 설명 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28, 그리고이 분석 결과 조 혈 선구자의 이러한 뚜렷한 파도의 클론 연구 촉진 추가 수 있습니다. 마지막으로, 사전-HSC의 인덱스 정렬 단일 셀 RNA 시퀀싱, HSC 선구자 개발의 글로벌 transcriptional 프로필 phenotypic 속성을 연결할 같은 다른 다운스트림 분석 결합할 수 있습니다. 전부,이 프로토콜 HSC 개발에 대 한 새로운 통찰력을 제공 한다 미 발달 hemogenic 선구자에서 클론 조의 강력한 분석에 대 한 메서드를 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 프레드 허 친 슨 흐름 Cytometry 코어에 FACS에 앤드류 버거, 스테이 시 Dozono, 그리고 브라이언 라덴을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 보조 공동 그랜트 #HL099997, 그리고 NIDDK 부여 #RC2DK114777 #HL100395, 건강 NHLBI UO1의 국가 학회 교부 금에 의해 지원 되었다. 브랜든 Hadland 알렉스의 레모네이드 스탠드 재단 희망과 현대 바퀴 기초에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
References
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