Summary
Burada fare embriyonik gelişim sırasında hematopoetik kök hücre öncüleri klonal analizi için metodoloji mevcut. Endotel hücre ortak kültür ve fenotipik özellikleri ve tek hematopoetik öncüleri potansiyelini engraftment karakterize nakli ile embriyonik aort-erbezi-mesonephros bölgesinden tek hücre dizin sıralama birleştirin.
Abstract
Hematopoetik kök hücre (HSC) genesis embriyonik gelişim sırasında çalışma özelliği erken embriyo HSC öncüleri nadir ve işlevsel olarak uzun vadeli multilineage engraftment potansiyelini belirlemek deneyleri eksikliği ile sınırlı bireysel sözde HSC öncüleri. Burada, yalıtım ve işlevsel olarak doğrulanmış HSC öncüleri tek hücre düzeyinde karakterizasyonu sağlar metodoloji açıklayın. İlk olarak, biz kesin fenotipik parametresi, tek tek sıralanmış her hücrenin katalog için dizin sıralama kullanmak deneysel analizi için ek işaretçileri olan HSC öncüleri için zenginleştirmek için fenotipik işaretçileri kullanarak. İkinci olarak, her dizin sıralanır hücre vasküler niş stroma sigara engrafting HSC öncüleri multilineage, uzun vadeli engraftment içinde potansiyel ile fonksiyonel HSC için olgunlaşma destekler aort-erbezi-mesonephros (AGM) bölge ile ortak kültürlü. nakli deneyleri. Bu metodoloji korelasyon klonal hemogenic öncüleri ile fonksiyonel engraftment potansiyellerini fenotipik özellikleri veya transkripsiyon profil, HSC habercisi ayrıntılı bir analiz için bir araç sağlayan gibi diğer özellikleri sağlar tek hücre düzeyinde geliştirme.
Introduction
Klonal çalışmalar heterojenite yetişkin HSCs, yaşlanma1sırasında HSC alt türlerini ve HSC davranış değişiklikleri yeni bilgi sağlayan uzun vadeli engraftment özelliklerini ortaya koymuştur. Ancak, embriyonik HSCs benzer çalışmaları ve onların öncüleri daha zor olmuştur. Erken embriyonik gelişim sırasında geçici bir süreç içinde hemogenic endotel anılacaktır olarak bilinen öncüleri nüfusu HSCs kaynaklanan olarak endotel hematopoetik geçiş2. Sağlam, uzun vadeli multilineage engraftment şartına yetişkin alıcılar nakli takip sağlamak için onların yetenek tarafından tanımlanan ilk HSC değil embriyonik günün ardından kadar 10.5 (E10.5) fare embriyo çok düşük frekanslı3, tespit . Gelişimleri sırasında öncüleri hemogenic endotel doğan HSC (pre-HSC) için olgunlaşma nakli deneyleri4,5 verimli engraftment için izin yetişkin HSC özelliklerini edinme önce geçmeleri gerekir , 6. nadir HSC kökenli, hematopoetik ataları ile erythroid, çok sayıda çalışmanın engellemeyecek myeloid ve lenfoid potansiyeli zaten algılanır HSC ortaya çıkması pre-HSC7,8önce. Böylece, pre-HSC diğer hematopoetik ataları ayırt clonally hücreleri izole etmek ve onları kendi olgunlaşma için yeterli sinyallerle HSC nakli deneyleri engraftment özelliklerini tespit etmek, sağlamak için yöntemler gerektirir.
Yaklaşımlar bir dizi tarafından ex vivo veya vivo olgunlaşma HSC için pre-HSC tespiti için izin olan tarif edilmiştir. Ex vivo yöntemler kültür nerede ilk HSC geliştirme9' tespit AGM bölge gibi embriyonik dokuların bağlıydı. Bu yöntemler, ayrılma, dahil protokolleri bina sıralama ve AGM dokuların yeniden toplama sıralanmış nüfus içinde para aort E11.5 için E9.5 üzerinden geliştirme sırasında HSC öncüleri içeren karakterizasyonu izin splanchnopleura (P-Sp) / AGM bölgeleri4,5,10; Ancak, bu yaklaşımların öncüleri klonal analiz için gerekli tek hücre düzeyinde yüksek üretilen iş analizi için mükellef değildir. Microenvironment HSC öncüleri, daha önceki aşamalarında destek için daha uygun olduğu kabul edilir nerede benzer şekilde, in vivo olgunlaşma yeni doğmuş fare, içine nakli tarafından da sarısı sac ve AGM sıralanmış nüfus çalışmaları sağladı / P-Sp (P-Sp habercisi AGM için bölgedir) pre-HSC, ama bu yöntemleri özellikleri ile de tek için sağlam bir platform sağlamak için başarısız hücre analizi11,12.
Rafii ve ark. çalışmalardan o Akt aktive endotel hücre (EC) stroma bir niş substrat yetişkin HSC kendini yenileme vitro13,14,15desteği sağlayabilir gösterdi. Biz son zamanlarda Akt aktif EC AGM bölgesinden (AGM-EC) elde edilen hemogenic öncüleri, gibi erken E9 geliştirme, HSC, Yetişkin engrafting için hem de sonraki izole olgunlaşma için uygun vitro niş sağlar tespit kendini yenileme oluşturulan HSC16. Bu sistemi basit bir 2-boyutlu ortak kültür istihdam olduğunu göz önüne alındığında, tek tek izole hemogenic öncüleri HSC potansiyelini klonal analiz için kolayca uyarlanabilir.
Son zamanlarda bir yaklaşım bireysel hemogenic öncüleri AGM-AB ortak kültür ve sonraki fonksiyonel analiz Ekiminde fare embriyo gelen dizin sıralanması birleştirerek klonal hemogenic öncüleri HSC potansiyelini tahlil bildirdin 17deneyleri. Dizin sıralama olduğunu Floresans aktif bir mod hücre (FACS) bu kayıtları (dizinler) sıralama her tek tek sıralanmış hücre böyle fenotipik parametreleri (Yani, ileri dağılım (FSC-A), yan dağılım (SSC-A), floresan parametreleri) tüm bu özellikleri geriye dönük olarak sıralama takip sonraki fonksiyonel analiz için ilişkili olabilir. FACS yazılım her hücre ve pozisyonu/kuyunun yerleştirildiği 96-şey plaka için her iki fenotipik bilgileri kaydeder. Bu teknik daha önce zarif kullanılmış olan yetişkin HSC heterojenite tanımlamak, daha fazla HSC uzun vadeli engrafting alt için zenginleştirmek ve fenotipik HSC parametrelerinin transkripsiyon ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir fenotipik parametreleri belirlemek için özellikleri tek düzey18,19hücre. Burada, benzersiz fenotipik parametreleri tanımlaması ve pre-HSC katkılarıyla lineage embriyonik gelişme erken aşamalarında sağlar bu yaklaşımın detaylı metodoloji sağlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi tarafından onaylanmıştır.
1. ortak kültür için AGM-EC Monolayers hazırlanması
- 24 saat önce AGM diseksiyon ve sıralama, AGM-EC kültür medya ve filtre sterilize yapmak.
- 96-şey plaka her şey için su (100 µL/de) % 0,1 jelatin ekleyin ve 15 dk. aspiratı jelatin için oda sıcaklığında kuluçkaya ve plaka bir doku kültürü mahallede kuyuları kuru olana kaldırıldı ve kapak ile bırakın.
-
AGM-EC monolayers ve 96-şey plakaları plakasına ayırmak.
Not: AGM-EC, yukarıda açıklanan16, AGM-EC kültür medya olarak hazırlanan korumak. Tutarlılık sağlamak için AGM-EC hücre hatları yeterli sayıda (genellikle geçiş 1-3) elde edilen en kısa zamanda donmuş olmalı ve tanımlanmış geçit numaradan (genellikle geçiş 5-12) ortak kültür deneyler için kullanılan. AGM-EC hücre hatları (CD45.2) AGM C57BL/6J türetilmiştir. Tüm medya besteleri için Malzemeler tablo görmek.- 75 cm2 şişeye AGM-EC kültüründe medyadan Aspire edin ve 5 mL PBS ekleyin. PBS Aspire edin ve 3 mL tripsin çözüm ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).
- 2-4 dk 37 ° C'de en hücreleri tabağını kaldırma kadar kuluçkaya. AGM-EC kültür medya ve damlalıklı tek hücre süspansiyon hazırlamak ve bir 15 mL tüp aktarmak için 8 - 10 kez bir 10 mL pipet ile 7 mL ekleyin.
- 300 x g 5 min için de spin, süpernatant kaldırmak, 10 mL AGM-EC kültür medyada yeniden askıya alma ve telefon numarası ile bir hemasitometre tahmin ediyoruz. 1 x 105 hücre/mL AGM-EC kültür medya bir konsantrasyon hücrelere sulandırmak.
- 100 µL AGM-EC hücre süspansiyon (1 x 104 hücreleri) gelatinized bir 96-şey plaka her şey için ekleyin. Bir 37 ° C, % 5 CO2 doku kültürü kuluçka yerde gecede AGM-EC iliştirin ve Konfluent monolayer oluşturmak izin vermek için.
Not: Bu nedenle sınırlı büyüme AGM-EC stromal hücreler veya hücre için en uygun ortak kültür topaklanma dağıtabilmenizi. -
AGM-EC monolayer AGM ortak kültürü için hazırlayın.
- Ertesi sabah, AGM serum serbest ortam hazırlamak.
- 12-şey çok kanallı pipet kullanarak, AGM-EC kültür medya AGM-EC kaldırın ve 200 µL/iyi AGM serum-Ücretsiz medya olmadan herhangi bir kalıntı serum içeren medya yıkamak için sitokinler ekleyin.
- Medyayı çıkarın ve 200 µL/iyi sitokinler ile AGM serum-Ücretsiz medya ekleyin. Hızlı bir şekilde iş ne zaman kaldırma ve endotel tabakası uzlaşma medya ekleyerek; örneğin, kaldırmak ve yeniden tek medya bir satır ekleyin. Embriyonik hücreleri sıralamak için hazır olana bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de 96-şey tabak koyun.
2. tek hücre süspansiyon fare embriyonik doku üzerinden hazırlanması
-
Zamanlanmış matings üzerinden AGM incelemek.
- İstenilen yaş embriyonik dokular oluşturmak için zamanlanmış matings ayarlayın.
- Hasat embriyo 9.5-11,5 gün sonrası coitum (dpc), bağlı olarak çözümlenmesi için pre-HSC aşaması, hamile kadın üzerinden.
Not: Yukarıda açıklanan ve tam olarak aşamalı temel alınarak somite sayısı16olarak C57BL/6J (CD45.2) fare embriyonik doku hasat. Embriyonik AGM bölgedeki nüfusun analiz odaklı olması ve onun habercisi, P-Sp, E11.5, E9.5 arasında somite evreleme üzerinde dayalı. - AGM embriyo20incelemek.
Not: Ayrıntılı iletişim kuralları AGM diseksiyon üzerinden fare embriyolar için olmuştur başkaları tarafından20yayınlandı. Alternatif olarak, sarısı sac veya pre-HSC etkinliğine sahip iddia edilen diğer dokularda da bu yöntemle analiz edilebilir.
-
Disseke embriyonik doku ayırmak.
- 15 mL konik tüp 10 mL % 10 ile PBS içeren disseke dokularda toplamak FBS buz üzerinde. Yerçekimi doku yerleş, PBS/FBS Aspire edin, sonra hemen bir 37 ° C su banyosu için 25 dk 1 mL % 0,25 collagenase ve yer ekleyin.
- 1 mL PBS/10% FBS ve damlalıklı yaklaşık 20 - 30 kat bir tek hücre süspansiyon elde etmek için 1 mL pipet ucu ile ekleyin. PBS/10% FBS bir ek 8 mL ekleyin ve 300 x g 5 dakika süreyle santrifüj hücreleri süpernatant atın.
3. antikor fare embriyonik hücreleri boyama
-
Engelleme arabellek antikor boyama için hazırlayın.
- 10 µg/mL Anti-fare CD16/CD32 (Fc reseptör (FcR) blok) ve 1 µg/mL DAPI (H2O hisse senedi 1 mg/mL) % 10 ile 1 mL PBS ekleyin FBS.
- 3 mL şırınga içinde çizmek ve sterilize etmek için bir 0,22 µm şırınga filtreden geçmek. Yeniden hücre Pelet 500 µL kapatmaktır Disosiye fare embriyonik dokulardan (Adım 2.2.2) dan tampon ve 5 min için buz üzerinde kuluçkaya askıya alma.
- Antikor mix17hazırlayın.
- 1 mL PBS % 10 ile 10 µg/mL FcR blok eklemek FBS ve her fluorochrome Birleşik anti-VE-Cadherin antikor 10 µL (CD144, Tablo reçetesigörmek) ve fluorochrome-Birleşik anti-EPCR antikor (CD201, Tablo reçetesigörmek). 1: 100 son seyreltme antikorların üreticinin önerilerini veya titrations göre göre belirtilmedikçe kullanın.
Not: Bu antikor sıralama, gates tanımlamak için (Adım 4.2) açıklandığı gibi kullanılır. Sıralama VE-Cadherin co ifadeye dayalı ve EPCR HSC habercisi etkinlik, yukarıda açıklanan17olarak içeren hücreler AGM kaynaklı kısmı için önemli zenginleştirme sağlar. - Ek fluorochrome-Birleşik antikorlar fenotipik analizinde bireysel dizin sıralanır öncüleri için ekleyin.
Not: Bu antikorlar mutlaka gates sıralama tanımlamak için kullanılır. Bu örnek protokol için biz PE Birleşik anti-CD41 antikor ve pre-HSC hemogenic endotel4 üzerinden ortaya çıkması sırasında gelişmeye bu hematopoetik işaretlerinin göreli ifade analiz etmek için anti-CD45 FITC Birleşik antikor dahil ettik ,5,16,17. Diğer işaretleri ilgi istediğiniz gibi dahil edilebilir. Fluorochrome-Birleşik izotip antikor denetimleriyle lekeli örnekleri analiz negatif ve pozitif geçitlerini tanımlamak için kullanılır. - 3 mL şırınga antikor karışımda çizmek ve sterilize etmek için bir 0,22 µm şırınga filtreden geçmek. Engelleme arabellek, mix ve en az 15-20 dk için buz üzerinde kuluçkaya pipet hücre süspansiyon için 500 µL antikor karışımı ekleyin.
- 1 mL PBS % 10 ile 10 µg/mL FcR blok eklemek FBS ve her fluorochrome Birleşik anti-VE-Cadherin antikor 10 µL (CD144, Tablo reçetesigörmek) ve fluorochrome-Birleşik anti-EPCR antikor (CD201, Tablo reçetesigörmek). 1: 100 son seyreltme antikorların üreticinin önerilerini veya titrations göre göre belirtilmedikçe kullanın.
-
Lekeli hücreleri yıkayın.
- 8 mL PBS/10% FBS ekleyin. 5 dk, aspiratı ve yeniden askıya hücre ile 1 mL PBS/10% FBS cips için 300 x g de hücreleri santrifüj kapasitesi.
- Hücre kümeleri 35 mikron hücre süzgeç kap üzerinde 5 mL tüp yoluyla hücre süspansiyon pipetting tarafından kaldırın. Hücre süzgeç bir ek 3 mL PBS/10% FBS ile yıkayın. 300 x g 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi, Aspire, 500 µL PBS/10% FBS yeniden askıya alma ve buza FACS kadar yer.
4. dizin tek Hemogenic öncüleri 96-AGM-EC Stroma Wells'le için ortak kültürü için sıralama
- Plaka modu için FACS makineyi hazırlamak ve 96-şey plakaları üreticinin talimatlarına göre sıralamak için hizalayın. Tek hücre modu ve maksimal saflık maskesi ayarları ve dizin parametreleri sıralanmış her hücre için edinimi etkinleştirmek için yazılım modunda sıralama dizini seçin.
-
Bir örneği örnekleri sıralama gates ayarlamak için lekeli antikor hücrelerden elde etmek.
- Lekeli hücre örnek FACS makine üzerinde yük ve hücreleri en düşük akış hızı elde etmek. FSC-bir ayet SSC-A ve select arsa hücreleri (Bu pre-HSC faaliyet farklı boyutu profilleri AGM17hücrelerdeki tanımlanır gözlem dayanır) büyüklüklerde (şekil 1B) içeren bir kapı. FSC-bir ayet FSC-W ve SSC-bir ayet SSC-W çizmek ve gates birini dışarıda bırakmak için seçin. FSC-bir ayet DAPI canlı hücreleri (DAPI için negatif) kapı Arsa (şekil 1B).
- PECy7 (veya ilgili fluorochrome VE-Cadherin leke için) PerCP (veya EPCR leke için ilgili fluorochrome) karşı çizmek. Bu VE-Cadherin (e nüfus endotel hücreleri gibi hematopoetik ataları ve pre-HSC AGM üzerinden olmak üzere) için olumludur ve (pre-HSC P-Sp/AGM17için zenginleştirir) yüksek EPCR ifadesi olan hücrelerin kapısı. Sıralama adım 4.3 (şekil 1B) Tek Kişilik hücrelerde dizinini oluşturmak için kullanılacak olan son kapıdır.
- Boyama için kullanılan ek fluorochromes arsa.
Not: analiz edilebilir subpopulation bağlı olarak, ek gates hücreleri boyama için dahil diğer işaretleri algılamayı göre ayarlanabilir. Öyle ki bu parametreler geriye dönük olarak analiz edilebilir ancak, dizin sıralama sıralanmış her hücre için floresan parametreleri kayıt sağlayan. Böylece, hiçbir ek geçişi bu noktada gereklidir. Tüm FACS kurulumları için tek antikorlar ile lekeli örnekleri emisyon üst üste fluorochromes ve izotip kontrol antikorlar, arka plan boyama için hesap ve belirlemek için yayılma için hesap için tazminat, ayarlamak için kullanılmalıdır negatif/pozitif gates.
-
Dizin AGM hücreleri sıralamak.
- AGM-EC stroma AGM serum-Ücretsiz medya (1.5.3. adımdaki) sitokinler FACs sıralama makinesine plaka blok ile hazırlanan bir 96-şey tabak koyun. Örnek yükleme ve örnek alma başlar. Dizin sıralama/tek hücre modu seçin ve bireysel 96-wells hücrelere sortingsingle başlar. Yamultma stres embriyonik hücrelerde en aza indirmek için en düşük akış hızını kullanın.
- Tüm olayları sırasında dizin sıralama kaydedilir sağlamak. Bu kaydedilmiş olan tüm olayları wells için sıralanır gibi gerçek sayı için tek tek sıralanmış 96-wells için göreli sıralama kapısı analiz toplam sayısı numaralandırılmasına olanak sağlar.
- Hücreleri tüm 96-şey plakasına sıralanmış sonra doku kültürü kuluçka %5 CO2adlı ayarla 37 ° C'de plaka yerleştirin. Deney için gerekli ek plakaları için yineleyin.
- Ortak kültür tek tek sıralanmış hücreleri 96-Wells için 7 gün (E10-10,5 embriyolar, E9-9.5 embriyo itibaren 7 gün 6 günden E11-11,5 embriyo göre hücreler için 5 gün) AGM-EC (Kimden adım 4.3) içeren. Hematopoetik kolonileri çeşitli boyutları ve türleri Morfoloji 100 X büyütme (şekil 2B), ters bir mikroskop ile ortak kültür döneminden sonra gözünün önüne getir.
Not: Medya ortak kültür döneminde değiştirilmesi gerekmez. Hareketlenme öncesi ilk belirtiler başlangıçta bir EC-benzer görünümdeki AGM-EC katmanına entegre olabilir ve başlangıçta AGM-EC stroma (şekil 2A) ayırt edici olamaz hemogenic göre. Ancak, aşağıdaki 24-48 h ortak kültür, küçük, yuvarlak hematopoetik hücreler veya hücre kümeleri algılanabilir. Ortak kültür (5-7 gün) sonunda, hematopoetik hücrelerin bireysel kolonileri içinde sıralanmış bir hücre klonal hematopoetik potansiyeli ile alınan 96-kuyu alt kümesini görüntülenmeyecektir. Görsel olarak incelenen wells birden fazla farklı koloni içerir, daha sonra bu örnek iyi göre birden fazla hücre almış olabilirsiniz örnekleri dışlamak için aşağı akım çözümlemesi söz konusu değildir.
5. klonal hematopoetik döl ortak kültür aşağıdaki analizi
-
Klonlar kuyudan her 96-FACS analiz için hasat.
- Şiddetle damlalıklı hematopoetik hücreler endotel katmanlardan 200 µL pipet ipuçları ile çok kanallı pipet kullanarak ayırmak için. Endotel tabakası ayırmak değil deneyin. Fenotipik hematopoetik döl FACS tarafından çözümlenmesi için 100 µL (örnek ~ %50) kaldırın.
- Bir 96-şey V-alt plaka aktarmak ve vasıl 300 x g hücreleri cips 2 dk santrifüj kapasitesi. Plaka ters sırada medya plaka tek bir hızlı hareket ile flicking medyayı çıkarın (fiske plaka).
- Kalan 100 µL hücreleri orijinal 96-şey plaka 37 ° C incubatorfor kullanımda sonraki engraftment tahlil (adım 6) yerleştirin.
-
Hücreleri hematopoetik analiz için uygun antikorlar ile kuluçkaya.
- Hücre topakları bir 96-şey V-alt her iyi PBS/2% 10 µg/mL FcR blok ve 1 µg/mL DAPI içeren FBS 50 µL ile yeniden askıya alma. Plaka 5 min için 4 ° C'de kuluçkaya.
- PBS/2% 10 µg/mL FcR blok ve PE-Cyanine7-Birleşik anti-VE-Cadherin, PerCP Birleşik anti-CD45, PE Birleşik anti-EPCR, APC Birleşik anti-Sca1 ve FITC Birleşik anti-Gr1 içeren HSC analiz için bir antikor karışımı içeren FBS 50 µL eklemek ve Anti-F4/80 (1: 100 son seyreltme, her antikor dayalı üreticinin önerilerini veya titrations göre aksi belirtilmedikçe). Plaka için en az 20 dk 4 ° C'de kuluçkaya.
-
Sıralı dilutions ile ilişkisiz antikor kaldırmak ve hücreleri çözümleyebilirsiniz.
- 200 µL/iyi PBS/2% FBS ve santrifüj 300 x g hücreleri cips için 2 dakika için ekleyin. O zaman, plaka süpernatant atmak ve her hücre Pelet 200 µL PBS/2% FBS ekleyin ve vasıl 300 x g hücreleri cips 2 dk santrifüj kapasitesi için hafifçe vur.
- Plaka süpernatant atıp 50 µL/iyi PBS/2% FBS analiz için eklemek için hafifçe vur. Hücreleri bir plaka okuyucu ile donatılmış bir Akış Sitometresi kullanarak FACS tarafından çözümlenecek devam edin.
Not: sabit birim (örneğin, re-süspansiyon için kullanılan toplam 50 µL 35 µL) hücrelerinin elde hematopoetik döl kümelerine Numaralandırılacak.
-
Her şey için ekran HSC potansiyel (şekil 3) içeren kolonileri hematopoetik döl içeren FACS verileri analiz.
- Myeloid işaretleri Gr1 ve F480 negatif CD45 olumlu nüfus ilk kapı. Hala VE-Cadherin seviyesinin düşük hızlı hücre kapı değil. Hematopoetik kolonileri hasat sırasında kesintiye AGM-EC katmandan VE-Cadherin pozitif ve negatif CD45 hücrelerdir.
- Kapı CD45+VE Cad- / düşükGr1-F4/80- hücreleri daha yüksek düzeyde EPCR ve Sca1 hızlı alt (şekil 3A -C).
Not: yılında önceki çalışmalar, CD45 içeren hücreleri eksik koloniler+VE Cad- / düşükGr1-F4/80-Sca1MerhabaEPCRMerhaba fenotip (şekil 3D) tekrarlanarak tespit sağlamak başarısız oldu multilineage periferik kan engraftment radyoaktif alıcı fareler17 (veri) gösterilmez; Böylece, bu koloniler adım 6 sonraki nakli analize dahil değil.
6. analiz bireysel klonlar ve korelasyon Engraftment özellikleri ile dizin sıralayarak aydınlatılmamıştır fenotipik özellikleri
- Gün (Eğer mümkünse) veya adım 5, fenotipik analizde takip sabah yeniden kalan 100 µL hücreleri kolonilerden (Kimden adım 5.1) ortak kültür 200 µL pipet ucu kullanarak dinç pipetting tarafından takip her 96-şey içeren hematopoetik askıya.
-
Hazırlamak ve congenic baskı B6 bütün kemik iliği kurtarma hücreleri ekleyin. SJL-PtprcbirPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) Yetişkin fareler16,17.
- Bir hemasitometre altında Türkler çözümde çekirdekli ilik hücreleri saymak. 5 x 10 bir konsantrasyon sulu5 hücre/mL PBS % 2 ile parçalanmayabilir FBS.
- Kurtarma kemik iliği hücrelerinin (5 x 104) 100 µL nakli analiz için hematopoetik döl içeren her şey için ve pipetting tarafından karıştırın.
-
Organ nakli döl içine tek bir bireysel klonların öğrenirim alıcı congenic zorlanma B6 ışınlanmış. SJL-PtprcbirPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) Yetişkin fare.
- B6 CD45.1 fareler aynı sayıda ayrı ayrı döl (1.000 cGy sezyum kaynağından kullanarak) tek bir klonu enjekte klonların sayı olarak ışınlatayım öğrenirim.
- 200 µL toplam hücre süspansiyon (Bu klon hücrelerden yanı sıra 5 x 104 B6 CD45.1 kurtarma kemik iliği hücreleri içerir) ½ mL insülin enjektör 29 G ½ inç iğne ile çizin.
- B6 CD45.1 Yetişkin alıcılar 2-24 saat öncesinde enjeksiyon ışınlatayım öğrenirim.
- Kuyruk erişimine izin veren bir plastik fare restrainer kullanarak, her klon hücrelerden ve alıcı hayatta yardımcı olmak için 5 x 104 B6 CD45.1 yetişkin kemik iliği kurtarma hücreleri içeren kuyruk ven 200 µL cilt yoluyla enjekte et.
- Kulak etiket ve alıcı fareler tartmak ve onların ağırlık/sağlık düzenli aralıklarla kontrol edin (örneğin, 3 - 4 kez / hafta post ışınlama/nakli, ya da bireysel kurumsal standart işletim yordamlar başına) iyi sağlık sağlamak için.
-
Periferik kan engraftment, düzenli aralıklarla (örneğin, 2, 16, 24 hafta) analizini gerçekleştirmek nakli takip.
- 50-100 µL kan retro-orbital taşma payı ya da başka bir etik onaylı kan icar yöntemi aracılığıyla kaldırın.
- Kan için 3 mL lizis arabellek (16,6 g NH4Cl, 2 g için 2 L H2O NaHCO3 ve 74.4 mg EDTA) ekleyin ve 5 dk. santrifüj vasıl 300 x g 5 dk. aspiratı ve yeniden askıya Pelet 2 mL ile oda sıcaklığında PBS/2% FBS kuluçkaya. 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.
- Pelet 150 µL PBS/2% FBS taşıyıcı 10 µg/mL FcR blok ve 1 µg/mL DAPI ile yeniden askıya alma ve 1/3 bir de içeren 50 µL izotip denetimleri için donör ve soyu, 1/3'e bir de içeren 50 µL antikor lineage için donör ve izotip denetimler için birime dağıtmak ve 1/3 için donör ve soyu tespit etmek için 50 µL antikorlar içeren bir kuyu.
Not: Antikor multilineage engraftment tespiti için: APCeFluor780 Birleşik anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-Birleşik anti-CD45.1, FITC Birleşik anti-CD3, PE Birleşik anti-F4/80, PerCP Birleşik anti-Gr1 ve APC Birleşik anti-CD19, veya ilgili izotip kontrol eder. - Klonlar FACS periferik kan katkısıyla CD45.2 (donör) Zaman içinde değerlendirilmesi ile uzun vadeli engraftment tanımlamak-hematopoetik hücreler elde edilen Miyeloid (Gr1 ve/veya F4/80 olumlu olarak), B-hücre (CD19 pozitif) ve T hücre (CD3 pozitif) (şekil 4A -B).
Not: Hematopoetik engraftment de CD45.2 (donör) tarafından çözümlenebilir-katkı kemik iliği, dalak, timus ve karın zarını veya kemik iliği hücrelerinin ikincil ekimi takiben hasat doku hematopoietik nüfusu elde B6 CD45.1 fareler seri engraftment özellikleri17analiz.
- Onun engraftment özelliklerle sıralama ilk tek hücre dizin bilgisi tarafından belirtildiği gibi her klonun fenotipik özellikleri aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Akış analizi yazılım kullanarak, dizin sıralanır (96-kuyuya hangi için sıralanmış korelasyon) her hücre için sıralama parametreleri yüklemek. Fonksiyonel çıktılarını (örneğin, uzun vadeli, multilineage engraftment) ilişkili oldukları sürece tek hücre fenotipik özellikleri değerlendirmek için akış araziler üzerine işlevsel veri eşleminin (şekil 4 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A bir şematik deneysel tasarım gösterir. P-Sp/AGM doku disseke, havuza alınmış ve collagenase içinde ayrışmış sonra dizin sıralama için antikorlar VE-Cadherin ve EPCR ile lekeli. Pre-HSC VE-Cadherin+EPCRyüksek (şekil 1B) göre hücrelerdeki zenginleştirilmiş. Diğer fluorochrome Birleşik antikorlar geriye dönük olarak her hücre için dizin sıralama sırasında kaydedilir ek fenotipik parametreler analiz dahil edilebilir. E11 AGM gelen temsilcisi bu deneyde, hücreleri de anti-CD45 FITC Birleşik ve PE-Birleşik anti-CD41 antikorlar ile lekeli. Heterojenite hematopoetik özgü Marker kalemleri VE-Cadherin+EPCRyüksek nüfus içinde (şekil 1 c), gözlenen bu sahne5at hematopoetik geliştirme bilinen eşzamansız ile tutarlı.
Dizin tek VE-Cadherin+EPCRyüksek AGM hücrelerin bireysel 96-wells için sıralama aşağıdaki içeren AGM-EC AGM serum-Ücretsiz medya ve sitokinler, koloni oluşumu oluşur. Başlangıçta, onlar kadar yuvarlak ve hematopoetik kümeleri (burada bir transgenik fare embriyo GFP ifade göre hücrelerden gösterilenşekil 2A, form başlamadan önce sıralanmış VE-Cadherin+EPCRyüksek AGM hücreleri AGM-EC katmanın entegre bunları AGM-EC stroma ayırmak için Ly6a organizatörü21altında). Ortak kültür 5-7 gün sonra kolonileri çeşitli boyutları ve türleri Morfoloji temsilcisi bir deneme, 6 E11 AGM sıralama izleyen gün burada gösterilen muayene ile ters bir mikroskop (şekil 2B), tarafından tespit edilebilir.
Sonraki, fenotipik çözümleme FACS tarafından hematopoetik bir koloni kurdu her VE-Cadherin+EPCRyüksek hücre döl yarısı yapılır. HSC fenotip ile hücreleri içeren kolonileri VE-Cadherin tanımlanır- / düşükGr1-F4/80-CD45+Sca1MerhabaEPCRMerhaba (şekil 3). İşte, aşağıdaki dört farklı koloniler elde edilen dizin sıralanır E11 AGM VE-Cadherin+EPCRyüksek hücre, üç diğer daha farklı hücre tipleri (şekil 3A ile fenotipik HSC farklı oranlarda içeren ortak kültür göstermektedir -C), ve dördüncü eksik HSC fenotip (şekil 3D) içeren hücreler. Sayısına göre kaplama hücreleri ve engraftable kök hücre kolonilerde sonuçlandı yüzde gözlenen kolonileri sayısı embriyonik yaş ve gerçekleştirilen sıralama bağlı olarak değişir. VE-Cadherin- / düşükGr1-F4/80-CD45+Sca1MerhabaEPCRMerhaba E11 AGM klonlar oluşturulan 53 ± 15 kolonileri 192 hücrelere %5 ± % 1.3 ile kaplama oluşturma klonlar bu uzun engrafted 192 hücre kaplama vadeli (Ortalama ± SD 3 deneyler için).
FACS tarafından algılanan HSC fenotip ile hücreleri fenotip engraftment potansiyel ile ilişkilendirmek için içeren bir hematopoetik koloni kurdu her VE-Cadherin+EPCRyüksek hücre döl yarısı kalan (örn., kolonileri) şekil 3A-Ctemsil radyasyonlu (1.000 cGy) Yetişkin congenic zorlanma (B6 CD45.1) farelere kurtarma hücreleri bir doz ile birlikte B6 CD45.1 iliği nakli. Uzun vadeli multilineage engraftment myeloid (Gr1 ve F4/80), donör (CD45.2) katkı takip ederek her klon için doğruladı B-hücre (CD19) ve T hücre (CD3) yuvası (şekil 4A) zamanla periferik kan. Çoğu kolonileri FACS tarafından algılanan HSC fenotip ile hücreleri içeren uzun vadeli engraftment sağlasa nakli bazı klonlar engraftment zaman (şekil 4B) kaybetmek veya görüntülemek gibi fonksiyonel multilineage engraftment onaylamak gereklidir lenfoid önyargılı engraftment (veri gösterilmez) gibi benzersiz engraftment özellikleri. Her VE-Cadherin+EPCRyüksek klon fonksiyonel HSC potansiyelini belirlendikten sonra bu geri sıralama parametreleri kesin fenotipik özellikleri tanımlamak için bu klonun dizin için ilişkilidir. Bu örnekte, gördüğümüz pre-HSC klonlar (kırmızı nokta) onların ifade CD41 ve CD45, bu işaretleri HSC (şekil 4 c) için pre-HSC olgunlaşma sırasında kurulan dinamik ifade ile tutarlı türdeş olmayan işlevsel olarak doğruladı. Klonlar, fenotipik tarama veya uzun vadeli yokluğu ya da eksik olan HSC potansiyel ama hematopoetik kolonileri şekillendirme nakli (HSC sigara hemogenic klon, mavi noktalar) takip multilineage engraftment de CD41 ve CD45 için türdeş olmayan, CD41 yüksek düzeyde bir alt hızlı öncelikle CD41düşükpre-HSC klonlar ile karşılaştırıldığında. Hematopoetik koloniler (hemogenic klonlar, hafif yeşil noktalar) formu değil klonlar vardır ağırlıklı olarak CD41- / düşükCD45-, hangi büyük olasılıkla yansıtmak hemogenic VE-Cadherin+EPCRyüksek endotel hücreleri.
Şekil 1: Protokolü genel bakış ve dizin sıralanması için temsilcisi Akış Sitometresi Analizi tek hücre. (A)protokol şematik gösterimi. (B) Akış Sitometresi Analizi Disosiye E11 AGM hücreleri gösteren gating strateji için pre-HSC (Analiz FACS analiz yazılımı ile) zenginleştirilmiş VE-Cadherin+EPCRyüksek hücre dizin sıralama için. Her kapı numaraları hücreleri yüzde temsil eder. (C) Akış Sitometresi Analizi CD41 ve CD45 gösteren VE-Cadherin+EPCRyüksek nüfus içinde boyama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: hematopoetik kolonileri oluşumu sırasında AGM-AB ortak kültür. (A)VE-Cadherin+EPCRyükseksıralı GFP+ hücre Ly6a-GFP transgenik embriyo21 AGM-EC üzerinde ortak kültürlü zaman hata görüntüleme ΜM barlarda ölçek her resmin sol alt içinde gösterilir. Sonra 6 gün AGM-EC üzerinde ortak kültür (B) temsilcisi kolonileri VE-Cadherin+EPCRyüksek dizin sıralanmış tek hücreleri kurdu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Akış Sitometresi Analizi döl ortak kültür AGM-EC üzerinde takip tek E11 AGM kaynaklı VE-Cadherin+EPCRyüksek hücre HSC potansiyeli içeren hücreler için geçişi VE-Cadherin olduğunu alt olarak gösterilir- / düşükGr1-F4/80- (sol kapı aynası), CD45+ (orta paneli) ve Sca1MerhabaEPCRMerhaba (doğru kapı aynası). (A)temsilcisi koloni HSC fenotip içeren hücreleri homojen bir nüfusa oluşan. (B-C) Hücreleri HSC fenotip ve daha farklı hücre tipleri bir karışımını içeren temsilcisi koloniler. (D) temsilcisi koloni HSC fenotip eksik hücrelerin oluşan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: döl AGM-AB ortak kültür ve korelasyon sıralama parametreleri dizini ile aşağıdaki bireysel klonların, periferik kan engraftment analizini. (A) periferik kan donör CD45.2 elde edilen engraftment myeloid (Gr1 ve F4/80), B-hücre (CD19) ve döl, bireysel E11 VE-Cadherin+EPCRyüksek ile nakledilen T-hücre (CD3) alt kümeleri temsilcisi alıcı (B6 CD45.1) AGM-AB ortak kültür takip klon. (B) periferik kan donör CD45.2 elde edilen engraftment döl bireysel E11 VE-Cadherin+EPCRyüksek klon AGM-AB ortak kültür takip nakli sonra zamanla. (C) korelasyon CD41 ve CD45 ifade her dizin sıralanmış VE-Cadherin+EPCRyüksek için aşağıdaki AGM-AB ortak kültür ekimi tahlil içinde uzun vadeli, multilineage engraftment göre HSC potansiyel ile klonu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HSC genesis embriyonik gelişim sırasında çalışmanın HSC potansiyel henüz transplante yetişkin alıcılar uzun vadeli multilineage hematopoetik rekonstitüsyon sağlamak için yetki eksik hemogenic öncüleri olarak algılamak için araç gerektirir. Bu protokol için biz embriyonik hemogenic öncüleri klonal bir tahlil vasküler niş ECs stromal ortak kültür tarafından öncüleri HSC için olgunlaşma destekler, AGM fonksiyonel analizde sonraki nakli deneyleri ile mevcut. Dizin izinleri sıralama birleşmesiyle retrospektif fenotipik parametrelerin pre-HSC yüzey işaretleyicileri tarafından tanımlanan özelliklerini tanımlamak için tahlil dahil. Bu yaklaşım, böylece toplu habercisi nüfus potansiyeli işaretleyicileri için eleme verimli etkinleştirme yeniden aggregation tabanlı HSC deneyleri4,5,ile10, sıralama kullanan diğer yöntemler üzerinde bir avantaj sağlar Pre-HSC aynı zamanda yüzey işaretlerinin tek tek her hücre için göreli ifade düzeyi hakkında bilgi sağlama. Bu yöntemi kullanarak, örneğin, biz daha önce EPCR pre-HSC nüfus için farklı yaşlardaki zenginleştirmek için kullanılmasına ek olarak, çentik ligand Dll4 ara ifade daha fazla bir subpopulation klonal olarak tanımlanan, rapor VE-Cadherin+EPCR+ öncüleri HSC ise çoğunlukla VE-Cadherin+EPCR+ hemogenic öncüleri Dll4 negatif potansiyel ile HSC potansiyel17yoksun.
Hematopoetik döl bir fenotip ile tespiti ortak kültür aşağıdaki temel alarak hemen bu yöntemin bir diğer avantajı için ekran HSC potansiyel yeteneğidir (VE-Cadherin- / düşükGr1-F4/80-CD45+Sca1 MerhabaEPCRMerhaba) uzun vadeli, multilineage engraftment ile ilişkili. Bu bu koloniler nakli deneyleri içinde uzun vadeli engraftment sağlamak değil gibi bu HSC fenotip ile hematopoetik döl eksik kolonileri nakli gereksinimini ortadan kaldırır. Ayrıca, ilk bilgi hemogenic öncüleri HSC potansiyel ortak kültür, uzun vadeli engraftment deneyleri, sonuçları beklemek için gerek kalmadan hemen ardından eksik gelen potansiyel pre-HSC ayırt hızla, örneğin, yararlıdır HSC-Kara filmin tarih öncesi aday işaretleri eleme. Ancak, fenotipik veri uzun vadeli engraftment transplantasyonu takip ile korelasyon pre-HSC klonlar kesin engraftment özelliklerini varyasyonları içine ek değerli bilgiler sağlar. Biz bulundu, örneğin, o klonal pre-HSC E9.5 ve E11.5 arasında P-Sp/AGM bölgesinden B1a hem de B2-lenfositleri, ortaya çıkmasına benzersiz potansiyeli var B1a-lenfosit potansiyel yetişkin HSC17' eksik ise. Ayrıca, biz bir evrim pre-HSC klon E9.5 ve E11.5 arasında engraftment özelliklerinde önceki pre-HSC Periton B1a ayet B2-lenfosit engraftment doğru ve temel sağlam kendini yenileme potansiyel daha az göreli bir farklılığı gösteren ile tespit üzerinde ikincil nakli17deneyleri.
Bu iletişim kuralı benzersiz özelliklerini klonal HSC öncüleri aydınlatmak için değerli bir yaklaşım sağlarken, kabul edilmelidir bazı sınırlamalar vardır. Döl ile HSC fenotipik AGM-AB ortak kültür takip FACS tarafından algılanmasını genellikle uzun vadeli multilineage engraftment ilişkilidir ancak yalnızca kısa süreli engraftment veya engraftment eksik bir veya daha bu fenotip ile bazı koloniler sağlar hematopoetik soy (şekil 4B; verileri gösterilmez). Böylece, işlevsel HSC doğrulama içinde altın standart ekimi kalır. Ayrıca, bu bazı pre-HSC engraftment özelliklerindeki farklılıklar klonlar, yerine hücre iç hemogenic farklılıkları yansıtan habercisi potansiyeli, neden olabilir Stokastik değişkenlik AGM-AB ortak kültür sırasında kullanılabileceği belirlenmemiştir kendini yenileme ayette farklılaşma kararları, pre-HSC olarak aynı anda HSC için olgunlaşması ve hücre bölünmeler geçiyor. Gerçekten de, bu kısmen koloni morfolojisi gözlenen heterojen ve fenotip bireysel pre-HSC klonlar (örneğin, şekil 3A-C) oluşturulan hücre için hesabı olabilir ve pre-HSC tarafından bir küçümseme neden tüm potansiyel pre-HSC klonlar olmasa bu tahlil fonksiyonel HSC AGM-AB ortak kültür takip nesil tarafından tespit edilir. Ancak, bu yöntem tarafından etkin (gibi Dll417) benzersiz fenotipik işaretleri fark onların ifade tarafından işlevsel olarak farklı hemogenic klon ayırmak için hemogenic öncüleri ile altgrupları tanımlamak için bir yol sağlar doğal hücre içsel farklılıklar.
Bu temel protokolü üzerinde bina, genişletilmiş uygulamaları bir dizi daha da geliştirme sırasında klonal hemogenic öncüleri hematopoetik potansiyelini çalışmaya dahil edilebilir. Yüzey işaretleyicileri, transgenik embriyo Floresans işaretlerinin ifade tespiti için antikor kullanımı ötesinde (örn., Ly6a- GFP21 veya hemogenic endotel/pre-HSC içinde ifade Runx1 -GFP22 ) olabilir Dizin hemogenic öncüleri sıralama için dahil. AGM-AB ortak kültür sözde pre-HSC algılamak için takip nakli deneyleri ek olarak döl de kültür OP9 veya OP9-Dl1 B ve T hücreli algılamaya gibi ikincil vitro deneyleri temel hematopoetik lineage potansiyel için tespit edilebilir potansiyel23veya klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar koloni deneyleri erythromyeloid potansiyeli tespit etmek için methylcellulose içinde şekillendirme. Nitekim, bazı klonların HSC hemogenic (örneğin, şekil 3D) büyük olasılıkla multipotent ataları, erythromyeloid ataları, temsil veya T ve B hücre ataları bu öncesinde ve HSC gelişimi bağımsızdır daha önce açıklanan 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28ve bu tahlil daha fazla hematopoetik öncüleri farklı bu dalgalar klonal çalışmaları kolaylaştırabilir. Son olarak, dizin pre-HSC sıralama tek hücre RNA-sıralama fenotipik özellikleri HSC öncüleri geliştirme genel transkripsiyon profilleri ile ilişkilendirmek için gibi diğer aşağı akım analizleri ile kombine edilebilir. Özet olarak, bu iletişim kuralı HSC geliştirme yeni anlayışlar sağlamalıdır embriyonik hemogenic öncüleri klonal hematopoiesis sağlam analizi için bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Fred Hutchinson Akış Sitometresi temel yardım için FACS ile Andrew Berger, Stacey Dozono ve Brian Raden teşekkür etmek istiyorum. Bu eser yardımcı işbirlikçi Grant #HL099997 ve NIDDK #RC2DK114777 vermek #HL100395, ulusal kurumları sağlık NHLBI UO1 grant tarafından desteklenmiştir. Brandon Hadland Alex'in limonata standı Vakfı ve Hyundai umut üzerinde tekerlekler Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
References
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
- Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
- Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
- Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
- Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
- Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
- Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
- Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
- Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
- Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
- deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
- Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
- Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
- Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
- Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
- Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
- Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).
