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Developmental Biology

भ्रूण टेम के क्लोनल विश्लेषण स्टेम सेल Endothelial सेल आला सह संस्कृति के साथ संयुक्त छंटाई एकल कोशिका सूचकांक का उपयोग कर पुरोगामी

Published: May 8, 2018 doi: 10.3791/56973
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, University of Washington School of Medicine

Summary

यहां हम murine भ्रूण के विकास के दौरान टेम स्टेम सेल पुरोगामी के क्लोनल विश्लेषण के लिए वर्तमान पद्धति । हम endothelial सेल सह संस्कृति और प्रत्यारोपण के साथ भ्रूण महाधमनी-gonad-mesonephros क्षेत्र से एकल कोशिकाओं के सूचकांक छंटाई गठबंधन phenotypic गुणों और एकल engraftment अग्रदूतों की टेम क्षमता को चिह्नित करने के लिए ।

Abstract

भ्रूण के विकास के दौरान टेम स्टेम सेल (HSC) उत्पत्ति का अध्ययन करने की क्षमता प्रारंभिक भ्रूण में HSC पुरोगामी की दुर्लभता द्वारा सीमित किया गया है और परख की कमी है कि कार्यात्मक दीर्घकालिक multilineage engraftment की क्षमता की पहचान वैयक्तिक ख्यात HSC पुरोगामी. यहाँ, हम एक कोशिका स्तर पर कार्यात्मक मान्य HSC पुरोगामी के अलगाव और लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है कि पद्धति का वर्णन. सबसे पहले, हम प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से हल सेल के सटीक phenotypic पैरामीटर सूची छंटाई सूचकांक का उपयोग, प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए अतिरिक्त मार्करों के साथ HSC अग्रदूतों के लिए समृद्ध करने के लिए phenotypic मार्करों का एक संयोजन का उपयोग कर । दूसरा, प्रत्येक सूचकांक-क्रमबद्ध कोशिका महाधमनी-gonad-mesonephros (एजीएम) क्षेत्र है, जो गैर की परिपक्वता-engrafting HSC के साथ कार्यात्मक HSC के लिए पुरोगामी का समर्थन करता है, दीर्घकालिक multilineage क्षमता से नाड़ी आला स्ट्रोमा के साथ सह-संस्कृति है प्रत्यारोपण परख । यह पद्धति उनके कार्यात्मक engraftment क्षमता या transcriptional प्रोफ़ाइल जैसे अंय गुणों के साथ क्लोनल hemogenic अग्रदूतों के phenotypic गुणों के सहसंबंध को सक्षम करता है, HSC अग्रदूत के विस्तृत विश्लेषण के लिए एक साधन प्रदान सिंगल सेल स्तर पर विकास ।

Introduction

क्लोनिंग अध्ययन वयस्क HSCs के दीर्घकालिक engraftment गुणों में विविधता से पता चला है, HSC उपप्रकार और1उंर बढ़ने के दौरान HSC व्यवहार में परिवर्तन में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करना । हालांकि, भ्रूण HSCs और उनके अग्रदूतों के समान अध्ययन और अधिक चुनौतीपूर्ण हो गया है । प्रारंभिक भ्रूण के विकास के दौरान, HSCs एक क्षणिक प्रक्रिया में hemogenic endothelium के रूप में जाना जाता है पुरोगामी की आबादी से उत्पन्न टेम संक्रमण के लिए endothelial के रूप में भेजा2. पहली HSC, उनकी क्षमता द्वारा परिभाषित करने के लिए मजबूत, दीर्घकालिक multilineage engraftment प्रदान करने के लिए वातानुकूलित वयस्क प्राप्तकर्ताओं में प्रत्यारोपण निंनलिखित, भ्रूण दिवस १०.५ (ई 10.5) में murine भ्रूण के बाद जब तक पता नहीं कर रहे हैं, बहुत कम आवृत्ति3 . उनके विकास के दौरान, HSC करने के लिए पुरोगामी (pre-HSC) hemogenic endothelium से उत्पन्न होने वाले वयस्क HSC के गुण प्राप्त करने से पहले परिपक्वता से गुजरना होगा जो प्रत्यारोपण परख में कुशल engraftment के लिए अनुमति देते हैं4,5 , 6. दुर्लभ HSC मूल, erythroid, माइलॉयड, और लसीकावत् क्षमता के साथ टेम progenitors की एक भीड़ के अध्ययन अस्पष्ट पहले से ही पूर्व HSC7,8से HSC के उद्भव के लिए पहले से पता चला रहे हैं । इस प्रकार, अंय टेम progenitors से पूर्व HSC भेद को क्लोनिंग कोशिकाओं को अलग करने और उंहें HSC को अपनी परिपक्वता के लिए पर्याप्त संकेतों के साथ प्रदान करने की आवश्यकता है, प्रत्यारोपण परख में उनके engraftment गुणों का पता लगाने के लिए ।

कई दृष्टिकोणों का वर्णन किया गया है जो या तो पूर्व vivo या vivo में परिपक्वता HSC द्वारा पूर्व HSC का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं । पूर्व vivo तरीकों भ्रूण के ऊतकों की संस्कृति पर निर्भर किया है, जैसे एजीएम क्षेत्र है, जहां पहली HSC विकास9में पता चला रहे हैं । इन तरीकों पर बिल्डिंग, प्रोटोकॉल जो पृथक्करण शामिल, छंटाई, और फिर से आमसभा के ऊतकों के एकत्रीकरण हल आबादी के लक्षण वर्णन की अनुमति दी है विकास के दौरान HSC अग्रदूतों ई 9.5 के पैरा में e 11.5 से महाधमनी splanchnopleura (पी-एसपी)/AGM क्षेत्रको४,५,१०; हालांकि, इन approaches क्लोनल विश्लेषण के लिए आवश्यक एकल कक्ष स्तर पर पुरोगामी के उच्च प्रवाह विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं । इसी तरह, नवजात चूहों में प्रत्यारोपण द्वारा vivo परिपक्वता में , जहां microenvironment HSC अग्रदूतों के पहले के चरणों के समर्थन के लिए और अधिक उपयुक्त होने के लिए माना है, भी की जर्दी थैली और एजीएम से क्रमबद्ध आबादी का अध्ययन सक्षम/ पी-एसपी (पी-एसपी एजीएम को प्रणेता क्षेत्र है) पूर्व HSC की विशेषताओं के साथ, लेकिन इन तरीकों को भी एकल सेल विश्लेषण11,12के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करने में विफल ।

Rafii एट अल से अध्ययन किया है कि एकेटी-सक्रिय endothelial सेल (ईसी) स्ट्रोमा इन विट्रो13,14,15में वयस्क HSC स्व-नवीकरण के समर्थन के लिए एक आला सब्सट्रेट प्रदान कर सकते हैं । हमने हाल ही में तय किया है कि एकेटी एजीएम क्षेत्र से व्युत्पन्न चुनाव आयोग (एजीएम-ईसी) hemogenic पुरोगामी की परिपक्वता के लिए एक विट्रो में उपयुक्त प्रदान करता है, के रूप में विकास में E9 के रूप में जल्दी पृथक, वयस्क-engrafting HSC, के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में बाद जनित HSC का स्व-नवीकरण16. यह देखते हुए कि इस प्रणाली के एक सरल 2 आयामी सह संस्कृति को रोजगार, यह व्यक्तिगत रूप से पृथक hemogenic पुरोगामी की HSC क्षमता का क्लोनल विश्लेषण के लिए आसानी से अनुकूलनीय है ।

हम हाल ही में परख के लिए एक दृष्टिकोण की सूचना दी है HSC क्लोनी hemogenic अग्रदूतों के एजीएम के साथ murine भ्रूण से व्यक्तिगत hemogenic अग्रदूतों की छंटाई सूचकांक-चुनाव आयोग सह संस्कृति और बाद में प्रत्यारोपण में कार्यात्मक विश्लेषण के संयोजन के द्वारा संभावित 17परख । अनुक्रमणिका सॉर्टिंग प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) जो अभिलेख (अनुक्रमणिका) सभी phenotypic पैरामीटर्स (, अग्रेषित स्कैटर (FSC-a), साइड स्कैटर (SSC-a), प्रतिदीप्ति पैरामीटर्स) के प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से सॉर्ट किए गए कक्ष का एक मोड है ऐसी है कि इन सुविधाओं को क्रमिक रूप से सॉर्ट करने के बाद कार्यशील विश्लेषण से संबद्ध किया जा सकता है । FACS सॉफ्टवेयर प्रत्येक कोशिका के लिए दोनों phenotypic जानकारी रिकॉर्ड और ९६-खैर प्लेट जिसमें यह रखा गया था की स्थिति/ यह तकनीक पहले से खूबसूरती से वयस्क HSC में विविधता की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, phenotypic पैरामीटर है कि आगे HSC के दीर्घकालिक engrafting सबसेट के लिए समृद्ध का निर्धारण, और phenotypic के HSC मानकों के transcriptional के साथ सहसंबंधी बनाना एकल कक्ष स्तर18,19पर गुण । यहां, हम इस दृष्टिकोण है कि अद्वितीय phenotypic मापदंडों और भ्रूण विकास की प्रारंभिक अवस्था के दौरान पूर्व HSC के वंश योगदान की पहचान में सक्षम बनाता है की विस्तृत पद्धति प्रदान करते हैं ।

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Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर और उपयोग समिति (IACUC) फ्रेड Hutchinson कैंसर रिसर्च सेंटर द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. सह-संस् कृति के लिए एजीएम-ईसी Monolayers की तैयारी

  1. 24 एच एजीएम विच्छेदन और तरह से पहले, एजीएम-चुनाव आयोग संस्कृति मीडिया और फ़िल्टर करना निष्फल ।
  2. पानी में ०.१% जिलेटिन जोड़ें (१०० µ एल/अच्छी तरह से) एक ९६ अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन के लिए जिलेटिन महाप्राण और प्लेट छोड़ने के ढक्कन के साथ एक ऊतक संस्कृति हूड में छोड़ जब तक कुओं सूख रहे हैं ।
  3. अलग कर देना ने एजीएम-ईसी monolayers और प्लेट को ९६-वेल प्लेट्स ।
    नोट: आमसभा-चुनाव आयोग बनाए रखें, के रूप में पहले से वर्णित16, एजीएम में चुनाव आयोग संस्कृति मीडिया । स्थिरता के लिए, आमसभा-चुनाव आयोग सेल लाइनों के रूप में पर्याप्त संख्या प्राप्त कर रहे है के रूप में जल्द ही जमे हुए होना चाहिए (आम तौर पर 1-3 गद्यांश) और एक निर्धारित मार्ग संख्या (आम तौर पर 5-12 पारित) सह संस्कृति प्रयोगों के लिए में इस्तेमाल किया एजीएम-ईसी सेल लाइंस C57BL/6J (सीडी 45.2) एजीएम से ली जाती हैं । सभी मीडिया रचनाओं के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
    1. महाप्राण ने एजीएम-ईसी कल्चर से मीडिया को ७५ सेमी2 कुप्पी में और 5 एमएल के पंजाबियों को जोड़ें । महाप्राण पंजाबियों, और 3 मिलीलीटर trypsin समाधान जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें).
    2. 2-4 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन जब तक अधिकांश कोशिकाओं से थाली उठा रहे हैं । एजीएम के 7 एमएल जोड़ें-ईसी कल्चर मीडिया और प्लास्टिक 8-10 बार एक 10 मिलीलीटर पिपेट के साथ एकल कोशिकाओं निलंबन तैयार करने के लिए, और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
    3. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर स्पिन, supernatant हटाने, 10 मिलीलीटर एजीएम में फिर से निलंबित-चुनाव आयोग संस्कृति मीडिया, और एक hemocytometer के साथ सेल संख्या का अनुमान है । एजीएम में 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को पतला-ईसी कल्चर मीडिया ।
  4. जोड़ें १०० µ एल एजीएम-ईसी सेल निलंबन (1 x 104 कोशिकाओं) एक जिलेटिन ९६ अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से । एक ३७ ° c में प्लेस, 5% सह2 ऊतक संस्कृति मशीन रात भर के लिए एजीएम-चुनाव आयोग को देते है और एक धाराप्रवाह monolayer फार्म की अनुमति देते हैं ।
    नोट: समान रूप से अधिक वृद्धि या सेल के लिए इष्टतम सह संस्कृति का झुरमुट सीमित है तो एजीएम-चुनाव आयोग stromal कोशिकाओं को वितरित ।
  5. आमसभा सह संस्कृति के लिए आमसभा-ईसी monolayer तैयार करें ।
    1. इसके बाद सुबह, एजीएम सीरम मुक्त मीडिया तैयार करते हैं ।
    2. एक 12-well मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, एजीएम-ईसी से आमसभा-ईसी कल्चर मीडिया को हटा दें और किसी भी अवशिष्ट सीरम-युक्त मीडिया को धोने के लिए साइटोकिंस के बिना एजीएम सीरम-फ्री मीडिया के २०० µ l/
    3. मीडिया निकालें और साइटोकिंस के साथ एजीएम सीरम मुक्त मीडिया के २०० µ l/ मीडिया को निकालते और जोड़ते समय शीघ्रता से कार्य करें ताकि endothelial परत समझौता न हो; उदा., निकालें और एक बार में मीडिया एक पंक्ति को फिर से जोड़ें । प्लेस ९६-अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति मशीन में प्लेटें ३७ डिग्री सेल्सियस पर जब तक भ्रूण कोशिकाओं छंटाई के लिए तैयार हैं ।

2. Murine भ्रूण के ऊतकों से एकल कोशिका निलंबन की तैयारी

  1. समय-सहवास से एजीएम को काटना.
    1. वांछित उम्र के भ्रूण के ऊतकों को पैदा करने के लिए समय पर संभोग की स्थापना की ।
    2. ९.५ में गर्भवती महिलाओं से फसल भ्रूण ११.५ दिन पोस्ट coitum (डीपीसी), पूर्व के मंच पर निर्भर करता है HSC विश्लेषण किया जाना है ।
      नोट: भ्रूण के ऊतकों C57BL/6J (सीडी 45.2) चूहों से काटा जाता है के रूप में पहले से वर्णित है और ठीक somite गिनती16के आधार पर मंचन किया । हम भ्रूण आमसभा क्षेत्र से आबादी के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया है और इसके अग्रदूत साबित, पी-सपा के बीच ई 9.5 ई के लिए 11.5, somite मचान के आधार पर ।
    3. काटना ने20भ्रूणों से आमसभा की ।
      नोट: murine भ्रूण से एजीएम के विच्छेदन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल20अंय लोगों द्वारा प्रकाशित किया गया है । वैकल्पिक रूप से, जर्दी थैली या अंय पूर्व HSC गतिविधि है कथित ऊतकों भी इस पद्धति द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।
  2. अलग कर देना में विच्छेदित भ्रूण के ऊतकों को ।
    1. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 10 मिलीलीटर FBS बर्फ पर 10% के साथ युक्त विच्छेदित ऊतकों को इकट्ठा । गुरुत्वाकर्षण ऊतकों को बसा, महाप्राण/FBS, और फिर तुरंत 25 मिनट के लिए एक ३७ ° c पानी स्नान में ०.२५% collagenase और जगह की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. एक सिंगल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 1 मिलीलीटर पिपेट टिप के साथ प्लास्टिक के बारे में 1 मिलीलीटर/10% FBS और 20-30 बार जोड़ें । पंजाब के अतिरिक्त 8 मिलीलीटर/10% FBS और ३०० x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं केंद्रापसारक जोड़ें । supernatant को त्यागें ।

3. Murine भ्रूण कोशिकाओं के धुंधला एंटीबॉडी

  1. एंटीबॉडी धुंधला के लिए अवरोध बफ़र तैयार करें ।
    1. 10 µ g/ml एंटी-माउस CD16/CD32 (Fc रिसेप्टर (FcR) ब्लॉक) और 1 µ g/एमएल DAPI (1 mg/एमएल स्टॉक को एच2ओ) में 10% FBS के साथ 1 मिलीलीटर पंजाबियों में जोड़ें ।
    2. एक 3 मिलीलीटर सिरिंज में ड्रा और बंध्याकरण करने के लिए एक ०.२२ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं. फिर से निलंबित असंबद्ध murine भ्रूण ऊतकों से सेल गोली (कदम -8 से) ५०० µ एल में बफर अवरुद्ध और 5 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
  2. एंटीबॉडी मिक्स17तैयार करें ।
    1. 10 µ g/ml FcR ब्लॉक को 10% FBS के साथ जोड़ें और 10 µ l को प्रत्येक fluorochrome-संयुग्मित एंटी-VE-Cadherin एंटीबॉडी (CD144, सामग्री की तालिकादेखें) और fluorochrome-संयुग्मित anti-EPCR एंटीबॉडी (CD201, सामग्री की तालिकादेखें) । एक 1:100 एंटीबॉडी के अंतिम कमजोर पड़ने का प्रयोग करें जब तक अंयथा संकेत निर्माता की सिफारिशों के आधार पर या titrations के अनुसार ।
      नोट: यह एंटीबॉडी संयोजन छंटाई के लिए फाटकों को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, नीचे वर्णित के रूप में (चरण ४.२) । VE-Cadherin और EPCR की सह-अभिव्यक्ति पर आधारित छंटाई एजीएम-व्युत्पन्न कोशिकाओं के भाग के लिए महत्वपूर्ण संवर्धन HSC अग्रदूत गतिविधि युक्त, के रूप में पहले वर्णित के रूप में17सक्षम बनाता है ।
    2. अतिरिक्त fluorochrome-संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ने के लिए आगे phenotypic विश्लेषण के व्यक्तिगत सूचकांक-क्रमबद्ध पुरोगामी ।
      नोट: ये एंटीबॉडी जरूरी छंटाई के लिए फाटकों को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं । इस नमूना प्रोटोकॉल में, हम पीई-संयुग्मित विरोधी CD41 एंटीबॉडी और FITC-संयुग्मित विरोधी CD45 एंटीबॉडी शामिल है इन टेम मार्करों, जो पूर्व के उद्भव के दौरान विकसित की सापेक्ष अभिव्यक्ति HSC hemogenic से endothelium का विश्लेषण करने के लिए4 ,5,16,17. ब्याज के अंय मार्करों वांछित के रूप में शामिल किया जा सकता है । fluorochrome-संयुग्मित isotype एंटीबॉडी नियंत्रण के साथ दाग नमूने विश्लेषण के लिए नकारात्मक और सकारात्मक फाटकों को परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
    3. एक 3 मिलीलीटर सिरिंज में एंटीबॉडी मिश्रण ड्रा और बंध्याकरण करने के लिए एक ०.२२ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं. एंटीबॉडी मिश्रण के ५०० µ एल जोड़ें बफर अवरुद्ध में सेल निलंबन करने के लिए, पिपेट मिश्रण करने के लिए, और बर्फ पर कम से 15-20 मिनट के लिए गर्मी ।
  3. सना हुआ कोशिकाओं को धो लें ।
    1. 8 मिलीलीटर पंजाबियों/10% FBS जोड़ें । 5 मिनट, महाप्राण के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, और पुनः निलंबित 1 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ सेल गोली/
    2. एक 5 एमएल ट्यूब पर एक ३५ माइक्रोन सेल छलनी टोपी के माध्यम से सेल pipetting द्वारा कक्ष का झुरमुट निकालें । सेल छलनी को एक अतिरिक्त 3 मिलीलीटर पंजाबियों/10% FBS से धोएं । 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, महाप्राण, फिर से ५०० में निलंबित µ l पंजाबियों/10% FBS, और बर्फ पर जगह FACS तक ।

4. सूचकांक ९६ के लिए एकल Hemogenic पुरोगामी की छंटाई-सह-संस्कृति के लिए चुनाव आयोग स्ट्रोमा के साथ कुओं

  1. प्लेट मोड के लिए FACS मशीन तैयार है और निर्माता के निर्देशों के अनुसार ९६-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए छंटाई के लिए संरेखित करें । अधिकतम शुद्धता मास्क सेटिंग्स के लिए सॉफ़्टवेयर में एकल कक्ष मोड और अनुक्रमणिका सॉर्टिंग मोड का चयन करें और प्रत्येक सॉर्ट किए गए कक्ष के लिए अनुक्रमणिका पैरामीटर्स के अधिग्रहण को सक्षम करें ।
  2. छंटाई के लिए द्वार स्थापित करने के लिए एंटीबॉडी दाग नमूनों से कोशिकाओं का एक नमूना प्राप्त करें ।
    1. FACS मशीन पर सना हुआ सेल नमूना लोड और सबसे कम प्रवाह दर पर कोशिकाओं को प्राप्त । भूखंड FSC-एक छंद SSC-a और एक फाटक है कि अलग आकार (चित्र 1b) (जो अवलोकन है कि पूर्व HSC गतिविधि की पहचान की है पर आधारित है का चयन करें विभिंन आकार प्रोफाइल के कक्षों में एजीएम17) । भूखंड FSC-एक छंद FSC-डब्ल्यू और एसएससी-एक छंद एसएससी-डब्ल्यू, और चुनें गेट्स दोहरी बाहर करने के लिए । फिर प्लाट FSC-ए छंद DAPI टू गेट लाइव सेल (निगेटिव फॉर DAPI) (फिगर 1b) ।
    2. प्लाट PECy7 (या जें-Cadherin दाग के लिए प्रासंगिक fluorochrome) बनाम PerCP (या fluorochrome दाग के लिए प्रासंगिक EPCR) । गेट कोशिकाओं है कि VE-Cadherin के लिए सकारात्मक है (जो endothelial कोशिकाओं की एक मिश्रित जनसंख्या के रूप में भी शामिल है टेम progenitors और पूर्व एजीएम से HSC) और है कि उच्च EPCR अभिव्यक्ति है (जो पी से पूर्व HSC के लिए समृद्ध-सपा/ यह अंतिम gate है जो चरण ४.३ (चित्र 1b) में सॉर्ट एकल कक्षों को अनुक्रमित करने के लिए उपयोग किया जाएगा ।
    3. प्लॉट अतिरिक्त fluorochromes धुंधला के लिए इस्तेमाल किया ।
      नोट: उपजनसंख्या के आधार पर विश्लेषण किया जा करने के लिए, अतिरिक्त फाटकों धुंधला कोशिकाओं के लिए शामिल अन्य मार्करों का पता लगाने के आधार पर सेट किया जा सकता है. हालांकि, अनुक्रमणिका सॉर्टिंग प्रत्येक सॉर्ट किए गए कक्ष के लिए फ्लोरोसेंट पैरामीटर्स की रिकॉर्डिंग सक्षम करता है जैसे कि इन पैरामीटर्स को पूर्वव्यापी रूप से विश्लेषण किया जा सकता है । इस प्रकार, कोई अतिरिक्त गेटिंग इस बिंदु पर आवश्यक है । सभी FACS setups के लिए, एकल एंटीबॉडी के साथ सना हुआ नमूने मुआवजा समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, अतिव्यापी fluorochromes के उत्सर्जन में spillover के लिए खाते के लिए, और isotype नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ, पृष्ठभूमि धुंधला और निर्धारित करने के लिए खाते में नकारात्मक/सकारात्मक गेट्स ।
  3. अनुक्रमणिका सॉर्ट करें एजीएम कक्ष ।
    1. प्लेस एक ९६-अच्छी तरह से एजीएम के साथ तैयार की थाली-चुनाव आयोग स्ट्रोमा में एजीएम सीरम साइटोकिंस (कदम 1.5.3 से) के साथ मुक्त मीडिया FACs छंटाई मशीन के प्लेट ब्लॉक में । नमूना लोड और नमूना अधिग्रहण शुरू करते हैं । अनुक्रमणिका सॉर्टिंग/एकल कक्ष मोड का चयन करें और व्यक्तिगत ९६-कुओं के लिए sortingsingle कक्षों को शुरू । भ्रूण कोशिकाओं पर कतरनी तनाव को कम करने के लिए सबसे कम प्रवाह दर का उपयोग करें ।
    2. सुनिश्चित करें कि सभी ईवेंट्स अनुक्रमणिका सॉर्टिंग के दौरान रिकॉर्ड किए गए हैं । यह व्यक्तिगत ९६-कुओं के लिए क्रमबद्ध वास्तविक संख्या के सापेक्ष छंटाई फाटक में विश्लेषित कोशिकाओं की कुल संख्या के गणन सक्षम हो जाएगा, नहीं के रूप में सभी घटनाओं दर्ज कुओं के लिए हल हो जाएगा ।
    3. एक बार कोशिकाओं को एक पूरे ९६-अच्छी तरह से थाली को हल किया गया है, एक ऊतक संस्कृति मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2पर सेट प्लेट जगह है । अतिरिक्त प्रति प्रयोग आवश्यक प्लेटों के लिए दोहराएँ ।
    4. सह-संस्कृति व्यक्तिगत रूप से ९६-एजीएम युक्त-चुनाव आयोग (४.३ कदम से) के लिए 7 दिनों के लिए (5 दिन E11 से हल कोशिकाओं के लिए-11.5 भ्रूण, E10 से 6 दिन-10.5 भ्रूण, 7 E9 से दिन-9.5 भ्रूण) में हल कोशिकाओं । 100X आवर्धन पर एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ विभिंन आकारों और morphologies की टेम कालोनियों कल्पना (चित्रा बी) सह संस्कृति अवधि के बाद ।
      नोट: सह-संस्कृति काल के दौरान मीडिया को बदलने की जरूरत नहीं है । क्रमबद्ध hemogenic पुरोगामी शुरू में एक चुनाव आयोग की तरह आकृति विज्ञान के साथ एजीएम ईसी परत में एकीकृत कर सकते है और शुरू में आमसभा से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता-ec स्ट्रोमा (चित्र 2a) । हालांकि, निंनलिखित 24-48 में एच संस्कृति, छोटे, गोल टेम कोशिकाओं या कोशिकाओं के समूहों का पता लगाया जा सकता है । सह संस्कृति के अंत में (5-7 दिन), टेम कोशिकाओं की व्यक्तिगत कालोनियों ९६-कुओं कि क्लोनल टेम क्षमता के साथ एक हल सेल प्राप्त के सबसेट में visualized किया जा सकता है । यदि नेत्रहीन निरीक्षण कुओं एक से अधिक विशिष्ट कॉलोनी होते हैं, तो इस नमूने अनुप्रवाह विश्लेषण से नमूने है कि एक से अधिक कक्ष सॉर्ट प्रति अच्छी तरह से प्राप्त हो सकता है बाहर निकालने के लिए बाहर रखा गया है ।

5. क्लोनल टेम संतति के निम्नलिखित सह-संस्कृति का विश्लेषण

  1. प्रत्येक ९६ से हार्वेस्ट क्लोन-FACS विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से ।
    1. जोरदार प्लास्टिक २०० मल्टीचैनल l पिपेट टिप्स के साथ एक µ पिपेट का उपयोग कर endothelial परतों से अलग कर देना टेम कोशिकाओं को. कोशिश करें कि endothelial लेयर को अलग कर देना न करें । FACS द्वारा टेम संततियों के phenotypic विश्लेषण के लिए १०० µ l (~ ५०% नमूने का) निकालें ।
    2. एक ९६-अच्छी तरह से वी के नीचे की थाली में स्थानांतरण और 2 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर केंद्रापसारक कोशिकाओं गोली । मीडिया को प्लेट से झाड़ू लगाकर मीडिया को सिंगल रैपिड मोशन के साथ हटा दें जबकि प्लेट उल्टे (फ्लिक प्लेट) हो ।
    3. शेष १०० µ l कोशिकाओं में मूल ९६-well थाली में एक ३७ ° c incubatorfor उपयोग बाद में engraftment परख (चरण 6) में रखें ।
  2. टेम विश्लेषण के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
    1. एक ९६-अच्छी तरह से वी नीचे के प्रत्येक कुआं में सेल छर्रों को फिर से निलंबित-पंजाब के ५० µ एल के साथ 2% FBS 10 µ जी/एमएल FcR ब्लॉक और 1 µ जी/एमएल DAPI युक्त । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन ।
    2. पंजाब के ५० µ एल जोड़ें/2% FBS युक्त 10 µ जी/एमएल FcR ब्लॉक और एंटीबॉडी के लिए एक HSC मिश्रण शामिल पीई-Cyanine7-संयुग्मित एंटी-VE-Cadherin, PerCP-संयुग्मित विरोधी CD45, पे-संयुग्मित विरोधी EPCR, सुरक्ष-संयुग्मित विरोधी Sca1, और FITC-संयुग्मित विरोधी Gr1 और विरोधी F4/80 (1:100 अंतिम कमजोर पड़ने पर प्रत्येक एंटीबॉडी जब तक अंयथा संकेत निर्माता की सिफारिशों के आधार पर या titrations के अनुसार) । 4 डिग्री सेल्सियस से कम 20 मिनट के लिए थाली में मशीन ।
  3. क्रमिक कमजोर पड़ने के साथ असीमित एंटीबॉडी निकालें और कोशिकाओं का विश्लेषण ।
    1. जोड़ें २०० µ एल/खैर पंजाबियों/2% FBS और 2 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर केंद्रापसारक कोशिकाओं गोली । फिर, झाड़ थाली supernatant को त्यागने और जोड़ने के लिए २०० µ l पंजाबियों/2% प्रत्येक सेल गोली करने के लिए FBS और 2 गोली कोशिकाओं को मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर केंद्रापसारक ।
    2. supernatant को छोड़ने के लिए फ़्लिक प्लेट और ५० µ जोड़ें l/विश्लेषण के लिए 2% FBS/ एक प्लेट रीडर से सुसज्जित एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर FACS द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें ।
      नोट: टेम संततियों के सबसेट की गणना करने के लिए कक्षों की एक निश्चित मात्रा (उदा., ३५ µ l को कुल ५० µ l का पुनः निलंबन के लिए उपयोग किया गया) प्राप्त करें.
  4. HSC क्षमता वाले (चित्र 3) वाली कालोनियों के लिए स्क्रीन के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त टेम संतति के लिए FACS डेटा का विश्लेषण करें ।
    1. गेट पहले CD45 सकारात्मक जनसंख्या कि माइलॉयड मार्करों Gr1 और F480 के लिए नकारात्मक है । अभी भी VE-Cadherin के निम्न स्तर व्यक्त कोशिकाओं है कि बाहर गेट नहीं है. टेम कालोनियों की फसल के दौरान बाधित कर रहे है कि एजीएम-ईसी परत से कोशिकाओं VE-Cadherin सकारात्मक और CD45 नकारात्मक हैं ।
    2. गेट CD45+VE-पाजी-/lowGr1-F4/80- कोशिकाओं और सबसेट है कि EPCR और Sca1 (आंकड़ा 3 -C) के उच्च स्तर को व्यक्त पर आगे ।
      नोट: पूर्व अध्ययनों में, CD45 के साथ कोशिकाओं की कमी कालोनियों+VE-सीएडी-/lowGr1-F4/80-Sca1hiEPCRhi phenotype (figure 3d) reproducibly को detectable प्रदान करने में विफल विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों में multilineage परिधीय रक्त engraftment17 (डेटा नहीं दिखाया गया है); इस प्रकार, इन कालोनियों चरण 6 में बाद प्रत्यारोपण विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाना चाहिए ।

6. Phenotypic गुणों के साथ व्यक्तिगत क्लोन और सहसंबंध के Engraftment गुणों का विश्लेषण सूचकांक छंटाई द्वारा आविर्भाव

  1. के दिन (यदि संभव हो) या सुबह चरण 5 में phenotypic विश्लेषण के बाद, पुन: एक ९६ से शेष १०० µ एल कोशिकाओं को निलंबित कर दिया-अच्छी तरह से सह संस्कृति निंनलिखित टेम से युक्त (५.१ कदम से) जोरदार pipetting एक २०० µ एल पिपेट टिप का उपयोग करके ।
  2. तैयार करने और congenic तनाव बी-6 के पूरे अस्थि मज्जा से बचाव कोशिकाओं को जोड़ने । SJL-PtprcaPepcb/BoyJ (B6 cd 45.1) वयस्क चूहे16,17.
    1. एक hemocytometer के तहत तुर्क समाधान में nucleated अस्थि मज्जा कोशिकाओं गिनती । 2% FBS के साथ पंजाब में 5 एक्स 105 nucleated कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए पतला ।
    2. बचाव अस्थि मज्जा कोशिकाओं के १०० µ एल जोड़ें (5 x 104) प्रत्यारोपण विश्लेषण और pipetting द्वारा मिश्रण के लिए एक अच्छी तरह से युक्त टेम संतान के लिए ।
  3. एक ही घातक विकिरणित प्राप्तकर्ता congenic तनाव बी-6 में व्यक्तिगत क्लोन की संतति प्रत्यारोपण । SJL-PtprcaPepcb/BoyJ (B6 cd 45.1) वयस्क माउस ।
    1. घातक रूप से विकीर्ण की संख्या के रूप में बी-6 सीडी 45.1 चूहों क्लोनों की संख्या व्यक्तिगत रूप से एक क्लोन की संतति इंजेक्षन करने के लिए (एक सीज़ियम स्रोत से १,००० cGy का उपयोग कर) ।
    2. ड्रा २०० µ एल कुल सेल निलंबन (यह क्लोन से कोशिकाओं को भी शामिल है के रूप में अच्छी तरह से 5 x 104 B6 सीडी 45.1 बचाव अस्थि मज्जा कोशिकाओं) एक ½ मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज में एक 29G ½ इंच सुई के साथ ।
    3. घातक विकीर्ण बी-6 सीडी 45.1 वयस्क प्राप्तकर्ताओं 2-24 ज इंजेक्शन से पहले ।
    4. एक प्लास्टिक माउस निरोधक है कि पूंछ का उपयोग की अनुमति देता है का उपयोग करना, पूंछ नस २०० µ एल प्रत्येक क्लोन और 5 एक्स 10 से दोनों कोशिकाओं से युक्त मात्रा के माध्यम से इंजेक्शन4 बी-6 सीडी 45.1 वयस्क अस्थि मज्जा बचाव कोशिकाओं को प्राप्तकर्ता अस्तित्व में सहायता ।
    5. कान टैग और प्राप्तकर्ता चूहों तौलना, और नियमित अंतराल पर अपने वजन/स्वास्थ्य की जांच करें (उदा, 3-4 बार/सप्ताह के बाद विकिरण/प्रत्यारोपण, या प्रति व्यक्ति संस्थागत मानक संचालन प्रक्रियाओं) अच्छा स्वास्थ्य सुनिश्चित करने के लिए ।
  4. नियमित अंतराल पर परिधीय रक्त engraftment का विश्लेषण करें (उदा., 2, 16, 24 सप्ताह) प्रत्यारोपण के बाद ।
    1. निकालें 50-100 µ रक्त के एल रेट्रो के माध्यम से कक्षीय भरो या एक और नैतिकता की दृष्टि से अनुमोदित रक्त विधि दे ।
    2. 3 मिलीलीटर lysis बफर जोड़ें (१६.६ जी एनएच4सीएल, 2 जी NaHCO3 और ७४.४ मिलीग्राम EDTA 2 एल एच2ओ) के लिए रक्त और कमरे के तापमान पर 5 min. केंद्रापसारक के लिए ३०० x g पर 5 min. महाप्राण के लिए और फिर से गोली निलंबित के लिए 2 एमएल पंजाबियों/2% FBS । 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    3. फिर से गोली से सस्पेंड १५० µ l पंजाबियों/2% FBS युक्त 10 µ g/मब FcR ब्लॉक और 1 µ g/मब DAPI, और एक अच्छी तरह से युक्त ५० µ एल isotype नियंत्रण के लिए मात्रा का वितरण 1/3 दाता और वंश, 1/3 के लिए एक अच्छी तरह से युक्त ५० µ एल एंटीबॉडी वंश के लिए दाता और isotype नियंत्रण के लिए , और 1/3 एक अच्छी तरह से युक्त ५० µ एल एंटीबॉडी दोनों दाता और वंश का पता लगाने के लिए ।
      नोट: multilineage engraftment का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी: APCeFluor780-संयुग्मित विरोधी सीडी 45.2, पीई-Cyanine7-संयुग्मित विरोधी सीडी 45.1, FITC-संयुग्मित विरोधी CD3, पीई-संयुग्मित विरोधी F4/80, PerCP-संयुग्मित विरोधी Gr1, और APC-संयुग्मित विरोधी CD19, या प्रासंगिक isotype नियंत्रण ।
    4. सीडी 45.2 (दाता) के समय FACS द्वारा परिधीय रक्त योगदान का आकलन करके लंबी अवधि के engraftment के साथ क्लोनों की पहचान करें-माइलॉयड (Gr1 और/या F4/80 पॉजिटिव), बी-सेल (CD19 पॉजिटिव), और टी-सेल (CD3 पॉजिटिव) (चित्र 4a -बी).
      नोट: टेम engraftment भी सीडी 45.2 (दाता) द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है-अस्थि मज्जा, तिल्ली, थाइमस, और आंख से काटा ऊतकों से टेम आबादी के लिए योगदान व्युत्पंन, या अस्थि मज्जा कोशिकाओं के बाद माध्यमिक प्रत्यारोपण में बी-6 सीडी 45.1 चूहों धारावाहिक engraftment गुण17का विश्लेषण करने के लिए ।
  5. प्रत्येक क्लोन के phenotypic गुण के रूप में प्रारंभिक एकल कोशिका सूचकांक द्वारा निर्धारित अपने engraftment गुणों के साथ छंटाई सहसंबंधी बनाना । प्रवाह विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, प्रत्येक इंडेक्स-सॉर्ट किए गए कक्ष के लिए सॉर्टिंग पैरामीटर्स अपलोड करें (९६-अच्छी तरह से जो इसे सॉर्ट किया गया था) । एकल कक्षों के phenotypic गुणों का मूल्यांकन करने के लिए प्रवाह भूखंडों पर कार्यात्मक डेटा मैप करें क्योंकि वे अपने कार्यात्मक आउटपुट (उदाहरण के लिए, दीर्घावधि, multilineage engraftment) (चित्र 4c) से संबंधित हैं ।

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Representative Results

चित्र 1a प्रयोगात्मक डिजाइन के एक योजनाबद्ध से पता चलता है । एक बार पी-एसपी/एजीएम ऊतकों, असंबद्ध, और collagenase में विच्छेदित कर रहे हैं, वे VE-Cadherin और EPCR सूचकांक छंटाई के लिए एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं । पूर्व HSC VE-Cadherin+EPCRउच्च (चित्र 1b) पर हल कोशिकाओं में समृद्ध कर रहे हैं । अंय fluorochrome-संयुग्मित एंटीबॉडी को पूर्वव्यापी रूप से अतिरिक्त phenotypic पैरामीटर्स का विश्लेषण करने के लिए शामिल किया जा सकता है, जो इंडेक्स छंटाई के दौरान प्रत्येक कोशिका के लिए रिकॉर्ड किए जाते हैं । E11 एजीएम से इस प्रतिनिधि प्रयोग में कोशिकाएँ FITC-संयुग्मित विरोधी CD45 और पीई-संयुग्मित विरोधी CD41 एंटीबॉडी से भी दाग रही हैं. इन टेम-विशिष्ट मार्करों के लिए VE-Cadherin+EPCRउच्च जनसंख्या के भीतर विविधता (चित्रा 1C), asynchrony विकास में इस चरण5में जाना जाता टेम के साथ संगत मनाया जाता है ।

एकल VE-Cadherin+EPCRउच्च एजीएम कोशिकाओं की छंटाई के बाद सूचकांक-एजीएम सीरम मुक्त मीडिया और साइटोकिंस, कॉलोनी गठन में आमसभा से युक्त प्रारंभ में, VE-Cadherin+EPCRउच्च एजीएम कक्ष में एकीकृत एजीएम-ईसी परत से पहले वे दौर शुरू करने और टेम समूहों (चित्रा 2a, एक ट्रांसजेनिक murine भ्रूण व्यक्त GFP से हल कोशिकाओं से यहां दिखाया के रूप में स्थापित Ly6a प्रमोटर21के तहत, उन्हें एजीएम-ईसी स्ट्रोमा से अलग करने के लिए) । सह संस्कृति के 5-7 दिनों के बाद, विभिंन आकारों और morphologies की कालोनियों एक औंधा माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 बी) के साथ निरीक्षण द्वारा पता लगाया जा सकता है, एक प्रतिनिधि प्रयोग से यहां दिखाया गया है, E11 आमसभा से छंटाई के बाद 6 दिन ।

अगले, FACS द्वारा phenotypic विश्लेषण प्रत्येक VE-Cadherin+EPCRउच्च कोशिका जो एक टेम कॉलोनी का गठन किया है की संतति के आधे पर प्रदर्शन कर रहा है । HSC phenotype के साथ कोशिकाओं युक्त कालोनियों VE के रूप में पहचाने जाते हैं-Cadherin-/lowGr1-F4/80-CD45+Sca1hiEPCRhi (figure 3). यहां, हम चार विभिंन कालोनियों सूचकांक-क्रमबद्ध E11 एजीएम VE-Cadherin+EPCRउच्च कोशिकाओं, तीन phenotypic HSC के विभिंन अनुपात के साथ अंय अधिक विभेदित सेल प्रकार के साथ के सह संस्कृति निंनलिखित प्राप्त शो (चित्र 3 ए -सी), और HSC phenotype (चित्रा 3 डी) के साथ चौथे कमी कोशिकाओं । प्लेटेड कोशिकाओं की संख्या के अनुसार मनाया कालोनियों की संख्या और engraftable स्टेम सेल कालोनियों के परिणामस्वरूप प्रतिशत भ्रूण की उंर और क्रमबद्ध प्रदर्शन के आधार पर बदलता है । जें-Cadherin-/lowGr1-F4/80-CD45+Sca1hiEPCRhi E11 एजीएम क्लोनों ५३ ± उत्पंन १९२ कोशिकाओं से बाहर 15 कालोनियों में 5% ± १.३% के साथ चढ़ाया १९२ कोशिकाओं मढ़वाया पैदा क्लोन है कि engrafted लंबे समय तक शब्द (3 प्रयोगों के लिए ± एसडी मतलब) ।

phenotype को engraftment क्षमता के साथ सहसंबंधित करने के लिए, प्रत्येक VE-Cadherin+EPCRउच्च कोशिका की संतति का शेष आधा जो टेम द्वारा HSC phenotype के साथ कोशिकाओं से युक्त एक FACS कॉलोनी का गठन किया गया है (जैसे, चित्रा 3ए-सी) में प्रतिनिधित्व कालोनियों विकिरणित (१,००० cGy) वयस्क congenic तनाव (बी-6 सीडी 45.1) चूहों को बी-6 सीडी 45.1 मज्जा से बचाव कोशिकाओं की एक खुराक के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है । लंबे समय तक multilineage engraftment दाता (सीडी 45.2) माइलॉयड के लिए योगदान (Gr1 और F4/80), बी सेल (CD19), और टी सेल (CD3) परिधीय रक्त के डिब्बे (चित्रा 4a) के बाद से प्रत्येक क्लोन के लिए पुष्टि की है । हालांकि अधिकांश कालोनियों HSC phenotype के साथ कोशिकाओं से युक्त FACS द्वारा पता लगाया लंबी अवधि के engraftment प्रदान करते हैं, ट्रांसप्लांटेशन कार्यात्मक multilineage engraftment की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है के रूप में कुछ क्लोन समय पर engraftment खो (चित्रा 4B), या प्रदर्शन अद्वितीय engraftment गुण जैसे लसीकावत्-पक्षपाती engraftment (डेटा नहीं दिखाया गया है) । एक बार प्रत्येक VE-Cadherin+EPCRउच्च क्लोन के कार्यात्मक HSC क्षमता निर्धारित किया जाता है, यह है कि क्लोन अपने सटीक phenotypic विशेषताओं की पहचान करने के लिए मापदंडों छंटाई सूचकांक को वापस संबंधित है । इस उदाहरण में, हम देखते है कि कार्यात्मक पूर्व की पुष्टि की HSC क्लोन (लाल डॉट्स) CD41 और CD45 की उनकी अभिव्यक्ति में विषम हैं, पूर्व HSC परिपक्वता के दौरान इन मार्करों की स्थापना की गतिशील अभिव्यक्ति के साथ संगत HSC (चित्र 4c) । टेम कालोनियों बनाने क्लोन लेकिन या तो phenotypic स्क्रीनिंग या दीर्घकालिक, multilineage engraftment निंनलिखित प्रत्यारोपण (गैर HSC hemogenic क्लोन, नीले डॉट्स) के अभाव द्वारा HSC क्षमता की कमी भी CD41 और CD45 के लिए विषम हैं, हालांकि एक सबसेट एक्सप्रेस CD41 के उच्च स्तर पूर्व HSC क्लोन है, जो मुख्य रूप से कर रहे है के साथ तुलना में CD41कम। क्लोनों कि टेम कालोनियों (गैर hemogenic क्लोन, लाइट ग्रीन डॉट्स) फार्म नहीं किया मुख्य रूप से CD41-/lowCD45-है, जो संभावना गैर hemogenic VE-Cadherin+EPCRउच्च endothelial कोशिकाओं को प्रतिबिंबित ।

Figure 1
चित्र 1: एकल कक्षों की अनुक्रमणिका सॉर्टिंग के लिए प्रोटोकॉल ओवरव्यू और प्रतिनिधि फ़्लो cytometry विश्लेषण. (A) प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण । (ख) असंबद्ध E11 एजीएम सेल के सूचकांक के लिए गेटिंग रणनीति दिखा के प्रवाह cytometry विश्लेषण VE-Cadherin+EPCRउच्च कोशिकाओं पूर्व HSC के लिए समृद्ध (FACS विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण) । प्रत्येक गेट में संख्या कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ग) VE-Cadherin+EPCRउच्च जनसंख्या के भीतर CD41 और CD45 धुंधला दिखा प्रवाह cytometry विश्लेषण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: आमसभा के दौरान टेम कालोनियों का गठन-चुनाव आयोग सह संस्कृति । (क) VE के समय चूक इमेजिंग-Cadherin+EPCRउच्चGFP+ क्रमबद्ध कोशिकाओं से Ly6a-GFP ट्रांसजेनिक भ्रूण21 सह-संस्कृति आयोग पर आमसभा । µm में स्केल सलाखों के प्रत्येक छवि के नीचे बाएं में दिखाए जाते हैं । (ख) VE-Cadherin से गठित प्रतिनिधि कालोनियों+EPCRउच्च सूचकांक-एक सेल के बाद 6 दिनों के सह आमसभा पर संस्कृति-ईसी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक एकल E11 एजीएम की संतति का प्रवाह cytometry विश्लेषण-व्युत्पंन VE-Cadherin+EPCRउच्च कोशिकाओं के बाद सह-संस्कृति पर आमसभा-चुनाव आयोग । HSC क्षमता वाले कक्षों के लिए गेटिंग VE-Cadherin-/lowGr1-F4/80- (बाएँ फलक), CD45+ (मध्य पैनल), और Sca1hiEPCRhi (दाएँ पैनल) के रूप में दिखाया गया है । (क) प्रतिनिधि HSC phenotype के साथ कोशिकाओं की एक सजातीय जनसंख्या से मिलकर कॉलोनी । (ख-ग) प्रतिनिधि HSC phenotype और अधिक विभेदित सेल प्रकार के साथ कोशिकाओं के मिश्रण युक्त कालोनियों । (D) प्रतिनिधि HSC phenotype की कमी कोशिकाओं से मिलकर कॉलोनी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: व्यक्तिगत क्लोनों की संतति के परिधीय रक्त engraftment का विश्लेषण एजीएम के बाद-चुनाव आयोग के सह-संस्कृति और सूचकांक छंटाई मापदंडों के साथ सहसंबंध । (क) दाता (सीडी 45.2)-व्युत्पन्न परिधीय रक्त engraftment की माइलॉयड (Gr1 और F4/बी-सेल (CD19), और टी-सेल (CD3) एक प्रतिनिधि प्राप्तकर्ता से सबसेट (बी-6 सीडी 45.1) व्यक्ति की संतति के साथ प्रत्यारोपित E11 VE-Cadherin+EPCRउच्च निंनलिखित एजीएम-चुनाव आयोग सह संस्कृति क्लोन । (ख) दाता (सीडी 45.2)-व्यक्तिगत E11 VE की संतति के प्रत्यारोपण के बाद समय के साथ परिधीय रक्त engraftment व्युत्पंन-Cadherin+EPCRउच्च क्लोन निंनलिखित एजीएम-चुनाव आयोग सह संस्कृति । (ग) प्रत्येक सूचकांक के लिए CD41 और CD45 अभिव्यक्ति का सहसंबंध VE हल-Cadherin+EPCR अपने HSC क्षमता निंनलिखित के साथउच्च क्लोन-चुनाव आयोग सह दीर्घकालिक पर आधारित संस्कृति, multilineage engraftment ट्रांसप्लांटेशन परख में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

भ्रूण विकास आवश्यक के दौरान HSC उत्पत्ति के अध्ययन के लिए hemogenic अग्रदूतों में HSC क्षमता का पता लगाने के लिए अभी तक क्षमता की कमी के लिए दीर्घकालिक multilineage टेम पुनर्गठन में प्रत्यारोपित वयस्क प्राप्तकर्ताओं प्रदान करने का मतलब है । इस प्रोटोकॉल में, हम stromal co द्वारा भ्रूण hemogenic पुरोगामी की एक क्लोनिंग की परख वर्तमान, जो HSC करने के लिए अग्रदूतों की परिपक्वता का समर्थन करता है आमसभा से संवहनी, प्रत्यारोपण परख में बाद में कार्यात्मक विश्लेषण के साथ । सूचकांक छँटाई के शामिल करने के लिए phenotypic मापदंडों के पूर्वव्यापी विश्लेषण परमिट पूर्व HSC के गुण के रूप में सतह मार्करों द्वारा परिभाषित के रूप में परख की विशेषता । यह दृष्टिकोण इस प्रकार अंय तरीकों पर एक लाभ प्रदान करता है कि थोक पुनः के साथ अग्रदूत आबादी की छंटाई पर निर्भर एकत्रीकरण-आधारित HSC परख4,5,10, संभावित मार्करों के लिए कुशल स्क्रीनिंग सक्षम पूर्व HSC की जबकि एक ही समय में प्रत्येक व्यक्ति के सेल के लिए सतह मार्करों के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं । इस पद्धति का प्रयोग, उदाहरण के लिए, हम पहले की सूचना दी है कि, EPCR के उपयोग के लिए पूर्व के लिए समृद्ध विकास के विभिंन चरणों में HSC आबादी, पायदान ligand Dll4 के मध्यवर्ती अभिव्यक्ति आगे क्लोनिंग के एक उपजनसंख्या परिभाषित के अलावा ve-Cadherin+EPCR+ HSC क्षमता के साथ पुरोगामी, जबकि Dll4 नेगेटिव VE-Cadherin+EPCR+ hemogenic पुरोगामी अधिकतर कमी HSC संभावित17.

इस विधि का एक और लाभ HSC क्षमता के लिए स्क्रीन करने की क्षमता है तुरंत सह संस्कृति के बाद एक phenotype के साथ टेम संतति का पता लगाने के आधार पर (VE-Cadherin-/lowGr1-F4/80-CD45+Sca1 हायEPCRहाय) कि दीर्घकालिक, multilineage engraftment के साथ संबंधित है । यह इस HSC phenotype के साथ टेम संतान की कमी कालोनियों प्रत्यारोपण की जरूरत समाप्त, के रूप में इन कालोनियों प्रत्यारोपण परख में दीर्घकालिक engraftment प्रदान नहीं करते । इसके अलावा, प्रारंभिक जानकारी HSC hemogenic से संभावित पूर्व भेद HSC क्षमता तुरंत सह संस्कृति के बाद के बाद, लंबे समय से परिणामों का इंतजार करने की आवश्यकता के बिना engraftment परख, उपयोगी है, उदाहरण के लिए, तेजी से HSC-पुरोगामी के स्क्रीनिंग उम्मीदवार मार्करों । हालांकि, लंबी अवधि के engraftment निंनलिखित प्रत्यारोपण के साथ phenotypic डेटा के सहसंबंध पूर्व HSC क्लोन के सटीक engraftment गुणों के रूपांतरों में अतिरिक्त मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । हमने पाया है, उदाहरण के लिए, कि क्लोनल पूर्व पी-सपा से HSC/9.5 और ई 11.5 के बीच क्षेत्र के लिए अद्वितीय दोनों B1a और B2-लिम्फोसाइटों को जंम देने की क्षमता है, जबकि B1a-लिम्फोसाइट क्षमता वयस्क HSC में कमी है17। इसके अलावा, हम पूर्व के engraftment गुणों में एक विकास का पता लगाया 9.5 और ई के बीच HSC क्लोन पहले पूर्व के साथ HSC एक सापेक्ष विषम का प्रदर्शन पेरिटोनियल B1a छंद B2-लिम्फोसाइट engraftment और कम मजबूत आत्म नवीकरण क्षमता आधारित माध्यमिक ट्रांसप्लांटेशन परख17पर ।

हालांकि यह प्रोटोकॉल क्लोनल HSC पुरोगामी के अनूठे गुणों को स्पष्ट करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदान करता है, कुछ सीमाएं है जिंहें स्वीकार किया जाना चाहिए । हालांकि FACS द्वारा HSC phenotypic के साथ संतति का पता लगाने के बाद आमसभा-चुनाव आयोग सह संस्कृति आम तौर पर दीर्घकालिक multilineage engraftment से संबंधित है, इस phenotype के साथ कुछ कालोनियों केवल अल्पकालिक engraftment या engraftment एक या एक से अधिक में कमी प्रदान टेम वंश (चित्र 4B; डेटा नहीं दिखाया गया है) । इस प्रकार, ट्रांसप्लांटेशन कार्यात्मक HSC मांयता में सोने के मानक बना हुआ है । इसके अलावा, यह से इंकार नहीं किया जा सकता है कि पूर्व HSC क्लोन के engraftment गुणों में अंतर के कुछ, बजाय hemogenic अग्रदूत साबित क्षमता में कोशिका आंतरिक मतभेदों को दर्शाती है, एजीएम के दौरान stochastic परिवर्तनशीलता से परिणाम-चुनाव आयोग सह संस्कृति हो सकता है स्व-नवीकरण छंद में भिंनता निर्णय, पूर्व HSC के रूप में एक साथ HSC के लिए परिपक्व और कोशिका विभाजन के दौर से गुजर रहे हैं । वास्तव में, यह भाग खाते में कॉलोनी आकृति विज्ञान और व्यक्तिगत पूर्व HSC क्लोन से उत्पंन कोशिकाओं के phenotype के मनाया विविधता के लिए मई (उदा, आंकड़ा 3ए-सी), और पूर्व के एक अनुमान में परिणाम हो सकता है HSC द्वारा यह परख नहीं तो सभी संभावित पूर्व HSC क्लोन कार्यात्मक HSC के उत्पादन से पता चला है आमसभा के बाद चुनाव आयोग सह संस्कृति । हालांकि, इस विधि द्वारा सक्षम अद्वितीय phenotypic मार्करों (जैसे Dll417) के अपने अंतर अभिव्यक्ति द्वारा कार्यात्मक विशिष्ट hemogenic क्लोन भेद करने की क्षमता के साथ hemogenic पुरोगामी की उपआबादी की पहचान करने के लिए एक साधन प्रदान करता है अंतर्निहित कोशिका-आंतरिक मतभेद ।

इस बुनियादी प्रोटोकॉल पर बिल्डिंग, विस्तारित अनुप्रयोगों के एक नंबर के विकास के दौरान क्लोनल hemogenic पुरोगामी की टेम क्षमता आगे का अध्ययन करने के लिए शामिल किया जा सकता है । सतह मार्करों का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के उपयोग से परे, ट्रांसजेनिक भ्रूण में प्रतिदीप्ति मार्कर की अभिव्यक्ति (उदा., Ly6a-GFP21 या Runx1-GFP22 में व्यक्त hemogenic endothelium/पूर्व HSC) हो सकता है hemogenic पुरोगामी की छंटाई सूचकांक के लिए शामिल किया गया । ख्यात पूर्व HSC का पता लगाने के लिए आमसभा-चुनाव आयोग सह संस्कृति के बाद प्रत्यारोपण परख के अलावा, संतति भी टेम वंश की क्षमता पर माध्यमिक इन विट्रो परख, जैसे OP9 पर संस्कृति या OP9-एलईडी dl1 का पता लगाने के लिए बी के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है और टी सेल संभावित23, या clonogenic कॉलोनी methylcellulose में erythromyeloid क्षमता का पता लगाने के लिए परख बनाने । दरअसल, कुछ गैर HSC hemogenic क्लोन (जैसे, चित्रा 3d) की संभावना का प्रतिनिधित्व multipotent progenitors, erythromyeloid progenitors, या टी और बी सेल progenitors पहले वर्णित है कि पूर्व में और HSC विकास के स्वतंत्र है 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28, और इस परख आगे टेम पुरोगामी की इन अलग तरंगों के क्लोनल अध्ययन की सुविधा हो सकती है । अंत में, पूर्व HSC की छंटाई सूचकांक HSC अग्रदूतों विकासशील की वैश्विक transcriptional प्रोफाइल के साथ phenotypic गुणों को सहसंबंधी बनाना, एकल सेल आरएनए-अनुक्रमण के रूप में अन्य अनुप्रवाह विश्लेषण के साथ संयुक्त किया जा सकता है । कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल HSC विकास में उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहिए कि भ्रूण hemogenic पुरोगामी से क्लोनल hematopoiesis के मजबूत विश्लेषण के लिए एक विधि प्रदान करता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम FACS के साथ सहायता के लिए फ्रेड Hutchinson प्रवाह Cytometry कोर में एंड्रयू बर्गर, स्टेसी Dozono, और ब्रायन ̈रदें शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस कार्य के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य NHLBI UO1 अनुदान #HL100395, सहायक सहयोगी अनुदान #HL099997, और NIDDK अनुदान #RC2DK114777 का समर्थन किया गया. ब्रेंडन Hadland है एलेक्स नींबू पानी स्टैंड फाउंडेशन और हुंडई व्हील्स फाउंडेशन पर आशा द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGM-EC culture media
Materials for culture of endothelial cells
TrypLE Express Gibco 12605-028 Use to dissociate AGM-EC monolayers
Gelatin 0.1% in water StemCell Technologies 7903 Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic
96-well tissue culture plates Corning 3599 Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-144 Use for dissection and FACS staining
500 ml filter bottles Fisher Scientific 9741202 Use to sterile filter Endothelial media
AGM-EC culture media (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 12440-053 400 mls
Hyclone Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH30088.03 100 mls
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 5 mls
Heparin Sigma H3149 50 mg dissolved in 10 mls media
L-glutamine (200 mM) StemCell Technologies 7100 5 mls
Endothelial Mitogen (ECGS) Alfa Aesar J64516 (BT-203) Add 10 mls media to dissolve and add
Materials for AGM index sort
Collagenase (0.25%) StemCell Technologies 7902 Use for dissociation of embryonic tissues
3ml syringe BD Biosciences 309657 Use to sterile filter antibody solutions for FACS
0.22 µM syringe-driven filter Millipore SLGP033RS Use to sterile filter antibody solutions for FACS
5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap Corning 352235 Use to remove cell clumps prior to FACS
DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) Millipore 268298 Use to exclude dead cells from sort
anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) BD Biosciences 553141 Use to block non-specific staining to Fc receptors
Antibodies for AGM index sort
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 eBioscience 25-1441-82 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4301-81 Isotype control for CD144 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 eBioscience 46-2012-80 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 eBioscience 46-4031-80 Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710
Anti-mouse CD41 PE BD Biosciences 558040 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE BD Biosciences 553925 Isotype control for CD41 PE
Anti-mouse CD45 FITC eBioscience 11-0451-85 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4031-81 Isotype control for CD45 FITC
AGM-serum free media (10mls)
X-Vivo 20 Lonza 04-448Q 10 mls
recombinant murine stem cell factor (SCF) Peprotech 250-03 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) Peprotech 300-19 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
recombinant murine interleukin-3 (IL3) Peprotech 213-13 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
Materials for Staining co-cultured cells
96 well plate, V-bottom Corning 3894 Use for FACS analysis
Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-0451-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 eBioscience 35-4031-80 Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-mouse CD201 (EPCR) PE eBioscience 12-2012-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4031-81 Isotype control for CD201 PE
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC eBioscience 17-5981-83 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC eBioscience 17-4321-81 Isotype control for Ly-6A/E APC
Anti-mouse F4/80 FITC eBioscience 11-4801-81 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4321-41 Isotype control for F4/80 FITC
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC BD Biosciences 553127 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC BD Biosciences 556923 Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC
Materials for tail vein injection for transplant
1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles BD Biosciences 309306 Use for tail vein injection for transplantation
Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP Biolegend 108426 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP Biolegend 400629 Isotype control for Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PE eBioscience 12-4801-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4321-80 Isotype control for F4/80 PE
Anti-mouse CD3 FITC BD Biosciences 555274 Staining
Anti-mouse CD19 APC BD Biosciences 550992 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC BD Biosciences 553932 Isotype control for CD19 APC
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 eBioscience 25-0453-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4321-81 Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 eBioscience 47-0454-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 eBioscience 47-4321-80 Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II with DIVA software BD Biosciences
BD FACSCanto II with plate reader BD Biosciences
Haemocytometer Fisher Scientific S17040 For counting cells
Multi-channel pipette Fisher Scientific 14-559-417 For dispensing cells
FACS analysis software FlowJo/BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३५ टेम स्टेम सेल (HSC) प्री-HSC महाधमनी-gonad-mesonephros क्षेत्र (एजीएम) भ्रूण hematopoiesis सूचकांक छँटाई एकल कोशिका क्लोनल विश्लेषण टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण
भ्रूण टेम के क्लोनल विश्लेषण स्टेम सेल Endothelial सेल आला सह संस्कृति के साथ संयुक्त छंटाई एकल कोशिका सूचकांक का उपयोग कर पुरोगामी
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Hadland, B. K., Varnum-Finney, B., Nourigat-Mckay, C., Flowers, D., Bernstein, I. D. Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture. J. Vis. Exp. (135), e56973, doi:10.3791/56973 (2018).

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