Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Gjenoppretting av narkotika-søker i mus bruker betinget sted preferanse paradigmet

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/56983
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Unidad de Investigación Psicobiología de las Drogodependencias, Departamento de Psicobiología, Facultad de Psicología, Universitat de València

Summary

Denne protokollen beskriver betinget sted preferanse (CPP) som modell for tilbakefall. Denne prosedyren tillater måling av tilbakefall i forsøksdyr, vurderer virkningen av stoffet-assosiert miljømessige signaler som begjær og tilbakefall i avsto rusavhengige er fokus for stoff-misbruk behandling programmer.

Abstract

Nåværende protokollen beskriver betinget sted preferanse (CPP) som en modell av tilbakefall ved narkotikaavhengighet. I denne modellen, dyr er først opplært til å erverve en betinget sted preferanse inne en narkotika-sammenkoblet avlukke og etter etter condition testen, de utfører flere økter å slukke etablerte preferanse. CPP tillater evaluering av betinget givende effekten av legemidler knyttet til miljømessige signaler. Deretter kan slukket CPP robust gjenopprettes ved ikke-kontingenten administrasjonen av en grunning dose av stoffet, og eksponering for stressende stimuli. Begge metodene vil bli forklart her. Når Dyret reinitiates de atferdsmessige respons, anses en gjenoppretting av betinget belønningen som har funnet sted.

De viktigste fordelene med denne protokollen er at det er ikke-invasiv, billig og enkel med god holdbarhet kriterier. I tillegg kan det studiet av ulike miljømessige manipulasjoner, som stress eller kosthold, som kan modulerer tilbakefall til narkotika-søker atferd. Imidlertid er en begrensning at hvis forskeren mål å utforske motivasjon og primære forsterkende virkningene av stoffet, bør det bli supplert med selv-administrasjonen prosedyrer, fordi de innebærer operant svar av dyr.

Introduction

Betinget sted preferanse (CPP) paradigme tilbyr en enkel måte å vurdere betinget belønningen av ulike stimuli1,2, og har blitt brukt grovt å studere betinget givende virkningene av vanedannende stoffer3 . Den er basert på Pavlovian condition, evaluere motiverende verdien av narkotika-assosiert miljømessige signaler for å opprettholde vanedannende atferd4. I denne modellen, miljømessige signaler kjøpe sekundære appetitive egenskaper (betinget givende effekter) når sammenkoblet med en primær reinforcer3. For eksempel en opprinnelig nøytralt sted (for eksempel fargen på et rom i CPP buret) er sammenkoblet med bestemte effekten av et rusmiddel under noen condition økter5, mens en annen rom er forbundet med injeksjon av et kjøretøy. Etter condition, hvis dyret tilbringer mer tid i rommet tidligere forbundet med stoffet, er det antatt at CPP har utviklet3. Etableringen av preferanse oppnås når dyret gir en positiv verdi til miljømessige signaler knyttet til stoffet, som er den primære reinforcer. Følgelig utføre dyr atferdsdata narkotika-søker svar svar på de kontekstavhengige stikkordene6. CPP modellen tillater evaluering av givende egenskapene til subthreshold doser av stoffet, om dyr i en bestemt tilstand (f.ekshar lidd av sosiale nederlag tidligere) er mer sårbare og følsom for doser som er ikke effektivt i naiv dyr7.

CPP modellen har også brukt til å evaluere utryddelse/gjeninnsettelse som en dyremodell å studere tilbakefall3, som er målet med nåværende protokollen. Det er tre forskjellige faser: oppkjøpet, utryddelse og gjenoppretting (figur 1). Dyr først få CPP for en narkotika-sammenkoblet kupé CPP reinstatement modellen, og deretter de utfører flere utryddelse økter. Vi definerer utryddelse som øyeblikket der dyr reduserer sin atferdsdata svar på tilnærming til en betinget givende stimulans som er fjernet (f.eksstoffet)8. Under utryddelse økter utforske dyr seksjonene i fravær av stoffet, slik at ervervet preferanse er gradvis dempes9. En viktig sak å vurdere er at atferdsendringer som dyret utstillinger under utryddelse (progressiv nedgang i tid brukt i narkotika-sammenkoblet batterirommet) kan skyldes nye læringsprosesser som konkurrerer med den forrige lærde svaret, eller på grunn av en nedgang i den interne motiverende tilstanden av emne3. Endelig vil reetablering av sted preferanse gjennom kontekst eller narkotika stikkordene være vår modell reinstatement1.

Administrere en grunning injeksjon av tilknyttede stoffet kan aktivere preferanse, som regnes som en reetablering av tilnærming til kontekstavhengig signaler. Stoffet grunning reinstatement oppstår på grunn av vedvarende minne behagelige effekten av stoffet, som indusert ute og motiverer dyr å søke miljømessige signaler knyttet til belønning.

Noen fordeler av CPP reinstatement modellen er at prosedyren er ikke-invasiv (kontrast selv administrasjonen, som krever kirurgi), rimelig og enkel. Dessuten, denne modellen har en godt kriterium gyldighet, som det etterligner godt hva som skjer i mennesker10,11, inducing reinstatement med stimuli som induserer tilbakefall, som re-eksponering mot narkotika12,13 eller understreke14.

Det er andre teknikker som utryddelse-reinstatement modell av intravenøs selv-administrasjonen. Her, trykk dyr en spak til selv-administrere stoffet, som tillater evaluering av operant responsen av dyr, compulsivity og motivasjon14,15,16. Den største fordelen med CPP over selv-administrasjonen prosedyrer er at CPP reinstatement anses å reflektere reaktivering av insentiv-motiverende verdien av sammenheng stimuli forbundet med stoffet, bestående av gjenopptreden av tilnærming virkemåten til sammenheng17. Videre kan ikke-stoff stimuli, som stress, også føre reinstatement18,19. For eksempel, beskrev en selv-administrasjonen studie ingen effekter på reinstatement av heroin i rotter etter en fot støt eller tilbakeholdenhet stress20. Forfatterne diskutert at det var mislykket fordi de stressors ble testet utenfor selv-administrasjonen kammeret i en annen sammenheng. Derimot når du bruker CPP modell av gjenoppretting, det var en klar gjeninnføring av morfin-indusert CPP etter benytter samme stressfaktorer, og brukes i en annen sammenheng som CPP og på forskjellige tider (0 og 15 minutter etter stress eksponering)18 .

Flere studier i litteraturen har vist ulike måter av narkotika og stress-indusert reinstatement. På den ene siden, har stoff-indusert reinstatement blitt rapportert i rotter og mus ved hjelp av morfin5,21,22,23, kokain24,25, amfetamin26, 27, etanol28,29og 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA)30. På den annen side, kan eksponering for stress være en avgjørende faktor i å narkotikamisbruk. Stress er kjent for å øke givende effektene av narkotika7,31,32 og deres rolle i tilbakefall er godt etablert33,34. For eksempel reinstates tap i sosial interaksjon med en conspecific morfin og kokain CPP18,19. I tillegg dyr utsatt for gjentatt sosiale tap er mer utsatt for betinget givende effekten av subthreshold doser kokain, og gjeninnsette preferanse med svært lave doser kokain7.

Programmet av CPP reinstatement modellen er en nyttig og følsom måte å evaluere sikkerhetsproblemet til å tilbakefall i dyr, og tillater vurdering av ulike subtile miljømessige manipulasjoner, som er de viktigste triggere som truer menneskets tilbakefall, som narkotika - eller stress-indusert reinstatement.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer med mus og omsorg overholdt nasjonale, regionale og lokale lover og regler, som er i samsvar med direktiv 2010/63/EU fra Europaparlamentet og Rådet for den 22 September 2010 på beskyttelse av dyr som brukes til vitenskaplige formål. Dyr bruk og omsorg komiteen av universitetet i Valencia godkjent stede protokollen.

1. materialer og oppsett for betinget sted preferanse:

  1. Håndtere mus 3 dager før testing for 1-2 min hver. Foten av halen skal fattast. Kroppen bør støttes hvis mulig. Dette gjøres å minimere smerte og ubehag når du håndterer et dyr og hindre forstyrrende variabler, som stress.
    Merk: 1 mannlige mus 60 dager gammelt (unge voksne) veiing 35-40 g var ansatt i stede eksperimenter. Stoff-indusert reinstatement kan utføres i mus av begge kjønn. Men om stress-indusert reinstatement, sosiale nederlag paradigmet er utformet bare for mannlige gnagere, som kvinner ikke indusere en aggressiv respons i bosatt mus.
  2. Sted condition, bruke identiske bokser med to identiske avdelinger (30.7 cm lang × 31,5 cm bredt × 34,5 cm høy) med en mindre sentrale gråsone (13,8 lang × 31,5 cm bredt × 34,5 høy).
    Merk: Rom har annen etasje teksturer og vegg farger (en glatt gulv i det svarte rommet og en grov etasje i den). Hvert kammer av CPP boksen inneholder fire infrarød lysstråler og seks sentrale batterirommet. Dette gjør opptak av avganger mellom rom og plasseringen av dyret.
  3. Sette opp rommet lysene (av eller senket) hver dag. Bruk røde lys (anbefalt), dyr ikke oppfatter det og det er dempes for eksperimentator (ca 40 lux målt på 1 m over gulvnivå).
  4. Konfigurere programmet til å registrere 15 min for pre- og post condition test (se Tabell for materiale for programvare) (figur 2)
  5. Forberede kokain løsningen kreves for hele eksperimentet. Oppløse kokainhydroklorid 0,9% NaCl (saltvann) i et volum på 0,1 mL/10 g kroppsvekt. Virvle blandingen og butikk på 4 ° C på slutten av dagen.
    Merk: Kokain konsentrasjoner kan variere etter studiens formål. Hvis målet er å evaluere subthreshold doser kokain, kan en 1 mg/kg konsentrasjon brukes, som er ineffektive i kontrollen dyr, som i tidligere studier24,35. Hvis en effektive dose er formålet, kan en 6 mg/kg konsentrasjon utvalgte, som er effektiv, men ikke få reinstatement24, eller en 25 mg/kg konsentrasjon, som er effektiv og induserer reinstatement av preferanse19.
  6. Test dyrene i deres mørke fasen og bruke samme for hvert dyr over dager.
  7. Bringe dyr hver dag til testing rom i burene sine hjem og la dem uforstyrret i 15 min som en habituering periode alle test-relaterte lyder.

2. test

  1. Oppkjøp
    Merk: Prosedyren sted condition, upartisk i første spontane preferanse, består av tre faser: før condition, condition og etter condition (figur 1).
    1. Før condition (Pre-C) (3 dager) (figur 2, Figur 3, Figur 4)
      Merk: Her, nøytral verdien av seksjonene i boksen CPP evalueres. Måle tid brukt i hver avdeling og senere sammenligne den med det i det samme rommet i post condition testen.
      1. Ta dyrene å test room og la dem habituated i 15 min.
      2. Kontroller at guillotines er fjernet fra buret.
      3. Konfigurere datamaskinen og programmet. Angi dyr IDer og trykk kommandoen "Trial" og "Start" (figur 2).
      4. Plasserer musen forsiktig i midten kammeret (grå rom) og la den testing rom med minimal støy.
      5. Bringe alle dyrene tilbake i burene sine hjem og lagre dataene når rettssaken er ferdig.
      6. Tillate mus til begge deler av apparatet i 15 min (900 s) per dag på 3 dager.
      7. Dag 3, skrive ned tid brukt i hver avdeling over en 900 s periode, og lagre den for tildelingen rom i neste fase (Figur 3).
      8. Tilordne halv dyrene i hver gruppe motta narkotika eller kjøretøy i enklave (f.ekssvart), og den andre halvparten i det andre rommet (f.ekshvite) (Figur 4).
        Merk: Den endelige fordelingen av dyrene må sørge for at halvparten av dyrene tilordnes opprinnelig ønsket rommet og den andre halvparten ikke-foretrukne rommet. I tillegg fikk halvparten av dyrene stoffet i enklave (for eksempel den svarte en) og den andre halvparten i den andre (i dette tilfellet den).
      9. Balanse score i gruppen i både rom og i hele grupper (test gruppe forskjeller med en variansanalyse (ANOVA)). Som omtrentlig veiledning, verdier skal rundt 360-370 s i Pre-C-testen (Figur 4). Merk: ingen vesentlig forskjell skal oppdages mellom tidsbruk i narkotika-sammen og kjøretøy-sammen seksjonene under Pre-C-testen.
      10. Ekskluder dyr som viser en sterk uvilje eller preferanse for noen kupé. Vurdere aversjon som bruker mindre tid enn 33% i rommet, og vurdere preferanser Når Dyret brukt flere 67% av den totale tiden i kupé.
    2. Condition (4 dager) (figur 5)
      1. Veie dyrene og bruke disse vektene for doser kokain i condition.
      2. Klargjør sprøyter med kokain eller saltvann basert på kroppen vekter.
      3. Injisere en musen samtidig intraperitoneally (ip) og plasser det straks forsiktig i det tilordnede svarte eller hvite rommet deres boksen.
      4. Etter en 4 h, injisere narkotika dosen umiddelbart før musen er begrenset narkotika-sammen-rommet i 30 min (figur 5).
      5. Alternative denne fremgangsmåten hver dag, begynner med kokain på dager 1 og 3, og saltvann på dager 2 og 4.
      6. Kontroller at confinement utføres i begge tilfeller ved å lukke giljotinen døren som skiller de to avdelinger, gjør det sentrale området utilgjengelig.
        Merk: I denne fasen er det ikke nødvendig å konfigurere PC-programmet.
    3. Etter condition (Post-C) (1 dag)
      1. Ta dyrene å test room og la dem habituated i 15 min.
      2. Fjerne giljotinen døren skille de to avdelinger.
      3. Konfigurere datamaskinen og programmet. Angi dyr IDer og trykk "start"-kommando.
      4. Registrere tiden som brukes av ubehandlet musene i hver avdeling i en 900 s observasjon periode.
      5. Når rettssaken er ferdig, bringe alle dyrene tilbake i burene sine hjem og lagre data.
      6. Vurdere at stoffet har indusert sted preferanse hvis tiden i narkotika-sammenkoblet rommet under Post-C er betydelig større enn i den Pre-C-testen. Hvis motsatt skjer, kan du vurdere en aversjon for narkotika-sammenkoblet batterirommet.
  2. Utryddelse
    1. Gjennomføre en ukentlig utryddelse økt i alle grupper/dyr som utviklet en preferanse for narkotika-sammenkoblet batterirommet.
    2. Plassere dyret i apparatet (uten guillotines) i 15 min (samme som pre- og Post-C tester) (figur 1).
      Merk: Hvis dosen ansatt i CPP er høy (25 mg/kg), utføre 1 utryddelse økt per uke. Hvis en subthreshold dose er brukt (1 mg/kg), deretter utføre 2 utryddelse økter per uke (f.eks mandag og torsdag).
    3. Vurdere preferanse slukket når data fra utryddelse testen ikke viser forskjellene med hensyn til den Pre-C-testen, men de viser forskjellene med hensyn til den Post-C-testen.
    4. Gjenta testen 24 timer senere for å bekrefte utryddelse.
  3. Gjenoppretting av CPP
    1. Priming-indusert reinstatement
      1. Evaluere effekten av en grunning dose av kokain 24 timer etter utryddelse er bekreftet.
        Merk: Grunning doser er halv forrige dose som dyret har fått under condition. Reinstatement testen gjennomgår den samme protokollen som Pre-C og Post-C tester, bortsett fra at dyrene få dosen av kokain i en ikke-kontingent sted 15 min før testen. Effekten av stoffet grunning i inducing reinstatement kan forsterkes etter gjentatte utryddelse/gjeninnsettelse erfaringer23, selv om rekkefølgen av doser ikke synes å spille en rolle i resultatene innhentet36.
      2. Ta dyrene til et annet rom testing rom (ikke-kontingenten sted) (figur 6).
      3. Injisere dem med halv forrige dose av kokain (f.ekshvis dyrene var betinget med 25 mg/kg kokain, en grunning dose ville være 12.5 mg/kg).
      4. Bringe dem tilbake til deres vivarium i 15 min.
      5. Ta dem inn i testing rom og plasserer dyrene i apparatet umiddelbart (uten giljotinen dørene skille seksjonene) i 15 min (samme som den pre og Post-C tester).
      6. Vurdere forskjellen i sekunder mellom tidsbruk i narkotika-sammenkoblet rommet under siste utryddelse økten og Reinstatement testen som et mål på graden av gjenoppretting av fortrinnsretten av stoffet.
      7. Gjenta utryddelse-reinstatement hver gang med minkende doser det er bekreftet for å være ineffektiv.
        Merk: En saltvann injeksjon kontroll kan brukes til å styre kapasiteten av kokain grunning (og ikke av injeksjon i seg selv) å indusere reinstatement.
    2. Stress-indusert reinstatement
      1. Vurdere effekten av en stress-indusert reinstatement 24 timer etter utryddelse er bekreftet
        Merk: Reinstatement testene er de samme som utføres i Post-C (gratis ambulation i 15 min), bortsett fra at dyrene er testet 15 min etter sosiale tap i en agonistic møte (figur 6)
      2. Ta dyrene til et annet rom fra CPP rommet.
      3. Plass eksperimentelle musen med en aggressiv motspiller sex matchet av samme alder og kroppsvekt i plast buret (figur 6).
        Merk: Agonistic møtet består av 10 min test i nøytral gjennomsiktig plast bur (23x13.5x13cm) med et nederlag resultat for eksperimentell musen. For å forberede aggressiv motstanderen, først isolere forskjellige dyr som passer i alder og kroppen vekt som eksperimentelle musene i 3 uker. Trene dem til å erverve kamp erfaring og teste dem å ha høye nivåer av aggressiv territorielle atferd. For å få fra aggressiv Art, mus må være isolert i minst 3 uker og trent i aggressiv og angripe atferd. Dyr er opplært i nøytrale omgivelser, overfor parvis. Vi la dem biter motstanderen 2 eller 3 ganger og få dem ut av buret, alltid ender trening før av to mus viser underkastelse, slik at opplevelsen av møtet forsterker aggressiv atferd. Etter lider aggresjon (trussel og angrep fra den aggressive conspecific), bør eksperimentelle mus presentere unngåelse/flykte og defensive/underdanig atferd. Vilkåret er å vedta en bestemt holdning tap, preget av underdanig stående og halte forepaws, oppadgående vinklet hodet, tilbaketrukket ører (figur 6). Ifølge Burke et al., 2016, vi anser at det sosiale møtet avsluttes tidligere hvis inntrengeren viser en underdanig supine holdning til > 8 s eller hvis 13 angrepet biter oppstod. Et annet alternativ til skjermen dyr uten risiko for betydelig skade kunne til tempo dyret i mesh kabinett med et hull, ikke stor nok for begge dyr skjedde.  Aggresjon kan registreres uten å utsette dyr til direkte aggressiv atferd.  Hvis et dyr opprettholder en skade med et sår 1cm i diameter og/eller direkte eksponering av muskler, det er utelukket fra studien og burde være euthanized.
      4. Etter 10 min av agonistic møte, ta musene testing rommet og plasserer dyrene i CPP apparatet umiddelbart (uten giljotinen dørene skille seksjonene) i 15 min (samme som den pre og Post-C tester).

3. statistisk analyse

Merk: Ideelt samplingsstørrelse bør være minst 15 dyr per gruppe.

  1. Analysere mellomtiden brukte i narkotika-sammenkoblet rommet av gruppen ved hjelp av en blandet VARIANSANALYSE med en mellom variabel, behandling, med to nivåer (kontrollgruppen, forsøksgruppen, eksempel på to grupper er i figur 7 c), og en i variabel-dager, med 2 nivåer (Pre-C og Post-C).
    Merk: I kontrollgruppen, dyr får stoffet men har ingen miljømessige manipulasjoner. På den annen side, i forsøksgruppen er dyrene utsatt for annerledes miljømessig vilkårene. Sammenligne tidsbruk i narkotika-sammenkoblet skuffen på Post-C dag med respekt Pre-C test for å se om det er noen betydelige forskjeller i sensitivitet til stoffet.
  2. I tillegg Utfør Bonferroni innlegg-hoc analyser for å sjekke noen av de betydelige scorene.
  3. Analysere data relatert til utryddelse og reinstatement verdiene i gruppene som utviklet preferanse med Student´s t-tester til å fortsette med utryddelse-gjenoppretting prosedyren i løpet av eksperimentet, men i siste øyeblikk, analysere dem med en VARIANSANALYSE med en innen variabel (dager) med mange nivåer, avhengig av hver gruppe.
    Merk: Når sammenligninger er økt, de som vil være betydelig tilfeldigvis også økt. Som sådan, for å unngå å få falske positiver (Type 1 feil) korrekt vi"" p-verdien og dermed gjør testen mer konservative med Bonferroni korreksjon for flere t-tester. Men for reinstatement testen gjøres sammenligningen mellom reinstatement testen og den siste utryddelse testen. Derfor er det ikke nødvendig for korreksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Først er representant resultatet fra grunning og stress-indusert gjenoppretting vist i figur 7 med voksen OF1 mannlige mus.

Dataene i figur 7AB representerer tid tilbrakt i narkotika-sammen compartment(s) i den pre og Post-C-testen ble analysert med et gjentatte measures VARIANSANALYSE med i fag variabel dager (sammenligne Pre-C og Post-C). Resultatene viste en signifikant effekt av variabelt dager [F(1,34) = 51.179, p < 0,001], som alle dyr utviklet en preferanse i Post-C dag sammenlignet med Pre-C. Alle dyrene var aircondition med 25 mg/kg kokain og når utryddelse ble oppnådd, en gruppe fikk en grunning dose 12.5 mg/kg kokain teste gjenoppretting (figur 7a) og den andre ble utsatt for en samhandling der den eksperimentelle dyret ble beseiret av en aggressiv motspiller (figur 7b). 15 min etter to hendelsene, dyr ble testet i deres tilhørende CPP-boksen.

Priming-indusert gjenoppretting (figur 7a) ble utsatt til senere redusere grunning doser (halv forrige en) til en grunning dose er bekreftet for å være ineffektiv. Doser var: 12,5, 6.25, 3.125 og 1.56 mg/kg kokain. Student´s t-test avslørte en betydelig effekt på 12,5 mg/kg kokain gjenoppretting med hensyn til utryddelse økten (t-statistikken (t) = 20.589, frihetsgrader (d.f.) = 17; p < 0,001) og påfølgende doser (6,25 mg/kg: t = 18.356; 3,125 mg/kg: t = 14.260; 1.56 mg/kg: t = 16.934 d.f. = 17; p < 0,001). Priming med 0.78 mg/kg ikke få gjenoppretting.

Om stress-indusert gjenoppretting (se figur 7b), blir utsatt for en aggressiv dyr og beseiret 15 min før testen fører til gjeninnføre det tidligere slukket preferansen (t = 26.810, d.f. = 15; p < 0,001)19 .

Andre miljømessige manipulasjoner, som lider gjentatte sosiale nederlag CPP prosedyren, endre givende effekten av subthreshold doser kokain (figur 7 c). A blandet VARIANSANALYSE med den mellom variabel "stress" og i variabelen "dager" ble utført, og det var en signifikant effekt av samspillet Stress x dager [F(1,29) = 4.144; p < 0,05]. Eneste sosialt beseiret dyr utstilt preferanse for narkotika-sammenkoblet rommet med en subthreshold dose av kokain, som har vist seg å være ineffektiv i standard dyr7. I tillegg etter utryddelse av preferanse, sosialt beseiret dyr gjeninnsatt deres preferanse med bare 0,5 mg/kg kokain priming (t = 25.484 d.f. = 17; p < 0,001).

Andre, som et negativt resultat, kan vi se hvordan reinstatement kan forebygges ved en positiv sosial interaksjon med et mildt conspecific (figur 8a). Derfor er det viktig å vurdere om dyr beseiret eller ikke etter et sosialt møte37.

Et annet eksempel på negative resultater som hindrer reinstatement kan ernæringsmessige endringer, som et fettrikt velsmakende kosthold inntak. Først ANOVA analyse viste en effekt av variabelt dager [F(1,26) = 21.527; p <.0.001], som begge grupper utviklet preferanse for narkotika-sammenkoblet batterirommet (p < 0,01) (figur 8b). Etter utryddelse viser våre resultater at dyr slått til fettrikt kosthold etter Post-C-testen redusert sin følsomhet til narkotika-grunning indusert reinstatement, som de ikke gjeninnsette preferanse med 6.25 mg/kg kokain dose38.

Figure 1
Figur 1: eksperimentelle prosedyren for betinget sted preferanse. Det består av tre faser: før condition, condition og etter condition. Det er 4 condition dager der prosedyren er vekslet hver dag, begynner med kokain på dager 1 og 3 og kjøretøy på dager 2 og 4. Deretter utføres utryddelse og reinstatement økter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: programvare bruk økter for Pre-C og Post-C tester hvor tid brukt i hver avdeling og mange poster registreres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Data etter Pre-C og Post-C test Her, registrere data fikk under testen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: upartiske tildeling av dyr til seksjonene for neste fase av condition. Ta data fra den siste Pre-C test dagen i de hvite og svarte avdelinger. Halv dyrene er tilordnet motta stoffet eller kjøretøy i enklave (svart eller hvitt) og den andre halvparten i det andre rommet. Ekskludere dyr som viser sterk uvilje eller preferanse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: siste tildeling av kjøretøy og kokain sammen økter. Denne illustrasjonen viser veksling på motstandere. På dager 1 og 3, et dyr (f.eks1.1) er første utsatt for kokain-sammenkoblet batterirommet (den) og etter fire timer, er utsatt for kjøretøy-sammenkoblet batterirommet (sort ettall). Rekkefølgen på motstandere er invertert dager 2 og 4, og dyret er først utsatt kjøretøy-sammen (svart) rommet og fire timer, kokain-sammen (hvit) rommet. Denne prosedyren er objektiv og balansert, samtidig condition økter kan gjennomføres med to dyr med begge deler av samme boks (f.eksdyr 1.1 og 2.4, 3.1 og 1.3), som tillater oss å redusere tid viet til den eksperimentelle prosedyren. Merk at disse parene av dyr følger motsatt rekkefølge motstandere condition fasen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: to modeller av reinstatement. (en) grunning-indusert reinstatement og (b) stress-indusert reinstatement. (en) dyr får en sprøytebruk i et ikke-kontingenten rom og er brakt til vivarium; 15 min senere de er testet i boksen CPP. (b) dyr blir slått i et agonistic møte i en ikke-kontingenten rom for 10 min, og etterpå de er testet i boksen CPP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: representant positive resultater. Grunning (en) og stress-indusert (b) gjenoppretting etter 25 mg/kg kokain CPP. (c) effekter av sosiale tap på givende effekter av subthreshold doser kokain (1 mg/kg). Stolper representerer mean (± SEM) tiden i sekunder som er brukt i narkotika-sammenkoblet rommet under pre condition (hvit), etter condition (svart), siste utryddelse økten (lys grå) og gjenoppretting (mørk grå). Reinstatement testen ble evaluert 15 min etter en grunning dose halv forrige dose mottatt. * p < 0,05; ** p < 0.01; p < 0,001 betydelig forskjell vs Pre-C (ANOVA med et i-fag variabel dager (sammenligne Pre-C og Post-C) eller tidligere utryddelse økten (Student t-test). Disse tallene er endret 7,19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: representant negative resultater. Effekter av beskyttende miljømessige manipulasjoner på givende effekter av kokain. (en) virkningene av en positiv sosial interaksjon før gjenoppretting test. (b) effekter av et fettrikt kosthold under hele utryddelse periode og gjenoppretting. Kontrollgruppen ble matet en standard diett (13% av kcal fra fett, 67% kcal fra karbohydrater og 20% kcal fra protein, 2,9 total kcal/g) og gruppen fettrikt kosthold (45% kcal fra fett, 36% kcal fra karbohydrater og 19% kcal fra protein, 4.6 total kcal/g). Stolper representerer mean (± SEM) tiden i sekunder som er brukt i narkotika-sammenkoblet rommet under pre condition (hvit), etter condition (svart), siste utryddelse økten (lys grå) og gjenoppretting (mørk grå). Reinstatement testen ble evaluert 15 min etter en grunning dose halv forrige mottatt dose. * p < 0,05; ** p < 0.01; betydelig forskjell vs Pre-C (ANOVA med et i-fag variabel dager (sammenligne Pre-C og Post-C) eller tidligere utryddelse økten (Student t-test). Disse tallene er endret fra 37,38. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hovedpoenget narkotika avhengighet forskning er utviklingen av behandlingsmetoder som reduserer craving, og dermed redusere sårbarheten for tilbakefall. Takket være reinstatement modell av CPP paradigmet er det mulig å studere påvirkning av ulike fremgangsmåter og miljømessige faktorer som modulerer relapse, som er en prioritet for fremtidig forskning. Det er noen viktige punkter å vurdere, som CPP paradigmet er en test som er svært følsom for miljøfaktorer.

Endringer og feilsøking: CPP versjonen av reinstatement modellen bør endres avhengig av stoffet av interesse. Det finnes ulike faktorer som kan påvirke omfanget av betinget innstilling, for eksempel varighet og antall condition økter. Antall tilknytninger vanligvis varierer fra en til seks, med fire er den vanligste. Varigheten av condition testene er etablert basert på egenskapene til stoffet og dens farmakokinetikken.

CPP studier innebære vanligvis mange prøvelser, så det er nyttig å bruke protokoller som reduserer tiden som kreves. Én måte å oppnå dette er å redusere antallet forsøk å utføre to økter condition per dag, som er vist i stede protokollen. I dette tilfellet er det nødvendig å sikre at effekten av stoffet fra forrige økt ikke dra til denne andre økten39, derfor fire timeintervallet mellom kokain - kjøretøy økten ble valgt. For eksempel skal tidspunktet for sammenkoblingen når det gjelder kokain i condition fasen hver 24 timer for 4 dager med paring varighet 30 min. Tvert imot, time course of condition prosedyren av etanol skal hver 48t, totalt 8 dager, 1 condition økt per dag, og vekslende kjøretøy og EtOH, endelig har totalt 4 EtOH motstandere. Etanol sammenkobling bør ha en kort varighet, for eksempel 5 minutter, som mer tid kunne produsere aversive stater. Effektive doser varierer fra 1-2 g/kg og subthreshold doser er 0,75 g/kg40. Priming-indusert reinstatement skal halv forrige dose mottatt, og apparatet må være den samme.

Imidlertid kan velge å gjøre 1 eller 2 økter en dag påvirke resultatene i noen spesielle narkotiske stoffer. For eksempel når det gjelder MDMA-indusert CPL med to økt protokollen, er betinget preferanse i post condition ikke observert, mens dette kan oppnås ved å utføre en enkelt forening hver dag30, så MDMA bør også administreres hver 48t, men varigheten av condition økten skal 30 min.

Det er to hovedmetoder for utryddelse som kjøres etter etablering av CPP, enten daglige injeksjoner av kjøretøy avgrense dyret i både tidligere narkotika og kjøretøy aircondition rom41,42, 43, eller ved å gjenta CPP testen, la dyrene utforske tre seksjonene uten giljotinen til preferanse ikke er observert7,18,30,38. I stede protokollen, vi ansatt sistnevnte, fordi det er en type av spontane utryddelse uten farmakologiske eller atferdsmessige manipulasjon gjelder condition (mer lik den forekommer i menneskelig narkomane), men begge metodene er akseptable og gyldig, som litteratur har vist i år.

Begrensninger av teknikken: Den viktigste begrensningen for CPP paradigmet og reinstatement modellen er at de er svært følsomme for miljømessige endringer. Rom og vivarium bør derfor holde stabile og konstant under hele prosedyren. Forsiktighet bør tas til aspekter som bor i samme rom med kamerater av det motsatte kjønnet, bur med gjenstander som hjul som gjør en bestemt og konstant støy, eller betingelser. I tillegg kontrollere disse variablene, er rollen av forskeren også kritisk, som de kan føre til en økning i dyrenes stressnivå og påvirke resultatene.

Betydning når det gjelder eksisterende metoder: Om andre metoder, i CPP versjon av reinstatement modellen, er forskeren den som administrerer stoffet til dyret, kontrast selv-administrasjonen paradigmer som evalueres animal´s motivasjon å ta stoffet. Det er viktig at vi ta hensyn. Dette betyr at vi ikke vurderer motivasjon gjennom et operant svar eller primære forsterkende virkningene av stoffet. Som vi nevnte, er CPP nyttig modell å vurdere den kritiske rollen som miljømessige stikkordene spille på tilbakefall i rusmisbruk lidelser, som faktisk er de viktigste faktorene som modulerer tilbakefall hos mennesker.

Fremtiden programmer: Fremtidige anvendelser av CPP reinstatement modellen bør rettes til den såkalte inkubasjonstiden for craving, som består av en progressiv økning i stikkordet reaktivitet etter avholdenhet av narkotika, etterligne craving hos mennesker. I dag, er lite kjent om dette i CPP paradigmet. For noen år siden, antydet bare én studie at CPP kan også måle denne inkubering periode44. Det ble nylig vurdert hvorvidt miljømessige stikkordene koblet til morfin i CPP kan øke de atferdsmessige respons over uttak perioden45. Denne studien fant at antall oppføringer å CPP seksjonene var økende over tid, som gjenspeiler inkubasjonstiden for ute og foreslå at belønning minner og narkotika craving kan skilles i CPP paradigmet.

Critical steps: det er flere viktige trinn i protokollen. For å bekrefte at dyr gjeninnsatt deres preferanse, bør utryddelse data reflektere en ekte utryddelse av preferanse, blir bekreftet før reinstatement testen. Data fra utryddelse testen skal ikke vise forskjellene med hensyn til den Pre-C-testen men med hensyn til den Post-C-testen.

Angående det sosiale stress-indusert reinstatement versjonen, vi bør har bekreftet at dyret er faktisk beseiret, siden en positiv sosiale møte som ikke slutter med tap viser beskyttende effekten blokkerer gjenoppretting av stedet preferanse for kokain. Hvis forsøksdyr ikke er beseiret, utelukkes fra studien. Vi anbefaler opptak og evaluere agonistic møtet, måler ventetiden på den aggressive atferden eller hengivelse atferd, antall angrep og tid brukt i hver av de virkemåtene. Vi anser at det eksperimentelle dyr er beseiret når den mottar minst 2 angrep (biter) og viser tegn til innlevering (som vist i figur 6). I alle tilfeller varer møtet 10 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Generalitat Valenciana, PROMETEOII / 2014/063; Helsedepartementet, sosiale tjenester og likestilling. Delegasjonen av regjeringen for den nasjonale narkotikaplan, forskningsprosjekter på narkotika avhengighet, 2014I007; Departementet for økonomi og konkurranseevne (MINECO), helse Institutt Carlos III, nettverk vanedannende lidelser (RTA) RD12 / 0028/0005 og RD16 / 0017/0007 og EU, ble tildelt und midler "una manera de hacer Europa" og PSI2014-51847-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MONPRE 2Z software CIBERTEC S.A., Spain N/A
Identical Plexiglas boxes with two equal sized compartments separated by a grey central area. CIBERTEC S.A., Spain N/A The compartments have different colored walls (black vs white) and distinct floor textures (fine grid in the black compartment and wide grid in the white one). All boxes are equipped with four infrared light beams in each compartment of the box and six in the central area which allow the recording of the position of the animal and its crossings from one compartment to the other.
Cocaine hydrochloride Laboratorios Alcaliber S.A., Madrid, Spain N/A
Animals: mice of the OF1 outbred strain Charles River, Barcelona Spain N/A Male mice who arrive to the laboratory on PND 42 and on PND 60 perform the CPP test. These animals are specially indicated for social defeat and aggression models.
Standard Diet- Teklad Global Diet 2014 Supplied by Harlan Laboratories Models, S. L. (Barcelona, Spain) 13 kcal % fat, 67 kcal % carbohydrates and 20% kcal protein; 2.9 kcal/g
High fat diet TD.06415 45 kcal % fat, 36 kcal % carbohydrates and 19% kcal protein; 4.6 kcal/g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bardo, M., Bevins, R. Conditioned place preference: what does it add to our preclinical understanding of drug reward? Psychopharmacology. 153, 31 (2000).
  2. Tzschentke, T. M. Review on CPP: Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addiction biology. 12 (3-4), 227-462 (2007).
  3. Aguilar, M. A., Rodríguez-Arias, M., Miñarro, J. Neurobiological mechanisms of the reinstatement of drug-conditioned place preference. Brain research reviews. 59 (2), 253-277 (2009).
  4. García-Pardo, M. P., Roger-Sánchez, C., De la Rubia Ortí, J. E., Aguilar, M. A. Animal models of drug addiction. Adicciones. 12 (0), 823 (2017).
  5. Manzanedo, C., Aguilar, M. A., Rodrı́guez-Arias, M., Miñarro, J. Effects of dopamine antagonists with different receptor blockade profiles on morphine-induced place preference in male mice. Behavioural brain research. 121 (1), 189-197 (2001).
  6. Robbins, T. W. The acquisition of responding with conditioned reinforcement: effects of pipradrol, methylphenidate, d-amphetamine, and nomifensine. Psychopharmacology. 58 (1), 79-87 (1978).
  7. Montagud-Romero, S., Nuñez, C., Blanco-Gandia, M. C., Martínez-Laorden, E., Aguilar, M. A., Navarro-Zaragoza, J., et al. Repeated social defeat and the rewarding effects of cocaine in adult and adolescent mice: dopamine transcription factors, proBDNF signaling pathways, and the TrkB receptor in the mesolimbic system. Psychopharmacology. , (2017).
  8. Pavlov, I. P. Conditioned Reflexes. , Oxford University Press. Oxford. (1927).
  9. Yahyavi-Firouz-Abadi, N., See, R. E. Anti-relapse medications: preclinical models for drug addiction treatment. Pharmacology & therapeutics. 124 (2), 235-247 (2009).
  10. Epstein, D. H., Preston, K. L., Stewart, J., Shaham, Y. Toward a model of drug relapse: an assessment of the validity of the reinstatement procedure. Psychopharmacology. 189 (1), 1-16 (2006).
  11. Geyer, M. A., Markou, A. Animal models of psychiatric disorders. Psychopharmacology: the Fourth Generation of Progress. Bloom, F. E., Kupfer, D. J. , Raven. New York. 787-798 (1995).
  12. De Wit, H. Priming effects with drugs and other reinforcers. Experimental and Clinical Psychopharmacology. 4 (1), 5 (1996).
  13. Wang, B., Luo, F., Zhang, W. T., Han, J. S. Stress or drug priming induces reinstatement of extinguished conditioned place preference. Neuroreport. 11 (12), 2781-2784 (2000).
  14. Shalev, U., Erb, S., Shaham, Y. Role of CRF and other neuropeptides in stress-induced reinstatement of drug seeking. Brain research. 1314, 15-28 (2010).
  15. Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology. 229 (3), 453 (2013).
  16. Weiss, F. Neurobiology of craving, conditioned reward and relapse. Current opinion in pharmacology. 5 (1), 9-19 (2005).
  17. Mueller, D., Stewart, J. Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction. Behavioural brain research. 115 (1), 39-47 (2000).
  18. Ribeiro Do Couto, B., Aguilar, M. A., Manzanedo, C., Rodriguez-Arias, M., Armario, A., Miñarro, J. Social stress is as effective as physical stress in reinstating morphine-induced place preference in mice. Psychopharmacology. 185 (4), 459-470 (2006).
  19. Titomanlio, F., Manzanedo, C., Rodríguez-Arias, M., Mattioli, L., Perfumi, M., Miñarro, J., Aguilar, M. A. Rhodiola rosea impairs acquisition and expression of conditioned place preference induced by cocaine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , (2013).
  20. Shalev, U., Highfield, D., Yap, J., Shaham, Y. Stress and relapse to drug seeking in rats: studies on the generality of the effect. Psychopharmacology. 150 (3), 337-346 (2000).
  21. Lu, L., Ceng, X., Huang, M. Corticotropin-releasing factor receptor type 1 mediates stress-induced relapse to opiate dependence in rats. Neuroreport. 11 (11), 2373-2378 (2000).
  22. Ribeiro Do Couto, B., Aguilar, M. A., Manzanedo, C., Rodriguez-Arias, M., Miñarro, J. Reinstatement of morphine-induced conditioned place preference in mice by priming injections. Neural Plast. 10, 279-290 (2003).
  23. Do Couto, B. R., Aguilar, M. A., Rodriguez-Arias, M., Miñarro, J. Long-lasting rewarding effects of morphine induced by drug primings. Brain research. 1050 (1), 53-63 (2005).
  24. Maldonado, C., Rodriguez-Arias, M., Castillo, A., Aguilar, M. A., Miñarro, J. Gamma-hydroxybutyric acid affects the acquisition and reinstatement of cocaine-induced conditioned place preference in mice. Behav. Pharmacol. 17, 119-131 (2006).
  25. Maldonado, C., Rodriguez-Arias, M., Castillo, A., Aguilar, M. A., Miñarro, J. Effect of memantine and CNQX in the acquisition, expression and reinstatement of cocaine-induced conditioned place preference. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 31, 932-939 (2007).
  26. Cruz, F. C., Marin, M. T., Planeta, C. S. The reinstatement of amphetamine-induced place preference is long-lasting and related to decreased expression of AMPA receptors in the nucleus accumbens. Neuroscience. 151, 313-319 (2008).
  27. Li, S. M., Ren, Y. H., Zheng, J. W. Effect of 7-nitroindazole on drug-priming reinstatement of D-methamphetamine-induced conditioned place preference. Eur. J. Pharmacol. 443, 205-206 (2002).
  28. Font, L., Miquel, M., Aragon, C. M. Involvement of brain catalase activity in the acquisition of ethanol-induced conditioned place preference. Physiol. Behav. 93, 733-741 (2008).
  29. Roger-Sánchez, C., Aguilar, M. A., Rodríguez-Arias, M., Aragon, C. M., Miñarro, J. Age-and sex-related differences in the acquisition and reinstatement of ethanol CPP in mice. Neurotoxicology and teratology. 34 (1), 108-115 (2012).
  30. Daza-Losada, M., Do Couto, B. R., Manzanedo, C., Aguilar, M. A., Rodríguez-Arias, M., Miñarro, J. Rewarding effects and reinstatement of MDMA-induced CPP in adolescent mice. Neuropsychopharmacology. 32 (8), 1750-1759 (2007).
  31. Will, M. J., Watkins, L. R., Maier, S. F. Uncontrollable stress potentiates morphine's rewarding properties. Pharmacol. Biochem. Behav. 60, 655-664 (1998).
  32. Der-Avakian, A., Will, M. J., Bland, S. T., Deak, T., Nguyen, D. T., Schmid, M. J., Spencer, R. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Surgical and pharmacological suppression of glucocorticoids prevents the enhancement of morphine conditioned place preference by uncontrollable stress in rats. Psychopharmacology. 179, 409-417 (2005).
  33. Sinha, R. How does stress increase risk of drug abuse and relapse? Psychopharmacology. 158, 343-359 (2001).
  34. Lu, L., Shepard, J. D., Hall, F. S., Shaham, Y. Effect of environmental stressors on opiate and psychostimulant reinforcement, reinstatement and discrimination in rats: a review. Neurosci. Biobehav. Rev. 27, 457-491 (2003).
  35. Vidal-Infer, A., Arenas, M. C., Daza-Losada, M., Aguilar, M. A., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. High novelty-seeking predicts greater sensitivity to the conditioned rewarding effects of cocaine. Pharmacol Biochem Behav. 102, 124-132 (2012).
  36. Reguilón, M. D., Montagud-Romero, S., Ferrer-Perez, C., Roger-Sánchez, C., Aguilar, M. A., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. Dopamine D2 receptors mediate the increase in reinstatement of the conditioned rewarding effects of cocaine induced by acute social defeat. European Journal of Pharmacology. 799, 48-57 (2017).
  37. Ribeiro Do Couto, B., Aguilar, M. A., Lluch, J., Rodríguez-Arias, M., Miñarro, J. Social experiences affect reinstatement of cocaine-induced place preference in mice. Psychopharmacology. 207 (3), 485-498 (2009).
  38. Blanco-Gandía, M. C., Aracil-Fernández, A., Montagud-Romero, S., Aguilar, M. A., Manzanares, J., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. Changes in gene expression and sensitivity of cocaine reward produced by a continuous fat diet. Psychopharmacology. 234 (15), 2337-2352 (2017).
  39. Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference paradigm: a comprehensive review of drug effects, recent progress and new issues. Progress in neurobiology. 56 (6), 613-672 (1998).
  40. Blanco-Gandía, M. C., Ledesma, J. C., Aracil-Fernández, A., Navarrete, F., Montagud-Romero, S., Aguilar, M. A., Manzanares, J., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. The rewarding effects of ethanol are modulated by binge eating of a high-fat diet during adolescence. Neuropharmacology. 121, 219-230 (2017).
  41. Itzhak, Y., Martin, J. L. Cocaine-induced conditioned place preference in mice: induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants. Neuropsychopharmacology. 26 (1), 130-134 (2002).
  42. Kreibich, A. S., Blendy, J. A. cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement. Journal of Neuroscience. 24 (30), 6686-6692 (2004).
  43. Zavala, A. R., Weber, S. M., Rice, H. J., Alleweireldt, A. T., Neisewander, J. L. Role of the prelimbic subregion of the medial prefrontal cortex in acquisition, extinction, and reinstatement of cocaine-conditioned place preference. Brain research. 990 (1), 157-164 (2003).
  44. Orsini, C., Bonito-Oliva, A., Conversi, D., Cabib, S. Genetic liability increases propensity to prime-induced reinstatement of conditioned place preference in mice exposed to low cocaine. Psychopharmacology. 198 (2), 287-296 (2008).
  45. Sun, Y., Pan, Z., Ma, Y. Increased entrances to side compartments indicate incubation of craving in morphine-induced rat and tree shrew CPP models. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 159, 62-68 (2017).

Tags

Atferd problemet 136 betinget plassere preferanse kokain gjenoppretting stress mus narkotika-søker
Gjenoppretting av narkotika-søker i mus bruker betinget sted preferanse paradigmet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blanco-Gandía, M. C., Aguilar,… More

Blanco-Gandía, M. C., Aguilar, M. A., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. Reinstatement of Drug-seeking in Mice Using the Conditioned Place Preference Paradigm. J. Vis. Exp. (136), e56983, doi:10.3791/56983 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter