Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Återinförande av drogsökande i möss med betingad plats preferens Paradigm

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/56983
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Unidad de Investigación Psicobiología de las Drogodependencias, Departamento de Psicobiología, Facultad de Psicología, Universitat de València

Summary

Det här protokollet beskriver luftkonditionerade rum preferens (CPP) som modell för återfall. Denna procedur tillåter mätning av återfall hos försöksdjur, med tanke på effekten av drogen-associerade miljö referenser som sug och återfall i abstaining missbrukare är för närvarande i fokus för drogmissbruk behandlingsprogram.

Abstract

Protokolls beskriver luftkonditionerade rum preferens (CPP) som en modell av återfall i drogberoende. I denna modell, djur utbildas först att förvärva en betingad plats preferens i drog-parat kupé, och efter efter Konditioneringsprovning, de utför flera sessioner för att släcka den etablerade preferensen. CPP medger utvärdering av konditionerat givande effekterna av droger med miljöförstöring ledtrådar. Utsläckt CPP kan sedan återställas kraftfullt genom icke-kontingent administrationen av en priming-dos av drogen och exponering för stressande stimuli. Båda metoderna kommer att förklaras här. När djuret reinitiates den beteendemässiga svaren, anses ett återinförande av konditionerat belöningen ha ägt rum.

De främsta fördelarna med detta protokoll är att det är icke-invasiv, billig och enkel med bra giltighetskriterierna. Det kan dessutom studiet av olika miljömässiga manipulationer, som stress eller diet, som kan modulera återfall i drogen söker beteenden. En begränsning är dock att om forskaren syftar till att utforska motivation och primära förstärkande effekterna av drogen, bör det kompletteras med självadministrering förfaranden, eftersom de innebär operant Svaren av djur.

Introduction

Luftkonditionerade rum preferens (CPP) paradigm erbjuder ett enkelt sätt att utvärdera betingade belöningen induceras av olika stimuli1,2, och har använts i stora drag att studera luftkonditionerade givande effekterna av beroendeframkallande droger3 . Den är baserad på Pavlovian luftkonditionering, utvärdera motiverande värdet av drogen-associerade miljömässiga ledtrådar för att upprätthålla beroendeframkallande beteende4. I denna modell, miljömässiga cues förvärva sekundär apéritivo fastigheter (betingad givande effekter) när den är ihopparad med en primär förstärkare3. Till exempel en från början neutral plats (till exempel färgen på ett fack i CPP buren) är parad med specifika effekter av ett läkemedel för missbruk under några luftkonditionering sessioner5, medan ett annat fack är associerad med injektion av ett fordon. Efter luftkonditionering, om djuret tillbringar mer tid i kupén tidigare associerade med drogen, förutsätts det att CPP har utvecklat3. Inrättandet av preferensen uppnås när djuret ger ett positivt värde för de miljömässiga signaler kopplade till drogen, vilket är den primära förstärkare. Följaktligen kommer djur utföra beteendemässiga drogsökande Svaren svar på dessa kontextuella ledtrådar6. CPP modellen medger utvärdering av de belönande egenskaperna hos subthreshold doser av läkemedlet, visar om djur i ett specifikt tillstånd (t.ex., efter att ha lidit av sociala nederlag tidigare) är mer sårbara och känsliga för doser som är inte effektivt i naiva djur7.

CPP modellen har också använts för att utvärdera utrotning/återställande som en djurmodell att studera återfall3, vilket är syftet med detta protokoll. Det finns tre olika faser: förvärv, utrotning och återanställning (figur 1). I CPP återanställning modellen, djur först skaffa CPP för en drog-parat kupé, och sedan de utför flera utrotning sessioner. Vi definierar utrotning eftersom det ögonblick där djuret minskar dess beteendemässiga Svaren för tillnärmning till luftkonditionerade givande stimulansåtgärder som har varit bort (t.ex., drogen)8. Under den utrotning sessioner utforska djur avdelningarna i avsaknad av drogen, så att förvärvade preferensen är successivt försvagade9. En viktig fråga att överväga är att de beteendeförändringar som djuret uppvisar under utrotning (progressiva minskningen av den tid som tillbringas i drog-parat facket) kan bero på nya lärprocesser som konkurrerar med den tidigare inlärda svaren, eller på grund av en minskning av det interna motiverande tillståndet för det ämne3. Slutligen, reestablishmenten av inställningen plats genom sammanhang eller drogen ledtrådar skulle vara vår modell av återanställning1.

Injektionen en priming av associerade drogen kan återinföra preferensen, som anses vara en reestablishment av tillnärmning till kontextuella ledtrådar. Drogen priming återanställning uppstår på grund av ett envist minne av lustfyllt effekterna av drogen, vilket inducerad begäret och motiverar djur att söka miljömässiga ledtrådar relaterade till belöning.

Några fördelar med CPP återanställning modellen är att förfarandet är icke-invasiv (motsats till självadministrering, som kräver kirurgi), billig och enkel. Denna modell har dessutom ett bra kriterium giltighet, eftersom det härmar väl vad som sker i människor10,11, förmå återanställning med stimuli som inducerar återfall, såsom re-exponering till drogen12,13 eller betona14.

Det finns andra tekniker såsom utrotning – återinförande modell av intravenös självadministrering. Djur Tryck här, en hävstång för att själv administrera drogen, vilket medger utvärdering av den operant respons av djur, tvångsmässighet och motivation14,15,16. Den största fördelen med CPP över självadministrering tillvägagångssätt är att CPP återanställning anses återspegla reaktivering av incitament-motiverande värdet av de sammanhang stimuli parat med drogen, bestående av återkomsten av metoden beteende till sammanhang17. Dessutom kan icke-medicinska stimuli, såsom stress, också inducera återanställning18,19. Till exempel, beskrivs en självadministrering studie inga effekter på återinförande av heroin intag hos råttor efter en fot chock eller återhållsamhet betona20. Författarna diskuterade att det var misslyckat eftersom dessa stressfaktorer testades utanför självadministrering kammaren i ett annat sammanhang. Däremot när du använder CPP modellen för återställande, fanns det en tydlig re-establishment av morfin-inducerad CPP efter användande de samma stressfaktorerna, och tillämpas i ett annat sammanhang som CPP och vid olika tidpunkter (0 och 15 min efter stress exponering)18 .

Flera studier i litteraturen har visat olika sätt av drog- och stressinducerade återanställning. Dels, har läkemedelsinducerad återanställning rapporterats hos råttor och möss använder morfin5,21,22,23, kokain24,25, amfetamin26, 27, etanol28,29och 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA)30. Däremot, kan exponering för stress vara en avgörande faktor i sårbarhet för drogmissbruk. Stress är känt för att öka givande effekterna av droger7,31,32 och deras roll i återfall är väl etablerad33,34. Nederlag i socialt samspel med en artgränserna återinförs till exempel morfin och kokain CPP18,19. Dessutom djur utsätts för upprepade sociala nederlag är mer sårbara för subthreshold doser kokain luftkonditionerade givande effekter och återställa inställningen med mycket låga doser av kokain7.

Tillämpning av CPP återanställning modellen är ett användbart och känsliga sätt att utvärdera sårbarhet för att återfall hos djur, och tillåter bedömning av olika subtila miljömässiga manipulationer, som är de viktigaste triggers som hotar människors återfall, såsom eller stress-läkemedelsinducerad återanställning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden som möss och deras omsorg uppfyllt nationella, regionala och lokala lagar och förordningar som är förenliga med direktiv 2010/63/EU av Europaparlamentet och rådet av den 22 September 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål. Djur användning och eftervård kommittén av Valencias universitet godkände detta protokoll.

1. material och Set-up för betingad plats förkärlek:

  1. Hantera möss 3 dagar före testning för 1-2 min varje. Basen av svansen bör röras. Kroppen bör stödjas om möjligt. Detta görs för att minimera smärta och ångest när du hanterar ett djur och förhindra störande variabler, såsom stress.
    Obs: Av 1 hanmöss sysselsatta 60 dagar gammal (unga vuxna) väger 35-40 g i nuvarande experiment. Läkemedelsinducerad återanställning kan utföras hos möss av båda könen. Men angående stressinducerade återanställning, sociala nederlag paradigm är endast avsedd för manliga gnagare, som kvinnor gör inte framkalla en aggressiv respons i bosatt möss.
  2. För rum med luftkonditionering, använda identiska lådor med två identiska fack (30,7 cm lång × 31,5 cm bred × 34,5 cm hög) åtskilda av en mindre central gråzon (13,8 lång × 31,5 cm bred × 34,5 hög).
    Obs: Fack har olika golv texturer och vägg färger (golv i svart kupén och grova golv i den vita). Varje fack i rutan CPP innehåller fyra infraröda ljusstrålar och sex i det centrala facket. Detta tillåter inspelning av korsningarna mellan fack och positionen för djuret.
  3. Ställ upp rummet ljus (off eller sänkt) varje dag. Använd röda lampor (rekommenderas), eftersom djur inte uppfattar det och det är försvagade för experimenter (cirka 40 lux mätt på 1 m ovanför golvnivå).
  4. Ställa in programmet att registrera 15 min för före och efter konditionering (se Tabell av material för programvara) (figur 2)
  5. Förbereda den kokain-lösningen som behövs för hela experimentet. Upplösa kokainhydroklorid i 0,9% NaCl (saltlösning) i en volym av 0,1 mL/10 g kroppsvikt. Vortex blandning och förvaras vid 4 ° C i slutet av dagen.
    Obs: Kokain koncentrationerna kan variera beroende på studiens syfte. Om syftet är att utvärdera de subthreshold doserna kokain, kan en koncentration av 1 mg/kg användas, vilket är ineffektivt i djuren i kontrollgruppen, som sett i tidigare studier24,35. Om en effektiv dos som är syftet, kan en 6 mg/kg koncentration vara valt, vilket är effektivt men inte inducerar återanställning24, eller en koncentration av 25 mg/kg, som är effektiv och inducerar återinförande av preferens19.
  6. Testa djuren under deras mörka fas och använda samma box för varje djur över flera dagar.
  7. Få djur varje dag till testning rummet i sina hem burar och lämna dem ostörda i 15 min som en tillvänjning period till alla test-relaterade ljud.

2. test

  1. Förvärv
    Obs: Tillvägagångssättet av plats luftkonditionering, opartisk när det gäller inledande spontana preferens, består av tre faser: före luftkonditionering, luftkonditionering och efter luftkonditionering (figur 1).
    1. Förkonditioneringen (Pre-C) (3 dagar) (bild 2, bild 3, bild 4)
      Obs: Här, neutrala värdet av facken i rutan CPP utvärderas. Mäta tidåtgången i varje fack och senare jämföra det med som tillbringade i samma utrymme i efter Konditioneringsprovning.
      1. Ta djuren till testrummet och lämna dem vana för 15 min.
      2. Kontrollera att Giljotiner avlägsnas från buren.
      3. Ställ in datorn och programmet. Ange djur IDs och tryck på kommandot ”prov” och ”Start” (figur 2).
      4. Placera musen försiktigt i mitten kammare (grå facket) och lämna testning rummet med minsta buller.
      5. Återföra alla djuren till deras hem burar och spara data när rättegången är klar.
      6. Tillåta möss åt båda fack i apparaten för 15 min (900 s) per dag på 3 dagar.
      7. På dag 3, skriv ner den tid i varje fack under en 900 s och spara den för tilldelningen av fack i nästa fas (figur 3).
      8. Tilldela halva djur i varje grupp får drogen eller om fordonet i ett fack (t.ex., svart) och den andra hälften i det andra facket (t.ex., vit) (figur 4).
        Obs: Den slutliga fördelningen av djuren måste säkerställa att hälften av djuren tilldelas inledningsvis Rekommenderad facket och den andra hälften i icke-önskade facket. Dessutom fick hälften av djuren drogen i ett fack (till exempel den svarta en) och den andra hälften i den andra (i detta fall, den vita en).
      9. Balans Poäng i gruppen inom båda fack samt i grupper (test grupp skillnader med en variansanalys (ANOVA)). Som en ungefärlig vägledning, bör värden runt 360-370 s i Pre-C test (figur 4). Obs: inga signifikanta skillnader bör upptäckas mellan tiden i drog-parad och fordon-parat facken under Pre-C provet.
      10. Utesluta djur som uppvisar en stark aversion eller preferens för någon avdelning. Överväga motvilja som spenderar mindre tid än 33% i kupén, och överväga preferens när djuret tillbringade mer än 67% av den totala tiden i det facket.
    2. Konditionering (4 dagar) (figur 5)
      1. Väga djuren och använda dessa vikter för kokain doser under konditioneringen.
      2. Förbereda sprutor med kokain eller saltlösning baserat på kroppsvikt.
      3. Injicera en mus i taget intraperitonealt (ip) och omedelbart placera den försiktigt i tilldelade svart eller vit facket av deras box.
      4. Efter ett intervall på 4 h, injicera drogen dosen omedelbart innan musen är begränsad till drog-parat facket i 30 min (figur 5).
      5. Alternativa proceduren varje dag, börjar med kokain på dag 1 och 3 och saltlösning på dag 2 och 4.
      6. Kontrollera att förlossningen sker i båda fallen genom att stänga dörren giljotinen som separerar de två avdelningarna att göra centralområdet otillgängliga.
        Obs: I denna fas finns det ingen anledning att ställa in programmet PC.
    3. Efter luftkonditionering (Post-C) (1 dag)
      1. Ta djuren till testrummet och lämna dem vana för 15 min.
      2. Ta bort giljotin dörren separera de två avdelningarna.
      3. Ställ in datorn och programmet. Ange djur IDs och tryck på ”start”-kommandot.
      4. Registrera den tid som de obehandlade möss i varje fack under en 900 s observationsperiod.
      5. När rättegången är klar, föra alla djur tillbaka till sina hem burar och spara data.
      6. Överväga att drogen har inducerad plats önskemål om tiden i drog-parat facket under den Post-C är betydligt större än i Pre-C test. Om motsatsen inträffar, överväga en motvilja för drog-parat facket.
  2. Utrotning
    1. Genomföra en handelsvecka utrotning i alla grupper/djur som utvecklade en preferens för drog-parat facket.
    2. Placera djuret i apparaten (utan Giljotiner) för 15 min (samma som pre- och Post-C testerna) (figur 1).
      Obs: Om dosen anställda i CPP är hög (25 mg/kg), utföra 1 utrotning session per vecka. Om en subthreshold dos är begagnade (1 mg/kg), sedan utföra 2 utrotning sessioner per vecka (t.ex. måndag och torsdag).
    3. Överväga inställningen släckas när data från utrotning testet inte visar skillnader med avseende på det Pre-C testet, men de visar skillnader med avseende på Post-C testet.
    4. Upprepa testet 24 h senare för att bekräfta utrotning.
  3. Återinförande av CPP
    1. Priming-inducerad återanställning
      1. Utvärdera effekterna av en priming-dos av kokain 24 h efter utrotning har bekräftats.
        Obs: Priming doser är halva den tidigare dosen som djuret har fått under konditioneringen. Återanställning testet genomgår samma protokoll som i Pre-C och Post-C tester, förutom att djuren få dos av kokain i en icke-kontingent plats 15 min före provningen. Effekten av drogen grundning i inducerande återanställning kan förbättras efter upprepade utrotning/återställande upplevelser23, även om ordningen på doserna inte verkar för att spela en roll i resultat erhålls36.
      2. Ta djuren till ett annat rum från testning rummet (icke-kontingent plats) (figur 6).
      3. Injicera dem med halva den tidigare dosen av kokain (t.ex., om djur var betingade med 25 mg/kg kokain, en priming-dos skulle vara 12,5 mg/kg).
      4. Föra dem tillbaka till deras vivarium i 15 min.
      5. Ta dem in i testing rummet och placera djuren i apparaten omedelbart (utan giljotin dörrarna separera facken) för 15 min (samma som den pre- och Post-C tester).
      6. Anser att skillnaden i sekunder mellan tiden i drog-parat facket under den senaste sessionen utrotning och återanställning testet som ett mått på graden av återställande av preferensaktierna induceras av drogen.
      7. Upprepa förfarandet för utrotning-återanställning varje gång med minskande doser tills det bekräftas vara ineffektiva.
        Obs: En saltlösning injektion kontroll kan användas för att styra kapaciteten av kokain priming (och inte injektionen) inducera återanställning.
    2. Stressinducerade återanställning
      1. Utvärdera effekterna av en stressinducerade återanställning 24 h efter utrotning har bekräftats
        Obs: Återställande tester är desamma som de som utförs i Post-C (gratis förflyttningar för 15 min), förutom att djur testas 15 min efter sociala nederlag i en agonistiska stöta (figur 6)
      2. Ta djuren till ett annat rum från CPP rummet.
      3. Placera den experimentella mus med en aggressiv motståndare sex matchas lika ålder och kroppsvikt i plast buren (figur 6).
        Obs: Agonistiska mötet består av en 10 min test i ett neutralt transparent plast bur (23x13.5x13cm) med ett nederlag resultat för experimentell musen. För att förbereda den aggressiva motståndaren, först isolera olika djur som matchar i ålder och kroppsvikt som experimentella möss i 3 veckor. Utbilda dem att förvärva fightingupplevelse och testa dem för att ha höga nivåer av aggressivt territoriellt beteende. För att få aggressiva artfränder, möss måste isoleras i minst 3 veckor, och sedan tränade i aggressiv och attackerar beteenden. Djur är utbildade i neutral miljö, inför dem parvis. Vi låter dem bita de motståndare 2 eller 3 gånger och få dem ur buren, alltid slutar utbildningen innan en av de två möss visar underkastelse, så att upplevelsen av mötet förstärker aggressivt beteende. Efter lidande aggression (hot och angrepp från de aggressiva artgränserna), bör experimentell möss presentera undvikande/fly och defensiv/undergiven beteende. Kriteriet är att anta en viss hållning av nederlag, kännetecknas av undergiven upprätt, halta framtassarna, uppåt vinklat huvud, och tillbakadragen öron (figur 6). Enligt Burke et al., 2016, vi anser att det sociala mötet avslutas tidigare om inkräktaren visar en undergiven liggande hållning för > 8 s eller om 13 attack biter inträffade. Ett annat alternativ till skärmen djur utan risk för betydande skada kan vara att tempo djuret i en mesh inhägnad med ett hål, inte tillräckligt stor för antingen djur att passera.  Aggression kan upptäckas utan att utsätta djur för direkt aggressiva beteende.  Om ett djur upprätthåller en skada med ett sår 1cm i diameter och/eller direkt exponering av muskeln, det är utesluten från studien och bör bli euthanized.
      4. Efter 10 min av agonistiska möte, ta möss in i testing rummet och placera djuren i CPP apparaten omedelbart (utan giljotin dörrarna separera facken) för 15 min (samma som den pre- och Post-C tester).

3. statistisk analys

Obs: Idealisk urvalets storlek bör vara minst 15 djur per grupp.

  1. Analysera tiden tillbringade i drog-parat facket i gruppen med hjälp av en blandad ANOVA med en mellan variabel, behandling, med två nivåer (kontrollgrupp, experimentella gruppen, exempel på två grupper är i figur 7 c), och en inom variabel – dagar, med 2 nivåer (Pre-C och Post-C).
    Obs: I kontrollgruppen djur får drogen men har inga miljömässiga manipulationer. Däremot, i den experimentella gruppen utsätts djur för olika miljöförhållanden. Jämför den tid i drog-parat facket Post-C dag med respekt den Pre-C test för att se om det finns några betydande skillnader i känslighet för läkemedlet.
  2. Dessutom utför Bonferroni post hoc-analyser för att kontrollera antingen av betydande partitur.
  3. Analysera data relaterade till utrotning och återanställning värden i de grupper som utvecklade önskemål med hjälp av Students t-test att fortsätta med förfarandet för utrotning-återinförande under experimentet, men i slutskedet, analysera dem med en ANOVA med en inom variabel (dagar) med antalet nivåer beroende på varje grupp.
    Obs: När antalet jämförelser ökas antalet av dem som kommer att vara betydande slump också ökat. Som sådan, för att undvika falskt positiva (typ 1 fel) rätta vi' ' p-värdet därmed att göra testet mer konservativ med Bonferroni korrigeringen för flera t-tester. Dock för återanställning test, bör jämförelsen göras mellan återanställning testet och det sista testet för utrotning. Därför finns det inget behov för korrigering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För det första visas representativa resultat från priming - och stressinducerade återinförande i figur 7 använder vuxna 1 manliga möss.

Data i figur 7a-b som representerar tid tillbringade i den drogen-parat delar skall det ingå i de pre- och Post-C prov analyserades med en upprepad åtgärder ANOVA med en inom-patienter variabel dagar (jämföra Pre-C och Post-C). Resultaten visade en betydande effekt på de variabel dagarna [F(1,34) = 51.179; p < 0,001], eftersom alla djur utvecklat en preferens i Post-C dag jämfört med den Pre-C. Alla djur var luftkonditionerade med 25 mg/kg kokain och när utrotning uppnåddes, en grupp fick en priming-dos på 12,5 mg/kg kokain att testa återinförande (figur 7a) och den andra utsattes för en social interaktion där de experimentella djur besegrades av en aggressiv motståndare (figur 7b). 15 min efter två händelserna, djur testades i deras motsvarande CPP-rutan.

Priming-inducerad återinförande (figur 7a) utsattes till efterföljande fallande priming doser (halva året) tills en priming-dos bekräftas vara ineffektiva. Doserna var: 12,5, 6.25, 3.125 och 1.56 mg/kg kokain. Students t-test visade en signifikant effekt på 12,5 mg/kg kokain återställande med avseende på utdöende sessionen (t statistik (t) = 20.589, frihetsgrader (d.f.) = 17; p < 0,001) och efterföljande doser (6,25 mg/kg: t = 18.356; 3.125 mg/kg: t = 14.260; 1,56 mg/kg: t = 16.934 d.f. = 17; p < 0,001). Grundning med 0,78 mg/kg inducerar inte återinförs.

Angående stressinducerade återinförande (se figur 7b), att vara utsatt för ett aggressivt djur och besegrade 15 min innan testet leder att återinföra den tidigare utsläckt preferensen (t = 26.810; d.f. = 15; p < 0,001)19 .

Andra miljömässiga manipulationer, som lider av upprepade sociala nederlag innan CPP förfarandet, ändra givande effekterna av subthreshold doser kokain (figur 7 c). A blandat ANOVA med den mellan variabel ”stress” och inom variabel ”dagar” utfördes, och det fanns en signifikant effekt av interaktionen Stress x dagar [F(1,29) = 4.144; p < 0,05]. Endast djur som socialt besegrade uppvisade preferens för drog-parat kupén med en subthreshold dos kokain, som har visat sig vara ineffektiva i standard djur7. Dessutom efter utrotning av preferensaktierna, socialt besegrade djur återinfört sina önskemål med bara 0,5 mg/kg kokain priming (t = 25.484 d.f. = 17; p < 0,001).

För det andra, som ett negativt resultat, kan vi se hur återanställning kan förebyggas genom en positiv social interaktion med en icke-aggressiv artgränserna (figur 8a). Det är därför viktigt att utvärdera om djur besegras eller inte efter en social får37.

Ett annat exempel på negativa resultat att förhindrar återanställning kan vara näringsmässiga manipulationer, såsom en hög fetthalt välsmakande kost intag. Först, ANOVA analys visade en effekt av de rörliga dagarna [F(1,26) = 21.527; p <.0.001], som båda grupperna utvecklats preferens för drog-parat facket (p < 0,01) (figur 8b). Efter utrotning visar våra resultat att djur som bytte till fettrik diet efter Post-C testet minskade deras känslighet för drogen-priming inducerad återanställning, eftersom de inte återställa inställningen med en 6,25 mg/kg kokain dos38.

Figure 1
Figur 1: experimentell förfarande av den luftkonditionerade plats preferenser. Det består av tre faser: före luftkonditionering, luftkonditionering och efter luftkonditionering. Det finns 4 luftkonditionering dagar där förfarandet är alternerade varje dag, börjar med kokain på dag 1 och 3 och med fordon på dag 2 och 4. Sedan, utrotning och återanställning sessioner utförs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: programvara användning sessioner för Pre-C och Post-C tester där träningstid i varje fack och antalet poster registreras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Data efter det Pre-C och Post-C test Här, dokumentera de uppgifter som erhållits under provningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: opartisk tilldelning av djur till facken för nästa fas av luftkonditionering. Ta data för den sista Pre-C testdagen i de vita och svarta fack. Halva djur tilldelas få läkemedlet eller fordon i ett fack (svart eller vitt), och den andra hälften i det andra facket. Utesluta djur som visar stark aversion eller preferens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: slutlig tilldelning av fordonet och kokain ihopkopplade sessioner. Denna figur visar växlingen på order av lottning. Dag 1 och 3, ett djur (t.ex., 1.1) först exponeras för kokain-parat facket (den vita en) och, efter fyra timmar, utsätts för fordon-parat facket (den svarta en). Ordningen på lottning är inverterad på dag 2 och 4, och djuret utsätts först till fordonet-parad (svart) fack och efter fyra timmar, i kokain-parad (vit) facket. Som detta förfarande är opartisk och motviktstruckar, samtidig luftkonditionering sessioner kan bedrivas med två djur använder båda fack i samma låda (t.ex., djur 1.1 och 2.4, 3.1 och 1.3), som tillåter oss att minska tid ägnas åt den experimentell förfarande. Notera att dessa par av djur följa omvänd ordning på lottning genom luftkonditionering fas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: två modeller av återanställning. (en) Priming-inducerad återställande och (b) stressinducerade återanställning. (en) djur får en injektionsmissbruk i ett icke-villkorade rum och förs till ett vivarium; 15 min senare de testas i rutan CPP. (b) djur besegras i ett agonistiska möte i ett icke-villkorade rum för 10 min och därefter de testas i rutan CPP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: representativa positiva resultat. Priming (en) och stressinducerade (b) återanställning efter 25 mg/kg kokain CPP. (c) effekterna av sociala nederlag på givande effekterna av subthreshold doser kokain (1 mg/kg). Staplarna representerar (± SEM) tiden i sekunder spenderas i drog-parat facket under förkonditioneringen (vit), efter luftkonditionering (svart), den sista utrotning session (ljusgrå) och återanställning (mörkgrå). Återanställning testet utvärderades 15 min efter en priming-dos av halva den tidigare dosen. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001 signifikant skillnad vs Pre-C (ANOVA med en inom-ämnen varierande dagar (jämföra Pre-C och Post-C) eller föregående utrotning session (Student's t-test). Dessa siffror har ändrats från 7,19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: representativa negativt resultat. Effekterna av skyddande miljö manipulationer på givande effekter av kokain. (en) effekterna av en positiv social interaktion innan återställande testa. (b) effekterna av en fettrik kost under hela utrotning och återanställning. Kontrollgruppen matades med en standard kost (13% av kcal från fett, 67% kalorier från kolhydrater och 20% kalorier från protein; 2,9 totala kcal/g) och gruppen fettrik kost (45% kcal från fett, 36% kalorier från kolhydrater och 19% kalorier från protein; 4,6 totala kcal/g). Staplarna representerar (± SEM) tiden i sekunder spenderas i drog-parat facket under förkonditioneringen (vit), efter luftkonditionering (svart), den sista utrotning session (ljusgrå) och återanställning (mörkgrå). Återanställning testet utvärderades 15 min efter en priming-dos av hälften av tidigare mottagna dosen. * p < 0,05; ** p < 0,01; signifikant skillnad vs Pre-C (ANOVA med en inom-ämnen varierande dagar (jämföra Pre-C och Post-C) eller föregående utrotning session (Student's t-test). Dessa siffror har ändrats från 37,38. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den centrala punkten i missbruk läkemedelsforskning är utvecklingen av behandlingar som minskar suget och, följaktligen, minska sårbarheten för att återfall. Tack vare den återanställning modellen av CPP paradigm är det möjligt att studera påverkan av olika processuella och miljömässiga faktorer som modulerar återfall, vilket är en prioritet för framtida forskning. Det finns några viktiga punkter att tänka, som CPP paradigm är ett test som är mycket känslig för miljöfaktorer.

Ändringar och felsökning: CPP versionen av återanställning modellen bör ändras beroende på drogen av intresse. Det finns olika faktorer som kan påverka omfattningen av konditionerat önskemål, t ex varaktighet och antalet sessioner som luftkonditionering. Antalet föreningar varierar vanligtvis från en till sex, fyra är den vanligaste. Varaktigheten av luftkonditionering testerna är etablerat enligt egenskaperna av drogen och dess farmakokinetik.

CPP studier innebära brukar många prövningar, så det är lämpligt att använda protokoll som minskar den tid som krävs. Ett sätt att uppnå detta är att minska antalet prövningar och ett annat sätt är att utföra två sessioner av luftkonditionering per dag, som visas i detta protokoll. I det här fallet är det nödvändigt att säkerställa att effekterna av läkemedlet från föregående session inte dra till denna andra session39, varför intervallet för fyra timmar mellan kokain - fordon session valdes. Exempelvis bör tidpunkten för ihopparningen när det gäller kokain under fasen luftkonditionering varje 24 h 4 dagar med en ihopkoppling varaktighet på 30 min. Tvärtom, tidsförloppet för luftkonditionering tillvägagångssättet av etanol bör varje 48 h, sammanlagt 8 dagar, 1 conditioning session per dag, och omväxlande fordonet och EtOH, slutligen har totalt 4 EtOH lottning. Etanol parning bör ha en kort varaktighet, till exempel 5 min, som mer tid kunde producera aversiva stater. Effektiva doser varierar från 1-2 g/kg och subthreshold doser är 0,75 g/kg40. Priming-inducerad återanställning bör vara halva den tidigare dosen och apparaten bör vara samma.

Dock kan väljer att göra 1 eller 2 sessioner per dag påverka resultatet i vissa särskilda läkemedel för missbruk. Till exempel när det gäller MDMA-inducerad CPL med protokollet två sessioner observeras konditionerat preferensen i efter luftkonditionering inte, medan detta kan erhållas genom att utföra en enda förening varje dag30, så MDMA administreras också varje 48 h, men varaktigheten av luftkonditionering sessionen bör vara 30 min.

Det finns två huvudsakliga metoder för utrotning som kunde köras efter etableringen av CPP, antingen dagliga injektioner av fordonet begränsa djuret i både tidigare drog och fordonet luftkonditionerade fack41,42, 43, eller genom att upprepa testet CPP, låta djuren utforska de tre fack utan giljotinen tills preferens observeras längre7,18,30,38. I detta protokoll, vi anställt den senare, eftersom det är en typ av spontana utrotning utan någon farmakologisk eller beteendemässiga manipulation relaterade till luftkonditionering (mer liknar det som förekommer i mänskliga missbrukare), men båda metoderna är acceptabla och giltig, som litteraturen har visat i år.

Begränsningar av teknik: Den viktigaste begränsningen av CPP paradigm och återanställning modell är att de är mycket känsliga för eventuella miljöförändringar. Rum och vivarium villkor bör därför bo stabil och konstant under hela förfarandet. Särskild försiktighet bör iakttas att aspekter som bor i samma rum med kompisar av det motsatta könet, burar med artefakter som hjul som gör en specifik och konstant buller, eller ljusförhållanden. Förutom att styra hur dessa variabler, är rollen av forskaren också kritisk, eftersom de kan inducera en ökning av djurens stressnivåer och störa resultatet.

Betydelse med avseende på befintliga metoder: När det gäller andra metoder, i CPP version av återanställning modellen, är forskaren som administrerar läkemedlet till djur, i motsats till självadministrering paradigm som utvärderar animal´s motivation att ta drogen. Det är viktigt att vi beaktar detta. Detta innebär att vi inte utvärderar motivation genom en operant respons eller primära förstärkande effekterna av drogen. Som vi nämnt, är CPP en användbar modell för att bedöma den kritiska roll som miljömässiga cues spela på återfall i missbruk störningar, som i själva verket de huvudfaktorer som modulerar återfall hos människor.

Framtid-program: Framtida tillämpningar av CPP återanställning modellen bör vara inriktade på att så kallade inkubering av röksug, som består av en progressiv ökning i cue reaktivitet efter abstinens av droger, härma begäret hos människor. Nuförtiden, är lite känt om detta i CPP paradigm. För några år sedan, föreslog endast en studie att CPP också kunde mäta denna inkubation perioden44. Mer nyligen, bedömdes det huruvida miljömässiga cues parat med morfin i CPP kunde öka den beteendemässiga Svaren över den tillbakadragande periodiska45. Denna studie fann att antalet poster till CPP facken ökar över tid, vilket återspeglar inkubering av röksug och tyder på att belöna minnen och drog begäret kan särskiljas i CPP paradigm.

Kritiska steg: det finns flera kritiska steg i protokollet. För att bekräfta att djur återinfört deras preferens, bör utrotning data återspegla en verklig utrotning av inställningen, bekräftas före återanställning provet. Data från utrotning testet bör inte visar skillnader med avseende på det Pre-C testet men med avseende på Post-C testet.

Om den sociala stressinducerade återanställning versionen, bör vi har bekräftat att djuret har besegrats faktiskt, sedan en positiv social möte som inte slutar i nederlag visar skyddande effekter blockerar ett återinförande av platsen preferensen av kokain. Om försöksdjuren inte har besegrats, kommer de att uteslutas från studien. Vi rekommenderar inspelning och utvärdera agonistiska mötet, mäta svarstiden för aggressiva beteendet eller inlämning beteende, antalet attacker och den tid som tillbringas i varje av dessa beteenden. Vi anser att det experimentella djuren är besegrad när det tar emot minst 2 attacker (bites) och visar tecken på underkastelse (som illustreras i figur 6). I alla fall varar mötet 10 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Generalitat Valenciana, PROMETEOII / 2014/063; Ministeriet för hälsovård, sociala tjänster och jämställdhet. Delegering av regeringen för den nationella planen på droger, forskningsprojekt på drogen beroenden, 2014I007; Ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft (MINECO), Health Institute Carlos III, nätverk av beroendeframkallande sjukdomar (RTA) RD12 / 0028/0005 och RD16 / 0017/0007 och Europeiska unionen, FEDER medel ”una manera de hacer Europa” och PSI2014-51847-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MONPRE 2Z software CIBERTEC S.A., Spain N/A
Identical Plexiglas boxes with two equal sized compartments separated by a grey central area. CIBERTEC S.A., Spain N/A The compartments have different colored walls (black vs white) and distinct floor textures (fine grid in the black compartment and wide grid in the white one). All boxes are equipped with four infrared light beams in each compartment of the box and six in the central area which allow the recording of the position of the animal and its crossings from one compartment to the other.
Cocaine hydrochloride Laboratorios Alcaliber S.A., Madrid, Spain N/A
Animals: mice of the OF1 outbred strain Charles River, Barcelona Spain N/A Male mice who arrive to the laboratory on PND 42 and on PND 60 perform the CPP test. These animals are specially indicated for social defeat and aggression models.
Standard Diet- Teklad Global Diet 2014 Supplied by Harlan Laboratories Models, S. L. (Barcelona, Spain) 13 kcal % fat, 67 kcal % carbohydrates and 20% kcal protein; 2.9 kcal/g
High fat diet TD.06415 45 kcal % fat, 36 kcal % carbohydrates and 19% kcal protein; 4.6 kcal/g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bardo, M., Bevins, R. Conditioned place preference: what does it add to our preclinical understanding of drug reward? Psychopharmacology. 153, 31 (2000).
  2. Tzschentke, T. M. Review on CPP: Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addiction biology. 12 (3-4), 227-462 (2007).
  3. Aguilar, M. A., Rodríguez-Arias, M., Miñarro, J. Neurobiological mechanisms of the reinstatement of drug-conditioned place preference. Brain research reviews. 59 (2), 253-277 (2009).
  4. García-Pardo, M. P., Roger-Sánchez, C., De la Rubia Ortí, J. E., Aguilar, M. A. Animal models of drug addiction. Adicciones. 12 (0), 823 (2017).
  5. Manzanedo, C., Aguilar, M. A., Rodrı́guez-Arias, M., Miñarro, J. Effects of dopamine antagonists with different receptor blockade profiles on morphine-induced place preference in male mice. Behavioural brain research. 121 (1), 189-197 (2001).
  6. Robbins, T. W. The acquisition of responding with conditioned reinforcement: effects of pipradrol, methylphenidate, d-amphetamine, and nomifensine. Psychopharmacology. 58 (1), 79-87 (1978).
  7. Montagud-Romero, S., Nuñez, C., Blanco-Gandia, M. C., Martínez-Laorden, E., Aguilar, M. A., Navarro-Zaragoza, J., et al. Repeated social defeat and the rewarding effects of cocaine in adult and adolescent mice: dopamine transcription factors, proBDNF signaling pathways, and the TrkB receptor in the mesolimbic system. Psychopharmacology. , (2017).
  8. Pavlov, I. P. Conditioned Reflexes. , Oxford University Press. Oxford. (1927).
  9. Yahyavi-Firouz-Abadi, N., See, R. E. Anti-relapse medications: preclinical models for drug addiction treatment. Pharmacology & therapeutics. 124 (2), 235-247 (2009).
  10. Epstein, D. H., Preston, K. L., Stewart, J., Shaham, Y. Toward a model of drug relapse: an assessment of the validity of the reinstatement procedure. Psychopharmacology. 189 (1), 1-16 (2006).
  11. Geyer, M. A., Markou, A. Animal models of psychiatric disorders. Psychopharmacology: the Fourth Generation of Progress. Bloom, F. E., Kupfer, D. J. , Raven. New York. 787-798 (1995).
  12. De Wit, H. Priming effects with drugs and other reinforcers. Experimental and Clinical Psychopharmacology. 4 (1), 5 (1996).
  13. Wang, B., Luo, F., Zhang, W. T., Han, J. S. Stress or drug priming induces reinstatement of extinguished conditioned place preference. Neuroreport. 11 (12), 2781-2784 (2000).
  14. Shalev, U., Erb, S., Shaham, Y. Role of CRF and other neuropeptides in stress-induced reinstatement of drug seeking. Brain research. 1314, 15-28 (2010).
  15. Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology. 229 (3), 453 (2013).
  16. Weiss, F. Neurobiology of craving, conditioned reward and relapse. Current opinion in pharmacology. 5 (1), 9-19 (2005).
  17. Mueller, D., Stewart, J. Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction. Behavioural brain research. 115 (1), 39-47 (2000).
  18. Ribeiro Do Couto, B., Aguilar, M. A., Manzanedo, C., Rodriguez-Arias, M., Armario, A., Miñarro, J. Social stress is as effective as physical stress in reinstating morphine-induced place preference in mice. Psychopharmacology. 185 (4), 459-470 (2006).
  19. Titomanlio, F., Manzanedo, C., Rodríguez-Arias, M., Mattioli, L., Perfumi, M., Miñarro, J., Aguilar, M. A. Rhodiola rosea impairs acquisition and expression of conditioned place preference induced by cocaine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , (2013).
  20. Shalev, U., Highfield, D., Yap, J., Shaham, Y. Stress and relapse to drug seeking in rats: studies on the generality of the effect. Psychopharmacology. 150 (3), 337-346 (2000).
  21. Lu, L., Ceng, X., Huang, M. Corticotropin-releasing factor receptor type 1 mediates stress-induced relapse to opiate dependence in rats. Neuroreport. 11 (11), 2373-2378 (2000).
  22. Ribeiro Do Couto, B., Aguilar, M. A., Manzanedo, C., Rodriguez-Arias, M., Miñarro, J. Reinstatement of morphine-induced conditioned place preference in mice by priming injections. Neural Plast. 10, 279-290 (2003).
  23. Do Couto, B. R., Aguilar, M. A., Rodriguez-Arias, M., Miñarro, J. Long-lasting rewarding effects of morphine induced by drug primings. Brain research. 1050 (1), 53-63 (2005).
  24. Maldonado, C., Rodriguez-Arias, M., Castillo, A., Aguilar, M. A., Miñarro, J. Gamma-hydroxybutyric acid affects the acquisition and reinstatement of cocaine-induced conditioned place preference in mice. Behav. Pharmacol. 17, 119-131 (2006).
  25. Maldonado, C., Rodriguez-Arias, M., Castillo, A., Aguilar, M. A., Miñarro, J. Effect of memantine and CNQX in the acquisition, expression and reinstatement of cocaine-induced conditioned place preference. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 31, 932-939 (2007).
  26. Cruz, F. C., Marin, M. T., Planeta, C. S. The reinstatement of amphetamine-induced place preference is long-lasting and related to decreased expression of AMPA receptors in the nucleus accumbens. Neuroscience. 151, 313-319 (2008).
  27. Li, S. M., Ren, Y. H., Zheng, J. W. Effect of 7-nitroindazole on drug-priming reinstatement of D-methamphetamine-induced conditioned place preference. Eur. J. Pharmacol. 443, 205-206 (2002).
  28. Font, L., Miquel, M., Aragon, C. M. Involvement of brain catalase activity in the acquisition of ethanol-induced conditioned place preference. Physiol. Behav. 93, 733-741 (2008).
  29. Roger-Sánchez, C., Aguilar, M. A., Rodríguez-Arias, M., Aragon, C. M., Miñarro, J. Age-and sex-related differences in the acquisition and reinstatement of ethanol CPP in mice. Neurotoxicology and teratology. 34 (1), 108-115 (2012).
  30. Daza-Losada, M., Do Couto, B. R., Manzanedo, C., Aguilar, M. A., Rodríguez-Arias, M., Miñarro, J. Rewarding effects and reinstatement of MDMA-induced CPP in adolescent mice. Neuropsychopharmacology. 32 (8), 1750-1759 (2007).
  31. Will, M. J., Watkins, L. R., Maier, S. F. Uncontrollable stress potentiates morphine's rewarding properties. Pharmacol. Biochem. Behav. 60, 655-664 (1998).
  32. Der-Avakian, A., Will, M. J., Bland, S. T., Deak, T., Nguyen, D. T., Schmid, M. J., Spencer, R. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Surgical and pharmacological suppression of glucocorticoids prevents the enhancement of morphine conditioned place preference by uncontrollable stress in rats. Psychopharmacology. 179, 409-417 (2005).
  33. Sinha, R. How does stress increase risk of drug abuse and relapse? Psychopharmacology. 158, 343-359 (2001).
  34. Lu, L., Shepard, J. D., Hall, F. S., Shaham, Y. Effect of environmental stressors on opiate and psychostimulant reinforcement, reinstatement and discrimination in rats: a review. Neurosci. Biobehav. Rev. 27, 457-491 (2003).
  35. Vidal-Infer, A., Arenas, M. C., Daza-Losada, M., Aguilar, M. A., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. High novelty-seeking predicts greater sensitivity to the conditioned rewarding effects of cocaine. Pharmacol Biochem Behav. 102, 124-132 (2012).
  36. Reguilón, M. D., Montagud-Romero, S., Ferrer-Perez, C., Roger-Sánchez, C., Aguilar, M. A., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. Dopamine D2 receptors mediate the increase in reinstatement of the conditioned rewarding effects of cocaine induced by acute social defeat. European Journal of Pharmacology. 799, 48-57 (2017).
  37. Ribeiro Do Couto, B., Aguilar, M. A., Lluch, J., Rodríguez-Arias, M., Miñarro, J. Social experiences affect reinstatement of cocaine-induced place preference in mice. Psychopharmacology. 207 (3), 485-498 (2009).
  38. Blanco-Gandía, M. C., Aracil-Fernández, A., Montagud-Romero, S., Aguilar, M. A., Manzanares, J., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. Changes in gene expression and sensitivity of cocaine reward produced by a continuous fat diet. Psychopharmacology. 234 (15), 2337-2352 (2017).
  39. Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference paradigm: a comprehensive review of drug effects, recent progress and new issues. Progress in neurobiology. 56 (6), 613-672 (1998).
  40. Blanco-Gandía, M. C., Ledesma, J. C., Aracil-Fernández, A., Navarrete, F., Montagud-Romero, S., Aguilar, M. A., Manzanares, J., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. The rewarding effects of ethanol are modulated by binge eating of a high-fat diet during adolescence. Neuropharmacology. 121, 219-230 (2017).
  41. Itzhak, Y., Martin, J. L. Cocaine-induced conditioned place preference in mice: induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants. Neuropsychopharmacology. 26 (1), 130-134 (2002).
  42. Kreibich, A. S., Blendy, J. A. cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement. Journal of Neuroscience. 24 (30), 6686-6692 (2004).
  43. Zavala, A. R., Weber, S. M., Rice, H. J., Alleweireldt, A. T., Neisewander, J. L. Role of the prelimbic subregion of the medial prefrontal cortex in acquisition, extinction, and reinstatement of cocaine-conditioned place preference. Brain research. 990 (1), 157-164 (2003).
  44. Orsini, C., Bonito-Oliva, A., Conversi, D., Cabib, S. Genetic liability increases propensity to prime-induced reinstatement of conditioned place preference in mice exposed to low cocaine. Psychopharmacology. 198 (2), 287-296 (2008).
  45. Sun, Y., Pan, Z., Ma, Y. Increased entrances to side compartments indicate incubation of craving in morphine-induced rat and tree shrew CPP models. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 159, 62-68 (2017).

Tags

Beteende fråga 136 betingad placera preferens kokain återställande stress möss drogsökande
Återinförande av drogsökande i möss med betingad plats preferens Paradigm
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blanco-Gandía, M. C., Aguilar,… More

Blanco-Gandía, M. C., Aguilar, M. A., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. Reinstatement of Drug-seeking in Mice Using the Conditioned Place Preference Paradigm. J. Vis. Exp. (136), e56983, doi:10.3791/56983 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter