Laminärt flöde-baserade analyser undersöka leukocyt rekrytering på odlade vaskulära celler och vidhäftande trombocyter
Summary
Leukocyter interagera glupskt med vaskulära celler och trombocyter efter fartyget vägg skada eller vid inflammation. Här beskriver vi en okomplicerad laminärt flöde-baserad analys för att karakterisera de molekylära mekanismer som ligger bakom interaktioner mellan leukocyter och deras cellulära partner.
Abstract
Rekrytering av leukocyter vid skada eller inflammation till platser i vävnad skada har undersökts under de senaste decennierna och har resulterat i begreppet leukocyt vidhäftning kaskad. Dock har de exakta molekylära mekanismerna som är involverade i leukocyt rekrytering ännu inte fullt identifierats. Eftersom leukocyt rekrytering förblir ett viktigt ämne i fältet av infektion, inflammation och (auto-) immun forskning, presenterar vi en enkel laminärt flöde-baserad analys att studera bakomliggande mekanismer för vidhäftningen, avinstallation vidhäftning, och transmigration av leukocyter under venösa och arteriella flödet regimer. In vitro- analysen kan användas för att studera molekylära mekanismer som ligger bakom interaktioner mellan leukocyter och deras cellulära partner i olika modeller av vaskulär inflammation. Det här protokollet beskriver en laminär-baserad analys använder en parallell-flow-kammare och en inverterad fas kontrast mikroskopet ansluten till en kamera för att studera samspelet mellan leukocyter och endotelceller eller blodplättar, vilket kan visualiseras och registreras sedan analyserade offline. Endotelceller, trombocyter eller leukocyter kan vara förbehandlade med hämmare eller antikroppar att bestämma specifika molekyler roll under denna process. Skeva villkor, dvs arteriell eller venös skjuvspänning, kan enkelt anpassas av viskositet och flödet av perfunderade vätskorna och höjden på kanalen.
Introduction
Vid skada, inflammation eller infektion svara leukocyter snabbt till patogen – eller skada-associerade molekylära mönster (PAMPs, dämpar), ändra i ett aktivt tillstånd och flytta ut blodet till platser i inflammation och vävnad. Leukocyter förmåga att interagera med deras cellulära och molekylära miljö är avgörande för deras rätta funktion som immunceller, som framhållits av genetiska sjukdomar såsom leukocyt vidhäftning brist1. Leukocyt vidhäftning har varit föremål för intensiv utredning under de senaste decennierna och detta har resulterat i begreppet leukocyt vidhäftning kaskad i början av 1990-talet2,3. Leukocyt vidhäftning initieras av selektin-medierad tillfångatagandet av leukocyter till endotelet, orsakar celler att rulla över vaskulär ytan. Denna rullande möjliggör leukocyter att skanna för endotel-bundna flyttande ledtrådar, t.ex., chemokiner, som inducerar aktivering av integriner. Därefter medla de aktiverade integriner bindningen till endotelceller ligander, vilket resulterar i fast leukocyt gripandet. Leukocyter kan därefter förbereda till extravasate genom att krypa och sprider, innan genomträngandet i endothelial enskiktslager och transmigrating in i underliggande vävnad. Det grundläggande konceptet för den kanoniska leukocyt kaskaden har förblivit i stort sett oförändrad sedan dess införande, med några mellanliggande steg till4. Ändå de exakta molekylära mekanismerna och rollerna för de många aktörerna i leukocyt rekrytering inte har klarlagts hittills och leukocyt rekrytering förblir ett viktigt ämne i fältet av infektion, inflammation och (auto-) immun forskning.
Exempelvis ökade under vaskulär inflammatoriska sjukdomar som åderförkalkning, leukocyt rekrytering till fartyget vägg enheter plack utveckling. Instabila aterosklerotiska plack kan brista, vilket leder till massiv aktivering av trombocyter och koagulationssystemet, och därefter ocklusion av fartyget5. Detta kan resultera i allvarliga kardiovaskulära utfall såsom hjärtinfarkt eller stroke. Dessutom endothelial denudation som det uppstår kliniskt, e.g. efter stentning av ett kranskärl, leder till en mängd interaktioner av leukocyter och trombocyter till utsatta fartyg vägg interiör (t.ex., matrix komponenter och slät muskel celler) och av leukocyter med trombocyter som täcker den vaskulära skadan. Dessa interaktioner är viktiga för den fortsatta utvecklingen av sjukdomen som monocyt-trombocyter interaktioner kan driva neointima bildning6,7. Dessutom trombocyt-leukocyt interaktioner medierade av leukocyt integrin Mac-1 (αMβ2) och trombocytantal GPIbα har nyligen identifierats som romanen förare av trombos i möss8.
Med tanke på den stora tillgången på människors och djurs blod som en källa av leukocyter och trombocyter för forskning, och den breda spectrumen av isolerade matrix molekyler och förevigade cellinjer leukocyt och vaskulär ursprung, är det möjligt att simulera leukocyter interaktioner under flöde i ett laboratorium inställning, med specialdesignade flöde perfusion chambers. Många varianter har utformats under de senaste decennierna, alltifrån vakuum-driven till självhäftande perfusion chambers. Alla varianter har det gemensamt att den orörliga delen (t.ex., odlade vaskulära celler eller matrix proteiner) monteras i en större läcka-bevis kammare utrustade med en fördefinierad kanal aktivera perfusion vätska över orörliga delen. Dessutom möjliggjort framsteg inom formsprutning teknik utvecklingen av skräddarsydda lösningar baserade på kisel polymerer9. Med viskositet och flödet av perfunderade vätskorna och höjden av kanalen bestämmer främst flödet perfusion enhet10skjuvspänningen egenskaper. I denna artikel presenterar vi en in vitro- Metod för att studera bakomliggande mekanismer för vidhäftningen, avinstallation adhesion och migration av leukocyter under venösa och arteriella flödet regimer. Fördelen med de metoder som presenteras här är att de kan utföras med vanliga kamera-anslutna fluorescens Mikroskop, och kräver inte en praktiker att inneha hög teknisk kompetens. In vitro- analysen kan manipuleras på många sätt (t.ex., lägga till hämmare eller blockera antikroppar), och är således tillämplig i olika modeller av vaskulär inflammation och gör utredningen av vidhäftning protein funktioner eller utvärdering av särskilda föreningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna in vitro- analys är en enkel metod för att undersöka bakomliggande mekanismer för leukocyt rekrytering vid vaskulär inflammation, men det finns några kritiska punkter noteras. Det första kravet för att framgångsrikt utföra denna analys är perfusionen i leukocyter över en intakt och konfluenta vaskulär eller trombocytantal enskiktslager. Detta kan uppnås genom tidigare beläggning av ytor med kollagen typ jag. I allmänhet när du arbetar med primära vaskulära celler, är det viktigt att fö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Drs. Martin M. Schmitt och Line Fraemohs. Detta arbete stöddes av Nederländerna stiftelse för vetenskaplig forskning (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Foundation för blodtransfusion forskning (LSBR Nr. 1638) och Deutsche Forschungsgemeinschafts (SFB1123/A2) tilldelas R.R.K.
Materials
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
- Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
- Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
- Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
- Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
- Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
- Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).
