Summary
Leucocytes avidement interagissent avec les cellules vasculaires et plaquettes après blessure de mur de navire ou lors d’une inflammation. Nous décrivons ici un simple test à flux laminaire pour caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires.
Abstract
Le recrutement des leucocytes à la blessure ou inflammation aux sites de blessures ou de dommages aux tissus a été étudié au cours de ces dernières décennies et a abouti à la notion de la cascade d’adhérence de leucocyte. Toutefois, l’exactes mécanismes moléculaires impliqués dans le recrutement des leucocytes n'ont pas encore été pleinement identifiés. Étant donné que le recrutement des leucocytes reste un sujet important dans le domaine de l’infection, l’inflammation et immunitaire recherche (auto-), nous présentons un simple test à flux laminaire pour étudier les mécanismes sous-jacents de l’adhérence, dé-adhérence, et transmigration des leucocytes en vertu des régimes d’écoulement veineux et artériels. L’essai in vitro peut être utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires dans différents modèles d’inflammation vasculaire. Ce protocole décrit une analyse axée sur les hottes à flux laminaire à l’aide d’une chambre à flux parallèle et un microscope à contraste de phase inversé relié à une caméra pour étudier les interactions des leucocytes et des cellules endothéliales ou les plaquettes, qui peuvent être visualisés et enregistrées puis analysés en mode hors connexion. Les cellules endothéliales, les plaquettes ou les leucocytes peuvent être prétraités avec inhibiteurs ou des anticorps afin de déterminer le rôle des molécules spécifiques au cours de ce processus. Conditions de cisaillement, contrainte de cisaillement c.-à-d. artériel ou veineux, peuvent être facilement adaptées par la viscosité et la vitesse d’écoulement des fluides perfusés et la hauteur du canal.
Introduction
Sur blessure, inflammation ou infection, leucocytes répondent rapidement à pathogène ou dommages associés à - molecular patterns (PAMPs, DAMPs), transformer un état activé et sortir de la circulation sanguine aux sites d’inflammation et tissus des dommages. La capacité des leucocytes d’interagir avec leur environnement cellulaire et moléculaire est essentielle pour leur bon fonctionnement comme des cellules immunitaires, mise en évidence par des maladies génétiques comme le déficit d’adhésion leucocytaire1. Adhésion leucocytaire a fait l’objet d’une enquête intense durant les dernières décennies, et il en est résulté dans le concept de la cascade d’adhérence de leucocyte dans le début des années 19902,3. Adhésion leucocytaire est initiée par la capture de sélectine médiée par des leucocytes à l’endothélium, provoquant les cellules à rouler sur la surface vasculaire. Ce roulement permet de leucocytes d’analyse pour l’endothélium lié aux indices migrateurs, par exemple, chimiokines, qui induisent l’activation des intégrines. Par la suite, les intégrines activés médient la liaison aux ligands endothéliales, entrainant l’arrestation de leucocyte ferme. Leucocytes puissent se préparer par la suite à extravasate en rampant et la diffusion, avant de pénétrer la monocouche endothéliale et transmigrant dans le tissu sous-jacent. Le concept de base de la cascade de leucocyte canonique a est restée pratiquement inchangée depuis son introduction, avec quelques étapes intermédiaires supplémentaire4. Néanmoins, les mécanismes moléculaires exacts et les rôles des nombreux joueurs impliqués dans le recrutement des leucocytes n’ont pas été clarifiées jusqu'à présent, et le recrutement des leucocytes reste un sujet important dans le domaine de l’infection, l’inflammation et (auto-) système immunitaire recherche.
Par exemple, au cours des maladies inflammatoires vasculaires telles que l’athérosclérose, augmenté le recrutement des leucocytes dans le développement de plaque bateau mur lecteurs. Les plaques d’athérome instables pourraient se rompre, menant à l’activation massive des plaquettes et du système de coagulation et par la suite à l’occlusion du vaisseau5. Cela peut entraîner des complications cardiovasculaires graves tels que l’infarctus du myocarde ou accident vasculaire cérébral. En outre, dénudation endothéliale telle qu’elle se produit sur le plan clinique, par exemple après la pose d’un stent d’une artère coronaire, mène à une multitude d’interactions des leucocytes et des plaquettes à l’intérieur de mur de navire exposés (p. ex., constituants de la matrice et lisse cellules musculaires) et des leucocytes avec plaquettes couvrant les lésions vasculaires. Ces interactions sont importantes pour le développement ultérieur de la maladie, car les interactions monocyte-plaquettes pourraient conduire néo-intimale formation6,7. En outre, les interactions leucocyte-plaquettaire médiée par les leucocytes intégrine Mac-1 (Mde α β (2) et plaquettes GPIbα ont récemment été identifiées comme les nouveaux pilotes de thrombose chez les souris8.
Compte tenu de la grande disponibilité de sang humain et des animaux comme une source de leucocytes et de plaquettes pour la recherche et le large éventail des molécules de la matrice isolés et lignées cellulaires immortalisées de leucocytes et d’origine vasculaire, il est possible de simuler des leucocytes interactions dans un écoulement dans un laboratoire, en utilisant spécialement conçu chambres de perfusion de flux. De nombreuses variantes ont été conçus au cours des dernières décennies, allant d’une situation de vide aux chambres de perfusion auto-adhésives. Toutes les variantes ont en commun que la partie immobile (par exemple, des cellules vasculaires ou protéines de la matrice) est Assemblée dans une plus grande chambre étanche équipée d’un canal prédéfini permettant une perfusion de liquides sur la partie immobile. En outre, avances en technologie de moulage a permis le développement de solutions sur mesure basées sur silice polymères9. La viscosité et la vitesse d’écoulement des fluides perfusés et la hauteur du canal principalement déterminent les caractéristiques de contrainte de cisaillement des flux perfusion périphérique10. Dans cet article, nous présentons une méthode in vitro pour étudier les mécanismes sous-jacents de l’adhérence, dé-adhérence et la transmigration des leucocytes en vertu des régimes d’écoulement veineux et artériels. L’avantage des méthodes présentées ici est qu’elles peuvent être effectuées à l’aide d’un microscope à fluorescence caméra connectée commune et ne nécessitent pas un expérimentateur de posséder des compétences techniques élevées. L’essai in vitro peut être manipulée à bien des égards (par exemple, en ajoutant des inhibiteurs ou en bloquant les anticorps) et n’est donc applicable dans différents modèles d’inflammation vasculaire et permet l’enquête d’adhérence fonctions protéiques ou le évaluation de composés spécifiques.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’éthique médicale et Animal conseils éthiques d’Université de Maastricht.
1. flow-Based Test avec des cellules humaines
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Isolement des plaquettes du sang humain
- Prélever du sang veineux en anticoagulant citrate (3,2 %).
- Ajouter 1/15 volume d’acide Citrate Dextrose (ACD : citrate trisodique 80 mM, 52 mM d’acide citrique et 183 mM de glucose) dans le sang.
- Centrifuger à 350 g sans frein pendant 15 min obtenir le plasma riche en plaquettes (PRP).
- Transférer le surnageant dans un tube conique de 15 mL et ajouter 1/20 volume d’ACD.
- Centrifuger à 1 110 g sans frein pendant 15 min obtenir plasma pauvre en plaquettes (PPP).
- Jeter le surnageant. Couper l’extrémité de l’embout de la pipette (1000 P), rendant grand alésage, quelles aides dans la prévention de l’activation plaquettaire et suspendre soigneusement le culot plaquettaire dans le même volume que la PRP en plaquettes tampon pH 6,6 (PB : 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,1 % d’albumine sérique bovine et 0,1 % de glucose). Ajouter 1/20 volume de ACD et mélanger doucement.
- Pellet les plaquettes à 1 110 g sans frein pendant 15 min.
- Jeter le surnageant et suspendre soigneusement les plaquettes comme ci-dessus dans 1 mL de tampon de plaquettes (pH 7.5).
- Mesurer la concentration de plaquettes dans une dilution au 1/10 avec un analyseur de hématologie automatisé.
- Réglez le volume avec un tampon plaquettaire (pH 7.5) pour atteindre un nombre de 2 x 107/ml.
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Isolement des cellules polynucléaires du sang humain (adapté de Brinkmann et al. 11 )
- Dessiner 24 mL de sang dans l’héparine (10 U/mL) comme anticoagulant.
- Ajouter 6 mL de milieu de diatrizoate polysucrose-sodium 1,077 g/mL densité (voir Table des matières) à un tube conique de 15 mL et soigneusement la couche 5-6 mL sang sur le dessus.
- Centrifuger pendant 20 min à 800 x g sans frein.
- Aspirer et jetez la couche supérieure clair jaunâtre et transférer la phase inférieure de rougeâtre contenant des granulocytes dans frais tubes coniques 15 mL. Laver les cellules en ajoutant PBS contenant 2 mM EDTA pour un volume final de 14 mL et centrifugation pendant 10 min à 300 x g sans frein.
- Pendant ce temps, préparer un milieu de gradient de densité (p. ex.percoll, voir Table des matières) solution de travail en mélangeant 18 mL de milieu gradient de densité avec 2 mL 10 x solution stock de PBS. Diluer cette solution diluée avec du PBS (1 x) pour obtenir 4,25 mL chacune des solutions moyennes dégradées 85 %, 80 %, 75 %, 70 % et 65 %.
- Préparer 2 tubes coniques avec le gradient de densité en superposant 2 mL de chaque pourcentage moyen sur le dessus de l’autre. Commencez par la plus forte concentration et continuer dans l’ordre décroissant. Marquer les couches sur le tube avec un marqueur imperméable à l’eau.
- Soigneusement la couche 2 mL des suspensions cellulaires sur chacune des deux gradients préparés.
- Centrifuger pendant 20 min à 800 x g sans frein dans une centrifugeuse soigneusement équilibrée.
- Après centrifugation, enlever la couche supérieure et la plupart des 65 % (premier anneau) de couche avec PBMC et recueillir dans des tubes neufs le blanc restant interphases jusqu'à la couche de 85 % (second anneau, PMN).
- Laver les cellules en remplissant les tubes avec PBS 2 mM EDTA et centrifugation pendant 10 min à 300 x g sans frein.
- Retirez le surnageant et suspendre les cellules sédimentées (typiquement ≥ 95 % sont des PMN) dans 1 mL de tampon de Hank (pH 7,45), contenant 10 mM Hepes et 0,2 % de l’albumine humaine (tampon).
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et suspendre des cellules à 1 x 106/ml.
- Continuer avec marquage fluorescent et la perfusion des leucocytes (étape 3.3).
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Préparation des plaquettes adhérentes - et les monocouches de cellules vasculaires
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Préparation de plat de culture cellulaire (cellules cultivées)
- Pré paration les récipients de culture de cellule 35 mm avec 1 mL de collagène de queue de rat diluée (30 µg/mL dilué dans du PBS filtré sur un filtre de 0,2 µm).
- Incuber 30 min à 37 ° C, jeter la solution de collagène et laver le plat une fois avec du PBS.
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Culture de cellules vasculaires en Pétri
- Détacher les primaires (p. ex., HUVEC, HAoEC, HAoSMC) ou immortalisé les cellules vasculaires (p. ex., EA. Hy926, SVEC) cultivées au confluent dans une fiole de T75 avec 1,5 mL de solution de détachement cellulaire (par exemple, accutase). Ajouter 4,5 mL de milieu de culture approprié pour neutraliser la solution de détachement cellulaire et déterminer la concentration en cellules avec une cellule comptant chambre. Suspendre les cellules à 0,5 x 105 cellules/mL dans le milieu approprié (par exemple, milieu de culture de cellules endothéliales complet).
- Ajouter 2 mL de suspension cellulaire à chaque plat de 35 mm. Culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2 à humidifié jusqu’au confluent (en 24 à 48 h, selon le type de cellule).
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Préparation de lamelle de verre (plaquettes adhérentes)
- Immerger la lamelle de verre une fois dans HCl-EtOH (1,2 M / 50 % v/v).
- Rincer la lamelle 2 fois dans l’eau ultrapure.
- Sécher la lamelle sous N2.
- Pré-couche la lamelle de verre avec 100 µL, conformément à la position du canal de la chambre de perfusion de collagène de queue de rat diluée de type I (30 µg/mL dilué dans du PBS filtré sur un filtre de 0,2 µm).
- Incuber 30 min à ta, jeter la solution de collagène et laver la lamelle 3 x avec du PBS.
- Bloquer la lamelle de collagène enduit avec 1 % de BSA dans HEPES pendant 0,5 h à température ambiante.
- Laver et sécher la lamelle et monter dans la chambre de perfusion. Isoler les plaquettes d’être humain ou du sang de souris comme indiqué à l’étape 1.1 ou 2.1, respectivement.
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Immobilisation des plaquettes
- Ajouter 70 µL d’une suspension de plaquettes 2 x 107/ml par canal et incuber pendant 1,5 h à 37 ° C et 5 % de CO2.
- Soigneusement remplacer les plaquettes non adhérents avec solution de saturation (5 % de BSA dans HEPES) pendant au moins 30 min à RT. continuer avec marquage fluorescent et la perfusion des leucocytes (étape 3.3).
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Stimulation de la monocouche cellulaire vasculaire
- Stimuler les cellules vasculaires en remplaçant les médias avec les supports neufs contenant 10 ng/mL facteur de nécrose tumorale α (TNFα) pendant 4 h à 37 ° C et 5 % de CO2.
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Préparation de plat de culture cellulaire (cellules cultivées)
2. flow-based test avec cellules murines
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Isolement des plaquettes du sang de souris
- Tirage de sang par ponction cardiaque à l’aide d’une aiguille de 21 G (environ 1 mL) d’anesthésiés (kétamine 80 mg/kg et la médétomidine 0,3 mg/kg) 6 – 8 semaines-vieilles souris (C57Bl/6) dans le citrate (3,2 %) comme anticoagulant.
- Ajouter du volume 1/6 de l’ACD.
- Centrifuger à 220 x g, freinage moyen pendant 5 min obtenir le plasma riche en plaquettes (PRP).
- Transférer le surnageant (~ 600 µL) plus 1/3 des globules rouges dans un nouveau tube
- Centrifuger à 95 g sans frein pendant 6 min.
- Transférer le surnageant (PRP) et mesurer la concentration de plaquettes dans une dilution au 1/10 dans un tampon de Tyrode (tampon TH : 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, 0,1 % d’albumine sérique bovine et 0,1 % le glucose) avec un analyseur de hématologie automatisé.
- Lavez les plaquettes en augmentant le volume de 1/25 d’ACD + 0.1 apyrase U/mL et centrifuger à 2 870 g, freinage moyen pendant 2 min.
- Jeter le surnageant et ajouter 600 µL de tampon de TH, volume 1/10 de l’ACD et 0,1 apyrase U/mL. Couper l’embout de la pipette (1000 P), rendant grand alésage, qui contribue à la prévention de l’activation plaquettaire et Suspendez doucement le culot.
- Centrifuger à 2 870 g, freinage moyen pendant 2 min
- Jeter le surnageant et Suspendez doucement les plaquettes dans un tampon de TH.
- Régler le volume avec le tampon de TH pour atteindre un nombre de 2 x 107/ml.
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Préparation des monocouches de plaquettes adhérentes
- Préparer la lamelle de verre (plaquettes adhérentes) selon les 1.3.3.
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Immobilisation des plaquettes
- Ajouter 100 µL d’une suspension de plaquettes 2 x 107/ml par canal et incuber pendant 1,5 h à 37 ° C et 5 % de CO2.
- Soigneusement remplacer les plaquettes non adhérents avec solution de saturation (5 % de BSA dans HEPES) pendant au moins 30 min à RT. continuer avec marquage fluorescent et la perfusion des leucocytes (étape 3.3)
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Stimulation de la monocouche de plaquettes de souris
- Avant la perfusion des leucocytes (étape 3.3), stimuler les plaquettes par perfusion de thrombine (0,5 nM) dans un tampon HHHSA pendant 3 min à 37 ° C.
3. marquage fluorescent et la Perfusion des leucocytes (PMN ou THP-1 pour homme et RAW264.7 ou les Monocytes de souris primaire pour Murine Flow-Based Test)
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Marquage fluorescent
- Étiqueter les leucocytes (1 x 106/ml) avec la tache de la cellule-perméants vert fluorescent d’acide nucléique (1 µM). Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ° C.
- Laver les cellules avec du PBS par centrifugation à 300 x g pendant 5 min et suspendre les cellules à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL (5 mL / condition de test, selon la vitesse d’écoulement) dans du tampon d’essai.
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Flux de préparation de dosage chambre
- Pour adhésion leucocytaire sur une monocouche de cellules, jetez le milieu de culture cellulaire du plat et le monter dans la chambre de flux. Raccordez le tuyau sur la seringue. Pour adhésion leucocytaire sur plaquettes immobilisées, connecter le micro slide à la seringue. Préchauffer un bain-marie à 37 ° C.
- Prenez une seringue de perfusion (50 mL), installation de seringue sur le support de la seringue et ensemble, retirer la pompe sur mode. Régler le débit de la pompe à 0 mL, puis affectez-lui le diamètre 26,70 mm pour la seringue de 50 mL.
- Brancher un connecteur luer de coudé à une extrémité de la tubulure. Placez un coupleur de verrouillage luer de la seringue et raccordez le tuyau avec le connecteur luer de coude au raccord luer lock. Branchez l’extrémité du tube gratuit à la chambre de flux.
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Adhérence et la perfusion de leucocytes
- Pour adhésion leucocytaire sur une monocouche de cellules, jetez le milieu de culture cellulaire du plat et le monter dans la chambre de flux. Raccordez le tuyau sur la seringue. Pour adhésion leucocytaire sur plaquettes immobilisées, connecter le micro slide à la seringue.
- Pour la perfusion de leucocytes et l’adhérence sur un vasculaire- ou monocouche plaquettaire, déposer le deuxième tube dans un tube conique de 50 mL contenant du tampon et remplissage de tubes avec pipette de 1 mL, puis squeeze la tubulure et connectez-le à une chambre à flux.
- Avant la perfusion de leucocyte, ajouter 3 mM CaCl2 et 2 mM MgCl2 à la suspension cellulaire et incuber pendant 5 min à 37 ° C.
- Perfuse du tampon d’essai avant la perfusion de cellules pour chasser l’air possible de la chambre et le tube.
- Fermer les extrémités de tube en serrant leur serré et passer le tuyau du tampon au suspension cellulaire, empêchant l’enfermement de bulles d’air. Perfuse cellules avec contrainte de taux/cisaillement débit adéquat jusqu'à ce qu’arrivent les premières cellules.
- Perfuse cellules avec débit adéquat taux/cisaillement pendant 2 min et capturer au moins 6 photos entre 2 à 6 min de roulement et adhérentes des cellules avec un microscope à contraste/fluorescence phase inverse (par exemple, EVOS-FL) grossissement de 100 connectés pour une caméra CCD ou CMOS.
NOTE : Taux/cisaillement de flux dépend de dimensions de chambre de flux et de la viscosité du perfusat. Chambre de perfusion utilisé ici (voir la Table des matières) :
Τ =η* 97.1*Φ
Τ : contrainte de cisaillement (1 dyn/cm2)
Η : viscosité (0,015 dyn * s/cm2)
Φ: débit (0,67 mL/min)
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Dé-adhésion leucocytaire
- Pour de-adhesion, passent le tuyau du suspension cellulaire au tampon en pressant sur le tube, empêchant les bulles d’air de devenir pris au piège.
- Détacher les cellules par perfusion avec du tampon avec un débit adéquat taux/cisaillement (cf. 3.3.7 Note).
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Transmigration des leucocytes
- Pour la transmigration des leucocytes, perfuse leucocytes (étape 3) jusqu'à ce qu’une quantité suffisante de leucocytes adhèrent (~ 50-champ de cellules/affichage).
- Remplacer suspension leucocytes avec du tampon d’essai.
- Enregistrer les cellules transmigrer en time-lapse toutes les 10 à 15 s pendant 30 à 60 min à 37 ° C.
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Representative Results
Pour étudier l’adhésion endothéliale-leucocytaire, fluorescent étiquetés cellules THP-1 ont été perfusés pendant une monocouche endothéliale TNFα - ou non-stimulés pendant 2 min à 3 dyne/cm2. Le nombre total de cellules adhérentes de monocytaire a été déterminé après 2 min de perfusion en capturant 6 champs indépendants sur une période de 2 à 6 min. Les cellules adhérentes ont été quantifiés dans au moins 6 photos prises avec un microscope à contraste/fluorescence phase inverse (par exemple, EVOS-FL) en utilisant un grossissement de X 10 relié à une caméra CCD ou CMOS numérique et la moyenne a été exprimée en cellules adhérentes / mm2. Lors de la stimulation endothéliale avec TNFα, arrestation de THP-1 augmente significativement par rapport à l’endothélium non stimulé. Micrographies représentatifs et la quantification des fermement adhérente THP-1 à non ou TNFα-stimulée par les cellules endothéliales est présenté dans la Figure 1. Adhésion plaquettaire-leucocytaire a été évaluée par la perfusion des neutrophiles fluorescent étiquetés sur une monocouche de plaquettes piège-6 - ou non-stimulés pendant 2 minutes à 1 dyne/cm2. Neutrophiles adhérents ont été quantifiés comme mentionné ci-dessus. TRAP-6 stimulation a considérablement augmenté l’adhérence des neutrophiles par rapport aux plaquettes non stimulés. Vidéos représentatives et la quantification des neutrophiles forte adhérence aux non - ou piège-6-stimulés monocouche de plaquettes est présenté dans la Figure 1B.
Figure 1 : Adhérence endothéliales et des plaquettes leucocytes conditions d’écoulement. Micrographies de quantification et de représentant de l’adhérence des cellules monocytaire humaines (THP-1) pour les cellules endothéliales (HUVEC) ensemencées sur enduit de collagène Pétri dans des conditions d’écoulement, avec ou sans activation de TNFα (10 ng/mL) (A). Micrographies de quantification et de représentant de l’adhérence des neutrophiles humains pour les plaquettes humaines immobilisées sur des lames de verre enduit de collagène en conditions d’écoulement, sans ou avec piège-6 activation (50 µM) (B). P valeurs ont été calculées par le t-test non apparié (n = 3 ; moyenne ± écart-type). Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
En outre, ce test peut être implémenté pour étudier le rôle des molécules d’adhésion, telles que la molécule d’adhérence jonctionnelles plaquettaire (JAM-A). L’adhérence de RAW264.7 souris monocytes/macrophages d’une monocouche de plaquettes de JAM-A (trJAM-A+ / +) et souris JAM-A-déficientes (trJAM-A- / -) a été évaluée dans notre première étude7. Il contient, plaquettes JAM-une carence en augmentation l’adhésion des monocytes de souris à la monocouche de plaquettes par rapport à des souris de type sauvage (Figure 2A-B). Neutrophiles de souris primaire peuvent également être isolés des souris comme décrit12.
Afin d’étudier les mécanismes sous-jacents, tels que les molécules d’adhérence impliquées dans les interactions de plaquettes-leucocyte, récepteurs de surface spécifiques peuvent être bloqués. Dans l’étude susmentionnée, blocage des leucocytes α, βM2 et de plaquettes GPIbα significativement diminué adhérence des monocytes, identifier un rôle pour l’axe de2 Mde la GPIbα-α β dans le recrutement d’une augmentation des monocytes à JAM-A- / - plaquettes (Figure 2A-B). En outre, expériences de détachement de cellules peuvent être effectuées pour étudier la dépendance de contrainte de cisaillement des interactions plaquettes-leucocytaire. Pour la mesure des flux dépendant de détachement des monocytes, contrainte de cisaillement était progressivement augmentée de 0 à 20 dynes/cm2. Dans cette étude, l’adhésion des cellules RAW264.7 sur JAM-A- / - plaquettes était plus résistante à la tension par rapport à JAM-A de cisaillement+ / + plaquettes (Figure 2C).
Figure 2 : JAM-A-deficiency favorise l’adhésion cellulaire monocytaire résistant au flux. Adhésion des monocytes/macrophages de souris RAW264.7 cellules aux plaquettes de JAM-A+ / + et JAM-A- / - souris immobilisées sur des lames de verre enduit de collagène dans des conditions d’écoulement, avec ou sans activation de la thrombine (IIa, 0,5 nM) en présence de Il est indiqué d’inhibiteurs (A). Micrographies représentatifs des monocytes/macrophages de souris RAW264.7 cellules adhérentes à JAM-A+ / + et plaquettes JAM-A- / - après le traitement avec des anticorps anti-GPIbα ou de contrôle isotype (B). Cell adhesion exprimée en pourcentage de cellules adhérentes au départ sous la contrainte de cisaillement progressivement accrue (dyne/cm2) sur les plaquettes immobilisés après l’activation de la thrombine (IIa, 0,5 nM). P valeurs ont été calculées par l’analyse de la variance avec après le test de Tukey (n = 3-5 ; moyenne ± SEM). Echelle = 100 µm. Ce chiffre a été modifié par Zhao et al. 7 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La durée d’enregistrement prolongée (30 à 60 min) des champs uniques après perfusion de leucocytes et adhérence permet l’étude des leucocytes rampant et s’étendant de comportement et la transmigration finale sur la couche endothéliale. Dans cette étude, nous avons analysé la transmigration des monocytes humains primaires (isolé avec le kit d’isolation de monocyte, conformément aux instructions du fabricant comme décrites13) à travers une couche endothéliale. Tel que présenté dans la Figure 3, suivant arrêt ferme à l’endothélium, les monocytes se préparent à extravasate en rampant et la diffusion jusqu'à ce que le site privilégié pour la transmigration est atteint. Par la suite, monocytes pénètrent la barrière cellulaire endothéliale soit par migration para - ou transcellulaire. Transmigrer cellules étaient définies comme des cellules qui se propagent sur les cellules endothéliales, en étendant leurs pseudopodes et en traversant la barrière endothéliale, diminuant ainsi leur éclat.
Figure 3 : In vitro transmigration des monocytes primaires à travers une monocouche endothéliale. Transmigration rampante et épandage et finale de monocytes à travers l’endothélium est enregistrée toutes les 15 s pour 30 min. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Ce dosage in vitro est une méthode simple pour étudier les mécanismes sous-jacents de recrutement des leucocytes au cours de l’inflammation vasculaire, mais il y a certains points critiques à noter. La première condition pour réaliser avec succès ce test est la perfusion des leucocytes sur un intact et anastomosé vasculaires ou monocouche plaquettaire. Ceci peut être réalisé en enduisant préalable des surfaces avec du collagène de type I. En général, lorsque vous travaillez avec des cellules vasculaires primaires, il est important de détacher délicatement à l’aide de la solution recommandée des détachement de la collagénase contenant des cellules (voir la Table des matières), qui est moins rigoureuse, mais aussi efficace que la trypsine. Pour les monocouches de plaquettes, il est important de laver délicatement les plaquettes lors de l’isolation pour empêcher l’agrégation et l’activation des plaquettes.
Une autre considération critique maintient la continuité de la pompe mode de retrait utilisé pour la perfusion, car une discontinuité mène à perturbé les conditions de taux et de cisaillement de débit. Ainsi, cela se traduit par l’inexactitude de réelles contraintes de cisaillement et, ultérieurement, à une interprétation erronée du processus physiologique dépendants du cisaillement. Ceci peut être évité par un entretien régulier de la pompe. En outre, essentielle pour la continuité durant la perfusion est l’utilisation d’une seringue de frais pour chaque expérience. Depuis la texture de la gomme dans les modifications de la seringue avec l’usage et le temps entre les expériences, il empêche un retrait continu.
Une autre étape critique est la prévention de l’air devient emprisonné durant la perfusion de leucocytes, étant donné que l’air sera ensuite déchirez les cellules de la surface et modifier les conditions de cisaillement. Ceci peut être évité en rinçant tous les tubes avant toute utilisation d’une eau ultra pure, puis avec du tampon d’essai. Aussi, lors de la connexion de tube de tampon à suspension cellulaire, ou d’une affection à l’autre, il est important de maintenir les interfaces liquides pendant la connexion. Ceci peut être réalisé en pressant sur le tube ou de ne pas altérer les niveaux de liquides dans le tube. En outre, le volume de fluide du perfusat devrait être toujours suffisant pour éviter que le niveau descendre au-dessous de l’extrémité de la tubulure et, ainsi, l’air étant repris dans le système.
Une possibilité de limiter cet essai pourrait être l’utilisation des cellules cultivées, qui sont conservés dans un environnement artificiel, c'est-à-dire cultivés sur une surface plastique entourée d’un milieu qui ne modélise pas avec précision l’état in vivo . Bien que le physicochimique et environnement physiologique peuvent être contrôlées avec précision, les cellules cultivées ont un taux de croissance rapide, ce qui augmente la variabilité génétique et donc de l’hétérogénéité des cellules au sein d’une population. En outre, le vasculaire- ou monocouche plaquettaire est constituée d’un seul type cellulaire. En particulier, lors d’enquêtes sur les interactions endothéliales-leucocyte, c.-à-d., transmigration des leucocytes à travers la barrière cellulaire endothéliale, le rôle physiologique de la membrane de sous-sol sous-jacente cellules endothéliales et péricytes ne peuvent pas être prises en compte. Sinon, il pourrait être intéressant de créer un environnement multicellulaire en mettant en œuvre des techniques de culture de cellules 3D dans ce test.
Pour résumer, compte tenu de ces points, l’essai à flux laminaire peut être efficacement appliquée dans différents modèles d’inflammation vasculaire. En particulier, il peut être facilement modifié pour adresse spécifique des questions de recherche, c'est-à-dire l’ajustement de l’effort de cisaillement en soit faisant varier le débit du perfusat, la viscosité du fluide, ou le canal hauteur et la largeur. En particulier, ce dernier est d’importance puisque les changements de dimensions de chambre de flux réduisent le volume de liquide ou de cellules nécessaires. Fluorescence de plus, différent marquage des leucocytes ou des molécules spécifiques de vasculaire ou monocouches de plaquettes peuvent être utilisés pour étudier les interactions cellule-cellule.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions les Drs Martin M. Schmitt et Fraemohs de la ligne. Ce travail a été soutenu par la Fondation néerlandaise pour la recherche scientifique (ZonMW VIDI 016.126.358 Landsteiner Fondation pour la recherche sur la transfusion sanguine (LSBR Nr. 1638) et le Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) attribué à R.R.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
- Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
- Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
- Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
- Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
- Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
- Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).
