Summary
Лейкоциты жадно взаимодействуют с сосудистой лейкоцитов и тромбоцитов после травмы судно стены или во время воспаления. Здесь мы опишем простой ламинарного потока на основе анализа характеризовать молекулярные механизмы, которые лежат в основе взаимодействия между лейкоцитов и их партнерами по сотовой.
Abstract
Набор лейкоцитов после травмы или воспаления сайты травмы или повреждения тканей была исследована в последние десятилетия и привело к концепции Каскад адгезии лейкоцитов. Однако точные молекулярные механизмы, участвующие в лейкоцитарной набора еще определены не полностью. Поскольку набор лейкоцита остается важным вопросом в области инфекции, воспаления и иммунных исследований (авто-), мы представляем простой ламинарного потока на основе анализа для изучения основных механизмов адгезии, де адгезии, и трансмиграции лейкоцитов при венозной и артериальной потока режимах. В vitro assay может использоваться для изучения молекулярных механизмов, которые лежат в основе взаимодействия между лейкоцитов и их клеточных партнерами в различных моделях сосудистого воспаления. Этот протокол описывает ламинарного потока на основе анализа, используя камеру параллель потока и инвертированным микроскопом контраст фазы, подключен к камере для изучения взаимодействия лейкоциты и эндотелиальных клеток или тромбоциты, которые могут быть визуализированы и зарегистрированы то проанализированы в автономном режиме. Эндотелиальные клетки, тромбоциты или лейкоциты могут быть предварительно обработанных с ингибиторами или антител для определения роли конкретных молекул в ходе этого процесса. Сдвига условия, т.е. артериальной или венозной касательное напряжение, может быть легко адаптирована по вязкости и расхода жидкости перфузии и высота канала.
Introduction
После травмы, воспаление или инфекция лейкоциты быстро реагировать на возбудителя - или повреждения связанные молекулярные модели (PAMPs, DAMPs), изменения в активированное состояние и выбраться поток крови к местам воспаления и тканей повреждения. Лейкоциты способность взаимодействовать с их клеточном и молекулярном окружающей среды имеет важное значение для их правильной работы как иммунные клетки, как подчеркнул генетических расстройств, таких как дефицит адгезии лейкоцитов1. Лейкоцитарной адгезии был предметом интенсивных исследований в течение последних десятилетий, и это привело к концепции Каскад адгезии лейкоцитов в начале 1990-х2,3. Лейкоцитарной адгезии инициируется селектина посредничестве захвата лейкоциты эндотелия, вызывая клеток для пролонгировать поверхности сосудов. Это подвижного позволяет лейкоцитов для проверки эндотелий прыгните мигрирующих подсказки, например, chemokines, которые вызывают активацию интегринов. Впоследствии активированные интегринов посредником привязки эндотелиальных лигандами, результате фирмы лейкоцита ареста. Лейкоциты могут впоследствии подготовиться к extravasate ползать и распространение, перед прорезывать эндотелиальной монослоя и пролетный в основной ткани. Основная концепция канонической лейкоцита Каскад остается практически неизменной с момента ее введения, с некоторые промежуточные шаги добавил4. Тем не менее точные молекулярные механизмы и роли многих игроков, участвующих в лейкоцитарной найма не выяснены до настоящего времени, и лейкоцитарной набор остается важным вопросом в области инфекции, воспаления и (авто-) иммунной исследования.
Например во время сосудистый воспалительных заболеваний как атеросклероз, увеличилась лейкоцита вербовки в развитие зубного налета диски судна стены. Нестабильные атеросклеротических бляшек может разрыва, привело к массовым активации тромбоцитов и свертывающей системы и впоследствии окклюзии сосуда5. Это может привести к тяжелой сердечно-сосудистые исходы, такие как инфаркт миокарда или инсульт. Кроме того эндотелиальных денудации как она возникает клинически, например после стентирования коронарных артерий, приводит к множество взаимодействий лейкоцитов и тромбоцитов до внутренней стены подвергается сосуд (например, матрица компоненты и гладкой мышечных клеток) и лейкоцитов с тромбоцитов, охватывающих сосудистых повреждений. Эти взаимодействия имеют важное значение для дальнейшего развития этого заболевания как Моноцит тромбоцитов взаимодействия может управлять neointima формирования6,7. Кроме того тромбоцитов и лейкоцитов взаимодействия при посредничестве Интегрин лейкоцита Mac-1 (αMβ2) и тромбоцитов GPIbα недавно были определены как Роман драйвера тромбоза в мышей8.
Учитывая широкую доступность крови человека и животных как источник лейкоцитов и тромбоцитов исследований, и широкий спектр изолированных матрица молекул и увековечен клеточных линий лейкоцитов и сосудистого происхождения, это возможно для имитации лейкоцитов взаимодействие в поток в лаборатории установки, используя специально разработанные потока перфузии камер. Многие варианты были разработаны за последние десятилетия, начиная от вакуум driven самоклеящиеся перфузии камер. Все варианты имеют в общем, которые неподвижной части (например, искусственный сосудистый клетки или матрица белков) собираются в больших герметичным камеру с предварительно определенный канал включение перфузии жидкости над неподвижной части. Кроме того прогресс в технологии формования включена разработка заказных решений на основе силики полимеров9. Главным образом определить касательное напряжение характеристики потока перфузии устройство10вязкости и расхода жидкости перфузии и высота канала. В этой статье мы представляем в vitro метод для изучения основных механизмов адгезии, снижения адгезии и переселение лейкоцитов при венозной и артериальной потока режимах. Преимущество методов, представленные здесь заключается в том, что они могут быть выполнены с использованием общей микроскоп камера подключена флуоресценции и не требуют экспериментаторов обладают высокой технической квалификации. В пробирке можно манипулировать во многих отношениях (например, путем добавления ингибиторы или блокирование антитела) и таким образом является применимым в различных моделях сосудистого воспаления и позволяет исследование адгезии функций белков или Оценка конкретных соединений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены медицинской этики и животных этические советы Маастрихтского университета.
1. на основе потока проба с клеток человека
-
Изоляция тромбоцитов крови человека
- Нарисуйте венозной крови в антикоагулянтом цитрат (3,2%).
- Добавить 1/15 объем кислоты цитрат декстрозы (ACD: 80 мм тринатрия цитрат, лимонная кислота 52 мм и 183 мм глюкозы) в крови.
- Центрифуга на 350 x g без тормоза за 15 мин до получения тромбоцитов богатой плазмы (PRP).
- Супернатант передать 15 мл Конические трубки и добавить 1/20 объем ACD.
- Центрифуга в 1110 g без тормоза за 15 мин до получения тромбоцитов бедных плазмы (ППС).
- Выбросите супернатант. Отрезать конце кончика пипетки (P 1000), что делает широкий родила, которых СПИД в предотвращении активации тромбоцитов и тщательно приостановить гранулы тромбоцитов в том же объеме, как ОТР в тромбоцитов буфер рН 6,6 (РВ: 136 мм NaCl, 10 мм Hepes 2,7 мм KCl, 2 мм MgCl2, альбумина bovine сыворотки 0,1% и 0,1% раствор глюкозы). Добавить 1/20 объем ACD и аккуратно перемешать.
- Гранулы тромбоцитов в 1110 g без тормозов на 15 мин.
- Отменить супернатант и тщательно приостановить тромбоцитов как выше в 1 мл тромбоцитов буфере (рН 7,5).
- Измерьте содержание тромбоцитов в 1/10 разрежения с автоматизированный гематологический анализатор.
- Отрегулируйте громкость с буфером тромбоцитов (рН 7,5) для достижения количество 2 x 10-7/мл.
-
Изоляция полиморфноядерных клеток из крови человека (адаптировано из Бринкманн и др. 11 )
- Нарисуйте 24 мл крови в гепарина (10 ед/мл), как антикоагулянт.
- Добавить 6 мл 1,077 г/мл плотности polysucrose натрия diatrizoate среды (см. Таблицу материалы) до 15 мл Конические трубки и тщательно слой 5-6 мл цельной крови на вершине.
- Центрифуги для 20 минут, 800 x g без тормозов.
- Аспирационная и отбросить ясно желтоватым верхний слой и передаче этапа нижнего красноватые, содержащие гранулоцитов в свежие 15 мл конические трубы. Вымойте клетки путем добавления PBS, содержащий 2 мм ЭДТА в окончательный объем 14 мл и центрифуги для 10 мин на 300 x g без тормозов.
- В то же время, готовить градиент средней плотности (например, percoll, см. Таблицу материалы) рабочий раствор путем смешивания средний градиент плотности 18 мл 2 мл 10 x PBS Стоковый раствор. Разбавляют этот рабочий раствор с PBS (1 x) для получения 4.25 мл каждого из 85%, 80%, 75%, 70% и 65% градиента средних решений.
- Подготовьте 2 конические трубы с градиент плотности, расслоение 2 мл каждый средний процент поверх друг друга. Начните с самой высокой концентрацией и далее в порядке убывания. Марк слои на трубе с маркером воды доказательство.
- Тщательно слой 2 мл суспензии клеток на каждой из двух подготовленных градиентов.
- Центрифуги для 20 минут, 800 x g без тормозов в центрифугу тщательно сбалансированный.
- После центрифугирования, снимают верхний слой и большинство из 65% слой (первое кольцо) с получения и собирать в новые трубы белый, оставаясь интерфазы до 85% слой (второе кольцо, ПМН).
- Вымойте клетки, заполнив трубы с PBS 2 мм ЭДТА и центрифуги для 10 мин на 300 x g без тормозов.
- Удалить супернатант и приостановить отложившейся ячейки (обычно ≥95% ПМН) в 1 мл Хэнка буфера (рН 7,45), содержащий 10 мм Hepes и 0,2% человеческого альбумина (Assay buffer).
- Подсчитать ячейки, используя Горяева и приостановить клеток в 1 x 10-6/мл.
- Продолжите с люминесцентные маркировки и перфузии лейкоцитов (шаг 3.3).
-
Подготовка адэрентных тромбоцитов и сосудистой клеток монослои
-
Подготовка клетки культуры блюдо (культивируемых клеток)
- Предварительно покройте блюда культуры клеток 35 мм с 1 мл разбавленной крысы хвост коллагена (30 мкг/мл разбавленной в PBS, фильтруется через фильтр 0.2 мкм).
- Инкубируйте 30 минут при 37 ° C, отменить решение коллаген и мыть блюдо с PBS.
-
Культура клеток сосудистой блюдах культуры
- Отсоединить основной (например, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) или увековечен сосудистой клетки (например, EA. Hy926, SVEC) выросла до впадения в колбе T75 с 1,5 мл раствора отряд клеток (например, accutase). Добавление 4,5 мл соответствующего роста средних для нейтрализации клеток отряд решения и определения концентрации клеток с ячейкой подсчета камеры. Приостановите клетки на 0,5 x 105 клеток/мл в соответствующий рост среднего (например, средний рост полный эндотелиальных клеток).
- Добавьте 2 мл суспензии клеток к каждому блюду 35 мм. Культура клетки в увлажненные инкубатора при 37 ° C с 5% CO2 до слияния (с 24-48 ч, в зависимости от типа ячейки).
-
Стекло coverslip подготовки (Адгезивная тромбоцитов)
- Погружать стекла coverslip раз в HCl-EtOH (1,2 М / 50% v/v).
- Промывайте coverslip 2 раза в ультрачистая вода.
- Сухой coverslip под N2.
- Предварительно пальто coverslip стекла с 100 мкл, в соответствии с позицией канала перфузии палаты разреженных крысы хвост коллаген типа I (30 мкг/мл разбавленной в PBS, фильтруется через фильтр 0.2 мкм).
- Инкубируйте 30 мин на RT, отменить решение коллаген и мыть coverslip 3 x с PBS.
- Блок coverslip коллагена покрытием с 1% BSA в HEPES на 0,5 ч на RT.
- Вымыть и высушить coverslip и смонтировать его в камеру перфузии. Изолируйте тромбоцитов человека или мыши крови, как указано в шаге 1.1 и 2.1, соответственно.
-
Иммобилизация тромбоцитов
- 70 мкл суспензии 2 x 10 по7тромбоцитов/мл на канал и проинкубируйте 1,5 ч при 37 ° C и 5% CO2.
- Тщательно Замените non сторонник тромбоцитов блокирования решения (5% BSA в HEPES) для по крайней мере 30 минут на RT. Continue с люминесцентные маркировки и перфузии лейкоцитов (шаг 3.3).
-
Стимуляция монослоя клеток сосудов
- Стимулировать клетки сосудистой, заменив СМИ с свежими СМИ, содержащие 10 нг/мл фактор некроза опухоли альфа (TNFα) за 4 ч при 37 ° C и 5% CO2.
-
Подготовка клетки культуры блюдо (культивируемых клеток)
2. на основе потока проба с мышиных клетки
-
Изоляция тромбоцитов крови мыши
- Крови обратить сердца прокола иглой 21 G (~ 1 мл) от наркоза (кетамин 80 мг/кг и medetomidine 0,3 мг/кг) 6-8 недели-старых мышей (C57Bl/6) в цитрат (3,2%), как антикоагулянт.
- Добавьте 1/6 объем ACD.
- Центрифуга на 220 x g, Средний тормозной 5 минут для получения тромбоцитов богатой плазмы (PRP).
- Передать новые трубки супернатант (~ 600 мкл) плюс 1/3 красных кровяных клеток
- Центрифуга на 95 x g без тормозов для 6 мин.
- Передача супернатант (PRP) и измерять концентрацию тромбоцитов в разведении 1/10 в Tyrode в буфере (TH буфера: 136 мм NaCl, 5 мм Hepes, 2,7 мм KCl, 0,42 мм NaH2PO4* H2O, 2 мм MgCl2, альбумина bovine сыворотки 0,1% и 0,1% глюкоза) с автоматизированный гематологический анализатор.
- Вымойте тромбоцитов, добавив 1/25 объем ACD + 0,1 ед/мл apyrase и центрифуги на 2870 g, Средний тормозной на 2 мин.
- Отменить супернатант и добавить 600 мкл й буфер, 1/10 объема ACD и 0,1 apyrase ед/мл. Отрезать верхушку пипетки (P 1000), что делает широкий родила, который помогает в профилактике активации тромбоцитов и осторожно приостановить гранулы.
- Центрифуга на 2870 g, Средний тормозной 2 мин
- Отменить супернатант и осторожно приостановить тромбоцитов в буфере тыс.
- Отрегулируйте громкость с TH буфер для достижения количество 2 x 10-7/мл.
-
Подготовка монослои адэрентных тромбоцитов
- Подготовка стекла coverslip (Адгезивная тромбоцитов) согласно 1.3.3.
-
Иммобилизация тромбоцитов
- 100 мкл суспензии 2 x 10 по7тромбоцитов/мл на канал и проинкубируйте 1,5 ч при 37 ° C и 5% CO2.
- Тщательно Замените non сторонник тромбоцитов блокирования решения (5% BSA в HEPES) для по крайней мере 30 минут на RT. Continue с люминесцентные маркировки и перфузии лейкоцитов (шаг 3.3)
-
Стимуляция мыши тромбоцитов монослоя
- До перфузии лейкоцитов (шаг 3.3), стимулировать тромбоцитов, перфузии тромбина (0,5 Нм) в буфер HHHSA за 3 мин при 37 ° C.
3. люминесцентные маркировки и перфузии лейкоцитов (ПМН или THP-1 для человека и RAW264.7 или мыши моноциты для мышиных Assay на основе потока)
-
Флуоресцентные метки
- Ярлык лейкоцитов (1 х 106/мл) с пятно клеток permeant Зеленый флуоресцентный нуклеиновой кислоты (1 мкм). Инкубировать клетки для 30 минут при 37 ° C.
- Вымыть клетки с PBS центрифугированием при 300 g x 5 минут и приостановить клетки к концентрации 0,5 х 106 клеток/мл (5 мл на условие теста, в зависимости от расхода) в assay buffer.
-
Подготовка Пробирная палата потока
- Для адгезии лейкоцитов на монослое клеток отказаться от среднего культуры клеток от блюдо и собрать его в камеру потока. Подключение труб к шприцу. Для адгезии лейкоцитов на иммобилизованных тромбоцитов Подключите микро слайд шприца. Предварительно теплой на водяной бане до 37 ° C.
- Возьмите шприц перфузии (50 мл), установить шприц на держатель шприц и установите насос на снять режим. Установка насоса громкости, 0 мл и задайте диаметр 26.70 мм для 50 мл шприц.
- Подключите коннектор "Луер" локоть к одному концу трубки. Место стяжку замком luer шприц и подключить трубы с локоть разъем luer luer замок автосцепки. Подключите конец свободного трубы к камере потока.
-
Лейкоцитарные перфузии и адгезии
- Для адгезии лейкоцитов на монослое клеток отказаться от среднего культуры клеток от блюдо и собрать его в камеру потока. Подключение труб к шприцу. Для адгезии лейкоцитов на иммобилизованных тромбоцитов Подключите микро слайд шприца.
- Для лейкоцитов перфузии и адгезии над сосудистой- или тромбоцитов монослоя, поместите второй трубы в конической Тюбик 50 мл, содержащие assay buffer и заполнения трубки с 1 мл пипетки, затем сожмите трубки и подключить его к камере потока.
- До лейкоцита перфузии добавить 3 мм CaCl2 и 2 мм MgCl2 суспензию клеток и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
- Perfuse аналитического буфера до перфузии клеток, чтобы удалить возможные воздуха из камеры и труб.
- Закрыть концы трубы, сжимая их жесткой и переключения труб из буфера пробирного суспензию клеток, предотвращая пузырьки воздуха от защемления. Perfuse клетки с соответствующего потока скорость/касательное напряжение, до тех пор, пока прибывают первые клетки.
- Perfuse клетки с соответствующего потока скорость/касательное напряжение на 2 мин и захватить по крайней мере 6 фотографии между 2-6 мин прокатки и адэрентных клеток с помощью микроскопа контраст/флюоресценцию Перевернутый фазы (например, EVOS-FL) связано с использованием 100 крат для цифровой CCD и CMOS камеры.
Примечание: Потока скорость/касательное напряжение зависит от потока размеры камеры и вязкость perfusate. Для перфузии камеры, используемые здесь (см. Таблицу материалы):
Τ =η* 97.1*Φ
Τ: Касательное напряжение (1 Дин/см2)
Η: вязкость (0,015 dyn * s/см2)
Φ: скорость потока (0,67 мл/мин)
-
Де адгезии лейкоцитов
- Для de-adhesion переключение труб из суспензии клеток пробирного буфер, сжимая труб, предотвращая стать в ловушке пузырьков воздуха.
- Отсоедините клетки, перфузии с Пробирной буфера с соответствующим потока скорость/касательное напряжение (см. 3.3.7 Примечание).
-
Лейкоцитарные перелетах
- Для переселения лейкоцитов, perfuse лейкоциты (шаг 3) до тех пор, пока достаточное количество лейкоцитов присоединиться (~ 50 клеток/просмотреть поле).
- Замените лейкоцита подвеска аналитического буфера.
- Запись пролетный клетки на промежуток времени каждые 10 – 15 s для 30 – 60 минут при 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для изучения эндотелиальной лейкоцитарной адгезии, дневно обозначенные THP-1 клетки были увлажненную над TNFα - или не стимулирует эндотелиальной монослоя за 2 мин на 3 Дин/см2. Общее количество адэрентных клеток monocytic был определен после 2 мин перфузии, захватив 6 независимых полей в течение 2-6 мин. Адэрентных клеток были количественно оценены в по крайней мере 6 изображения, захваченные с помощью микроскопа контраст/флюоресценцию Перевернутый фазы (например, EVOS-FL) с помощью 10-кратном подключен к цифровой CCD и CMOS камеры и среднем была выражена как адэрентных клеток / 2мм. После эндотелиальной стимуляции с TNFα арест THP-1 значительно увеличилась по сравнению с кератоз эндотелия. Представитель микроскопии и количественная оценка твердо THP-1 приверженцем не - или TNFα-стимулирует эндотелиальных клеток представлена на рисунке 1. Адгезии тромбоцитов и лейкоцитов оценивали перфузии дневно обозначенные нейтрофилов через ЛОВУШКУ-6 - или не стимулирует тромбоцитов монослоя за 2 минуты на 1 Дин/см2. Адгезивная нейтрофилов были количественно как упомянуто выше. Ловушка-6 стимуляции значительно увеличить адгезию нейтрофилов по отношению к кератоз тромбоцитов. Представитель видео и количественная оценка твердо адэрентных нейтрофилов к не - или ловушка-6-стимулирует тромбоцитов монослоя представлена в Рисунок 1B.
Рисунок 1 : Эндотелия и тромбоцитов лейкоцитарной адгезии условиях потока. Количественная оценка и представитель микроскопии адгезии клеток человека monocytic (THP-1) для эндотелиальных клеток (HUVEC) посеян на коллаген покрытием культуры блюда условиях потока, с или без активации TNFα (10 нг/мл) (A). Количественная оценка и представитель микроскопии адгезию нейтрофилов человека тромбоцитов человека, иммобилизованных на коллаген покрытием стекла слайды условиях потока, без или с активации ловушки-6 (50 мкм) (B). Непарных t теста были рассчитаны значения P (n = 3; означает ± SD). Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Кроме того этот assay может быть реализован для изучения роли молекул адгезии, таких как молекулы соединительной адгезии тромбоцитов (JAM-A). Адгезия RAW264.7 мыши моноцитов/макрофагов для тромбоцитов монослоя от JAM-A (trJAM-A+/ +) и джем-A-недостаточным (trJAM-A- / -) мышах оценивалась в наших бывших исследования7. Как заметил в нем, тромбоцитов дефицит джем-А увеличение адгезии мыши моноцитов в монослое тромбоцитов, по сравнению с дикого типа мыши (рис. 2A-B). В качестве альтернативы как описано12мыши нейтрофилов может быть изолированы от мышей.
Для изучения базовых механизмов, таких как сцепления молекул, участвующих в взаимодействии тромбоцитов и лейкоцитов, специфическими рецепторами на поверхности может быть заблокирован. В вышеупомянутом исследовании блокирование GPIbα тромбоцитов и лейкоцитов αMβ2 значительно сократилась Моноцит адгезии, определив роль для оси2 MGPIbα-α β в увеличение Моноцит вербовку в джем-A- / - тромбоцитов (A-BРисунок 2). Кроме того клетки отряда может быть эксперименты расследовать касательное напряжение зависимость тромбоцитов и лейкоцитов взаимодействий. Для измерения потока зависимых отряд моноцитов касательное напряжение постепенно увеличена с 0 до 20 Дин/см2. В этом исследовании, адгезии клеток RAW264.7 на джем-A- / - тромбоцитов было более устойчивы к сдвига стресс, по сравнению с ВАРЕНЬЕМ-A+/ + тромбоцитов (рис. 2C).
Рисунок 2 : JAM-A-дефицит способствует потока устойчивостью monocytic клеточной адгезии. Адгезии мыши моноцитов/макрофагов RAW264.7 клетки к тромбоцитов с ВАРЕНЬЕМ-A+/ + и джем-A- / - мышей, иммобилизованных на коллаген покрытием стекла слайды условиях потока, с или без активации тромбина (IIa, 0.5 Нм) в указанные ингибиторы (A). Представитель микроскопии мыши моноцитов/макрофагов RAW264.7 клетки приверженцем джем-A+/ + и джем-A- / - тромбоциты после лечения с изотипа управления или анти GPIbα антител (B). Сотовый адгезии, выражается в процентах первоначально адэрентных клеток под постепенно увеличение касательное напряжение (дин/см2) на иммобилизованных тромбоцитов после активации тромбина (IIa, 0.5 Нм). ANOVA были рассчитаны значения P с Тьюки после тестирования (n = 3-5; означает ± SEM). Шкалы бар = 100 мкм. Эта цифра была изменена с Чжао и др. 7 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Время длительной записи (30-60 мин) единого поля после перфузии лейкоцитов и сцепление позволяет исследование лейкоцитарной ползать и распространение поведение и окончательное переселение через эндотелиального слоя. В рамках этого исследования мы проанализировали трансмиграции первичных человеческих моноцитов (изолированные в комплект изоляции Моноцит, согласно инструкции производителя как описано13) через эндотелиального слоя. Как представлены на рис. 3, следующие фирмы арест эндотелия, моноциты подготовиться к extravasate ползать и распространения пока не достигнуто предпочтительным местом для переселения. Впоследствии моноциты проникнуть барьер эндотелиальных клеток либо путем переноса пара - или transcellular. Пролетный клетки были определены как клетки, которые растянуть на эндотелиальных клеток, расширяя их Псевдоподия и проходящей через эндотелиальный барьер, уменьшая их яркость.
Рисунок 3: В пробирке трансмиграции первичных моноцитов через эндотелиальные монослоя. Моноцит обхода и распространяя и окончательное переселение через эндотелий был записан каждые 15 s 30 мин , пожалуйста, нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот assay в vitro простой метод для изучения основных механизмов найма лейкоцитов во время сосудистого воспаления, но есть некоторые критические точки следует отметить. Первым требованием для успешного выполнения этот assay является перфузии лейкоциты над нетронутыми и вырожденная сосудистой или тромбоцитов монослоя. Это может быть достигнуто путем предварительного покрытия поверхностей с коллаген типа I. В целом, при работе с первичных клеток сосудистой, важно аккуратно отсоединить клеток с использованием рекомендуемое решение коллагеназы содержащих отряд (см. Таблицу материалы), который является менее строгим, но столь же эффективным, как трипсина. Для тромбоцитов монослои важно, чтобы аккуратно помыть во время изоляции для предотвращения активации тромбоцитов и агрегации тромбоцитов.
Другое критическое рассмотрение сохранения непрерывности насоса режим вывода, используемый для перфузии, поскольку разрыв приводит к нарушенных условиях скорость и наклон потока. Таким образом это приводит к неточности фактической касательное напряжение и, впоследствии, к неправильному толкованию физиологически сдвига зависимых процессов. Это может быть предотвращено путем регулярного технического обслуживания насоса. Кроме того решающее значение для обеспечения непрерывности в перфузии является использование свежих шприц для каждого эксперимента. Начиная с текстуры резины внутри шприца изменения с увеличением использования и времени между эксперименты он предотвращает непрерывного ухода.
Важным шагом является предотвращение воздуха становится захваченных во время перфузии лейкоциты, так как воздух будет впоследствии оторвать клетки с поверхности и изменять условия сдвига. Это может быть предотвращено путем полоскать всех труб до использования с ультра-чистой водой, а затем с буфером пробирного. Кроме того при подключении труб от аналитического буфера для суспензии клеток, или из одного состояния в другое, важно поддерживать жидкости интерфейсы во время подключения. Это может достигаться, сжимая трубы или, не изменяя уровень жидкости внутри труб. Кроме того объем жидкости perfusate всегда должно быть достаточно для предотвращения уровень падения ниже конца трубы и, таким образом, воздуха рассматривается в системе.
Возможное ограничение этот assay может быть использование культивируемых клеток, которые поддерживаются в искусственной среде, т.е. культивированный на поверхности пластика, окруженный средство которое не точно модель государства в естественных условиях . Хотя физико и физиологической среды можно точно контролировать, культивируемых клеток имеют быстрый рост, который увеличивает генетической изменчивости и, таким образом, гетерогенности клеток в составе населения. Кроме того сосудистая- или тромбоцитов монослоя состоит из одной ячейки типа только. В частности, при расследовании эндотелиальной лейкоцита взаимодействия, т.е., трансмиграции лейкоцитов через барьер эндотелиальных клеток, физиологически соответствующую роль базовой эндотелиальных клеток базальной мембраны и pericytes не может приниматься во внимание. Кроме того было бы интересно создать многоклеточных окружающей среды путем внедрения методов культивирования 3D-клеток в этот assay.
Таким образом, учитывая эти моменты, на основе ламинарного потока assay может эффективно применяться в различных моделях сосудистого воспаления. В частности это могут быть легко изменены для решения конкретных исследовательских вопросов, т.е. корректировка касательное напряжение варьируя скорость потока perfusate, жидкости вязкость, или канал высоты и ширины. В частности последний имеет значение так как изменения в размеры камеры потока уменьшить объем жидкости или клетки необходимы. Кроме того, различные флуоресценции маркировки лейкоцитов, или конкретных молекул сосудистой или монослои тромбоцитов может быть использован для изучения взаимодействия ячеек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Drs. Мартин м. Шмитт и линии Fraemohs. Эта работа была поддержана Нидерландского фонда научных исследований (ВиДи ZonMW 016.126.358, Ландштайнер Фонд исследований переливания крови (LSBR Nr. 1638) и Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) присуждена R.R.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
- Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
- Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
- Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
- Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
- Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
- Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).
