Summary
לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.
Abstract
הגיוס של לויקוציטים בעת פציעה או דלקת לאתרים של פציעה או נזק לרקמות נחקר במהלך העשורים האחרונים, הביא הרעיון של המפל אדהזיה ליקוציט. עם זאת, המנגנון המולקולרי המדויק מעורב ליקוציט גיוס לא עדיין מלא זוהו. מאז הגיוס ליקוציט נותר נושא חשוב בתחום של זיהום, דלקת, ומחקר (auto-) המערכת החיסונית, אנו מציגים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה ללמוד מנגנונים הבסיסית של הדבקה, אדהזיה ולהשתחרר, ו גלגול של לויקוציטים תחת משטרים ורידים, עורקים זרימה. וזמינותו במבחנה ניתן ללמוד את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם במודלים שונים של דלקת בכלי הדם. פרוטוקול זה מתאר assay מבוסס זרימה שכבתית באמצעות תא במקביל זרימה במיקרוסקופ ניגוד שלב הפוכה מחובר מצלמה ללמוד את האינטראקציות של לויקוציטים, תאי אנדותל או טסיות הדם, אשר ניתן דמיינו הוקלט אז ניתח באופן לא מקוון. תאי אנדותל, טסיות דם או לויקוציטים יכול להיות pretreated עם מעכבי או נוגדנים כדי לקבוע את התפקיד של מולקולות ספציפיות בתהליך זה. הטיה תנאים, דהיינו עורקי או ורידי גזירה, ניתן להתאים בקלות על ידי צמיגות ו קצב זרימה של נוזלים perfused, ואת הגובה של הערוץ.
Introduction
על פציעה, דלקת או זיהום, לויקוציטים להגיב במהירות כדי פתוגן או נזק-הקשורים מולקולרית דפוסי (PAMPs, DAMPs), לשנות את מצב מופעל ועל העברת מחוץ לזרם הדם לאתרים של דלקת ברקמות נזק. היכולת של לויקוציטים לאינטראקציה עם הסביבה תאית ומולקולרית שלהם חיוני לתפקוד הנכון שלהם כמו תאים חיסוניים, כפי שמודגש על ידי הפרעות גנטיות כגון ליקוציט אדהזיה מחסור1. ליקוציט אדהזיה כבר הנושא של החקירה אינטנסיבי במהלך העשורים האחרונים, כתוצאה מכך הרעיון של המפל אדהזיה ליקוציט בתחילת שנות ה-902,3. אדהזיה ליקוציט הוא שיזם התפיסה בחירת שמלות בתיווך של לויקוציטים כדי אנדותל, גורם לתאים לגלגל על פני כלי הדם. זה מתגלגל מאפשר לויקוציטים לסריקה אנדותל מכורך רמזים נודדות, למשל, נוגדנים, אשר זירוז הפעלת אינטגרינים. לאחר מכן, הפעלת אינטגרינים מתווכים האיגוד על ליגנדים אנדותל, וכתוצאה מכך ליקוציט המשרד מעצר. לויקוציטים יכול לאחר מכן התכונן בורחת על ידי זוחלים והפצת, לפני חדירה של טפט אנדותל, transmigrating לתוך הרקמה הבסיסית. התפיסה הבסיסית של המפל ליקוציט הקנוני נשאר ברובו ללא שינוי מאז השקתו, עם מדרגות ביניים להוסיף4. ובכל זאת, את המנגנונים המולקולריים המדויק ואת התפקידים של השחקנים הרבים המעורבים ליקוציט הגיוס יש לא הובהרו עד כה, ונשאר גיוס ליקוציט מהווים נושא חשוב בתחום של זיהום, דלקת, ועמיד (auto) מחקר.
לדוגמה, במהלך מחלות דלקתיות בכלי הדם כגון טרשת עורקים, גדל ליקוציט גיוס לתוך התפתחות רובד כלי כוננים קיר. הפלאק טרשת עורקים לא יציב ייתכן קרע, מובילה להפעלה מסיבית של טסיות הדם, במערכת קרישת הדם, ולאחר מכן ל סגר של כלי השיט5. זה עלול לגרום לתוצאות לב וכלי דם חמורים כגון אוטם שריר הלב או שבץ מוחי. בנוסף, אנדותל חסיפה כפי שהיא מתרחשת קלינית, למשל לאחר סטנט של עורק כלילי, מוביל אל שפע של אינטראקציות של לויקוציטים, טסיות הפנים קיר הספינה החשוף (למשל, מטריקס רכיבים וחלקה. שרירים תאים) של לויקוציטים עם טסיות כיסוי הפגיעה בכלי הדם. אינטראקציות אלה חשובים להמשך פיתוח של המחלה כפי מונוציט-טסיות אינטראקציות שאסע neointima היווצרות6,7. בנוסף, טסיות-ליקוציט אינטראקציות מתווכת על-ידי ליקוציט אינטגרין Mac-1 (αMβ2), טסיות GPIbα לאחרונה זוהו מנהלי התקנים הרומן של פקקת עכברים8.
לאור זמינותו רחב של דם האדם ושל בעלי החיים כמקור של לויקוציטים ולבנים וטסיות דם עבור המחקר ואת הספקטרום הרחב של מטריקס מבודד מולקולות וקווים מונצחים תא של ליקוציט ולמקור כלי דם, זה ריאלי כדי לדמות ליקוציט אינטראקציות תחת זרימה בתוך מעבדה הגדרת, באמצעות זרימת שתוכנן במיוחד זלוף צ'יימברס. וריאציות רבות עוצבו העשורים האחרונים, החל מונחה ואקום ללשכה זלוף דביק. כל הווריאציות יש במשותף זה החלק משותק (למשל, בתרבית תאים וסקולרית או מטריצה חלבונים) התכנסה לתוך תא עמיד בפני נזילה גדול מאובזר עם ערוץ מוגדרים מראש ומאפשרת זלוף של נוזלים על החלק משותק. בנוסף, ההתקדמות שהמודעות הטכנולוגיה אפשרה פיתוח פתרונות התפורים מבוססת על פולימרים סיליקה9. צמיגות ואת קצב זרימה של נוזלים perfused, ואת הגובה של הערוץ בעיקר לקבוע מאפייני זרימה זלוף התקן10גזירה. במאמר זה, נציג של שיטת במבחנה ללמוד מנגנונים הבסיסית של הדבקה, דה- אדהזיה ולאחר גלגול של לויקוציטים תחת משטרים ורידים, עורקים זרימה. היתרון של השיטות המובאות כאן היא כי יכול להתבצע באמצעות מיקרוסקופ מחוברת זריחה נפוצות והם אינם מחייבים ניסויים בעל מיומנות טכנית גבוהה. וזמינותו במבחנה ניתן לטפל בדרכים רבות (למשל, על-ידי הוספת מעכבי או חסימת נוגדנים), ולכן הרלוונטיים במודלים שונים של דלקת כלי הדם ואת מאפשר החקירה של אדהזיה חלבון פונקציות או הערכה של תרכובות ייעודיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי רפואית אתית ועל בעלי חיים אתיים לוחות של מאסטריכט האוניברסיטה.
1. מבוססת זרימה Assay עם תאים אנושיים
-
בידוד של טסיות הדם האנושי
- דם ורידי ב קרישה ציטראט (3.2%).
- להוסיף 1/15 נפח של חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD: ציטראט trisodium 80 מ מ, חומצה ציטרית 52 מ"מ ו- 183 מ מ גלוקוז) לדם.
- צנטריפוגה-350 גרם x ללא בלם למשך 15 דקות להשיג פלזמה עשיר טסיות (PRP).
- להעביר את תגובת שיקוע צינור חרוטי 15 מ"ל ולהוסיף 1/20 נפח ACD.
- צנטריפוגה ב g 1,110 ללא בלם למשך 15 דקות להשיג טסיות המסכן פלזמה (PPP).
- למחוק את תגובת שיקוע. לחתוך את הקצה של הקצה pipet (P 1000), שהופך אותו רחב נשא, אשר מסייע למניעת הפעלה טסיות, וכן להשעות בקפידה בגדר טסיות באותו אמצעי אחסון כמו PRP טסיות מאגר רמת החומציות 6.6 (PB: 136 מ"מ NaCl, 10 מ מ Hepes מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 2 מ מ MgCl2, אלבומין שור 0.1% ו- 0.1% גלוקוז). מוסיפים 1/20 נפח ACD ומערבבים בעדינות.
- גלולה טסיות הדם ב g 1,110 ללא בלם למשך 15 דקות.
- למחוק את תגובת שיקוע, בזהירות להשעות את טסיות הדם כמו מעל במאגר טסיות 1 מ"ל (pH 7.5).
- מודדים את ריכוז טסיות ב- 1/10 לדילול עם מנתח המטולוגיה אוטומטיות.
- לכוון את עוצמת הקול באמצעות מאגר טסיות (pH 7.5) כדי להשיג את ספירה של 2 x 107/mL.
-
בידוד תאי אורך חייהם של דם אנושי (מקורי Brinkmann. et al. 11 )
- צייר 24 מ של דם בהפרין (10 U/mL) בתור קרישה.
- להוסיף 6 מ של 1.077 g/mL צפיפות polysucrose-נתרן diatrizoate בינוני (ראה טבלה של חומרים) צינור חרוטי 15-mL, ו בזהירות שכבה 5-6 מ"ל דם מלא על העליונה.
- צנטריפוגה כעשרים דקות ב g x 800 ללא בלם.
- תשאף למחוק את השכבה העליונה ברור צהבהב, להעביר את שלב אדמדם התחתון המכיל גרנולוציטים לתוך צינורות חרוט צח של 15-mL. רחץ תאים על-ידי הוספת PBS המכיל 2 מ מ EDTA לאמצעי הסופי של 14 מ"ל, צנטריפוגה 10 דקות ב g x 300 ללא בלם.
- בינתיים, מכינים מדיום הדרגתיות צפיפות (למשל, percoll, ראה טבלה של חומרים) הפתרון עובד על ידי ערבוב 18 mL צפיפות בינונית הדרגתיות 2 מ ל 10 x פתרון מניות PBS. לדלל את הפתרון עובד עם PBS (1 x) כדי להשיג 4.25 גרם אחד של 85%, 80%, 75%, 70% ו- 65% פתרונות בינוני הדרגתיות.
- להכין 2 צינורות חרוט עם המילוי ההדרגתי צפיפות על-ידי שכבות 2 מ של כל אחוז בינוני אחד על גבי השני. להתחיל עם הריכוז הגבוה ביותר והמשך יורד. סמן את השכבות ברכבת התחתית עם סימן מים הוכחה.
- בזהירות שכבה 2 מיליליטר המתלים תא אל כל אחד שני מעברי הצבע מוכן.
- צנטריפוגה כעשרים דקות ב g x 800 ללא בלם ומפרידה ומאוזנת היטב.
- לאחר צנטריפוגה, הסרת השכבה העליונה ואת רוב 65% שכבה (הטבעת הראשונה) עם PBMCs, ולאסוף לתוך צינורות חדשים הלבן שנותרו interphases עד לשכבת 85% (שני טבעת, נויטרופיל).
- רחץ תאים על-ידי מילוי את צינורות עם PBS 2 מ מ EDTA, ואת צנטריפוגה 10 דקות ב g x 300 ללא בלם.
- הסר את תגובת שיקוע, להשעות את התאים sedimented (בדרך כלל ≥95% הם נויטרופיל) ב 1 מ"ל של האנק מאגר (pH 7.45), המכיל 10 מ מ Hepes ו- 0.2% אלבומין אנושי (Assay מאגר).
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer וכן להשעות תאים-עונה 1 פרק 106/mL.
- להמשיך עם תיוג פלורסנט זלוף של לויקוציטים (שלב 3.3).
-
הכנת חסיד טסית דם, תא כלי דם-monolayers
-
תא תרבות מאכל הכנה (בתרבית תאים)
- מעיל מראש את המנות תרבות תא 35 מ מ עם 1 מ"ל של קולגן זנב העכברוש מדולל (30 µg/mL מדולל ב- PBS מסונן מעל מסנן 0.2 µm).
- תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לבטל את הפתרון קולגן, לשטוף את הצלחת פעם אחת עם PBS.
-
התרבות של תאי הדם במנות תרבות
- ניתוק הראשית (למשל, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) או מונצחים כלי דם תאים (למשל, EA. Hy926, SVEC) גדל הנהרות בבקבוקון T75 עם 1.5 מ ל פתרון של ניתוק התא (למשל, accutase). הוסף 4.5 מ של מדיום הגידול המתאים לנטרל את הפתרון ניתוק התא ולקבוע את הריכוז תא עם תא ספירת קאמרית. להשעות את התאים ב- 0.5 x 105 תאים/מ ל מדיום הגידול המתאים (למשל, מדיום הגידול תא אנדותל מלאה).
- להוסיף 2 מ"ל של השעיה תא כל מנה 35 מ מ. התרבות התאים חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO2 עד למפגש (לוקח 24-48 שעות, בהתאם לסוג התא).
-
זכוכית coverslip הכנה (חסיד טסיות דם)
- לטבול את coverslip זכוכית פעם ב- HCl-EtOH (1.2 מ' / 50% v/v).
- יש לשטוף את coverslip 2 פעמים במים הנדסה גנטית.
- יבש את coverslip תחת N2.
- המעיל מראש coverslip זכוכית עם µL 100, לפי המיקום של הערוץ של התא זלוף של עכברוש מדולל הזנב קולגן מסוג I (30 µg/mL מדולל ב- PBS מסונן מעל מסנן 0.2 µm).
- תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT, לבטל את הפתרון קולגן, לשטוף את coverslip 3 x עם PBS.
- לחסום את coverslip קולגן מצופה עם BSA 1% ב- HEPES עבור 0.5 h RT.
- לשטוף, לייבש את coverslip והר אותו אל החדר זלוף. לבודד את טסיות הדם של האדם או העכבר הדם כמתואר בשלב 1.1 או 2.1, בהתאמה.
-
קיבעון של טסיות
- הוסף µL 70 של השעיה טסיות /mL של72 x 10 לערוץ, ולאחר תקופת דגירה של 1.5 h-CO 37 ° C ו-5%2.
- בזהירות להחליף שאינם מחסידי טסיות פתרון חסימה (BSA 5% ב- HEPES) במשך לפחות 30 דקות-המשך RT. עם תיוג פלורסנט זלוף של לויקוציטים (שלב 3.3).
-
גירוי של תא הדם חד שכבתי
- לגרות את תאי הדם על-ידי החלפת המדיה טריים המדיה המכילה 10 ננוגרם למ"ל הגידול נקרוזה מקדם α (TNFα) במשך 4 שעות-CO 37 ° C ו-5%2.
-
תא תרבות מאכל הכנה (בתרבית תאים)
2. מבוססת זרימה Assay עם תאים מאתר
-
בידוד של טסיות הדם העכבר
- דם על ידי ניקוב הלב באמצעות מחט 21 G (~ 1 מ"ל) מ. מורדם (קטמין 80 מ"ג/ק"ג, medetomidine 0.3 מ"ג/ק"ג) בשבוע 6-8-עכבר זקן (C57Bl/6) ציטראט (3.2%) בתור קרישה.
- הוסף 1/6 נפח ACD.
- צנטריפוגה ב 220 x g, בלם בינונית במשך 5 דקות כדי להשיג פלזמה עשיר טסיות (PRP).
- להעביר את תגובת שיקוע (~ 600 µL) ועוד 1/3 של כדוריות דם אדומות צינור חדש
- צנטריפוגה ב g x 95 ללא בלמים במשך 6 דקות.
- להעביר את תגובת שיקוע (PRP) ולמדוד את הריכוז טסיות ב- 1/10 לדילול במאגר של Tyrode (מאגר TH: 136 מ"מ NaCl, 5 מ מ Hepes, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 0.42 מ מ2PO NaH4* H2O, 2 מ מ MgCl2, אלבומין שור 0.1% ו- 0.1% גלוקוז) עם מנתח המטולוגיה אוטומטית.
- לשטוף את טסיות הדם על-ידי הוספת 1/25 נפח ACD + 0.1 U/mL apyrase, צנטריפוגה ב g 2,870, בלם בינוני למשך 2 דקות.
- למחוק את תגובת שיקוע והוסף מאגר 600 של תאנון µL, 1/10 נפח ACD ו 0.1 U/mL apyrase. . תחתכי את הטיפ pipet (P 1000), שהופך אותו רחב נשא, אשר מסייע במניעה של טסיות ההפעלה, וכן להשעות בעדינות בגדר.
- צנטריפוגה ב 2,870 g, בלם בינוני למשך 2 דקות
- למחוק את תגובת שיקוע, בעדינות להשעות את טסיות הדם במאגר TH.
- לכוון את עוצמת הקול עם TH מאגר להשגת ספירה של 2 x 107/mL.
-
הכנת monolayers טסיות חסיד
- להכין coverslip זכוכית (חסיד טסיות) לפי 1.3.3.
-
קיבעון של טסיות
- להוסיף 100 µL של השעיה טסיות /mL של72 x 10 לכל ערוץ, תקופת דגירה של 1.5 h-CO 37 ° C ו-5%2.
- בזהירות להחליף שאינם מחסידי טסיות פתרון חסימה (BSA 5% ב- HEPES) במשך לפחות 30 דקות-המשך RT. עם תיוג פלורסנט זלוף של לויקוציטים (שלב 3.3)
-
גירוי של העכבר טסיות חד שכבתי
- לפני זלוף של לויקוציטים (שלב 3.3), לעורר טסיות הדם על-ידי זלוף של תרומבין (0.5 ננומטר) במאגר HHHSA למשך 3 דקות ב 37 º C.
3. תיוג פלורסנט זלוף של לויקוציטים (נויטרופיל או THP-1 בני אדם באופן RAW264.7 או העכבר הראשי ומונוציטים עבור מאתר Assay מבוססות זרימה)
-
תיוג פלורסנט
- תווית של לויקוציטים (1 x 106/mL) עם הכתם תא-permeant חומצת גרעין ירוק פלואורסצנטי (1 מיקרומטר). דגירה התאים למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את התאים עם PBS על ידי צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות, וכן להשעות לתאים ריכוז של 0.5 x 106 תאים למ"ל (5 מ"ל לכל תנאי הבדיקה, בהתאם קצב הזרימה) במאגר וזמינותו.
-
זרימה קאמרית assay הכנה
- ליקוציט הדבקה על טפט התא, למחוק את המדיום התרבות התא מתוך קערה, להרכיב אותו אל החדר זרימה. להתחבר לצנרת המזרק. ליקוציט הדבקה על קיבוע טסיות, להתחבר השקופית מיקרו המזרק. לחמם באמבט מים ל- 37 מעלות צלזיוס.
- לקחת מזרק זלוף (50 מ"ל), התקנת מזרק מזרק מחזיק ולאחר סט למשוך המשאבה על מצב. להגדיר את עוצמת הקול של המשאבה מ 0 ל, ולהגדיר את הקוטר מ מ 26.70 עבור המזרק 50 מ.
- להתחבר מחבר מרפקי סכינים סטריליים קצה אחד של הצנרת. למיקום מצמד נעל זכוכית על המזרק ולחבר את הצנרור עם המחבר סכינים סטריליים המרפק כדי מחבר נעל זכוכית. חבר את הקצה אבובים חינם לתא זרימה.
-
ליקוציט זלוף והצמדות
- ליקוציט הדבקה על טפט התא, למחוק את המדיום התרבות התא מתוך קערה, להרכיב אותו אל החדר זרימה. להתחבר לצנרת המזרק. ליקוציט הדבקה על קיבוע טסיות, להתחבר השקופית מיקרו המזרק.
- ליקוציט זלוף, אדהזיה מעל כלי דם- או טסיות טפט, למיקום הצנרת השני לתוך צינור חרוטי 50 מ ל המכיל מאגר assay ומילוי אבובים עם 1 מ ל pipet, ואז לסחוט את הצנרור ולחבר אותה לתא זרימה.
- לפני ליקוציט זלוף, להוסיף 3 מ מ CaCl2 ו- 2 מ מ MgCl2 התליה תא, תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
- Perfuse assay מאגר לפני זלוף של תאים כדי להסיר את האוויר אפשרי קאמרית, אבובים.
- לסגור את הקצוות צינור לוחצת עליהם חזק ולעבור אבובים מהמאגר assay כדי תא ההשעיה, מניעת בועות אוויר מלהיות לכוד. Perfuse תאים עם קצב הזרימה המתאימה/גזירה עד התאים הראשונים יגיעו.
- Perfuse תאים עם זרימה המתאים קצב/גזירה למשך 2 דקות, לכידת תמונות לפחות 6 בין 2-6 דקות של תאים חסיד מתגלגל במיקרוסקופ ניגוד/זריחה שלב הפוכה (למשל, EVOS-FL) באמצעות הגדלה X 100 מחובר כדי מצלמה CCD או CMOS דיגיטלית.
הערה: קצב זרימה/גזירה תלוי זרימה קאמרית מידות צמיגות של perfusate. עבור לשכת זלוף המשמש כאן (ראה טבלה של חומרים):
Τ =η* 97.1*באופן כללי
Τ: גזירה (1 רמות דינ/cm2)
Η: צמיגות (0.015 רמות דינ * s/cm2)
באופן כללי: קצב הזרימה (0.67 mL/min)
-
ליקוציט והתבקשתי אדהזיה
- עבור de-adhesion, מעבר לצנרת מהשעיה תא למאגר assay לוחצת על אבובים, מונעת את בועות האוויר הופך להיות לכוד.
- ניתוק התאים על ידי זלוף עם מאגר assay עם הזרימה המתאימה קצב/גזירה (ראה 3.3.7 הערה).
-
ליקוציט גלגול
- עבור ליקוציט גלגול, perfuse לויקוציטים (שלב 3) עד כמות נאותה של לויקוציטים דבקים (~ 50 תאים/הצג שדה).
- החלף ליקוציט ההשעיה מאגר וזמינותו.
- להקליט תאים transmigrating על-ידי זמן לשגות כל s 10 – 15 למשך 30-60 דקות ב 37 º C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ללמוד אנדותל-ליקוציט אדהזיה, שכותרתו fluorescently תאים THP-1 היו perfused על טפט אנדותל TNFα - או אי-גירוי למשך 2 דקות-דיין 3/ס מ2. המספר הכולל של תאים monocytic חסיד נקבע לאחר 2 דקות של זלוף על-ידי לכידתו 6 שדות עצמאית על פני תקופה של 2-6 דקות. התאים חסיד היו לכמת לפחות 6 תמונות שנתפסו עם מיקרוסקופ ניגוד/זריחה שלב הפוכה (למשל, EVOS-FL) באמצעות הגדלה X 10 מחוברת מצלמת CCD או CMOS דיגיטלית והביע הממוצע היה כמו תאים חסיד / מ מ2. על גירוי אנדותל עם TNFα, מעצר THP-1 גדל באופן משמעותי בהשוואה לאנדותל unstimulated. נציג micrographs, כימות של בחוזקה מחסידי THP-1 לתאי אנדותל הלא - או TNFα-גירוי מוצג באיור1. הדבקות טסיות-ליקוציט נאמד על ידי זלוף של נויטרופילים fluorescently שכותרתו מעל טפט טסיות השמנה-6 - או אי-גירוי למשך 2 דקות-דיין 1/cm2. נויטרופילים חסיד היו לכמת כאמור לעיל. השמנה-6 גירוי הגדילה משמעותית את הידבקות של נויטרופילים ביחס unstimulated טסיות. נציג קטעי וידאו, כימות של נויטרופילים חסיד בחוזקה כדי טפט טסיות הלא - או מלכודת-6-גירוי מוצג באיור 1ב'.
איור 1 : אדהזיה אנדותל - ו טסיות-ליקוציט תחת תנאי זרימה. Micrographs כמת ונציג של הידבקות של תאים monocytic אנושיים (THP-1) לתאי אנדותל (HUVEC) נזרע על תרבות מצופים קולגן מנות בתנאים זרימה, עם או בלי TNFα הפעלה (10 ng/mL) (A). Micrographs כמת ונציג של הידבקות של נויטרופילים האנושי טסיות דם האדם מתאושש בשקופיות זכוכית מצופים קולגן תחת תנאי זרימה, בלי או עם הפעלת השמנה-6 (50 מיקרומטר) (B). ערכים P חושבו על ידי אינטראקצית-t-test (n = 3; מתכוון ± SD). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
יתר על כן, ניתן ליישם את assay ללמוד את התפקיד של מולקולות אדהזיה, כגון מולקולה מהחיבור הדבקות טסיות (ג'אם-A). הדבקה של RAW264.7 העכבר מונוציט/מקרופאג על טפט טסיות ריבה-א (trJAM-A+ +), ריבה-A-לקויה (trJAM-A- / -) עכברים נאמד ב שלנו מחקר לשעבר7. כפי שנצפה בו, טסיות ריבה-A מחסור גדל את הידבקות של העכבר ומונוציטים טפט טסיות בהשוואה פראי סוג עכברים (איור 2א-ב). לחלופין, העכבר הראשי נויטרופילים יכול להיות מבודד עכברים כמו שמתואר12.
ללמוד מנגנוני הבסיסית, כגון מולקולות אדהזיה מעורבים באינטראקציות טסיות-ליקוציט, ניתן לחסום קולטנים משטח מסוים. במחקר הנ ל, חסימת של טסית דם GPIbα, ליקוציט α βM2 באופן משמעותי ירד אדהזיה מונוציט, זיהוי תפקיד עבור הציר2 β GPIbα-αMבלשכת הגיוס מונוציט מוגברת כדיריבה-A- / - טסיות הדם (איור 2א-ב). יתר על כן, ניתן לבצע ניסויים ניתוק התא לחקור גזירה התלות של טסיות-ליקוציט אינטראקציות. לשקילת ניתוק זרימת תלוית ומונוציטים, גזירה היה מצטבר גדל מ- 0 ל- 20 dynes/cm2. במחקר זה, הידבקות של תאים RAW264.7 על ריבה-A- / - טסיות היה יותר עמידים להטיית מתח בהשוואה ריבה-A+ + טסיות הדם (איור 2C).
איור 2 : ריבה-A-מחסור מקדמת אדהזיה עמידים זרימה תא monocytic. הידבקות של העכבר מונוציט/macrophage RAW264.7 תאים טסיות ריבה-א+ + ועכברים ריבה-A- / - משותק בשקופיות זכוכית מצופים קולגן בתנאים זרימה, עם או בלי תרומבין הפעלה (IIa, 0.5 ננומטר) רכוש מעכבי המצוין (A). Micrographs נציג של העכבר מונוציט/macrophage RAW264.7 תאים ו"היסטוריון ריבה-A+ + ולבנים וטסיות דם ריבה-A- / - לאחר הטיפול עם נוגדנים פקד או אנטי-GPIbα isotype (B). תא אדהזיה הביע כאחוז של תאים חסיד בתחילה תחת גזירה גדל בהפרש קבוע (דיין/cm2) על טסיות קיבוע לאחר הפעלת תרומבין (IIa, 0.5 ננומטר). ערכים P חושבו מאת אנובה עם Tukey שלאחר הבדיקה (n = 3-5; מתכוון ± SEM). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. דמות זו שונתה מ זאו. et al. 7 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
זמן ההקלטה ממושך (30-60 דקות) של שדות בודדים בעקבות ליקוציט זלוף והצמדות מאפשר חקר ליקוציט זוחלים והפצת ההתנהגות ואת גלגול הסופי לאורך השכבה אנדותל. במסגרת מחקר זה, ניתחנו גלגול של ראשי ומונוציטים אנושי (מבודד עם ערכת בידוד מונוציט, על פי הוראות היצרן כפי שמתואר13) על פני שכבת אנדותל. כפי שהוצג באיור 3, מעצר המשרד הבאים אנדותל, ומונוציטים היכונו בורחת על ידי זוחלים והפצת עד האתר המועדף על גלגול. לאחר מכן, ומונוציטים לחדור המחסום תא אנדותל או על ידי העברה פארא - או transcellular. תאים transmigrating הוגדרו התאים משתרע על פני תאי אנדותל, על ידי הרחבת שלהם pseudopodia עובר דרך המכשול אנדותל, ובכך הפחתת הבהירות שלהם.
איור 3: במבחנה גלגול של ראשי ומונוציטים מעבר חד שכבתי אנדותל. מונוציט גלגול הסריקה ואת מתפשטת הסופי על פני אנדותל הוקלט כל 15 s במשך 30 דקות אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה וזמינותו במבחנה היא שיטה פשוטה כדי לחקור מנגנונים הבסיסית של ליקוציט הגיוס בעת דלקת כלי הדם, אבל יש כמה נקודות קריטיות שיירשמו. הדרישה הראשונה לביצוע בהצלחה assay הזה הוא זלוף של לויקוציטים ללא פגע, confluent וסקולרית או טסיות טפט. זו יכולה להיות מושגת על ידי מוקדמת ציפוי של המשטחים עם קולגן סוג אני. באופן כללי, בעת עבודה עם ראשי תאי דם, זה חשוב לנתק בעדינות תאים באמצעות המכילות collagenase ניתוק הפתרון המומלץ (ראה את הטבלה של חומרים), וזה פחות קפדניות, אך יעיל כמו טריפסין. עבור monolayers טסיות, חשוב לשטוף בעדינות את טסיות הדם במהלך בידוד למניעת הפעלה טסיות ו צבירה.
עוד שיקול מכריע הוא שמירה על ההמשכיות של המשאבה במצב נסיגה המשמש את זלוף, מאז רציפות מוביל מופרע קצב זרימה ותנאי הטיה. לפיכך, התוצאה דיוקים של גזירה בפועל, כתוצאה מכך, ובמידה פירוש מוטעה של תהליכים תלויי-הטיה פיזיולוגית. זה ניתנת למניעה על ידי תחזוקה שוטפת של המשאבה. בנוסף, קריטי עבור ההמשכיות במהלך זלוף הוא השימוש של מזרק טריים בכל ניסוי. מאז המרקם של הגומי בתוך השינויים מזרק עם הגדלת השימוש ואת הזמן בין ניסויים, זה מונע נסיגה מתמדת.
שלב קריטי עוד יותר הוא מניעת האוויר הופך להיות לכוד במהלך זלוף של לויקוציטים, מאז אוויר לאחר מכן לתלוש תאים מפני השטח, לשנות את התנאים הטיה. זה ניתנת למניעה על ידי שטיפה מראש כל צינורות להשתמש עם מים אולטרא טהורים ולאחר מכן באמצעות מאגר וזמינותו. כמו כן, בעת חיבור לצנרת מהמאגר assay כדי תא ההשעיה, או ממצב אחד לשני, חשוב לשמור על נוזלי ממשקים במהלך החיבור. זו יכולה להיות מושגת על ידי לסחוט את הצנרור או לא לשנות את רמות נוזלי בתוך צינורות. עוד יותר, נפח נוזלים perfusate תמיד צריך להיות מספיק למנוע את רמת יורדות מתחת לסוף אבובים, לפיכך, אוויר נלקח במערכת.
מגבלה אפשרי של assay הזה עשוי להיות שימוש בתרבית תאים נשמרים בסביבה מלאכותית, דהיינו תרבותי על משטח פלסטיק מוקף מדיום זה לא מדויק המדינה ויוו . למרות physiochemical וסביבה פיזיולוגיים יכול להיות דווקא נשלט, תאים בתרבית יש קצב צמיחה מהירה, דבר המגביר את וריאציה גנטית והטרוגניות ובכך את התאים בתוך אוכלוסיה. יתר על כן, כלי הדם- או טסיות חד שכבתי מורכב סוג תא בודד בלבד. בפרט, כאשר חוקרים אנדותל-ליקוציט אינטראקציות, קרי, גלגול של לויקוציטים מעבר למכשול תא אנדותל, תפקיד רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של קרום המרתף הבסיסית של תאי אנדותל, pericytes לא יכול להילקח בחשבון. לחלופין, ייתכן מעניין ליצור סביבה multicellular על-ידי יישום טכניקות culturing 3D-תא ב זה וזמינותו.
לסיכום, ניקח את הנקודות הללו בחשבון, וזמינותו מבוסס זרימה שכבתית ניתן ביעילות ליישם מודלים שונים של דלקת בכלי הדם. בפרט, זה יכול להיות בקלות שונה מחקר ספציפי על שאלות, דהיינו התאמת הלחץ הטיה על ידי שינוי קצב זרימה של perfusate, צמיגות נוזלים, או ערוץ הגובה והרוחב. במיוחד, האחרון הוא בעל חשיבות מאז שינויים בממדים קאמרית זרימה להפחית את נפח הנוזלים או התאים הדרושים. קרינה פלואורסצנטית נוספת, שונה תיוג של לויקוציטים, או של מולקולות ספציפיות של כלי הדם או טסיות monolayers יכול לשמש כדי ללמוד אינטראקציות תא-תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד"ר מרטין מ שמיט, קו Fraemohs. עבודה זו נתמכה על ידי קרן הולנד למחקר מדעי (אני אגיד להם ZonMW 016.126.358 לנדשטיינר קרן למחקר עירוי דם (LSBR Nr. 1638), פתוח (SFB1123/A2) הוענק R.R.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
- Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
- Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
- Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
- Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
- Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
- Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).
