Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

Summary

Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.

Abstract

De aanwerving van de leukocyten op letsel of ontsteking naar sites van letsel of weefselbeschadiging van het is onderzocht tijdens de afgelopen decennia en heeft geleid tot het concept van de leukocyten hechting cascade. Echter, de exacte moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten hebben niet nog volledig geïdentificeerd. Aangezien leukocyte werving blijft een belangrijk onderwerp op het gebied van infectie, ontsteking en immuun onderzoek (auto-), presenteren we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde bepaling aan de studie van de onderliggende mechanismen van de hechting, ambtshalve adhesie, en transmigratie van leukocyten onder veneuze en arteriële stroom regimes. De in vitro -assay kan worden gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners in verschillende modellen van vasculaire ontsteking. Dit protocol beschrijft een laminaire flow gebaseerde bepaling met behulp van een parallel-flow kamer en een omgekeerde fasecontrastmicroscoop aangesloten op een camera te bestuderen van de interacties van leukocyten en endotheliale cellen of Trombocyten, die kunnen worden gevisualiseerd en vervolgens geregistreerd off line geanalyseerd. Endotheliale cellen, bloedplaatjes of leukocyten kunnen worden voorbehandeld met remmers of antilichamen te bepalen van de rol van specifieke moleculen tijdens dit proces. Schuintrekken voorwaarden, d.w.z. arteriële of veneuze schuifspanning, kunnen gemakkelijk worden aangepast door de viscositeit en de stroomsnelheid van de perfused vloeistoffen en de hoogte van het kanaal.

Introduction

Op verwonding, ontsteking of infectie beantwoorden leukocyten snel aan pathogen - of schade-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs, DAMPs) omzetten in een geactiveerde staat, en verlaat de bloedstroom naar sites van ontsteking en weefsel schade. Het vermogen van leukocyten om te interageren met hun omgeving cellulaire en moleculaire is essentieel voor de juiste functie als immune cellen, zoals benadrukt door genetische afwijkingen zoals leukocyte hechting deficiëntie¹. Leukocyten hechting is het onderwerp van intensief onderzoek de afgelopen decennia geweest en dit heeft geresulteerd in het concept van de leukocyten hechting cascade in de vroege jaren 1990^2,3. Leukocyten hechting wordt geïnitieerd door de selectine-gemedieerde vangst van leukocyten aan het endotheel, waardoor de cellen om te rollen over de vasculaire oppervlak. Deze rollen kan leukocyten te scannen voor endotheel-afhankelijke trekkende signalen, bijvoorbeeld, chemokines, die de activering van de integrins induceren. Vervolgens bemiddelen de geactiveerde verschijnsel de binding aan endothelial liganden, wat resulteert in krachtige leukocyte arrestatie. Leukocyten kunnen vervolgens bereiden op extravasate door kruipen en verspreiden, voordat het endotheel enkelgelaagde doordringen en transmigrating in het onderliggende weefsel. Het basisconcept van de canonieke leukocyte cascade heeft grotendeels onveranderd gebleven sinds de invoering ervan, met enkele tussenstappen toegevoegd⁴. Niettemin, de exacte moleculaire mechanismen en de rol van de vele spelers die betrokken zijn bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten nog niet zijn opgehelderd tot nu toe, en leukocyten werving blijft een belangrijk onderwerp op het gebied van infectie, ontsteking en (auto-) immuun onderzoek.

Bijvoorbeeld verhoogd tijdens vasculaire ontstekingsziekten zoals atherosclerose, leukocyte inlijving in het vaartuig muur stations plaque ontwikkeling. Unstable atherosclerotische plaques kunnen scheuren, leidt tot massale activering van bloedplaatjes en het systeem van de coagulatie, en vervolgens tot occlusie van het vaartuig⁵. Dit kan resulteren in ernstige cardiovasculaire uitkomsten zoals een hartinfarct of beroerte. Daarnaast endothelial denudatie als het optreedt klinisch, bijvoorbeeld na stenting van een kransslagader, leidt tot een veelheid van interacties van leukocyten en trombocyten naar de blootgestelde vaartuig muur binnenland (b.v., matrix onderdelen en glad spier cellen) en leukocyten met bloedplaatjes die betrekking hebben op de vasculaire verwonding. Deze interacties zijn belangrijk voor de verdere ontwikkeling van de ziekte zoals monocyt-bloedplaatjes interacties^6,7van de vorming van de neointima zou rijden. Bovendien, bloedplaatjes-leukocyte interacties gemedieerd door leukocyten integrine Mac-1 (α_Mβ₂) en bloedplaatjes GPIbα hebben onlangs geïdentificeerd als roman bestuurders van trombose in muizen⁸.

Gezien de brede beschikbaarheid van mens en dier bloed als een bron van leukocyten en trombocyten voor onderzoek en het brede spectrum van moleculen van geïsoleerde matrix en vereeuwigd cellijnen van leukocyten en vasculaire oorsprong, is het mogelijk te simuleren van leukocyten interacties onder stroom in een laboratorium instellen, met behulp van speciaal ontworpen stroom perfusie kamers. Vele varianten hebben ontwikkeld in de afgelopen decennia, variërend van vacuüm-gedreven aan zelfklevende perfusie kamers. Alle varianten hebben gemeen dat het onbeweeglijke gedeelte (bijvoorbeeld, gekweekte vasculaire cellen of matrix eiwitten) is geassembleerd tot een grotere lekvrije kamer uitgerust met een vooraf gedefinieerde kanaal perfusie van vloeistoffen inschakelen via het onbeweeglijke gedeelte. Vooruitgang in technologie molding ingeschakeld bovendien de ontwikkeling van op maat gemaakte oplossingen op basis van silica polymeren⁹. De viscositeit en de stroomsnelheid van de perfused vloeistoffen en de hoogte van het kanaal voornamelijk de schuifspanning kenmerken van de stroom perfusie apparaat¹⁰te bepalen. In dit artikel presenteren we een studie van de onderliggende mechanismen van de hechting-, ambtshalve hechting is de methode van in vitro en transmigratie van leukocyten onder veneuze en arteriële stroom regimes. Het voordeel van de methoden die hier gepresenteerd is dat ze kunnen worden uitgevoerd met behulp van een gemeenschappelijk camera-aangesloten fluorescentie Microscoop, en geen een onderzoekers vereisen te hoge technische bekwaamheid bezitten. De in vitro -assay kan worden gemanipuleerd in vele opzichten (bijvoorbeelddoor het toevoegen van remmers of blokkeren van antilichamen), en is dus die van toepassing zijn in verschillende modellen van vasculaire ontsteking en laat het onderzoek wrijvingscoëfficiënt eiwitfuncties of de evaluatie van specifieke verbindingen.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de medisch-ethische en dier ethische Boards van Universiteit Maastricht.

1. op stroming gebaseerde Assay met menselijke cellen

1. Isolatie van bloedplaatjes uit menselijk bloed
   1. Citraat (3,2%) antistollingsmiddel veneuze bloed trekken.
   2. Voeg 1/15 hoeveelheid zuur citraat Dextrose toe (ACD: 80 mM Trinatriumcitraat citraat en citroenzuur 52 mM 183 mM glucose) naar het bloed.
   3. Centrifugeer bij 350 x g zonder rem voor 15 min te verkrijgen van bloedplaatjes rijk plasma (PRP).
   4. Het supernatant overbrengen in een conische tube van 15 mL en voeg 1/20 ACD hoeveelheid toe.
   5. Centrifugeer bij 1.110 g zonder rem voor 15 min te verkrijgen van bloedplaatjes arme plasma (PPP).
   6. Verwijder het supernatant. Afgesneden van het einde van het uiteinde van de pipet (P-1000), waardoor het brede droeg, welke hulpmiddelen bij de preventie van bloedplaatjes activering en zorgvuldig Suspendeer de pellet bloedplaatjes in hetzelfde volume als PRP in bloedplaatjes buffer pH 6.6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 0,1% bovien serumalbumine en 0,1% glucose). Voeg 1/20 volume van ACD en zachtjes meng.
   7. Pellet de bloedplaatjes 1.110 g zonder rem gedurende 15 minuten.
   8. Verwijder het supernatant en Suspendeer zorgvuldig de bloedplaatjes als hierboven in 1 mL bloedplaatjes buffer (pH 7.5).
   9. Het meten van de concentratie van de bloedplaatjes in een verdunning van 1/10 met een geautomatiseerde hematologie analyzer.
   10. Regel het volume met bloedplaatjes buffer (pH 7.5) om een telling van 2 x 10⁷/mL.
2. Isolatie van polymorfonucleaire cellen uit menselijk bloed (aangepast uit Brinkmann et al. ¹¹ )
   1. Tekenen 24 mL bloed in heparine (10 U/mL) als antistollingsmiddel.
   2. Voeg 6 mL van 1.077 g/mL dichtheid polysucrose-natrium diatrizoate medium (Zie Tabel van materialen) naar een conische buis 15 mL, en zorgvuldig laag 5-6 mL bloed op de top.
   3. Centrifugeer gedurende 20 min op 800 x g zonder rem.
   4. Gecombineerd en negeren de duidelijke gelige toplaag en overdracht van de lagere roodachtig fase met granulocyten in vers 15 mL conische buizen. Wassen cellen door toevoeging van PBS met 2 mM EDTA tot een eindvolume van 14 mL en Centrifugeer gedurende 10 min op 300 x g zonder rem.
   5. In de tussentijd bereidt een kleurovergang medium dichtheid (bijvoorbeeld, percoll, Zie Tabel van materialen) werkende oplossing door het mengen van 18 mL dichtheid kleurovergang medium met 2 mL 10 x stockoplossing van PBS. Verdun deze werkoplossing met PBS (1 x) te verkrijgen van 4,25 mL elk van 85%, 80%, 75%, 70% en 65% kleurovergang middellange oplossingen.
   6. Bereiden 2 conische buisjes met het verloop van de dichtheid van 2 mL van elke middelgrote percentage boven op elkaar stapelen. Beginnen met de hoogste concentratie en ga verder in aflopende volgorde. Mark de lagen op de buis met een waterdichte marker.
   7. Zorgvuldig laag 2 mL van de cel schorsingen op elk van de twee bereid verlopen.
   8. Centrifugeer gedurende 20 min op 800 x g zonder rem in een zorgvuldig uitgebalanceerde centrifuge.
   9. Na het centrifugeren, het verwijderen van de bovenste laag en de meeste van de 65% laag (eerste ring) met PBMCs en verzamelen in nieuwe buizen de resterende interfasen tot de 85% laag wit (tweede ring, PMN).
   10. Wassen cellen door het invullen van de buizen met PBS 2 mM EDTA en Centrifugeer gedurende 10 min op 300 x g zonder rem.
   11. Verwijder het supernatant en schorten gesedimenteerd cellen (meestal ≥95% PMN) in 1 mL Henks buffer (pH 7,45), met 10 mM Hepes en 0,2% menselijke albumine (Assay buffer).
   12. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en cellen op 1 x 10⁶/mL op te schorten.
   13. Ga verder met fluorescerende labeling en perfusie van leukocyten (stap 3.3).
3. Voorbereiding van aanhangend bloedplaatjes- en vasculaire cel-monolayers
   1. Cel cultuur schotel voorbereiding (gekweekte cellen)
      1. Vooraf jas de 35 mm cel cultuur gerechten met 1 mL verdunde rat staart collageen (30 µg/mL verdund in PBS gefilterd over een 0,2 µm filter).
      2. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C, negeren de collageen-oplossing, en wassen van de schotel een keer met PBS.
   2. Cultuur van vasculaire cellen in cultuur gerechten
      1. Loskoppelen van de primaire (bijvoorbeeld, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) of vereeuwigd vasculaire cellen (bijvoorbeeld, EA. Hy926, SVEC) uitgegroeid tot samenvloeiing in een maatkolf van T75 met 1,5 mL cel detachement (bijvoorbeeld, accutase). Voeg 4.5 mL passende groeimedium neutraliseren de mobiele-detachement oplossing te bepalen van de concentratie van de cel met een cel tellen kamer. Opschorten van de cellen bij 0,5 x 10⁵ cellen/mL in passende groeimedium (b.v., het groeimedium volledig endothelial cel).
      2. Voeg 2 mL celsuspensie aan elk gerecht van 35 mm. De cellen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO₂ cultuur tot samenvloeiing (waarbij 24-48 h, afhankelijk van het celtype).
   3. Glas dekglaasje aan voorbereiding (aanhangend bloedplaatjes)
      1. Dompel het glas dekglaasje aan eens in de HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).
      2. Spoel het dekglaasje aan 2 keer in ultrazuiver water.
      3. Droog het dekglaasje aan onder N₂.
      4. Pre jas het dekglaasje glas aan met 100 µL, overeenkomstig het standpunt van het kanaal van de kamer van de perfusie van verdunde rat staart collageen type I (30 µg/mL verdund in PBS gefilterd over een 0,2 µm filter).
      5. Incubeer gedurende 30 min op RT, negeren de collageen-oplossing en wassen het dekglaasje aan 3 x met PBS.
      6. Blok de collageen gecoat dekglaasje aan met 1% BSA in HEPES voor 0.5 h op RT.
      7. Wassen en drogen van het dekglaasje aan en dit koppelen in de bedwelmingsruimte perfusie. Bloedplaatjes van menselijke of muis bloed zoals beschreven in stap 1.1 of 2.1, respectievelijk te isoleren.
   4. Immobilisatie van bloedplaatjes
      1. Voeg 70 µL van een schorsing van 2 x 10⁷/mL bloedplaatjes per kanaal en incubeer gedurende 1,5 uur op 37 ° C en 5% CO₂.
      2. Zorgvuldig vervangen door niet-aanhanger bloedplaatjes blokkerende oplossing (5% BSA in HEPES) voor minstens 30 min op RT. doorgaan met fluorescerende labeling en perfusie van leukocyten (stap 3.3).
   5. Stimulatie van vasculaire cel enkelgelaagde
      1. De vasculaire cellen stimuleren door het vervangen van de media met verse medium met 10 ng/mL Tumornecrosefactor α (TNFα) voor 4 uur bij 37 ° C en 5% CO₂.

2. stroom gebaseerde Assay met lymfkliertest cellen

1. Isolatie van bloedplaatjes uit bloed van de muis
   1. Loting bloed door cardiale punctie met behulp van een naald 21 G (~ 1 mL) van verdoofd (ketamine 80 mg/kg en medetomidine 0,3 mg/kg) 6 – 8 week-oude muizen (C57Bl/6) in citraat (3,2%) als antistollingsmiddel.
   2. Voeg 1/6 ACD hoeveelheid toe.
   3. Centrifuge op 220 x g, middellange rem voor 5 min te verkrijgen van bloedplaatjes rijk plasma (PRP).
   4. Het supernatant (~ 600 µL) plus 1/3 van de rode bloedcellen overbrengen in een nieuwe buis
   5. Centrifugeer bij 95 x g zonder rem voor 6 min.
   6. Het supernatant (PRP) overbrengen en meten van de concentratie van de bloedplaatjes in een verdunning van 1/10 in Tyrode de buffer (TH buffer: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0.42 mM NaH₂PO₄* H₂O, 2 mM MgCl₂, 0,1% bovien serumalbumine en 0,1% glucose) met een geautomatiseerde hematologie analyzer.
   7. Wassen van de bloedplaatjes door het toevoegen van 1/25 volume van ACD + 0,1 U/mL apyrase, samen en centrifugeer bij 2.870 g, middellange rem gedurende 2 minuten.
   8. Verwijder het supernatant en 600 µL TH buffer, 1/10 volume van ACD en 0.1 U/mL apyrase toevoegen. Afgesneden de Pipetteer tip (P-1000), droeg waardoor het brede, die helpt bij het voorkomen van bloedplaatjes activering, en zachtjes schorten de pellet.
   9. Centrifugeer bij 2.870 g, middellange rem gedurende 2 minuten
   10. Verwijder het supernatant en voorzichtig het opschorten van de bloedplaatjes in TH buffer.
   11. Regel het volume met TH buffer om een telling van 2 x 10⁷/mL.
2. Voorbereiding van aanhangend bloedplaatjes monolayers
   1. Glas dekglaasje aan (aanhangend bloedplaatjes) per 1.3.3 voor te bereiden.
3. Immobilisatie van bloedplaatjes
   1. Voeg 100 µL van een schorsing van 2 x 10⁷/mL bloedplaatjes per kanaal en incubeer gedurende 1,5 uur op 37 ° C en 5% CO₂.
   2. Zorgvuldig vervangen door niet-aanhanger bloedplaatjes blokkerende oplossing (5% BSA in HEPES) voor minstens 30 min op RT. doorgaan met fluorescerende labeling en perfusie van leukocyten (stap 3.3)
4. Stimulatie van muis bloedplaatjes enkelgelaagde
   1. Voorafgaand aan de perfusie van leukocyten (stap 3.3), de bloedplaatjes te stimuleren door perfusie van trombine (0,5 nM) in HHHSA buffer gedurende 3 minuten bij 37 ° C.

3. fluorescerende Labeling en perfusie van leukocyten (PMN of THP-1 voor mens en RAW264.7 of primaire muisknop monocyten voor lymfkliertest Flow gebaseerde Assay)

1. Fluorescerende etiketten
   1. Label de leukocyten (1 x 10⁶/mL) met de cel-permeant groen fluorescent nucleïnezuur vlek (1 µM). Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
   2. De cellen met PBS door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten wassen en schorten cellen tot een concentratie van 0,5 x 10⁶ cellen/mL (5 mL per testvoorwaarde, afhankelijk van het debiet) in assay buffer.
2. Flow kamer assay voorbereiding
   1. Voor de hechting van de leukocyten op een cel enkelgelaagde, negeren het kweekmedium van de cel van de schotel, en omgezet in stroom aanwezig. Buizen verbinden met de spuit. Voor de hechting van de leukocyten op geïmmobiliseerdet bloedplaatjes, verbinden met de micro dia de spuit. Vooraf warm een waterbad 37 ° c.
   2. Neem een perfusie spuit (50 mL), installeren spuit op de spuit houder, en de pomp op trekken modus. Stelt het volume van de pomp tot 0 mL, en de diameter tot 26.70 mm voor de 50 mL spuit.
   3. Sluit een kniestuk luer aan één uiteinde van de buis. Plaats een luer lock koppelstuk aan de spuit en verbind de slang met de elleboog luer aansluiting om de luer lock koppelstuk. Sluit het uiteinde van de gratis buis aan de kamer van de stroom.
3. Leukocyten perfusie en hechting
   1. Voor de hechting van de leukocyten op een cel enkelgelaagde, negeren het kweekmedium van de cel van de schotel, en omgezet in stroom aanwezig. Buizen verbinden met de spuit. Voor de hechting van de leukocyten op geïmmobiliseerdet bloedplaatjes, verbinden met de micro dia de spuit.
   2. Voor leukocyten perfusie en hechting over een vasculaire- of bloedplaatjes enkelgelaagde, plaats van de tweede buis in een conische buis van 50 mL, met assay buffer en vul buizen met 1 mL pipet, dan knijp van de buis en sluit u deze aan een stroom-kamer.
   3. Voorafgaand aan de leukocyten perfusie,₂ CaCl 3 mM en 2 mM MgCl₂ toevoegen aan de celsuspensie en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
   4. Perfuse assay buffer vóór perfusie van cellen te verwijderen mogelijk lucht uit de kamer en buizen.
   5. Nauwe buis eindigt door knijpen ze strak en schakelaar buizen uit assay buffer te celsuspensie, luchtbellen voorkomen overlappingsbreedte. Perfuse cellen met passende stroom tarief/schuifspanning totdat de eerste cellen aankomen.
   6. Perfuse cellen met passende stroom tarief/schuifspanning gedurende 2 minuten, en ten minste 6 foto's tussen 2 – 6 min etappen te verwezenlijken, Adherente cellen met een omgekeerde fase contrast/fluorescentie Microscoop (bijvoorbeeldEVOS-FL) vastleggen met behulp van 100 X vergroting aangesloten voor een digitale CCD of CMOS camera.
      Opmerking: Flow rate/schuifspanning hangt flow kamer afmetingen en viscositeit van perfusaat. Voor perfusie kamer hier gebruikt (Zie Tabel van materialen):
      Τ =η* 97.1*Φ
      Τ: schuifspanning (1 dyn/cm²)
      Η: viscositeit (0,015 dyn * s/cm²)
      Φ: debiet (0,67 mL/min)
4. Leukocyten ambtshalve hechting
   1. Voor de-adhesion, schakelen buis van celsuspensie aan assay buffer door uitknijpen de slang, luchtbellen voorkomen steeds gevangen
   2. Loskoppelen cellen door perfusie met assay buffer met een passende stroom tarief/schuifspanning (zie 3.3.7 Opmerking).
5. Leukocyten zielsverhuizing
   1. Voor leukocyten zielsverhuizing, perfuse leukocyten (stap 3) totdat een voldoende hoeveelheid van leukocyten houden (~ 50 cellen/weergaveveld).
   2. Leukocyten schorsing vervangen door assay buffer.
   3. Record transmigrating cellen tegen tijd vervallen elke 10-15 s gedurende 30-60 minuten bij 37 ° C.

Representative Results

Studeren endotheel-leukocyte hechting, werden fluorescently geëtiketteerde THP-1 cellen over een TNFα - of niet-gestimuleerd endothelial enkelgelaagde gedurende 2 minuten op 3 dyne/cm²geperfundeerd. Het totale aantal aanhangend monocytic cellen werd vastgesteld na 2 min van perfusie door het vastleggen van 6 onafhankelijke velden over een periode van 2-6 min. De Adherente cellen werden gekwantificeerd in ten minste 6 foto's gevangen met een omgekeerde fase contrast/fluorescentie Microscoop (bijvoorbeeldEVOS-FL) u 10 X vergroting op een digitale CCD of CMOS-camera is aangesloten en de gemiddelde werd uitgedrukt als Adherente cellen / mm². Op endotheel stimulatie met TNFα, THP-1 arrestatie aanzienlijk verhoogd ten opzichte van ongestimuleerde endotheel. Representatieve microfoto en de kwantificering van stevig aanhanger THP-1 naar niet - of TNFα-gestimuleerd endotheliale cellen wordt gepresenteerd in Figuur 1. Hechting van bloedplaatjes-leukocyten werd beoordeeld door perfusie van fluorescently geëtiketteerde neutrofielen over een enkelgelaagde bloedplaatjes TRAP-6 - of niet-gestimuleerd gedurende 2 minuten bij 1 dyne/cm². Aanhangend neutrofielen werden gekwantificeerd zoals hierboven vermeld. TRAP-6 stimulatie aanzienlijk verhoogd de hechting van neutrofielen ten opzichte van ongestimuleerde bloedplaatjes. Representatieve video's en de kwantificering van stevig aanhangend neutrofielen naar niet - of TRAP-6-gestimuleerd bloedplaatjes monolayer wordt gepresenteerd in Figuur 1B.

Figuur 1 : Endotheel - en bloedplaatjes-leukocyte hechting onder stromingscondities. Kwantificering en vertegenwoordiger microfoto wrijvingscoëfficiënt van menselijke monocytic cellen (THP-1) naar endotheliale cellen (HUVEC) zaadjes op collageen beklede cultuur gerechten onder stromingscondities, met of zonder TNFα activering (10 ng/mL) (A). Kwantificering en vertegenwoordiger microfoto wrijvingscoëfficiënt van menselijke neutrofielen menselijke bloedplaatjes geïmmobiliseerd op dia's de collageen-gecoat glas onder stromingscondities, zonder of met TRAP-6 activering (50 µM) (B). P-waarden werden berekend door de ongepaarde t-test (n = 3; betekenen ± SD). Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Bovendien kan deze test worden geïmplementeerd om te bestuderen van de rol van celadhesie-moleculen, zoals bloedplaatjes regulates adhesie molecuul een (JAM-A). De hechting van RAW264.7 muis monocyt/macrofaag aan een monolayer van bloedplaatjes van JAM-A (trJAM-A^{+/ +}) en JAM-A-deficiënte (trJAM-A^{- / -}) muizen in onze voormalige studie⁷evalueerden. Zoals daarin waargenomen, toegenomen bloedplaatjes JAM-A deficiëntie de hechting van muis monocyten aan de bloedplaatjes enkelgelaagde vergeleken met wild type muizen (Figuur 2A-B). U kunt ook kunnen primaire muisknop neutrofielen worden geïsoleerd van muizen als beschreven¹².

Om te bestuderen van de onderliggende mechanismen, zoals celadhesie-moleculen die betrokken zijn bij de bloedplaatjes-leukocyte interacties, kunnen specifieke oppervlakte receptoren worden geblokkeerd. In de bovengenoemde studie daalde blokkeren van bloedplaatjes GPIbα en leukocyten α_Mβ₂ aanzienlijk monocyt adhesie, identificeren van een rol voor de GPIbα-α_Mβ₂ as bij de verhoogde monocyt werving voor JAM-A^{- / -} bloedplaatjes (Figuur 2A-B). Bovendien, cel detachement experimenten kunnen worden uitgevoerd om te onderzoeken schuifspanning afhankelijkheid van bloedplaatjes-leukocyte interacties. Voor de meting van de stroom-afhankelijke detachement van monocyten, werd schuifspanning stapsgewijs verhoogd van 0 tot 20 dynes/cm². In deze studie werd de hechting van RAW264.7 cellen in JAM-A^{- / -} bloedplaatjes meer resistent tegen shear stress in vergelijking met JAM-A^{+/ +} bloedplaatjes (Figuur 2C).

Figuur 2 : JAM-A-tekort bevordert stroom-resistente monocytic cel adhesie. Hechting van muis monocyt/macrofaag RAW264.7 cellen bloedplaatjes van JAM-A^{+/ +} en JAM-A^{- / -} muizen geïmmobiliseerd op dia's de collageen-gecoat glas onder stromingscondities, met of zonder trombine activering (IIa, 0,5 nM) in aanwezigheid van aangegeven remmers (A). Representatieve microfoto van muis monocyt/macrofaag RAW264.7 cellen aanhanger met JAM-A^{+/ +} en JAM-A^{- / -} bloedplaatjes na behandeling met isotype besturingselement of anti-GPIbα antilichamen (B). Cel adhesie uitgedrukt als percentage van aanvankelijk Adherente cellen onder stapsgewijs toegenomen schuifspanning (dyne/cm²) op geïmmobiliseerdet trombocyten na trombine activering (IIa, 0,5 nM). P-waarden werden berekend door ANOVA met Tukey van na de test (n = 3-5; ± SEM te betekenen). Schaal bar = 100 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Zhao et al. ⁷ Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

De langdurige opnametijd (30-60 min) van enkele velden na leukocyte perfusie en hechting kan de studie van leukocyten kruipen en gedrag en definitieve transmigratie verspreiden over de endothelial laag. We hebben binnen deze studie, de transmigratie van primaire menselijke monocyten (geïsoleerd met de monocyt isolatie kit, volgens de instructies van de fabrikant als beschreven¹³) geanalyseerd in een endothelial laag. Als aangegeven in Figuur 3, volgende stevige arrestatie te het endotheel, voorbereiden monocyten extravasate door kruipen en verspreiding totdat de gewenste site voor transmigratie is bereikt. Vervolgens, doordringen monocyten de barrière endothelial cel ofwel door migratie van para- of transcellulair. Transmigrating cellen werden gedefinieerd als cellen die gespreid over de endotheliale cellen, door uitbreiding van hun pseudopodia en passeren de endothelial barrière, daardoor verminderend hun helderheid.

Figuur 3: In vitro transmigratie van primaire monocyten over een endothelial enkelgelaagde. Monocyt verkennen en verspreiden en definitieve transmigratie over het endotheel werd opgenomen elke 15 s voor 30 min. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussion

Deze in vitro -test is een eenvoudige methode om te onderzoeken van de onderliggende mechanismen van leukocyten aanwerving tijdens vasculaire ontsteking, maar er zijn een aantal kritische punten te worden opgemerkt. De eerste voorwaarde voor het succesvol uitvoeren van deze test is de perfusie van leukocyten over een intact en confluente vasculaire of bloedplaatjes enkelgelaagde. Dit kan worden bereikt door voorafgaande coating van de oppervlakken met collageen type I. In het algemeen, bij het werken met primaire vasculaire cellen, het is belangrijk om voorzichtig los cellen met behulp van de aanbevolen collagenase-bevattende detachement oplossing te maken (Zie de Tabel van materialen), die is minder streng, maar zo effectief als trypsine. Voor bloedplaatjes monolayers is het belangrijk om voorzichtig wassen trombocyten tijdens isolatie om te voorkomen dat de activering van de bloedplaatjes en aggregatie.

Een andere belangrijke overweging is het handhaven van de continuïteit van de pomp terugtrekking modus die wordt gebruikt voor de perfusie, aangezien een discontinuïteit tot leidt gestoord stromingscondities tarief en schuintrekken. Dus, dit resulteert in de onnauwkeurigheid van werkelijke shear stress en vervolgens naar de verkeerde interpretatie van fysiologisch schuintrekken-afhankelijke processen. Dit kan worden voorkomen door regelmatig onderhoud van de pomp. Cruciaal voor de continuïteit tijdens perfusie is bovendien het gebruik van een verse spuit voor elk experiment. Sinds de textuur van het rubber binnen de wijzigingen van de spuit met toenemende gebruik en tijd tussen experimenten, voorkomt het een continu opname.

Een verdere belangrijke stap is het voorkomen van lucht steeds gevangen tijdens de perfusie van leukocyten, omdat lucht zal vervolgens cellen afgescheurd van het oppervlak en schuintrekken voorwaarden wijzigen. Dit kan worden voorkomen door het spoelen alle buizen vóór gebruik met ultra puur water en daarna met assay buffer. Ook bij het aansluiten van leidingen vanuit assay buffer celsuspensie of vanuit één voorwaarde naar de andere, is het belangrijk om vloeibare interfaces tijdens verbinding. Dit kan worden bereikt door het knijpen van de buis of door de vloeistof niveaus binnen de buis niet te wijzigen. Verder, de vloeistof volume van het perfusaat altijd toereikend te zijn om te voorkomen dat het niveau onder het einde van de buis en, dus, lucht in het systeem worden overgenomen.

Een mogelijke beperking van deze bepaling zou het gebruik van gekweekte cellen die worden onderhouden in een kunstmatige omgeving, d.w.z. gekweekt op een kunststof ondergrond omgeven door een medium dat doet niet nauwkeurig model van de Braziliaanse in vivo . Hoewel de physiochemical en fysiologische omgeving kunnen precies worden gecontroleerd, hebben gekweekte cellen een snelle groei, waardoor de genetische variatie en dus de heterogeniteit van de cellen binnen een populatie. Bovendien, de vasculaire- of bloedplaatjes enkelgelaagde bestaat uit een enkele celtype alleen. In het bijzonder, bij het onderzoeken van endotheel-leukocyte interacties, dat wil zeggen, transmigratie van leukocyten in de endothelial cel barrière, het fysiologisch relevante rol van de onderliggende endotheel-kelder celmembraan en pericytes kan geen rekening worden gehouden. Anderzijds is het wellicht interessant om te maken een meercellig omgeving door het implementeren van 3D-cel kweken technieken in deze test.

Om samen te vatten, deze punten in aanmerking genomen, de laminaire flow gebaseerde bepaling kan worden efficiënt toegepast in verschillende modellen van vasculaire ontsteking. In het bijzonder, kan het eenvoudig worden aangepast om specifiek onderzoeksvragen te stellen, dat wil zeggen de aanpassing van de shear stress door het variëren van het debiet van het perfusaat, de vloeistof viscositeit, of de zender hoogte en breedte. Met name is de laatste van belang aangezien wijzigingen in flow kamer dimensies verminderen volume van de vloeistof of cellen nodig. Verdere, verschillende fluorescentie labeling van leukocyten, of aan specifieke moleculen van vasculaire of bloedplaatjes monolayers kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van cel-cel interacties.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL	Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE	world precision instruments	78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish	corning	353001
50 mL syringe	Becton Dickinson	300137
Silicone tubing	VWR	228-0700
Elbow Luer Connector Male	Ibidi	10802
Female Luer Lock Coupler	Ibidi	10823
Flow chamber	University Hospital RWTH Aachen		Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005.
Ibidi sticky slide VI 0.4	Ibidi	80608
Coverslips for sticky slides	Ibidi	10812
Collagen Type I, rat tail	Life Technologies Europe bv	A1048301
Recombinant Human TNF-α	Peprotech	300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)	Anaspec / Eurogentec	24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain	Life Technologies Europe bv	S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x	Sigma-Aldrich Chemie	H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid	Life Technologies Europe bv	15630049
BUMINATE Albumin, 25%	Baxter	60010
Water for injection	B. Braun	3624315
Calcium chloride dihydrate	Merck	102382
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich Chemie	M2670
Apyrase	Sigma-Aldrich Chemie	A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Promocell GmbH	C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell GmbH	C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)	ATCC	PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium	ATCC	PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE	ATCC	PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)	ATCC	PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926	ATCC	CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)	ATCC	CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1	DSMZ	ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine	Lonza	BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7	ATCC	TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Accutase	Promocell GmbH	C-41310
Percoll	Sigma-Aldrich Chemie	P1644
Histopaque 1119	Sigma-Aldrich Chemie	11191
10x PBS	Life Technologies Europe bv	14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin	Becton Dickinson	367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%	Greiner Bio	455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water	Sigma-Aldrich Chemie	Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood