Summary
Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.
Abstract
Lökosit yaralanma veya iltihap sitelerine yaralanma veya doku hasarı üzerine alımı son yıllarda incelenmiş ve lökosit yapışma cascade kavramında sonuçlandı. Ancak, lökosit işe dahil tam moleküler mekanizmalar henüz tam olarak tespit edilmiştir değil. Lökosit işe alım enfeksiyon, inflamasyon ve (auto-) bağışıklık araştırma alanında önemli bir konu kalır bu yana, biz temel mekanizmaları yapıştırılması çalışma, de-yapışma için basit bir laminar akış tabanlı tahlil mevcut ve hicret Arteryel ve venöz akışı rejimler altında lökositlerin. Vitro tahlil lökosit ve damar iltihabı farklı modellerde hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı, lökosit ve endotel hücreleri veya görüntülenir ve sonra kaydedilen trombosit etkileşimleri çalışmaya paralel akış odası ve bir ters faz kontrast mikroskobu bir kameraya bağlı kullanarak bir laminar akış tabanlı tahlil açıklar çevrimdışı analiz. Endotel hücreleri, trombosit veya lökosit inhibitörleri veya bu işlem sırasında belirli molekülleri rolünü belirlemek için antikorlar ile pretreated. Kesme koşulları, Yani atardamar veya toplardamar kesme stres, kolayca viskozite ve perfused sıvı akış hızı ve kanal yüksekliği tarafından adapte edilebilir.
Introduction
Yaralanma, iltihap veya enfeksiyon lökosit hızlı patojen veya hasar-ilişkili için moleküler desen (PAMPs, DAMPs), aktif bir duruma değiştirmek ve inflamasyon ve doku hasarı sitelere kan akışı dışarı hareket yanıt. Onların hücresel ve moleküler çevre ile etkileşim olanağı lökositlerin lökosit yapışma eksikliği1gibi genetik bozukluklar tarafından vurgulanmış olarak bağışıklık hücreleri olarak onların doğru işlevi için esastır. Lökosit yapışma son on yıl boyunca yoğun soruşturma konusu olmuştur ve bu erken 1990'larda2,3lökosit yapışma cascade kavramı sonuçlandı. Lökosit yapışma lökositlerin endotel vasküler yüzey üzerinde rulo için hücreleri neden selektin-aracılı yakalama tarafından başlatılır. Bu inişli çıkışlı lökositlerin endotel bağımlı göçmen cues, örneğin, integrinler aktivasyonu teşvik kemokinler için taramak sağlar. Daha sonra aktif integrinler firma lökosit durması sonucu bağlama endotel ligandlar için aracılık. Lökosit daha sonra tarama ve endotel monolayer delici ve temel dokusuna transmigrating önce yayarak extravasate hazırlayabilirsiniz. Kurallı lökosit cascade temel kavramı sunulmasından bu yana büyük ölçüde değişmeden kalmıştır, bazı ara adımlar ile4ekledi. Yine de, tam moleküler mekanizmaları ve lökosit işe dahil birçok oyuncu rollerini şu ana kadar açıklık olmuştur değil ve lökosit işe alım enfeksiyon, inflamasyon ve (auto-) bağışıklık alanında önemli bir konu kalır araştırma.
Örneğin, ateroskleroz gibi vasküler inflamatuar hastalıklar sırasında gemi duvar sürücüler plak gelişme içine lökosit işe arttı. Kararsız aterosklerotik plaklar rüptürü, trombosit ve koagülasyon sisteminin büyük harekete geçirmek ve daha sonra5damar tıkanıklığı. Bu kalp krizi veya felç gibi ciddi kardiyovasküler sonuçlara yol açabilir. Buna ek olarak, klinik olarak, olarak endotel denudation oluşur örneğin bir koroner arter uygulaması sonra yol açar lökosit ve trombosit maruz damar duvar iç (örneğin, matris bileşenleri ve pürüzsüz etkileşimler çok sayıda kas hücreleri) ve vasküler yaralanma kapsayan trombosit ile lökositlerin. Bu etkileşimler monosit-trombosit etkileşimleri neointima oluşumu6,7sürücü olarak daha da geliştirilmesi hastalık için önemlidir. Buna ek olarak, trombosit-lökosit etkileşimleri lökosit integrin Mac-1 (αMβ2) aracılı ve trombosit GPIbα trombozu fareler8roman sürücüleri olarak son zamanlarda belirlenmiştir.
İnsan ve hayvan kan geniş durumu lökosit ve trombosit bir kaynak olarak araştırma ve izole matris molekülleri geniş yelpazede ve lökosit ve vasküler kökenli ölümsüzleştirdi hücre hatları için göz önüne alındığında, lökosit benzetimini yapmak için uygun etkileşimler bir laboratuvar ayarı, özel olarak tasarlanmış akışı perfüzyon Chambers'ı kullanarak akış altında. Adl değişik vakum odaklı kendinden yapışkanlı perfüzyon odalarına kadar geçen on yıl boyunca tasarlanmıştır. Tüm türevleri ortak yönü hareketsiz bölümü (örneğin, kültürlü damar hücreleri veya matris proteinler) önceden tanımlanmış bir kanal perfüzyon sıvıların hareketsiz bölümü üzerinde etkinleştirme ile donatılmış büyük bir sızıntı geçirmez odasına monte var. Buna ek olarak, teknoloji kalıp gelişmeler silis polimerler9tarihinde alan ısmarlama çözümler geliştirme etkin. Viskozite ve perfused sıvı akış hızı ve kanal yüksekliği esas olarak akış perfüzyon aygıt10makaslama stres özelliklerini belirlemek. Bu makalede, biz bir temel mekanizmaları yapıştırılması çalışma, de-yapışma için vitro yöntemi ve Hicret Arteryel ve venöz akışı rejimler altında lökositlerin mevcut. Burada sunulan yöntemleri onlar ortak kamera bağlı floresan mikroskop kullanılarak yapılır ve yüksek teknik yeterlilik Uluslararas› bir Denemecileri gerektirmeyen avantajdır. Vitro tahlil (inhibitörleri ekleyerek veya antikor engellemeörneğin,), birçok yönden manipüle edilebilir ve böylece damar iltihabı farklı modellerinde geçerli ve yapışma incelenmesi protein işlevleri sağlar veya belirli bileşikler değerlendirilmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada tıbbi etik ve Maastricht University of hayvan etik kurulları tarafından onaylanmıştır.
1. akış tabanlı tahlil insan hücreleri ile
-
İnsan kanı düşük trombosit yalıtım
- Venöz kan sitrat (% 3,2) antikoagülan çizin.
- Asit sitrat dekstroz hacmi 1/15 ekleyin (ACD: 80 mM TRISODYUM sitrat, 52 mM sitrik asit ve 183 mM glikoz) kan.
- 350 x g fren trombosit zengin plazma (PRP) elde etmek 15 dakika olmadan, santrifüj kapasitesi.
- 15 mL konik tüp süpernatant nakletmek ve eklemek ACD hacmi 1/20.
- 1110 g fren trombosit zavallı plazma (PPP) elde etmek 15 dakika olmadan, santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant atmak. Damlalıklı ipucu (P 1000) sonunda kesti, yapım o geniş, hangi AIDS önleme trombosit aktivasyon delik ve dikkatle trombosit tampon pH 6,6 PRP olarak aynı birimindeki trombosit Pelet askıya (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2.7 mM KCl, 2 mM MgCl2, % 0,1 sığır serum albümin ve % 0.1 glikoz). ACD hacmi 1/20 ekleyin ve karışımı yavaşça.
- Trombosit 1110 g fren 15dk için olmadan, cips.
- Süpernatant atın ve dikkatli olarak trombosit yukarıda 1 mL trombosit arabellek (pH 7.5) askıya alma.
- Bir otomatik Hematoloji analyzer ile 1/10 seyreltme trombosit konsantrasyon ölçmek.
- 2 x 107/mL sayısını elde etmek için trombosit arabelleği (pH 7.5) ile ses düzeyini ayarlayın.
-
Yalıtım polimorfonükleer hücre insan kanı (uyarlama Brinkmann vd. 11 )
- Kan 24 mL heparin (10 U/mL) antikoagülan olarak çizin.
- 1.077 g/mL yoğunluk polysucrose sodyum diatrizoate orta 6 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) 15 mL konik tüp ve dikkatle üst katmanı 5-6 mL tam kan.
- Santrifüj fren olmadan 800 x g de 20 dk için.
- Aspire edin ve açık sarımsı üst tabaka atmak ve granülosit taze 15 mL konik tüpler içine içeren alt kırmızımsı faz transfer. Hücreleri son hacmi 14 mL ve santrifüj fren olmadan 300 x g de 10 dakika için 2 mM EDTA içeren PBS ekleyerek yıkayın.
- Bu arada, bir yoğunluk gradient orta hazırlamak (örneğin, percoll, bkz: Malzemeler tablo) PBS hisse senedi çözüm x 2 mL 10 ile 18 mL yoğunluk gradient orta karıştırma tarafından çalışma çözüm. Bu çalışma çözüm PBS ile seyreltik (1 x 4.25 mL her biri % 85, % 80'i, % 75, % 70 ve % 65 degrade orta çözümler elde etmek için).
- 2 konik tüpler yoğunluğu gradyan ile üst üste orta her yüzde 2 mL katman tarafından hazırlayın. En yüksek konsantrasyon ile başlarlar ve azalan düzende. Tüp katmanları bir su geçirmez marker ile işaretleyin.
- Dikkatli bir şekilde her iki hazır degradeler hücre süspansiyonlar 2 mL katman.
- Santrifüj vasıl 800 x g dikkatli bir şekilde dengeli bir santrifüj fren olmadan 20 dk için.
- Üst katmanı ve % 65 çoğunu Santrifüjü sonra Kaldır katman (ilk halka) ile PBMCs ve interphases % 85 katman kadar kalan beyaz yeni tüpler içine toplamak (ikinci halka, PMN).
- Hücreleri PBS 2 mM EDTA ile tüplerin ve santrifüj fren olmadan 300 x g, 10 dk kadar doldurarak yıkayın.
- Hank'in arabelleği (pH 7,45), içeren 10 mM Hepes ve % 0,2 insan albumini (tahlil arabellek) 1 mL posalı hücrelerde (genellikle ≥95% olan PMN) askıya alma ve süpernatant çıkarın.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 1 x 106/mL hücreleri askıya alma.
- Floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (Adım 3.3) ile devam.
-
Yapisan trombosit - ve vasküler hücre-monolayers hazırlanması
-
Hücre kültür yemek hazırlama (kültürlü hücreleri)
- 35 mm hücre kültür yemekleri 1 mL sulandırılmış sıçan kuyruk kollajen (30 µg/PBS 0.2 µm filtre filtre içinde seyreltilmiş mL) ile önceden kat.
- 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya, kollajen çözüm atın ve bir kez PBS ile çanak yıkama.
-
Kültür vasküler hücre kültür yemekleri
- İlköğretim (örneğin, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) veya (örneğin, EA. ölümsüzleştirdi damar hücreleri ayırma Hy926, SVEC) izdiham içinde bir T75 şişesi 1.5 mL hücre dekolmanı çözümü (örneğin, accutase) ile büyüdü. Hücre dekolmanı çözüm nötralize ve odası sayma bir hücreyle hücre konsantrasyonu belirlemek için uygun büyüme orta 4.5 mL ekleyin. Senaryo Özeti 105 hücre/mL uygun büyüme orta (örneğin, tam endotel hücre büyüme orta) x 0.5 askıya alma.
- Hücre süspansiyon 2 mL her 35 mm çanak ekleyin. Oksijen kuluçka %5 CO2 37 ° C'de hücreler (hücre türüne bağlı olarak 24-48 h alarak) izdiham kadar kültür.
-
Cam coverslip hazırlık (yapışık trombosit)
- Bir kez içinde HCl-alkol cam coverslip bırakın (1, 2 M / % 50 v/v).
- Coverslip 2 kez ultrasaf su içinde yıkayın.
- Coverslip altında N2kuru.
- Öncesi kat cam coverslip ile seyreltilmiş sıçan kuyruk kollajen perfüzyon TMMOB kanal konumunu uygun olarak 100 µL tip ı (30 µg/PBS 0.2 µm filtre filtre içinde seyreltilmiş mL).
- RT, 30 dk için kuluçkaya, kollajen çözüm atmak ve coverslip 3 yıkama x PBS ile.
- Blok kolajen kaplı coverslip HEPES RT. 0,5 h için % 1 BSA ile
- Yıkama ve coverslip kuru ve perfüzyon odasına monte edin. Trombosit insan üzerinden veya adım 1.1 ya da 2.1, sırasıyla belirtildiği gibi fare kan ayırma.
-
Trombosit immobilizasyon
- Kanal başına 2 x 107/mL trombosit süspansiyon, 70 µL ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO21,5 saat için kuluçkaya.
- Dikkatle yapışık olmayan trombosit engelleme çözüm (HEPES %5 BSA) için en az 30 dk RT. devam, floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (Adım 3.3) ile değiştirin.
-
Vasküler hücre monolayer uyarılması
- Vasküler hücre 10 ng/mL tümör nekrozis faktör α (TNFα) içeren taze medya ile medya değiştirerek CO237 ° C ve %5 4 h için teşvik etmek.
-
Hücre kültür yemek hazırlama (kültürlü hücreleri)
2. akış tabanlı tahlil fare hücreleri ile
-
Trombosit fare kandan yalıtım
- Kardiyak delik üzerinden 21 G iğne (~ 1 mL) kullanarak çizmek kan anestezi (ketamin 80 mg/kg ve medetomidine 0.3 mg/kg) 6-8 hafta-yaşlı fareler (C57Bl/6) sitrat (% 3,2) antikoagülan olarak.
- ACD hacmi 1/6 ekleyin.
- 220 x g, santrifüj, trombosit zengin plazma (PRP) elde etmek 5 min için orta fren.
- Süpernatant (~ 600 µL) 1/3 kırmızı kan hücrelerinin yeni bir tüp transferi
- 95 x g 6 min için fren olmadan, santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant (PRP) aktarmak ve trombosit konsantrasyon Tyrode'nın tampon 1/10 seyreltme ölçmek (TH arabellek: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2.7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, % 0,1 sığır serum albümin ve % 0.1 glikoz) bir otomatik Hematoloji analyzer ile.
- Trombosit ACD + 0.1 U/mL apyrase 1/25 hacmi ekleyerek yıkama ve 2,870 g, 2 min için orta fren de santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant atın ve 600 µL TH arabellek, ACD hacmi 1/10 ve 0.1 U/mL apyrase ekleyin. Damlalıklı ipucu (P 1000) off kesmek, yapım o geniş, trombosit aktivasyon önlenmesinde yardımcı olur ve yavaşça Pelet askıya taşıyordu.
- Santrifüj 2,870 g de, 2 min için orta fren
- Süpernatant atın ve yavaşça trombosit TH arabellekte askıya alma.
- 2 x 107/mL sayısını elde etmek için TH arabelleği ile ses düzeyini ayarlayın.
-
Yapisan trombosit monolayers hazırlanması
- Cam coverslip (yapışık trombosit) 1.3.3 göre hazırlayın.
-
Trombosit immobilizasyon
- Kanal başına 2 x 107/mL trombosit süspansiyon, 100 µL ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO21,5 saat için kuluçkaya.
- Dikkatle yapışık olmayan trombosit engelleme çözüm (HEPES %5 BSA) için en az 30 dk RT. devam, floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (Adım 3.3) ile eski yerine koymak ile
-
Fare trombosit monolayer uyarılması
- Önce perfüzyon lökositlerin (Adım 3,3), trombosit Trombin perfüzyon tarafından teşvik (0.5 nM) HHHSA arabelleği için 37 ° C'de 3 dk.
3. floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (PMN veya THP-1 insan ve RAW264.7 için veya birincil fare monosit fare akış tabanlı tahlil için)
-
Floresan etiketleme
- Lökosit (1 x 106/mL) hücre permeant yeşil flüoresan nükleik asit leke (1 µM) ile etiketleyin. 37 ° C'de 30 dk için hücreleri kuluçkaya
- PBS ile hücreleri tarafından Santrifüjü 300 x g 5 min için de yıkama ve 0.5 x 106 hücre/mL (5 mL test durumuna bağlı olarak akış hızı başına) tahlil arabellekte bir konsantrasyon hücrelere askıya alma.
-
Akış odası tahlil hazırlık
- Lökosit yapışma hücre monolayer Tarih için çanak hücre kültür ortamından atın ve akış odasına topla. Boru şırıngaya takın. İmmobilize trombositler üzerinde lökosit yapışma için mikro slayt şırıngaya takın. Önceden bir su banyosu ile 37 ° c sıcak
- Bir perfüzyon şırınga (50 mL), yükleme şırınga tenkıye tutucusu ve pompa çekilme kümesi modu almak. Pompa birimi için 0 mL ve 50 mL şırınga için 26.70 mm çapı ayarlayın.
- Tüp tek bir amaç için bir dirsek radarı konektörüne takın. Radarı kilit bağlantı için belgili tanımlık tenkıye yerleştirin ve tüp radarı kilit coupler dirsek radarı konektörüne bağlayın. Ücretsiz tüp ucunu akışı odasına bağlayın.
-
Lökosit perfüzyon ve yapışma
- Lökosit yapışma hücre monolayer Tarih için çanak hücre kültür ortamından atın ve akış odasına topla. Boru şırıngaya takın. İmmobilize trombositler üzerinde lökosit yapışma için mikro slayt şırıngaya takın.
- Lökosit perfüzyon ve üzerinde bir vasküler adezyon için-ya da trombosit monolayer, ikinci tüp tahlil tampon ve 1 mL damlalıklı ile boru dolgu içeren bir 50 mL konik tüp içine yerleştirin sonra tüp sıkmak ve akış odasına bağlayın.
- Lökosit perfüzyon önce 3 mM CaCl2 ve 2 mM MgCl2 hücre süspansiyon ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
- Tahlil arabellek perfüzyon olası hava odası ve kablo kanalları kaldırmak için hücre önce sıvı.
- Onları sıkı sıkarak tüp biter kapatın ve hücre süspansiyon, tuzağa üzerinden hava kabarcıkları önlenmesi için tahlil arabellek üzerinden tüp geçiş. İlk hücreleri gelene kadar uygun akış hızı/makaslama stres içeren hücreler sıvı.
- Uygun akış hızı/makaslama stres 2 min için hücrelerle sıvı ve 2-6 dk bir ters faz kontrast/Floresans mikroskobu (örneğin, EVOS-FL) ile çalışırken ve yapışık hücrelerinin arasında en az 6 resim yakalama 100 X büyütme kullanarak bağlı bir CCD veya CMOS kamera için.
Not: Akış odası boyutları ve perfusate viskozite akış hızı/makaslama stres bağlıdır. Burada kullanılan perfüzyon odası için (bkz. Tablo malzeme):
Τη= * 97.1*Φ
Τ: yamultma stres (1 dyn/cm2)
Η: viskozite (0,015 dyn * s/cm2)
Φ: akış hızı (0.67 mL/dk)
-
Lökosit de-yapışma
- De-adhesion için tahlil arabelleğine hücre süspansiyon gelen tüp hava kabarcıkları sıkışmış olma engelleyen Borulama, sıkarak geçin.
- Hücreleri tarafından perfüzyon ile tahlil arabellek uygun akış hızı/makaslama stres (bkz: 3.3.7 Not) ile bağlantısını kesin.
-
Lökosit hicret
- Lökosit hicret için lökosit (Adım 3) sıvı yeterli bir miktar lökositlerin uygun kadar (~ 50 hücreler/görünüm alanı).
- Lökosit süspansiyon tahlil arabellek ile değiştirin.
- Transmigrating hücreleri zaman atlamalı tarafından her 10-15 s 37 ° C'de 30-60 dk kayıt
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endotel lökosit yapışma çalışmaya fluorescently etiketli THP-1 hücreleri üzerinde 3 din/cm22 min için TNFα - veya sigara-uyarılmış endotel monolayer periosteum. Yapisan Monositik hücre toplam sayısı perfüzyon 2 dk sonra 6 bağımsız alan 2-6 dk bir süre içinde yakalama tarafından tespit edilmiştir. Yapışık hücreleri en az 6 resimleri bir ters faz kontrast/Floresans mikroskobu (örneğin, EVOS-FL) ele quantified bağlantılı CCD veya CMOS kamera 10 X büyütme kullanarak ve ortalama yapışık hücreleri ifade edildi / mm2. TNFα ile endotel stimülasyon THP-1 tutuklama unstimulated endotel ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde arttı. Sıkıca temsilcisi Filmler ve bir miktar yapışık THP-1 sigara - ya da TNFα-uyarılmış endotel hücrelere şekil 1' de sunulmuştur. Trombosit-lökosit yapışma tarafından fluorescently etiketli nötrofil perfüzyon 1 din/cm2az 2 dakika boyunca bir tuzak-6 - veya sigara-uyarılan trombosit monolayer değerlendirildi. Yapisan nötrofil yukarıda da belirtildiği gibi sayısal. TUZAK-6 stimülasyon yapışma nötrofil unstimulated trombosit göre önemli ölçüde arttı. Temsilcisi videolar ve sigara - veya tuzak-6-uyarılan trombosit monolayer için sıkıca yapışık nötrofil miktar şekil 1' deBsundu.
Resim 1 : Endotel - ve trombosit-lökosit yapışma akışı koşullar altında. Miktar ve temsilcisi Filmler insan Monositik hücre (THP-1) (HUVEC) endotel hücrelere yapıştırılması seribaşı kolajen kaplı kültür yemekleri akışı koşullar altında ile ya da ezelî TNFα harekete geçirmek (10 ng/mL)(a). Miktar ve temsilcisi Filmler yapıştırılması insan nötrofil insan trombositler kollajen kaplı cam slaytlara akış koşullarında immobilize olmadan veya tuzak-6 harekete geçirmek (50 µM) ile (B). P değerleri unpaired t-testi ile hesaplanan (n = 3; ± SD demek). Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ayrıca, bu tahlil adezyon molekülleri, trombosit bileske adezyon molekül A (reçel-A) gibi rolü eğitim için uygulanabilir. RAW264.7 fare monosit/makrofaj trombosit monolayer için reçel-a yapışma (trJAM-A+/ +) ve reçel-A-eksik (trJAM-A- / -) fareler bizim eski çalışma7' değerlendirilmesi. Orada gözlemlediği gibi trombosit reçel-A eksikliği fare monosit (Şekil 2A-B) farelerde vahşi tip karşılaştırıldığında trombosit monolayer için yapışma arttı. Alternatif olarak, birincil fare nötrofil açıklanan12fareler ayrılmış olabilir.
Adezyon molekülleri trombosit-lökosit etkileşimlerde yer gibi temel mekanizmaları incelemek için belirli yüzey reseptörleri bloke edilebilir. Söz konusu çalışmada, trombosit GPIbα ve lökosit αMβ2 önemli ölçüde engelleme monosit yapışma, artan monosit istihdamı için reçel-A- / - GPIbα-αMβ2 eksen için bir rolü tanımlayan azaldı trombosit (Şekil 2A-B). Ayrıca, hücre dekolmanı deneyler kesme stres bağımlılığı trombosit-lökosit etkileşimlerin araştırmak için gerçekleştirilir. Monosit akışı bağımlı müfreze ölçüm için kesme stres artımlı olarak 0 ile 20 dynes/cm2' ye yükseltilmiştir. Bu çalışmada, reçel-A- / - trombosit RAW264.7 hücre adezyon reçel-A göre stres yamultmak için daha dayanıklı+/ + trombosit (Şekil 2C).
Resim 2 : Reçel-A-eksikliği teşvik akışı dayanıklı Monositik hücre adezyon. Fare monosit/makrofaj RAW264.7 yapışma hücreleri trombosit için reçel-A'dan+/ + ve kolajen kaplı cam slaytlara akışı koşullar altında ya da olmadan Trombin harekete geçirmek immobilize reçel-A- / - fareler (IIA, 0.5 nM) varlığı Belirtilen inhibitörleri(a). Fare monosit/makrofaj RAW264.7 temsilcisi Filmler hücreleri yapışık reçel-A'ya+/ + ve reçel-A- / - trombosit izotip kontrol veya anti-GPIbα antikorlar (B) ile tedavi sonrası. Hücre adezyon Trombin etkinleştirmeden sonra immobilize trombosit kademeli olarak artan kesme stres (din/cm2) altında başlangıçta yapışık hücreleri yüzdesi olarak ifade edilen (IIA, 0.5 nM). P değerleri Tukey'nın sonrası test ile ANOVA tarafından hesaplanan (n = 3-5; ± SEM demek). Ölçek çubuğu 100 µm =. Bu rakam Zhao ve ark. değiştirildi 7 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tekli alanları lökosit perfüzyon ve yapışma aşağıdaki uzun süreli kayıt süresi (30-60 dk) tarama ve davranış ve son hicret endotel tabakası arasında yayılan lökosit çalışma sağlar. Bu çalışma içinde bir endotel tabakası arasında birincil insan monosit (olarak açıklanan13üretici yönergelerine göre monosit izolasyon kiti ile izole) hicret analiz ettim. Şekil 3, endotel için aşağıdaki firma tutuklama sunulan monosit tarama ve Hicret için tercih edilen site ulaşılana kadar yayılan extravasate hazır olun. Daha sonra monosit endotel hücre bariyer tarafından para - ya da transcellular geçiş nüfuz. Transmigrating hücreleri kendi pseudopodia uzanan ve böylece onların parlaklığa endotel bariyer ile endotel hücreleri üzerinde yayılmış hücreler olarak tanımlanmış.
Şekil 3: Vitro endotel monolayer genelinde birincil monosit hicret. Monosit gezinme ve yayılan ve son hicret endotel genelinde kaydedildi her 15 s 30 dk. için burayı tıklayın bu videoyu izlemek için. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu vitro tahlil vasküler enflamasyon sırasında lökosit alımı temel mekanizmaları araştırmak için basit bir yöntemdir, ancak dikkat edilmesi gereken bazı kritik nokta. Bu tahlil başarıyla gerçekleştirmek için ilk perfüzyon lökosit bir sağlam ve Konfluent vasküler veya trombosit monolayer gereksinimdir. Bu önceden kaplama kollajen türü olan yüzeylerin tarafından ben elde edilebilir. Genel olarak, birincil damar hücreleri ile çalışırken, yavaşça önerilen collagenase içeren dekolmanı çözüm kullanarak hücreleri ayırmak önemli olan ( Tablo malzemeleri, olan daha az titiz bakın), ama tripsin kadar etkili. Trombosit monolayers için hafifçe yıkamak trombosit yalıtım sırasında trombosit aktivasyon ve toplama önlemek için önemlidir.
Diğer bir önemli faktör pompa sürekliliğini korumak bir süreksizlik yol açar bu yana perfüzyon için kullanılan para çekme modu rahatsız akış hızı ve kayma koşulları. Böylece, bu yanlışlık gerçek kesme stres ve daha sonra fizyolojik olarak kesme bağımlı işlemlerin yanlış yorumlama için sonuçlar. Bu pompa düzenli bakım ile önlenebilir. Ayrıca, her deneme için taze bir şırınga kullanımı sırasında perfüzyon devamı için önemlidir. Şırınga değişiklikleri ile artan kullanımı ve deneyler arasında zaman içinde lastik doku beri sürekli bir geri çekilme engeller.
Bir daha da kritik adım beri hava daha sonra hücre yüzeyinden koparmak ve kesme koşulları değiştirme lökosit, perfüzyon sırasında sıkışmış olma hava önleme olduğunu. Bu tüm boru ultra saf su ile ve sonra tahlil arabelleği ile kullanmadan önce durulama ile önlenebilir. Ayrıca, boru tahlil arabelleğe hücre süspansiyon veya diğer bir koşul bağlanırken, bağlantı sırasında sıvı arabirimleri sağlamak önemlidir. Bu boru sıkma veya boru içinde sıvı düzeyleri değiştirmeden elde edilebilir. Ayrıca, perfusate sıvı hacmi her zaman boru sonuna düşen düzeyi önlemek ve böylece, sistemdeki götürülüyor hava için yeterli olmalıdır.
Bu testin olası bir sınırlama yapay bir ortamda, Yani doğru vivo içinde devlet modeli değil bir medyum tarafından çevrili bir plastik yüzey üzerinde kültürlü korunur kültürlü hücreleri kullanımı olabilir. Her ne kadar physiochemical ve fizyolojik ortamı tam olarak kontrol edilebilir, kültürlü hücreleri artar genetik varyasyon ve böylece bir nüfus içindeki hücreleri heterojen bir hızlı büyüme oranına sahip. Ayrıca, damar-ya da trombosit monolayer bir tek hücre türü yalnızca oluşur. Soruşturma zaman lökosit endotel etkileşimleri, Yani, hicret lökositlerin endotel hücre bariyer, fizyolojik ilgili rolü altında yatan endotel hücre membran ve perisitlerden arasında özellikle, dikkate alınamaz. Alternatif olarak, bu tahlil 3D-hücre kodlamayla tekniklerini uygulayarak çok hücreli bir ortam oluşturmak ilginç olabilir.
Özet olarak, bu noktaları dikkate alarak, Laminer akış tabanlı tahlil verimli damar iltihabı farklı modeller uygulanabilir. Özellikle, kolayca adres belirli araştırma soruları için Yani kesme stres düzeltilmesi ya perfusate, sıvı viskozitesi veya kanal yüksekliği ve genişliği akış hızı değiştirerek değiştirilebilir. Sıvı birim veya hücreler gerekli değişiklikleri akış odası boyutta azaltmak bu yana özellikle, ikinci önem taşımaktadır. Ayrıca, farklı floresan lökositlerin veya vasküler, belirli moleküllerin etiketleme veya trombosit monolayers hücre-hücre etkileşimleri çalışma için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Drs. Martin M. Schmitt ve satır Fraemohs teşekkür ederim. Bu eser bilimsel araştırma (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Vakfı kan nakli araştırma (LSBR Nr. 1638) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) R.R.K. için ödül için Hollanda Vakfı tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
- Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
- Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
- Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
- Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
- Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
- Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).
