Summary
الكريات البيضاء شوق تتفاعل مع خلايا الأوعية الدموية والصفائح الدموية بعد إصابة الجدار السفينة أو أثناء التهاب. وهنا يصف لنا تحليل القائم على التدفق الصفحي مباشرة لتوصيف الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التفاعلات بين الكريات البيضاء وشركائها الخلوية.
Abstract
تجنيد الكريات البيضاء عند الإصابة أو التهاب للمواقع من ضرر أو تلف الأنسجة حققت خلال العقود الأخيرة، وقد أدى مفهوم تتالي التصاق الكريات البيض. ومع ذلك، الآليات الجزيئية الدقيقة التي تشارك في تجنيد الكريات البيض لا بعد تماما حددت. التوظيف الكريات البيض لا يزال موضوعا هاما في مجال العدوى والتهاب (السيارات) محصنة والبحوث، فإننا نعرض تحليل القائم على التدفق الصفحي مباشرة لدراسة الآليات الكامنة للالتصاق، الالتصاق دي، و التهجير من الكريات البيضاء تحت أنظمة التدفق الوريدي والشرياني. يمكن استخدام التحليل في المختبر لدراسة الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التفاعلات بين الكريات البيضاء وشركائها الخلوية في نماذج مختلفة من التهاب الأوعية الدموية. ويصف هذا البروتوكول تحليل القائم على التدفق الصفحي استخدام دائرة التوازي-تدفق و مقلوب مجهر تباين المرحلة متصلة بكاميرا لدراسة التفاعلات بين الكريات البيضاء وخلايا بطانية أو الصفائح الدموية، التي يمكن أن تصور وتسجل ثم تحليل دون اتصال. يمكن pretreated خلايا بطانية أو الصفائح الدموية أو الكريات البيضاء مع مثبطات أو الأجسام المضادة لتحديد دور جزيئات محددة أثناء هذه العملية. شروط القص، أي الشرياني أو الوريدي القص الإجهاد، يمكن تكييفها بسهولة من اللزوجة ومعدل التدفق للسوائل perfused والارتفاع للقناة.
Introduction
عند الإصابة أو الالتهاب أو العدوى، الكريات البيضاء بسرعة الاستجابة الممرض أو الأضرار-المرتبطة بالجزيئات أنماط (بامبس، دامبس)، تغيير في حالة نشطة، والانتقال من مجرى الدم إلى مواقع لتلف الأنسجة والتهاب. قدرة الكريات البيضاء على التفاعل مع بيئتها الخلوية والجزيئية ضروري لوظيفتها الصحيحة كالخلايا المناعية، كما أبرزت الاضطرابات الوراثية مثل نقص التصاق الكريات البيض1. التصاق الكريات البيض خضعت لتحقيقات مكثفة خلال العقود الماضية وأسفر ذلك عن مفهوم تتالي التصاق الكريات البيض في أوائل التسعينات2،3. التصاق الكريات البيض تبدأ بإلقاء القبض على سيليكتين بوساطة الكريات البيضاء إلى البطانة، مما تسبب في الخلايا للفة فوق سطح الأوعية الدموية. هذا المتداول تمكن الكريات البيضاء المسح الضوئي لربط البطانة المهاجرة العظة، مثلاً، المستقطبات، والحث على تفعيل إينتيجرينس. وفي وقت لاحق، التوسط integrins المنشط الربط إلى يغاندس بطانية، أسفرت عن اعتقال الكريات البيض وطيد. في وقت لاحق قد تعد الكريات البيضاء اكسترافاساتي بالزحف والانتشار، قبل اختراق أحادي الطبقة البطانية وترانسميجراتينج إلى الأنسجة الكامنة. المفهوم الأساسي لسلسلة الكريات البيض المتعارف عليه قد يتغير إلى حد كبير منذ إطلاقها، مع بعض الخطوات الوسيطة وأضاف4. ومع ذلك، الآليات الجزيئية الدقيقة وأدوار العديد من اللاعبين المتورطين في تجنيد الكريات البيض لم توضح حتى الآن، وتجنيد الكريات البيض لا يزال موضوعا هاما في مجال الإصابة بالتهاب و (السيارات-) محصنة ضد البحث.
على سبيل المثال، أثناء أمراض التهاب الأوعية الدموية مثل تصلب الشرايين، زيادة تجنيد الكريات البيض في وضع اللوحة محركات الأقراص الجدار السفينة. قد تمزق لويحات تصلب الشرايين غير مستقرة، مما يؤدي إلى تنشيط واسعة النطاق لنظام التخثر والصفائح الدموية، وفيما بعد انسداد السفينة5. قد ينتج هذا عن نتائج القلب والأوعية الدموية الشديدة مثل احتشاء عضلة القلب أو السكتة الدماغية. وباﻹضافة إلى ذلك، تعرية غشائي كما يحدث سريرياً، مثلاً بعد الدعامات للشريان التاجي، يؤدي إلى العديد من التفاعلات من الكريات البيضاء والصفائح الدموية إلى داخل الجدار سفينة مكشوفة (مثلاً، عناصر المصفوفة وسلس خلايا العضلات) والكريات البيضاء مع الصفائح الدموية تغطي إصابة الأوعية الدموية. هذه التفاعلات تعتبر هامة لمواصلة تطوير هذا المرض كما قد تدفع التفاعلات الوحيدات-الصفائح الدموية نيوينتيما تشكيل6،7. وباﻹضافة إلى ذلك، توسط التفاعلات الكريات البيض الصفيحات الكريات البيض إنتغرين ماك-1 (α βم2) والصفائح الدموية GPIbα قد حددت مؤخرا كسائقين رواية تجلط الدم في الفئران8.
ونظرا لتوافر الدم البشري والحيواني على نطاق واسع كمصدر للكريات البيضاء والصفائح الدموية للبحوث، وطائفة واسعة من الجزيئات مصفوفة معزولة وخطوط الخلية مخلدة الكريات البيض ومنشأ الأوعية الدموية، أنه من الممكن لمحاكاة الكريات البيض التفاعلات تحت التدفق في مختبر للإعداد، باستخدام الدوائر نضح تدفق مصممة خصيصا. وقد صممت العديد من المتغيرات العقود الماضية، بدءاً من يحركها الفراغ إلى الدوائر نضح ذاتية اللصق. كافة المتغيرات تشترك في هذا الجزء غير متحركة (مثلاً، واستزراع خلايا الأوعية الدموية أو مصفوفة البروتينات) يتم تجميعها إلى غرفة مانعة للتسرب أكبر مزودة بقناة معرفة مسبقاً تمكين نضح السوائل فوق الجزء غير متحرك. وباﻹضافة إلى ذلك، مكن التقدم في صب التكنولوجيا وضع حلول مخصصة استناداً إلى السليكا البوليمرات9. اللزوجة ومعدل التدفق للسوائل perfused والارتفاع للقناة أساسا تحديد خصائص القص إجهاد الجهاز نضح تدفق10. في هذه المقالة، نقدم الأسلوب في المختبر لدراسة الآليات الكامنة للالتصاق، الالتصاق دي، والتهجير من الكريات البيضاء تحت أنظمة التدفق الوريدي والشرياني. استفادة الأساليب المقدمة هنا هو أنها يمكن أن يؤديها باستخدام مجهر الأسفار كاميرا متصلة مشتركة، ولا تتطلب من المجربون أن تمتلك الكفاءة التقنية العالية. الفحص في المختبر يمكن التلاعب بطرق عديدة (مثلاً، عن طريق إضافة مثبطات أو حجب الأجسام المضادة)، وهكذا قابلاً للتطبيق في نماذج مختلفة من التهاب الأوعية الدموية ويسمح التحقيق في التصاق وظائف البروتين أو تقييم لمركبات معينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها الأخلاقية الطبية ومجالس الأخلاقية الحيوان في جامعة ماستريخت.
1-تدفق على أساس مقايسة مع الخلايا البشرية
-
عزل الصفائح الدموية من الدم البشري
- سحب الدم الوريدي في تخثر سترات (3.2 في المائة).
- إضافة إلى حجم 1/15 من "حمض سترات الدكستروز" (حوار التعاون الآسيوي: سترات صوديوم 80 مم، وحمض الستريك 52 مم والجلوكوز 183 مم) في الدم.
- الطرد المركزي في 350 x ز دون الفرامل لمدة 15 دقيقة للحصول على البلازما الغنية الصفائح الدموية (PRP).
- نقل المادة طافية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وإضافة المجلد 1/20 من حوار التعاون الآسيوي.
- الطرد المركزي في 1,110 ز دون الفرامل لمدة 15 دقيقة للحصول على البلازما الفقيرة الصفائح الدموية (تعادل القوة الشرائية).
- تجاهل المادة طافية. قطع نهاية طرف بيبيت (1000 ف)، يجعلها واسعة تتحمل، فيها الإيدز في منع تنشيط الصفائح الدموية، وتعليق بيليه الصفائح الدموية بعناية في نفس وحدة التخزين كالحزب الثوري في الصفيحات المخزن المؤقت pH 6.6 (PB: 136 مم كلوريد الصوديوم، 10 مم هيبيس ، 2.7 مم بوكل، 2 مم مجكل2والبومين المصل البقري 0.1% والجلوكوز 0.1%). إضافة إلى حجم 1/20 من حوار التعاون الآسيوي وتخلط برفق.
- بيليه الصفائح الدموية في 1,110 ز دون الفرامل لمدة 15 دقيقة.
- تجاهل المادة طافية وتعليق الصفائح الدموية أعلاه بعناية في المخزن المؤقت للصفائح الدموية 1 مل (درجة الحموضة 7.5).
- قياس تركيز الصفائح الدموية في تمييع 1/10 مع محلل الدم الآلي.
- ضبط حجم الصوت مع المخزن المؤقت للصفائح الدموية (درجة الحموضة 7.5) لتحقيق عد من 2 × 107/mL.
-
عزل خلايا النوى من الدم البشري (مقتبس من برينكمان et al. 11 )
- رسم 24 مل دم في الهيبارين (10 U/mL) تخثر الدم.
- إضافة 6 مل من كثافة 1.077 غ/مل بوليسوكروسي الصوديوم دياتريزواتي المتوسطة (انظر الجدول للمواد) إلى الأنبوبة المخروطية 15 مل، وعناية الطبقة 5-6 مل الدم كله على أعلى.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 800 x ز دون الفرامل.
- نضح وتجاهل الطبقة العليا مصفر واضح ونقل في مرحلة المحمر السفلي يحتوي على المحببة إلى أنابيب مخروطية الشكل 15 مل جديدة. تغسل الخلايا عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني يحتوي على 2 مم أدتا إلى وحدة تخزين نهائي 14 مل، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة على 300 غرام x دون الفرامل.
- وفي الوقت نفسه، تعد وسيلة تدرج في كثافة (مثلاً، بركل، انظر الجدول للمواد) حل عملي بخلط 18 مل الكثافة المتوسطة التدرج مع 2 مل 10 × الحل مخزون برنامج تلفزيوني. تمييع هذا الحل العمل مع برنامج تلفزيوني (س 1) للحصول على مل 4.25 كل حل من الحلول المتوسطة التدرج 85%، 80%، 75%، 70%، و 65%.
- إعداد أنابيب مخروطية 2 مع التدرج كثافة من طبقات 2 مل من كل نسبة مئوية متوسطة فوق بعضها البعض. بدء تشغيل مع أعلى تركيز والاستمرار في ترتيب تنازلي. علامة الطبقات في الأنبوب مع علامة الماء.
- الطبقة 2 مل تعليق خلية على كل من التدرجات استعداد اثنين بعناية.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 800 x ز دون الفرامل في أجهزة الطرد مركزي متوازنة بعناية.
- بعد الطرد المركزي، إزالة الطبقة العليا وأكثر من 65% طبقة (الحلقة الأولى) مع ببمكس، وجمع في أنابيب جديدة الأبيض الباقية إينتيرفاسيس حتى الطبقة 85% (الدائري الثاني، المجنحة).
- تغسل الخلايا عن طريق ملء أنابيب مع برنامج تلفزيوني 2 مم يدتا، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة على 300 غرام x دون الفرامل.
- إزالة المادة طافية وتعليق الخلايا رسابة (عادة % إيه ناين فايف هي المجنحة) في 1 مل من المخزن المؤقت في هانك (pH 7.45)، التي تحتوي على 10 ملم الزلال البشري حبيس و 0.2 في المائة (مقايسة المخزن المؤقت).
- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وتعليق الخلايا في/mL61 x 10.
- تواصل مع وضع العلامات الفلورية ونضح من الكريات البيضاء (الخطوة 3، 3).
-
إعداد ملتصقة الصفائح الدموية وخلايا الأوعية الدموية-مونولاييرس
-
إعداد طبق ثقافة الخلية (الخلايا المستزرعة)
- قبل معطف أطباق الثقافة خلية 35 ملم مع 1 مل الكولاجين ذيل الجرذ المخفف (30 ميكروغرام/مل مخففة في برنامج تلفزيوني تصفيتها عبر فلتر 0.2 ميكرون).
- احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وتجاهل الحل الكولاجين، وغسل الطبق مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
-
ثقافة خلايا الأوعية الدموية في أطباق الثقافة
- فصل الابتدائي (مثلاً، هوفيك, هاويك, هاوسمك) أو خلايا الأوعية الدموية مخلدة (مثلاً، عصام. Hy926، سفيك) ارتفع إلى التقاء في قارورة T75 مع 1.5 مل الخلية المفرزة الحل (مثلاً، أككوتاسي). إضافة 4.5 مل متوسط النمو المناسبة لتحييد الحل مفرزة الخلية وتحديد تركيز الخلية مع خلية العد الدائرة. تعليق الخلايا في 0.5 × 105 خلايا/مل في المتوسطة النمو المناسب (مثلاً، الخلية البطانية كاملة النمو المتوسطة).
- إضافة 2 مل تعليق خلية لكل طبق 35 ملم. ثقافة الخلايا في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 حتى التقاء (أخذ ح 24 – 48، تبعاً لنوع الخلية).
-
إعداد ساترة زجاجية (ملتصقة الصفائح الدموية)
- تزج ساترة زجاجية مرة في HCl-EtOH (1.2 متر/50% v/v).
- شطف ساترة 2 مرات في الماء عالي النقاوة.
- جاف ساترة تحت ن2.
- معطف قبل ساترة زجاجية مع 100 ميليلتر، وفقا لموقف القناة الدائرة نضح الفئران المخفف الذيل الكولاجين النوع الأول (30 ميكروغرام/مل مخففة في برنامج تلفزيوني تصفيتها عبر فلتر 0.2 ميكرون).
- احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت وتجاهل الحل الكولاجين، وتغسل ساترة 3 x مع برنامج تلفزيوني.
- كتلة ساترة الكولاجين المغلفة مع جيش صرب البوسنة 1% في حبيس ح 0.5 في الرايت
- تغسل والجاف ساترة وجبل في قاعة التروية. عزل الصفائح الدموية من البشر أو الدم الماوس كما هو موضح في الخطوة 1، 1 أو 2-1، على التوالي.
-
التثبيت من الصفائح الدموية
- إضافة 70 ميليلتر من 2 × 107/mL الصفائح الدموية تعليق كل قناة، واحتضان ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- عناية استبدال الصفائح الدموية غير ملتصقة بعرقلة الحل (5% جيش صرب البوسنة في حبيس) مدة 30 دقيقة على الأقل في متابعة الرايت مع وضع العلامات الفلورية ونضح من الكريات البيضاء (الخطوة 3، 3).
-
تنشيط خلايا الأوعية الدموية أحادي الطبقة
- تنشيط الخلايا والأوعية الدموية بالاستعاضة عن وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الطازجة التي تحتوي على 10 α عامل نخر الورم نانوغرام/مليلتر (TNFα) ح 4 في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
-
إعداد طبق ثقافة الخلية (الخلايا المستزرعة)
2-القائم على التدفق المقايسة مع خلايا موريني
-
عزل الصفائح الدموية من الدم الماوس
- تخديره من سحب الدم من ثقب القلب باستخدام إبرة ز 21 (~ 1 مل) من (الكيتامين 80 ملغ/كغ وميديتوميديني 0.3 مغ/كغ) الأسبوع 6-8-الفئران القديمة (C57Bl/6) في سترات (3.2 في المائة) تخثر الدم.
- إضافة إلى حجم 1/6 لحوار التعاون الآسيوي.
- أجهزة الطرد المركزي في 220 س ز، والفرامل متوسطة لمدة 5 دقائق للحصول على البلازما الغنية الصفائح الدموية (PRP).
- نقل المادة طافية (~ 600 ميليلتر) بالإضافة إلى 1/3 خلايا الدم الحمراء إلى أنبوب جديد
- الطرد المركزي في 95 ز العاشر دون الفرامل لمدة 6 دقائق.
- نقل المادة طافية (PRP) وقياس تركيز الصفائح الدموية في 1/10 إضعاف في المخزن المؤقت تيرودي (TH المخزن المؤقت: 136 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم هيبيس، 2.7 مم بوكل، 0.42 مم NaH2بو4* ح2س، 2 مم مجكل2، ألبومين المصل البقري 0.1% و 0.1% الجلوكوز) مع محلل الدم الآلي.
- تغسل الصفائح بإضافة المجلد 1/25 لحوار التعاون الآسيوي + 0.1 مليلتر يو أبيراسي، والطرد المركزي في 2,870 ز، فرامل متوسطة لمدة 2 دقيقة.
- تجاهل المادة طافية وإضافة 600 ميليلتر TH العازلة، المجلد 1/10 لحوار التعاون الآسيوي، وأبيراسي U/mL 0.1. قطع الحافة بيبيت (1000 ف)، يجعلها واسعة تتحمل، مما يساعد في منع تنشيط الصفائح الدموية، وتعلق بلطف بيليه.
- أجهزة الطرد المركزي في 2,870 ز، والفرامل متوسطة لمدة 2 دقيقة
- تجاهل المادة طافية وتعليق الصفائح بلطف في المخزن المؤقت لل.
- ضبط حجم الصوت بال المخزن المؤقت لتحقيق عد من 2 × 107/mL.
-
إعداد مونولاييرس الصفائح الدموية ملتصقة
- إعداد ساترة زجاجية (الصفائح الدموية ملتصقة) حسب 1.3.3.
-
التثبيت من الصفائح الدموية
- إضافة 100 ميليلتر من 2 × 107/mL الصفائح الدموية تعليق كل قناة، واحتضان ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- استبدال بعناية الصفائح الدموية غير ملتصقة بعرقلة الحل (5% جيش صرب البوسنة في هيبيس) مدة 30 دقيقة على الأقل في متابعة الرايت مع وضع العلامات الفلورية ونضح من الكريات البيضاء (الخطوة 3، 3)
-
تنشيط ماوس الصفيحات أحادي الطبقة
- قبل التروية من الكريات البيضاء (الخطوة 3، 3)، حفز الصفائح نضح ثرومبين (0.5 nM) في المخزن المؤقت حصصة لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية.
3. فلوري وسم ونضح من الكريات البيضاء (المجنحة أو THP-1 للإنسان و RAW264.7 أو وحيدات الماوس الأساسي للتحليل القائم على التدفق مورين)
-
وسم نيون
- قم بتسمية الكريات البيضاء (1 × 106/mL) مع الحمض النووي الفلورية الخضراء خلية بيرمينت وصمة عار (1 ميكرومتر). احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- وقف الخلايا بتركيز 0.5 × 106 خلايا/مل (5 مل كل شرط الاختبار، تبعاً لمعدل التدفق) في المخزن المؤقت للمقايسة، وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني بالطرد المركزي على 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
-
تدفق إعداد المقايسة الدائرة
- لالتصاق الكريات البيض في أحادي الطبقة خلية، تجاهل مستنبت الخلية من الطبق، وجمع في قاعة تدفق. قم بتوصيل أنابيب المحاقن. لالتصاق الكريات البيض على الصفائح الدموية المعطل تداولها، قم بتوصيل الشريحة مايكرو المحاقن. قبل الحارة حمام مائي إلى 37 درجة مئوية.
- تأخذ حقنه التروية (50 مل)، المحاقن التثبيت على حامل حقنه، ومجموعة سحب المضخة على الوضع. تعيين حجم مضخة لمل 0، وتعيين القطر إلى 26.70 مم لحقنه 50 مل.
- قم بتوصيل موصل اللوير كوع واحدة من نهاية الأنبوب. ضع مقرنة قفل اللوير للمحاقن وتوصيل الأنابيب مع موصل اللوير الكوع المقرنة قفل اللوير. قم بتوصيل نهاية الأنابيب مجاناً إلى الدائرة تدفق.
-
نضح الكريات البيض والالتصاق
- لالتصاق الكريات البيض في أحادي الطبقة خلية، تجاهل مستنبت الخلية من الطبق، وجمع في قاعة تدفق. قم بتوصيل أنابيب المحاقن. لالتصاق الكريات البيض على الصفائح الدموية المعطل تداولها، قم بتوصيل الشريحة مايكرو المحاقن.
- لنضح الكريات البيض والالتصاق أكثر الأوعية الدموية-أو أحادي الطبقة الصفائح الدموية، وضع الأنبوب الثاني في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل الذي يحتوي على المخزن المؤقت للمقايسة وملء الأنابيب مع 1 مل بيبيت، ثم الضغط الأنابيب وتوصيله إلى دائرة تدفق.
- قبل التروية الكريات البيض، إضافة 3 مم كاكل2 و 2 مم مجكل2 إلى تعليق خلية واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- نتخلل الإنزيم المخزن المؤقت قبل التروية للخلايا لإزالة جوية محتملة من الدائرة والأنابيب.
- أغلق أنبوب ينتهي بالضغط على ضيق وتبديل الأنابيب من المخزن المؤقت للمقايسة إلى تعليق خلية، منع فقاعات الهواء من الوقوع. نتخلل الخلايا مع الإجهاد القص/معدل التدفق المناسب حتى تصل الخلايا الأولى.
- نتخلل الخلايا مع الإجهاد القص/معدل التدفق المناسب لمدة 2 دقيقة، والتقاط صور على الأقل 6 بين دقيقة 2-6 خلايا متجددة وملتصقة مجهر تباين/فلورية مرحلة مقلوب (مثلاً، أفوس-فلوريدا) استخدام التكبير X 100 متصل أن كاميرا رقمية CCD أو CMOS.
ملاحظة: إجهاد القص/معدل التدفق يعتمد على تدفق الدائرة الأبعاد واللزوجة من بيرفوساتي. لنضح الدائرة المستخدمة هنا (انظر الجدول للمواد):
Τ =η* 97.1*Φ
Τ: إجهاد القص (1 داين/سم2)
Η: اللزوجة (0.015 داين * s/سم2)
Φ: معدل التدفق (0.67 مل/دقيقة)
-
التصاق الكريات البيض دي
- دياديسيون، تبديل الأنابيب من تعليق خلية إلى المخزن المؤقت للفحص بالضغط في الأنابيب، الحيلولة دون أن تصبح المحاصرين فقاعات الهواء.
- فصل الخلايا من نضح مع المخزن المؤقت للمقايسة مع التأكيد على معدل/قص تدفق مناسب (انظر 3.3.7 الملاحظة).
-
التهجير الكريات البيض
- للتهجير الكريات البيض، نتخلل الكريات البيضاء (الخطوة 3) حتى تنضم كمية كافية من الكريات البيضاء (~ 50 عرض الخلايا/حقل).
- استبدال تعليق الكريات البيض مع المخزن المؤقت للمقايسة.
- سجل خلايا ترانسميجراتينج بواسطة الفاصل الزمني كل 10 – 15 ثانية لمدة 30 – 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
دراسة التصاق غشائي الكريات البيض، كانت perfused المسمى فلوريسسينتلي THP-1 خلايا أكثر TNFα-أو غير-حفز غشائي أحادي الطبقة لمدة 2 دقيقة في 3 داين/سم2. العدد الإجمالي للخلايا مونوسيتيك ملتصقة تحددها بعد 2 دقيقة من نضح التقاط 6 حقول مستقلة على مدى فترة من 2-6 دقيقة. تم قياس كمية الخلايا ملتصقة بالصور على الأقل 6 أسر مع مجهر تباين/فلورية مرحلة مقلوب (مثلاً، أفوس-فلوريدا) استخدام التكبير X 10 متصل بكاميرا CCD أو CMOS رقمية وأعرب المتوسط كخلايا ملتصقة/ مم2. عند تحفيز غشائي مع TNFα، اعتقال THP-1 زيادة كبيرة مقارنة بالبطانة أونستيمولاتيد. ميكروجرافس الممثل والتحديد الكمي راسخا ملتصقة THP-1 لغير-أو TNFα-حفز خلايا بطانية يرد في الشكل 1. قيمت التصاق الصفائح الدموية-الكريات البيض قبل نضح العَدلات المسمى فلوريسسينتلي على أحادي الطبقة الصفيحات فخ-6-أو غير-حفز لمدة دقيقتين في 1 داين/سم2. كانت كمياً ملتصقة العَدلات كما هو مذكور أعلاه. التحفيز فخ-6 زيادة كبيرة في انضمام العَدلات بالنسبة للصفائح الدموية أونستيمولاتيد. فيديو تمثيلية والتحديد الكمي العَدلات ملتصقة بشدة إلى غير-أو فخ-6-حفز أحادي الطبقة الصفيحات يرد في الشكل 1ب.
الشكل 1 : التصاق غشائي-والصفائح الدموية-الكريات البيض تحت ظروف التدفق. ميكروجرافس الكمي والممثل لالتصاق الخلايا مونوسيتيك البشرية (THP-1) إلى خلايا بطانية (هوفيك) المصنف على أطباق الثقافة المغلفة بالكولاجين تحت ظروف التدفق، مع أو بدون تفعيل TNFα (10 نانوغرام/مل) (A). ميكروجرافس الكمي والممثل لالتصاق العَدلات البشرية للصفائح الدموية البشرية معطلة على الشرائح الزجاجية المغلفة بالكولاجين تحت ظروف التدفق، دون أو مع تنشيط فخ-6 (50 ميكرومتر) (ب). تم حساب قيم P بالاختبار t مزاوج (n = 3؛ ويعني ± التنمية المستدامة). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وعلاوة على ذلك، يمكن تنفيذ هذا التحليل لدراسة دور جزيئات الالتصاق، مثل جزيء هالة التصاق الصفائح الدموية (جام-أ). انضمام RAW264.7 الماوس الوحيدات/بلعم لأحادي الطبقة الصفيحات من أ جام (ترجام-أ+ +) وتم تقييم الفئران جام-A-نقص (ترجام-أ--/--) في الدراسة السابقة لدينا7. كما لاحظ فيه، زاد المربي-نقص الصفائح الدموية انضمام وحيدات الماوس لأحادي الطبقة الصفائح الدموية مقارنة بالفئران البرية نوع (الشكل 2أ-ب). وبدلاً من ذلك، يمكن أن العَدلات الماوس الأساسي معزولة من الفئران ك وصف12.
دراسة الآليات الكامنة، مثل التصاق جزيئات المشاركة في التفاعلات الصفائح الدموية-الكريات البيض، يمكن حظر المستقبلات السطحية محددة. في الدراسة المذكورة أعلاه، وحجب GPIbα الصفائح الدموية والكريات البيض αMبيتا2 إلى حد كبير انخفض التصاق الوحيدات، تحديد دور للمحور2 β في تجنيد الوحيدات زيادةجام-أ--/--GPIbα-αM الصفائح الدموية (الشكل 2أ-ب). علاوة على ذلك، يمكن إجراء تجارب مفرزة خلية للتحقيق في الاعتماد على إجهاد القص للتفاعلات الصفائح الدموية-الكريات البيض. لقياس التدفق تعتمد على مفرزة من وحيدات، زاد إجهاد القص تدريجيا من 0 إلى 20 دينيس/سم2. في هذه الدراسة، والتصاق الخلايا RAW264.7 على الصفائح الدموية جام-أ--/-- كان أكثر قدرة على مقاومة القص الإجهاد مقارنة بالمربي-أ+ + الصفائح الدموية (الشكل 2-ج).
الشكل 2 : مربي-A-نقص يعزز التصاق الخلايا مونوسيتيك المقاوم لتدفق. التصاق الماوس الوحيدات/بلعم RAW264.7 الخلايا للصفائح الدموية من مربي أ+ + والمربي-أ--/-- الفئران معطلة على الشرائح الزجاجية المغلفة بالكولاجين تحت ظروف التدفق، مع أو بدون تفعيل ثرومبين (معهد مراجعي الحسابات الداخليين، 0.5 nM) حضور مثبطات المشار إليه (A). ميكروجرافس الممثل للماوس الوحيدات/بلعم RAW264.7 الخلايا ملتصقة بالمربي-أ+ + والصفائح الدموية جام-أ--/-- بعد العلاج مع ايستب التحكم أو مكافحة--GPIbα الأجسام المضادة (ب). خلية التصاق أعرب كنسبة مئوية من الخلايا ملتصقة في البداية تحت تدريجيا زيادة إجهاد القص (داين/سم2) على الصفائح الدموية المعطل تداولها بعد التنشيط ثرومبين (معهد مراجعي الحسابات الداخليين، 0.5 nM). حسبت قيم P ب ANOVA مع ما بعد الاختبار في توكي (n = 3-5؛ ويعني ± ووزارة شؤون المرأة). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشاو et al. 7 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
يسمح وقت التسجيل المطول (30-60 دقيقة) من حقول مفردة بعد نضح الكريات البيض والالتصاق دراسة الكريات البيض الزحف ونشر السلوك والتهجير النهائي عبر الطبقة غشائي. ضمن هذه الدراسة، قمنا بتحليل الهجرة الداخلية وحيدات البشرية الأولية (معزولة مع عدة العزلة الوحيدات، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة ك وصف13) عبر طبقة بطانية. كما عرضت في الشكل 3، اعتقال الشركات التالية للبطانة، إعداد وحيدات اكسترافاساتي بالزحف والانتشار حتى يتم الوصول إلى الموقع المفضل للتهجير. وفي وقت لاحق، اختراق وحيدات حاجز غشائي خلية أما عن طريق الهجرة الفقرة--أو ترانسسيلولار. تم تعريف الخلايا ترانسميجراتينج كالخلايا التي انتشرت عبر خلايا بطانية، تمتد على pseudopodia ومروراً بحاجز غشائي، مما يقلل من سطوع بهم.
الشكل 3: في المختبر التهجير وحيدات الأساسي عبر أحادي الطبقة غشائي. سجلت الوحيدات التهجير الزحف والانتشار والنهائي عبر البطانة كل 15 ثانية عن 30 دقيقة الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا التحليل في المختبر وسيلة مباشرة للتحقيق في الآليات الأساسية للتوظيف الكريات البيض أثناء التهاب الأوعية الدموية، ولكن هناك بعض النقاط الحرجة للإشارة إلى. الشرط الأول لنجاح إجراء هذا الفحص هو نضح من الكريات البيضاء حالها والمتلاقية الأوعية الدموية أو أحادي الطبقة الصفائح الدموية. هذا يمكن أن يتحقق بطلاء المسبقة للسطوح مع نوع الكولاجين أنا. بشكل عام، عند العمل مع الخلايا والأوعية الدموية الأولية، من المهم أن لطف فصل الخلايا باستخدام الحل الموصى به مفرزة المحتوية على كولاجيناز (انظر الجدول للمواد)، وهو أقل صرامة، ولكن فعالة كما التربسين. للصفائح الدموية مونولاييرس، من المهم أن تغسل بلطف الصفائح الدموية خلال العزل لمنع تنشيط الصفائح الدموية والتجميع.
اعتبار حاسم آخر هو المحافظة على استمرارية المضخة سحب وضع المستخدم التروية، نظراً لانقطاع يؤدي إلى انزعاج ظروف القص ومعدل التدفق. وهكذا، ينتج عن هذا عدم دقة من إجهاد القص الفعلية، ومن ثم إلى التفسير الخاطئ للعمليات الفيزيولوجية تعتمد على القص. ويمكن منع هذا بالصيانة المنتظمة للمضخة. بالإضافة إلى ذلك، حاسمة بالنسبة للاستمرارية أثناء التروية استخدام حقنه جديدة لكل تجربة. منذ نسيج المطاط ضمن التغييرات المحاقن مع زيادة الاستخدام والوقت ما بين التجارب، فإنه يمنع انسحاب مستمر.
خطوة حاسمة أخرى هي منع الهواء تصبح المحاصرين خلال نضح من الكريات البيضاء، نظراً للجو تمزيق الخلايا من على سطح الأرض في وقت لاحق وتغيير شروط القص. يمكن منع هذا بدهن جميع الأنابيب قبل استخدامها مع المياه النقية فائقة، ومن ثم مع المخزن المؤقت للمقايسة. أيضا، عند توصيل الأنابيب من المخزن المؤقت المقايسة لتعليق خلية، أو من شرط واحد للآخر، من المهم الحفاظ على واجهات السائل أثناء الاتصال. يمكن تحقيق هذا بالضغط الأنابيب أو بعدم تغيير مستويات السائل داخل الأنابيب. علاوة على ذلك، أن حجم السوائل بيرفوساتي ينبغي دائماً كافية للحيلولة دون مستوى تتراجع نهاية الأنبوب، والهواء وبالتالي، يجري تناولها في النظام.
حد ممكن من هذا التحليل قد يكون استخدام الخلايا المزروعة التي يتم الاحتفاظ بها في بيئة اصطناعية، أي مثقف على سطح بلاستيك محاطة بمتوسط الذي ليس بدقة نموذج الدولة في فيفو . على الرغم من أن يمكن التحكم بدقة أن البيئة الفيزيولوجية والفيزيائية، تحتوي الخلايا المستزرعة بمعدل نمو سريع، مما يزيد من التنوع الوراثي، ومن ثم عدم تجانس الخلايا داخل مجموعة من سكان. وعلاوة على ذلك، الأوعية الدموية-أو أحادي الطبقة الصفائح الدموية تتكون من نوع خلية مفردة فقط. وخاصة عند التحقيق في التفاعلات غشائي الكريات البيض، أي، والتهجير من الكريات البيضاء عبر حاجز غشائي خلية، ودور الناحية الفسيولوجية ذات الصلة الكامنة غشائي خلية الغشاء وبيريسيتيس لا يمكن أن تؤخذ في الاعتبار. وبدلاً من ذلك، قد يكون من المثير للاهتمام أن خلق بيئة متعددة الخلايا من خلال تنفيذ تقنيات 3D-خلية تثقيف في هذا التحليل.
وباختصار، مع أخذ هذه النقاط في الاعتبار، التحليل القائم على التدفق الصفحي يمكن كفاءة تطبيق في نماذج مختلفة من التهاب الأوعية الدموية. على وجه الخصوص، فإنه يمكن تعديلها بسهولة لمعالجة مسائل بحثية محددة، أي تعديل إجهاد القص قبل متفاوتة أما معدل التدفق بيرفوساتي، ولزوجة السوائل، أو قناة الارتفاع والعرض. وخاصة الأخير بأهمية نظراً للتغيرات في أبعاد الدائرة تدفق تقليل حجم السوائل أو الخلايا المطلوبة. الأسفار المختلفة، وكذلك وضع العلامات من الكريات البيضاء، أو جزيئات معينة من الأوعية الدموية أو مونولاييرس الصفائح الدموية يمكن أن تستخدم لدراسة التفاعلات خلية خلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور مارتن م. شميت وخط فرايموهس. هذا العمل كان تدعمه "مؤسسة هولندا" "البحث العلمي" (زونمو على 016.126.358 اندشتاينر مؤسسة بحوث نقل الدم (Nr. 1638) والألمانية الأوقيانوغرافية (SFB1123/A2) منحت إلى R.R.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
- Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
- Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
- Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
- Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
- Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
- Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).
