Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الروغان السطحية من جسيمات نانوية فيروس التهاب الكبد الوبائي ه استخدام أساليب تصريف المواد الكيميائية

Published: May 11, 2018 doi: 10.3791/57020
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis
* These authors contributed equally

Summary

ونحن قد هندسة البروتين قفيصه من فيروس التهاب الكبد الوبائي ه نانوحبيبات ثيرانوستيك (هيفنب). هيفنب تجميع ذاتي في قفص icosahedral مستقرة في إيصال المخاطية. وهنا يصف لنا بتعديل هيفنبس للورم الاستهداف بتحور يتعرض سطح المخلفات إلى سيستينيس، الذي متزاوجة يغاندس الاصطناعية التي تربط الخلايا السرطانية على وجه التحديد.

Abstract

جسيمات شبيهة بالفيروس (فلبس) استخدمت نانوكاريرس لعرض الأجنبية [ابيتوبس] و/أو تسليم الجزيئات الصغيرة في الكشف والعلاج من الأمراض المختلفة. يعتمد هذا التطبيق على التحوير الوراثي، التجميع الذاتي وتصريف سيستين للوفاء بتطبيق استهداف الورم من المؤتلف فلبس. بالمقارنة مع الوراثية يقدم التعديل الاقتران وحدها، والمواد الكيميائية من الببتيدات الأجانب إلى فلبس كبير فائدة لأنه يسمح بمجموعة متنوعة من الكيانات، مثل الببتيدات الاصطناعية أو oligosaccharides، يكون مترافق لسطح فلبس بطريقة مرنة والتضمين دون تغيير للجمعية عزام.

هنا، نحن توضح كيفية استخدام التهاب الكبد الوبائي ه فيروس نانوحبيبات (هيفنب)، كبسولة ثيرانوستيك نمطي، كناقل توصيل متعددة الوظائف. وتشمل مهام هيفنبس استهداف الأنسجة وتصوير وتقديم العلاج. استناداً إلى بحوث هيفنب الهيكلية الراسخة، اختيرت بقايا مستقلة هيكلياً والمعرضة للسطح لاستبدال سيستئين كمواقع التصريف لمجموعات كيميائية ترتبط ماليميدي عن طريق الروابط ثيول انتقائية. سيستين واحد بعينه-تعديل هيفنب (Cys استبدال الهليونين في 573 aa (هيفنب-573 ج)) كان مترافق للثدي سرطان خلية محددة يجند، LXY30 وتسميته بالقرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد) الأسفار صبغ (Cy5.5)، التقديم الورم المستهدفة هيفنبس كبسولات التشخيصية الفعالة (LXY30-هيفنب-Cy5.5). يمكن أن تستخدم استراتيجيات هندسية مماثلة مع المجمعات الجزيئات الأخرى مع هياكل ذرية معروفة جيدا لاستكشاف تطبيقات محتملة في إيصال ثيرانوستيك.

Introduction

تطوير ناقلات نانو الحجم في إيصال التشخيصية والعلاجية، المعروفة باسم نانوثيرانوستيكس، حولت الكثير من ميدان الطب الحيوي بعيداً عن العلاجات معممة نحو التنفيذ الهادف1. تسليم نانوثيرانوستيك المستهدفة يدمج ناقلات نانو الحجم (nanoparticles) مع جزيئات ثيرانوستيك ستابلي توجيه الجزيئات ثيرانوستيك إلى أنسجة مريضة محددة أو المسارات البيوكيميائية2،3،4 . قد حان لطب النانوي في صدارة التنفيذ الهادف لأن جسيمات نانوية الحجم الأمثل لها القدرة على تحقيق استقرار الدورة الدموية لجزيئات ثيرانوستيك واستهداف جزيئات سطح الخلية المقدمة في الأنسجة المريضة بشكل انتقائي. لا تزال تعاني العديد من الأنظمة الأساسية نانوثيرانوستيك من امتصاص الخلية سلبية وتدهور ناضجة مسبقاً وسمية ورابطة غير كافية مع جزيئات ثيرانوستيك. فلبس التغلب على كثير من هذه العقبات في التنفيذ الهادف. فقد استخدمت نانوكاريرس لعرض الأجنبية [ابيتوبس] و/أو تسليم الجزيئات الصغيرة: نظام التي يمكن استخدامها لمكافحة العديد من الأمراض1. هذا التطبيق يعتمد أساسا على الخاصية التجميع الذاتي فضلا عن سهولة التعديلات الوراثية، لتحقيق التطبيق مصممة لعزام معطى. ومقارنة بالهندسة الوراثية، تصريف المواد الكيميائية من الببتيدات الأجنبية إلى عزام يعرض ميزة كبيرة لأنه يسمح بمجموعة كبيرة ومتنوعة من الكيانات، مثل الببتيدات أو oligosaccharides، يكون مترافق لسطح فلبس في التضمين و طريقة مرنة دون تغيير للجمعية عزام.

هيفنبس، المستمدة من البروتين قفيصه الهجينة المؤتلف، 2nd فتح قراءة الإطار (ORF2)، وهي غير معدية، تجميع ذاتي كابسيدس قادرة على ربط الخلايا وإدخال. نظراً لتطور الهجينة لانتقال الغشاء المخاطي، المثل مستقرة في ظروف المخاطية proteolytic وحمضيه5البروتين قفيصه المجمعة. هيفنبس تشكل جوفاء، T = 1 قفيصه icosahedral، تتألف من وحدات متطابقة 606،7 من ORF2، جعلها مستقرة جداً سواء في التخزين وفي ظروف قاسية الفسيولوجية. تفتقر إلى أي عناصر جينية فيروسية، يتحقق إنتاج فعالة وعالية الغلة من خلال نظام التعبير باكولوفيروس في خلايا الحشرات. بسبب استقرارها proteolytic، تستخرج هيفنبس الذاتي تجميعها وتنقيته من المادة طافية الخلية، خفض إلى حد كبير خطوات التنقية اللازمة. بالإضافة إلى ذلك، تمتلك هيفنبس نتوء مكشوفة سطح مجال (ف) متصلاً من خلال مفصل مرنة لقاعدة icosahedral مستقرة. المجال ف أشكال التموج المكشوفة السطح فوق قاعدة icosahedral بينما المفصل مرنة تجعل من الممكن تعديل المجال ف إلى حد كبير دون المساس بالهيكل الأساسي إيكوساهيدرال. مع الوحدات المتكررة 60، نتائج تعديل مواقع محددة واحدة في 60 موقعا متماثل للتحوير الكيميائي. في الآونة الأخيرة، وقد اقترحنا نانو-منصة استخدام هيفنب التي يمكن كيميائيا متزاوجة يغاندس أو الجزيئات الصغيرة للتطبيقات ثيرانوستيك. وتحقق ذلك باستبدال واحد من الأحماض الأمينية سيستين في مجال نتوء الهجينة-عزام كموقع رد فعل مع الببتيدات مرتبطة ماليميدي أو الجزيئات. استناداً إلى التحليل الهيكلي السابق عزام الهجينة ومدروسة مكسبه [ابيتوبس]8،9استعيض الأحماض الأمينية الهجينة-عزام الخمسة التالية مع سيستئين كمرشحين محتملين: Y485C، T489C، S533C، N573C، و T586C ( الشكل 1). وأكدت بها تشكيلات عزام بعد التعبير وتنقية من خلايا الحشرات، انتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) المراقبة (الشكل 2)، والمواقع سيستين المكشوفة التي تم تحليلها بواسطة الغربية لطخة بعد البيوتين مرتبطة ماليميدي الاقتران (الشكل 2). بين طفرات الخمسة، ج هيفنب-573 عرض أقوى إشارة من تصريف ماليميدي-البيوتين (الشكل 2)، وكان يستخدم لمتابعة مظاهرة ك nanocarrier لخلايا سرطان الثدي تستهدف4 (الشكل 3).

ويصور هذا البروتوكول أساليب تصريف المواد الكيميائية لإرفاق جزيئات استهداف الورم هيفنبس عن طريق التصريف السطحي سيستين. نحن بالتفصيل على تصريف الورم الاستهداف والكشف عن الجزيئات لإيصال الورم مع المؤتلف هيفنبس التي تحتوي على سيستين في N573 (هيفنب-573C). ركزنا على انقر فوق كيمياء اقتران عملية من خطوتين لربط ورم سرطان الثدي تستهدف الببتيد، LXY3010 إلى هيفنبس بشكل LXY30-هيفنب (الشكل 4). وفي وقت لاحق، N-هيدروكسيسوكسيميدي (NHS)-كانت مترافق Cy5.5 إلى موقع Lys منفصلة في هيفنبس لبناء LXY30-هيفنب-Cy5.5 لكشف فلوري على حد سواء في المختبر (الشكل 5) و المجراة في4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-هيفنب الإنتاج في خلايا الحشرات

ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات التالية في غطاء ثقافة خلية. الرجوع إلى المنشور السابق لدينا لإنتاج هيفنب أكثر تفصيلاً الإجراءات11.

  1. ثقافة الخلايا Sf9 في وسائل الإعلام خلية الحشرات (انظر الجدول للمواد) لالتقاء 50-75% في لوحات 6-جيدا.
  2. باستخدام الخلية الحشرات تعداء الكواشف طبقاً للبروتوكولات الشركة المصنعة، ترانسفيكت باكميدس التي تحتوي على ORF2 هيفنب-573 ج داخل الخلايا Sf99 لإنتاج باكولوفيروس المؤتلف. احتضان transfected الخلايا عند 27 درجة مئوية ل 3-6 أيام، اعتماداً على بقاء الخلايا.
  3. جمع المادة طافية في الإصابة بعد 3-6 أيام (بعد أن يتم تفكيك الخلايا ترانسفيكتيد بسبب الإصابة باكولوفيروس) كمخزون باكولوفيروس P0.
  4. إزالة الثقافة المتوسطة قبل تطبيق 200 ميليلتر من الأسهم P0 إلى الخلايا Sf9 المتلاقية 50-75% في قارورة أحادي الطبقة2 سم 25. روك قارورة كل 15 دقيقة لضمان التغطية الكاملة للعدوى. كرر 4 مرات، لمدة 60 دقيقة.
  5. إضافة 2 مل مستنبت الخلية الحشرات قارورة وتبقى عند 27 درجة مئوية لمدة 3-6، اعتماداً على بقاء الخلايا، تضخيم باكولوفيروس إلى عيار أعلى.
  6. القيام بفحوصات اللوحة للحصول على عيار باكولوفيروس قراءة12.
  7. الثقافة علقت Tn5 الحشرات الخلايا (جدول المواد) مع 100 مل من خلايا الحشرات المتوسطة في قارورة 250 مل ويهز في 27 درجة مئوية في 150 دورة في الدقيقة لعيار من 0.5 × 105 -1 × 106 للتطعيم.
  8. إضافة باكولوفيروس في عدد وافر عدوى (وزارة الداخلية) من 5-10 إلى 100 مل Tn5 الخلايا في قارورة 250 مل. بعد التلقيح، هزة في 27 درجة مئوية في 150 دورة في الدقيقة لمدة 5-7 أيام.
  9. عندما يبدو أن معظم خلايا الحويصلات و 70-90% خلايا ميتة تحت المجهر الضوئي الملاحظة، جمع الخلايا Tn5 ونقل إلى أنابيب ultracentrifuge مل 33. المكان أولتراسينتريفوجي الأنابيب في يتأرجح الدوارات دلو، والتوازن، وتدور إلى أسفل الخلية تحت الأنقاض والمؤتلف باكولوفيروسيس في 10,000 س ز لمدة 90 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  10. الاحتفاظ بالمادة طافية يحتوي على هيفنبس صدر في 4 درجات مئوية لمزيد من التنقية. لتخزين ممتدة من باكولوفيروس طافية، إضافة مثبطات البروتياز.

2. تنقية هيفنب

  1. بيليه، وعزل هيفنبس استخدام الفصل التدرج (CsCl) كلوريد السيزيوم:
    1. نقل المادة طافية المجمعة (من الخطوة 1، 10) وإضافة 20% NP-40 في كل أنبوب لجعل تركيز نهائي من 0.5% 40 NP بحل أي غشاء خلوي المتبقية. مزيج من بيبيتينج برفق واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 25 درجة مئوية.
    2. أولتراسينتريفوجي هيفنبس في 112,400 س ز في يتأرجح الدوارات دلو ح 2 في 4 درجات مئوية بيليه أسفل هيفنبس من المادة طافية. تجاهل المادة طافية بعد الطرد المركزي ولطف إعادة تعليق بيليه الخام في ميليلتر 200 من 10 ملم مس المخزن المؤقت pH 6.2 في كل أنبوب بين عشية وضحاها (O/N) في 4 درجات مئوية. تشغيل مخزون النشر الاستراتيجي-الصفحة (الخطوة 3.1) للتأكد من وجود ORF2 هيفنب في النفط الخام بيليه كعصابة كاتشين 52.
    3. إعداد تدرج CsCl 38.5% (w/v) بخلط ز 1.96 CsCl وبيليه الخام إعادة تعليق ~ 4 مل من 0.01 م مس 6.2 درجة الحموضة في أنبوب أولتراسينتريفوجي 5 مل. تحقيق التوازن بين الأنابيب وفي دوار دلو يتأرجح. أولتراسينتريفوجي في 147,000 س ز ح 16 عند 4 درجة مئوية.
  2. جمع الكسور بعد CsCl التدرج:
    1. تجاهل الكسر ميليلتر 500 الأعلى، الذي هو أساسا غشاء الخلية خفيفة الوزن الحطام. جمع 500 ميليلتر الكسور، بدءاً من الجزء العلوي من الأنبوب، وتغيير نصائح الفترات الفاصلة بين كل جزء. وضع كل جزء في أنابيب مرقمة المسمى 1.5 مل.
      ملاحظة: وجود ORF2 هيفنب في الكسور يفصل CsCl التدرج لا يمكن الكشف عنها عن طريق تشغيل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي الهلام بسبب التركيز العالي ل CsCl. يمكن إزالة أو تضعف باتباع إجراء تنظيف CsCl CsCl في كل جزء. وبدلاً من ذلك، يمكن الاستعاضة عن التدرج CsCl 10-40% سكروز تدرج13 لتجنب CsCl المتبقية.
    2. نقل كل جزء في أنبوب أولتراسينتريفوجي 5 مل وتمييع CsCl مع مل 4.5 من 10 ملم مس، 6.2 درجة الحموضة. تحقيق التوازن بين الأنابيب وفي دوار دلو يتأرجح. أولتراسينتريفوجي في 147,000 س ز ح 2 في 4 درجات مئوية بيليه لأسفل هيفنبس.
    3. تجاهل المادة طافية ولطف إعادة تعليق هيفنبس في 100 ميليلتر من 10 ملم مس 6.2 درجة الحموضة في كل أنبوبة. وتغطي هذه الأنابيب تجنب التبخر واحتضان س/ن في 4 درجات مئوية.
    4. سجل A280 القراءة ونسبة نانومتر A260/A280 باستخدام جهاز المطياف الضوئي. تحديد تركيز ORF2 التقريبي:
      Equation
      وسوف تحتوي على كل ORF2 1 Cys الموقع وموقع Lys لتصريف المواد الكيميائية.
      ملاحظة: هو معامل الانقراض المولى ORF2 هيفنب 60,280، وما يعادل 1.019 مغ/مل × A280. والسبب في ذلك ما يقرب من 1:1 التي يمكن تقريبها تركيز هيفنبس (في ملغ/مل) A280، ومن ثم تركيز ORF2 حسب المعادلة المذكورة أعلاه. على سبيل المثال، سيتعين هيفنب مع أن قراءة A280 من 1 بتركيز 1 ملغ/مل، وما يعادل 18.8 مكم ORF2.
    5. إعداد صفحة بالحزب الديمقراطي الصربي. استخدام عينة ميليلتر 6 من كل جزء بسيط لتحديد الكسور التي تحتوي على 53.3 كاتشين ORF2 هيفنب البروتين (الخطوة 3.1). وينبغي إيجاد في هيفنبس في الكسور 3-5، مع كثافة ~1.25 غ/مل.
    6. التأكد من الوجود ونقاء هيفنبس تيم الملاحظة. إعداد أو تمييع عينات هيفنب إلى 0.5-2.0 ملغ/مل لل. هيفنبس تظهر في تيم كالبروتينات icosahedral فارغة، ~ 27 نانومتر في القطر (الشكل 2). بعض الملوثات البروتين قد تبقى في الكسور، وسيتبع تحت تيم (الخطوة 3، 2).
  3. في حالة أن الشوائب موجودة تحت TEM، كرر الخطوة 2.1.3-2.2.6 لنقاء أفضل من هيفنبس.
    ملاحظة: قد يسبب تنقية إضافية من خلال التدرج CsCl خسارة العائد من هيفنبس. وبدلاً من ذلك، يمكن الاستعاضة عن تنقية CsCl التدرج تدرج سكروز 10-40% لتجنب المتبقية CsCl13.

3-هيفنب الوصف

  1. إعداد صفحة الحزب الديمقراطي الصربي % 4-12 مكررا-تريس "البروتين الهلام"، 1.0 مم، 17-الآبار (انظر الجدول للمواد) وفقا لدليل المستخدم14:
    1. إضافة 2 ميليلتر من 4 × تحميل المخزن المؤقت إلى 6 ميكروليتر من عينة البروتين. احتضان المخلوط عينة في كتلة حرارة لمدة 10 دقيقة عند 100 درجة مئوية تجريدها من البروتين. تحميل عينات البروتين على الهلام.
    2. تشغيل مخزون النشر الاستراتيجي-الصفحة بوضع العاصمة إمدادات الطاقة في 100 V مدة 10 دقيقة، ثم 150 الخامس لمدة 45 دقيقة حتى تشغيل العينات إلى حوالي 1 سم فوق الجزء السفلي من الجل.
    3. وصمة هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع أخذ الأزرق (0.25% (w/v) أخذ R250 الزرقاء الرائعة، الميثانول 30% (v/v)، وحمض الخليك 10% (v/v))، عن ح 1.
    4. بعد هذا الإجراء المصبوغة، إزالة وصمة عار أخذ الأزرق وتطبيق المصبوغة إزالة المخزن المؤقت (الميثانول 30% (v/v)، وحمض الخليك 10% (v/v)) على هلام بروتين > ح 12 في درجة حرارة الغرفة.
    5. الوثيقة الجل تحت الضوء الأبيض للتأكد من وجود ORF2 هيفنب في الفرقة كاتشين 52.
  2. مراقبة هيفنبس استخدام ال.
    1. إعداد أو تمييع عينات هيفنب إلى 0.5-2 مغ/مل مع 10 ملم مس 6.2 درجة الحموضة لتصوير تيم.
    2. تتأين الشبكات المغلفة بالكربون مع 40 mA توهج التفريغ لمدة 30 ثانية لإنتاج الكربون ماء سطح. ويرد في الجدول للموادمعدات تفريغ الوهج.
      ملاحظة: على سطح الكربون ماء شبكات يمكن فقط آخر لمدة 30 دقيقة بعد توهج الاضطلاع بالعلاج.
    3. عقد في ملاقط وإضافة 2 ميليلتر من عينة هيفنب إلى الشبكة، انتظر 15-30 ثانية، ولطخة مع أوراق الترشيح.
    4. فورا غسل الشبكة مع ddH20 ووصمة عار مع أوراق الترشيح.
    5. فور إضافة 2 ميليلتر من خلات اليورانيل 2% إلى الشبكة، انتظر 15 ثانية، ثم وصمة عار مع أوراق الترشيح. الجافة الشبكات عينة بوضعها في إلكتروني تجفيف مجلس الوزراء الجافة س/أ.
    6. نقل الشبكة إلى تيم والصورة عند التكبير 10-80 ك. هيفنبس تظهر في تيم كالبروتينات icosahedral الفارغة التي هي ~ 27 نانومتر في القطر، ونظرا لعدم وجود الرنا الفيروسي.

4-الأسلحة الكيميائية تصريف هيفنبس مع البيوتين ويجند استهداف سرطان فلوروفوريس

  1. إجراء اقتران خطوة واحدة هيفنبس وماليميدي المرتبطة البيوتين.
    1. المخزن المؤقت التغيير: تطبيق هيفنبس في وحدات الغسيل الكلوي مصغرة ودياليزي ضد 0.01 M برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4 في درجة حرارة الغرفة ح 1 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (جدول المواد). نقل هيفنبس إلى أنابيب 1.5 مل وقياس تركيز البروتين في 280 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
    2. مزيج هيفنب إلى 1 مغ/مل، وما يعادل 18.8 ميكرومتر Cys رد فعل المواقع (انظر التفاصيل في الخطوة 2.2.4)، مع مبلغ مساو من ماليميدي-البيوتين (100 ميكرومتر) في برنامج تلفزيوني 0.01 متر، الرقم الهيدروجيني 7.4، جعل نسبة مولى 1:5؛ الرد يا/ن في 4 درجات مئوية. إزالة البيوتين ماليميدي غير منضم مع إجراء ك 40 عمود Desalting موكو تدور وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (جدول المواد).
    3. تحليل العينات من خلال معيار الحد من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الخطوة 3.1).
    4. استخدام إجراءات معيارية، تعد من تشيميلومينيسسينت "الغربية لطخة" استخدام Streptavidin المرتبطة ببرنامج الصحة الإنجابية. التقاط الإشارات تشيميلومينيسسينت برأي X الفيلم (الشكل 2).
  2. تنفيذ الخطوة اثنين الاقتران LXY30 إلى سيستين سطح مكشوف على "مصادر القدرة النووية الهجينة" (الشكل 5).
    1. المخزن المؤقت exchange: تطبيق هيفنبس في وحدات الغسيل الكلوي مصغرة ودياليزي ضد برنامج تلفزيوني 0.01 م الهيدروجيني 7.4 في درجة حرارة الغرفة حاء 1 نقل هيفنبس إلى أنابيب 1.5 مل وقياس تركيز البروتين في 280 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
    2. إضافة 650 مكم ماليميدي-أزيد و 650 ميكرومتر ألكاين-LXY3010 في 0.01 M برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4 مع 200 ميكرومتر CuSO4 و 1 ملم حمض الأسكوربيك لتشكيل LXY30 المرتبطة ماليميدي (القانون النموذجي للتحكيم-LXY30) في 650 ميكرومتر. احتضان الخليط في 4 درجات مئوية عن س/أ.
    3. مزيج هيفنب إلى 1 مغ/مل، وما يعادل 18.8 ميكرومتر من موقع رد الفعل Cys (انظر التفاصيل في الخطوة 2.2.4)، مع حوالي 10% حجم من القانون النموذجي للتحكيم-LXY30 (650 ميكرومتر) في برنامج تلفزيوني 0.01 M pH 7.4، جعل نسبة مولى 1:3؛ الرد يا/ن في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: نظراً لتركيز عالية نسبيا من القانون النموذجي للتحكيم-LXY30، تركيزات نهائية من كواشف مختبر، مثل CuSO4، تقل حوالي 10 مرات بعد الاختلاط، لتفادي إلحاق الضرر بهم هيفنبس. خيار آخر هو أسلوب التصريف خالية من الاتحاد الجمركي15.
    4. إزالة غير منضم LXY30--ماليميدي--انقر فوق مع عمود "الدوران الملحي موكو ك" 40 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد). تبقى هيفنبس المرتبطة LXY30 (LXY30-هيفنبس) في 4 درجات مئوية.
  3. إجراء اقتران خطوة واحدة من LXY30-هيفنبس واستر Cy5.5 دائرة الصحة الوطنية (نهس-Cy5.5)
    1. مزيج هيفنبس المرتبطة LXY30 (LXY30-هيفنبس) إلى 1 مغ/مل، وما يعادل 18.8 ميكرومتر في موقع رد الفعل Cys (انظر التفاصيل في الخطوة 2.2.4)، مع تساوي حجم دائرة الصحة الوطنية--Cy5.5 (100 ميكرومتر) في 0.01 M برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4 جعل نسبة مولى 1:5؛ الرد يا/ن في 4 درجات مئوية.
    2. إزالة غير منضم Cy5.5--دائرة الصحة الوطنية مع إجراء عمود "الدوران الملحي موكو" ك 40 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد). الحفاظ على LXY30، ترتبط Cy5.5 هيفنبس (LXY30-هيفنب-Cy5.5) في 4 درجات مئوية.

5-هيفنب ملزم والاستيعاب في خلايا سرطان الثدي نجمة داود الحمراء--MB231

  1. خلايا سرطان الثدي MDA-MB231 البذور في كوب 35 ملم أسفل الأطباق (5 × 104 كل طبق) س/ن في ثقافة خلية الثديية مجلس الوزراء.
  2. لتجربة ربط الخلية، وإعداد LXY30-هيفنب-Cy5.5 بالخطوات التالية 4.2-4.3. تمييع LXY30-هيفنب-Cy5.5 إلى 0.01 ملغ/مل، وما يعادل ميكرومتر 0.188 من ORF2 هيفنب (راجع الخطوة 2.2.4)، في 250 ميليلتر من 0-1% FBS/دميم.
    1. إعداد نموذج التحكم السلبي في 0.01 ملغ/مل هيفنب-Cy5.5 خطوة بعد 4.3 لكن مترافق مع دائرة الصحة الوطنية--Cy5.5 صبغ فقط، (الهجينة-Cy5.5). تمييع هيفنب-Cy5.5 إلى 0.01 ملغ/مل، وما يعادل ميكرومتر 0.188 من ORF2 هيفنب (راجع الخطوة 2.2.4)، في 250 ميليلتر من 10% FBS تكملة مع دميم.
  3. تغسل الخلايا مرة واحدة عن طريق تطبيق 250 ميليلتر من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني م 1، الرقم الهيدروجيني 7.4. إزالة المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني بعد الغسيل، مع الاحتفاظ ببعض المخزن المؤقت في الطبق ثقافة الخلية.
  4. تطبيق 250 ميليلتر من LXY30-هيفنب-Cy5.5 في 10% FBS تكملة مع دميم أو هيفنب-Cy5.5 في 10% FBS تكملة مع دميم لخلايا سرطان الثدي MDA MB231 المستزرعة. درع الخلية مثقف الأطباق من الضوء مع رقائق الألومنيوم.
  5. تبقى الأطباق الخلايا المزروعة في ثقافة خلية 37 درجة مئوية مجلس الوزراء ح 1 لاستيعاب.
  6. أغسل 3 مرات، 5 دقيقة للمياه والصرف الصحي، مع 250 ميليلتر من برنامج تلفزيوني م 1، الرقم الهيدروجيني 7.4 الخلايا المستزرعة على الجليد.
  7. إصلاح الخلايا 4% في منهاج عمل بيجين في برنامج تلفزيوني م 1، الرقم الهيدروجيني 7.4 20 دقيقة ويغسل ثم مرة واحدة مع 250 ميليلتر من برنامج تلفزيوني م 1، الرقم الهيدروجيني 7.4.
    ملاحظة: الخلايا جاهزة الآن تصويرها بالمجهر [كنفوكل]. وترد البيانات الممثلة في الشكل 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أقرب إلى الهجينة-فلبس، Cys جميع تعديل كابسيدس هيفنبس شكل icosahedral القابلة للذوبان، والإجمالي لا في الحل أثناء الإنتاج أو تنقية. قبل وبعد الاقتران ماليميدي-البيوتين خطوة واحدة، كل من Cys تعديل هيفنبس تم تمييزه عن فلبس الهجينة في وصمة سلبية م (الشكل 2). ماليميدي-البيوتين تصريف الكفاءة Cys هيفنبس تم التعديل تم اختباره أولاً مع النشاف الغربية عن طريق ربط ستريبتافيدين تشيميلومينيسسينت. وبعد الاقتران ماليميدي-البيوتين، تعديل Cys هيفنبس عرض ستريبتافيدين ملزم إشارات (الشكل 2).

تصريف سيستين خطوتين فعالة تأثر النظام التي أجريت على التصريف. لأنه هو يكون إنتغرين α3β1 overexpressed في خلايا الورم سرطان الثدي، يجند اصطناعية، LXY30، تم اختيار10، مع النسب المحددة إلى α3β1 كجزيء المتقارنة استهداف الورم. الروغان ماليميدي المباشر (مي) من LXY30 لم يكن مجديا لأن LXY30 ﺣﻭﻟﻳ من خلال ثنائي كبريتيد الجزيئات سندات؛ ومن ثم، كان هناك مصدر قلق بالنسبة سيلفريكتيفيتي. بدلاً من ذلك، كان LXY30 فونكتيوناليزيد مع جماعة ألكاين ومنضمة إلى ماليميدي-أزيد من خلال فعل كيمياء انقر فوق. عندما NPs الهجينة-573 ج ملزمون بأزيد ماليميدي أولاً، متبوعاً بفعل كيمياء اضغط على LXY30-ألكاين، ظهرت NPs الهجينة-573 ج لتفكيك تحت الملاحظة تيم (الشكل 4). ومع ذلك، لا يؤثر فعل كيمياء فوق أولية بين LXY30-ألكاين وأزيد ماليميدي على شكل مي-LXY30، تليها تصريف الماي-LXY30 لتعديل Cys هيفنبس (LXY30-القانون النموذجي للتحكيم-Cy5.5) هيكلها (الشكل 4 باء). يصور 4 الشكل تخطيطي LXY30 الروغان هيفنبس لاستهداف خلايا الورم.

هيفنبس مترافق لسرطان الثدي تستهدف يجند، LXY30 (LXY30-هيفنبس) ملزمة وتم استيعابه في خلايا سرطان الثدي المزروعة. لكشف فلوري، LXY30-هيفنبس و 573Cs هيفنب غير منضم تم تسميته بالمستشفيات فونكتيوناليزيد Cy5.5 صبغة الفلورسنت (دائرة الصحة الوطنية--Cy5.5) من خلال اقتران أمين الأولية ليسين في هيفنب-573Cs-LXY30-هيفنب-Cy5.5 وهيفنب-Cy5.5 طبقت إلى مثقف سرطان الثدي الخلايا (نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231)، ويلاحظ بالفحص المجهري [كنفوكل]. الصور fluorescence الجرد مجهر [كنفوكل] تشير إلى LXY30-هيفنب-Cy5.5 كان أعلى ملزمة تقارب واستيعاب زيادة في جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا السرطانية الثدي مقارنة مع هيفنب-Cy5.5 (الشكل 5).

Figure 1
رقم 1: استبدال سيستين في المجال نتوء السطح نانوحبيبات فيروس التهاب الكبد الوبائي ه. واقترحت الطفرات سيستين لبقايا Y485، T489، S533، N573، و T586 في المنطقة لفائف مرنة للتقليل من الاضطراب في هيكل الثانوية ORF2 الهجينة (A). جميع مخلفات منتقاة للطفرة سيستين تقع على سطح المجال نتوء (ف) (رمادي؛ المجالات الأخرى هي shell (S)-الملك في الزرقاء والأوسط (M)-المجال باللون الوردي)، مع بقايا Y485 (السماوي)، T489 (أصفر)، T586 (برتقالي) على قصوى المياه السطحية، وبقايا S533 (أرجواني) و N573 (أحمر) على الجهة التي تواجه خمسة إضعاف محور هيفنب (ب). تم تعديل الرقم من تشن et al. عام 20164 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: وصف هيفنب تحمل N573C كمثال لجميع Cys تعديل هيفنبس- ج هيفنب-573 ظهرت إسقاطات كروية على إلكترون ميكروجرافس (A)، وظلت كجزيئات سليمة بعد الاقتران بيوتينيلاتينج القانون النموذجي للتحكيم (ب). الممثل نتائج التعرض التصريف وحانمه لتعديل Cys هيفنبس. وتم منضمة إلى ماليميدي-البيوتين عن طريق اقتران سيستين-ماليميدي وجزيئي في وقت لاحق عن طريق لطخة غربية لربط ستريبتافيدين. الطفرة سيستين في N573 يسمح بكفاءة بيوتينيليشن إلى هيفنب مقارنة بمواقع الطفرة، أي، Y485، T489، S533، والأخرى T586 (ج). شريط يساوي 100 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التخطيطي لخلايا سرطان الثدي التي تستهدف على وجه التحديد بالمسمى Cy5.5 LXY30-هيفنبس (LXY30-هيفنب-Cy5.5)- LXY30-هيفنب-Cy5.5 بشكل انتقائي ربط خلايا سرطان الثدي (أرجواني) نظراً لتقارب معين في LXY30 إلى α3β1، وانتغرين أعرب عن الإفراط في غشاء الخلية سرطان الثدي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تخطيطي خطوتين عمليات تصريف المواد الكيميائية، بما في ذلك رد فعل ثيول انتقائية وأزيد تشجعهن النحاس-ألكاين سيكلواديشن أو رد فعل 'فوق الكيمياء' لبناء LXY30-هيفنبس- تم اختبار طريقتين. الأسلوب 1: تم تنفيذ أزيد تشجعهن النحاس-ألكاين سيكلواديشن رد فعل بين القانون النموذجي للتحكيم-أزيد والكاين-LXY30 على شكل LXY30 المرتبطة بالقانون النموذجي للتحكيم (القانون النموذجي للتحكيم-LXY30) أولاً. ثم تمت إضافة المال-LXY30 تتفاعل مع موقع Cys NPs الهجينة-573 ج (A). LXY30 و Cy5.5 زينت الهجينة-573 ج NPs (LXY30-هيفنب-Cy5.5) بقيت سليمة بعد كل هذه العمليات الكيميائية الاقتران (ب). الأسلوب 2: تبدأ عملية الاقتران بوسم أزيد مرتبطة بالقانون النموذجي للتحكيم (القانون النموذجي للتحكيم-أزيد) في موقع Cys NPs الهجينة-573 ج من خلال فعل ثيول انتقائية لبناء هيفنبس المرتبطة بأزيد (أزيد-هيفنبس)، تليها إضافة LXY30-ألكاين، وحمض الأسكوربيك، وخصصت4 شكل مرتبط LXY30 هيفنبس (LXY30-هيفنبس) (A). ومع ذلك، تضررت معظم LXY30-هيفنبس أو تفكيكها من عمليات التصريف، التي قد تنجم عن الكواشف رد الفعل، بما في ذلك أزيد، وحمض الأسكوربيك، وخصصت4 (ج). القانون النموذجي للتحكيم: ماليميدي. تم تعديل هذا الرقم من تشن et al. عام 20164 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: نتائج تمثيلية لربط الخلية واستيعاب المسمى فلوريسسينتلي LXY30-هيفنبس، التي تربط بين خلايا سرطان الثدي MDA-ميغابايت-231- صور fluorescence نير LXY30-هيفنب-Cy5.5 الاستهداف لجمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا. الإشارة الأنوية، التي كانت ملطخة ب DAPI (الأزرق)، وإشارة Cy5.5 (أحمر) تم الحصول عليها باستخدام مجهر الأسفار [كنفوكل]. تم تعديل هذا الرقم من تشن et al. عام 20164 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على النقيض من الإجراء يستغرق وقتاً طويلاً في مجال الهندسة الوراثية، التي عادة ما يستغرق أسابيع، هنا نظهر خطوتين بسيطة وإجراءات تصريف المواد الكيميائية خطوة واحدة، والتي يمكن أن تكتمل في غضون 3 أيام، إضافة السرطان استهداف يجند و/أو الأسفار صبغ الكشف عن مواقع Cys/ليز هيفنبس. يمكن استخدام هذا الأسلوب إلى الشاشة ليجند أفضل للهدف من مجموعة من المرشحين، وبالتالي يستفيد من خدمات توليف جزيء الببتيد الصغيرة المتاحة في فترة زمنية معقولة التكلفة والتسليم.

على عكس الهندسة الوراثية التقليدية، التي يمكن فقط إدراج البروتينية في البروتينات للفائدة، يمكن الاتصال على تصريف المواد الكيميائية المواد المختلفة بما في ذلك البروتينية والجزيئات الكيميائية الصغيرة، وجسيمات نانو على السطح من بروتين فائدة، ما دام هناك بقايا Cys أو ليز لاستخدامها كموقع رد الفعل. إذا لم يكن هناك لا بقايا هذه في موقع تصريف المواد الكيميائية، يمكن تعديل بسيط Cys/ليز استبدال وراثيا على بروتين الفائدة لجعله كيميائيا أكتيفاتابل كما هو موضح في البحوث السابقة4.

للتحكم تصريف المواد الكيميائية تحدث فقط على مواقع التفاعل الانتقائي، هيكل كل جزيء المتقارنة والبروتين مترافق الحاجة إلى أن تكون دراسة وافية لتجنب مفاعليه إينتراموليكولار. كما تبين هذه الوثيقة مع سرطان الثدي تستهدف الببتيد LXY3010، تستقر سند ثنائي كبريتيد حرجة تكيف يجند دوري. ونظرا ثيول-مفاعليه ماليميدي، ماليميدي المباشر-الروغان من يغاندس LXY30 سوف يؤدي على الأرجح في مفاعليه إينتراموليكولار. بدلاً من ذلك، كان يؤديها هما الخطوة الاقتران (الخطوة 4.2) رد فعل أزيد مرتبطة ماليميدي مع LXY30 ألكاين مرتبطة من خلال نقرة الكيمياء رد فعل. ومع ذلك، تسلسل انقر الكيمياء رد فعل ورد فعل ثيول المحدد أمر حاسم إينتاكتنيس كونفورماشونال من LXY30-هيفنبس (الشكل 4). من خلال فعل انقر-كيمياء4 حفزت CuSO، LXY30 غير مباشر ملزمة بأن ماليميدي لبناء مي-LXY30. وفي وقت لاحق، هي مترافق مي-LXY30 إلى هيفنب-573 ج أن المشكلة LXY30-هيفنبس يمكن الاحتفاظ بهيكلها icosahedral الأصلي (الشكل 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

الكتاب نعترف بالرعاية من التمويل اللازم يستبدل بالمعاهد الوطنية للصحة منح #' ق: AI095382، EB021230، CA198880، المعهد الوطني للأغذية والزراعة، فضلا عن البرنامج "أستاذ مرموق في فنلندا".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO Thermo Fisher Scientific 69572 mini dialysis unit
High Five Cells Thermo Fisher Scientific B85502 Tn5 cells
SF9 Cells  Thermo Fisher Scientific 11496015 Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Thermo Fisher Scientific A11101, A11100 Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Life Technologies 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 Bacmid
ESF921 Insect Cell Media Expression Systems LLC 96-001-01 insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg Lumiprobe Corp 27020 Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL Thermo Scientific 87766 spin desalting column
MES Hydrate Sigma-Aldrich Chemical Co M8250-250G MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes Beckman Coulter, Inc Depends on Rotor ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NPO321BOX SDS protein gel
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher Scientific 10362100 transfection reagent
EMS Glow Discharger Electron Microscopy Science glow discharger

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
  2. Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
  3. Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
  4. Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
  5. Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
  6. Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
  7. Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
  8. Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
  9. Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
  10. Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
  11. Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
  12. Technologies, I. bL. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System: User Manual. , Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf (2015).
  13. Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
  14. Technologies, N. bL. Vol. MAN0007891 1-2. , Life Technologies. (2013).
  15. Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).

Tags

الهندسة الحيوية، 135 قضية، استبدال سيستين، تصريف المواد الكيميائية، والتهاب الكبد الوبائي ه، جسيمات شبيهة بالفيروس، وعرض متعددي يجند، استهداف يجند
الروغان السطحية من جسيمات نانوية فيروس التهاب الكبد الوبائي ه استخدام أساليب تصريف المواد الكيميائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli,… More

Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli, M., Cheng, R. H. Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods. J. Vis. Exp. (135), e57020, doi:10.3791/57020 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter