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Bioengineering

रासायनिक विकार विधियों के प्रयोग से हेपेटाइटिस ई वायरस नैनोकणों की सतह Functionalization

Published: May 11, 2018 doi: 10.3791/57020
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis
* These authors contributed equally

Summary

हम एक theranostic nanoparticle (HEVNP) के रूप में हेपेटाइटिस ई वायरस के कैप्सिड प्रोटीन इंजीनियर है । HEVNP श्लैष्मिक डिलीवरी में एक स्थिर icosahedral पिंजरे में सेल्फी इक्ट्ठा करते हैं । यहां, हम cysteines के लिए सतह उजागर अवशेषों को बदलना द्वारा ट्यूमर लक्ष्यीकरण के लिए HEVNPs के संशोधन का वर्णन है, जो सिंथेटिक लाइगैंडों कि विशेष रूप से बांध ट्यूमर कोशिकाओं संयुग्मी ।

Abstract

वायरस जैसे कणों (VLPs) का इस्तेमाल विदेशी epitopes को प्रदर्शित करने के लिए nanocarriers के रूप में किया गया है और विभिन्न रोगों का पता लगाने और उपचार में छोटे अणुओं उद्धार/ यह आवेदन रिकॉमबिनेंट VLPs के ट्यूमर लक्ष्यीकरण आवेदन को पूरा करने के लिए आनुवंशिक संशोधन, स्व-विधानसभा, और cysteine विकार पर निर्भर करता है. अकेले आनुवंशिक संशोधन के साथ तुलना में, विकार करने के लिए विदेशी पेप्टाइड्स के रासायनिक VLPs एक महत्वपूर्ण लाभ क्योंकि यह संस्थाओं की एक किस्म की अनुमति देता है, ऐसे सिंथेटिक पेप्टाइड्स या oligosaccharides के रूप में, VLP विधानसभा के परिवर्तन के बिना एक संग्राहक और लचीला तरीके से VLPs की सतह के लिए संयुग्मित हो ।

यहां, हम प्रदर्शन कैसे हेपेटाइटिस ई वायरस nanoparticle (HEVNP), एक मॉड्यूलर theranostic कैप्सूल, एक बहुआयामी प्रसव वाहक के रूप में उपयोग करने के लिए । HEVNPs के कार्य ऊतक लक्ष्यीकरण, इमेजिंग, और चिकित्सकीय वितरण शामिल हैं । HEVNP की अच्छी तरह से स्थापित संरचनात्मक अनुसंधान के आधार पर, संरचनात्मक रूप से स्वतंत्र और सतह उजागर अवशेषों thiol-चुनिंदा लिंकेज के माध्यम से maleimide-लिंक्ड रासायनिक समूहों के लिए विकार साइटों के रूप में cysteine प्रतिस्थापन के लिए चुना गया था । एक विशेष cysteine संशोधित HEVNP (५७३ एए (HEVNP-573C) में asparagine के एक Cys प्रतिस्थापन) एक स्तन कैंसर कोशिका के लिए संयुग्मित था विशिष्ट ligand, LXY30 और पास के साथ लेबल-अवरक्त (NIR) प्रतिदीप्ति डाई (cy 5.5), ट्यूमर प्रतिपादन-लक्षित HEVNPs के रूप में प्रभावी नैदानिक कैप्सूल (LXY30-HEVNP-cy 5.5) । इसी तरह इंजीनियरिंग रणनीतियों अच्छी तरह से ज्ञात परमाणु संरचनाओं के साथ अंय macromolecular परिसरों के साथ नियोजित किया जा सकता है theranostic वितरण में संभावित अनुप्रयोगों का पता लगाने ।

Introduction

नैनो के विकास-चिकित्सीय और नैदानिक वितरण, nanotheranostics के रूप में जाना में वैक्टर आकार, जैव चिकित्सा क्षेत्र के ज्यादा स्थानांतरित कर दिया है लक्षित प्रसव के प्रति सामान्यीकृत उपचार से दूर1। लक्षित nanotheranostic डिलिवरी नैनो आकार वैक्टर (नैनोकणों) theranostic अणुओं के साथ एक विशिष्ट रोगग्रस्त ऊतक या जैव रासायनिक मार्ग के लिए छुरा प्रत्यक्ष theranostic अणुओं को एकीकृत करता है2,3,4 . Nanomedicine लक्षित प्रसव के सबसे आगे आ गया है क्योंकि इष्टतम आकार नैनोकणों क्षमता के लिए theranostic अणुओं के संचलन को स्थिर है और चुनिंदा कोशिकाओं की सतह रोगग्रस्त ऊतकों पर प्रस्तुत अणुओं । कई nanotheranostic प्लेटफार्मों अभी भी निष्क्रिय कोशिका के ऊपर से पीड़ित, पूर्व परिपक्व गिरावट, विषाक्तता, और theranostic अणुओं के साथ अपर्याप्त सहयोग । VLPs लक्षित वितरण में इन बाधाओं के कई दूर । वे nanocarriers के रूप में इस्तेमाल किया गया है के लिए विदेशी epitopes प्रदर्शन और/या छोटे अणुओं उद्धार: एक आहार है कि कई रोगों से निपटने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है1। इस आवेदन में मुख्य रूप से आत्म विधानसभा की संपत्ति पर निर्भर करता है के रूप में अच्छी तरह से आनुवंशिक संशोधनों की आसानी, दिए गए VLP के लिए डिजाइन आवेदन को पूरा करने के लिए. आनुवंशिक इंजीनियरिंग की तुलना में, VLP के लिए विदेशी पेप्टाइड्स के रासायनिक विकार एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदर्शित करता है क्योंकि यह संस्थाओं की एक महान विविधता की अनुमति देता है, जैसे पेप्टाइड्स या oligosaccharides, एक संग्राहक में VLPs की सतह के लिए संयुग्मित किया जा करने के लिए और VLP विधानसभा के परिवर्तन के बिना लचीला तरीके से ।

HEVNPs, रिकॉमबिनेंट HEV कैप्सिड प्रोटीन, 2एनडी ओपन रीडिंग फ्रेम (ORF2) से व्युत्पंन, गैर संक्रामक, स्व-सेल बाध्यकारी और प्रवेश के capsids में सक्षम कोडांतरण हैं । क्योंकि HEV श्लैष्मिक संचरण के लिए विकसित, इकट्ठे कैप्सिड प्रोटीन proteolytic और अम्लीय श्लैष्मिक स्थितियों में इसी तरह स्थिर है5. HEVNPs फार्म एक खोखले, टी = 1 icosahedral कैप्सिड, ६० समान इकाइयों6से बना है,ORF2 के7 , यह बहुत भंडारण में और कठोर शारीरिक स्थितियों में दोनों स्थिर प्रतिपादन । किसी भी वायरल आनुवंशिक तत्वों की कमी, कुशल, उच्च उपज उत्पादन कीट कोशिकाओं में baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली के माध्यम से हासिल की है । क्योंकि उनके proteolytic स्थिरता, स्व इकट्ठे HEVNPs निकाले जाते है और कोशिका supernatant से शुद्ध, काफी आवश्यक शुद्धि चरणों को कम करने । इसके अतिरिक्त, HEVNPs एक सतह उजागर दखल डोमेन (पी डोमेन) एक स्थिर icosahedral आधार के लिए एक लचीला काज के माध्यम से जुड़ा है । पी डोमेन रूपों सतह उजागर icosahedral आधार के ऊपर spikes जबकि लचीला काज यह महत्वपूर्ण आधार icosahedral संरचना समझौता किए बिना पी डोमेन को संशोधित करने के लिए संभव बनाता है । ६० दोहराया इकाइयों के साथ, एक साइट-रासायनिक मॉडुलन के लिए ६० सममित साइटों में विशिष्ट संशोधन के परिणाम । हाल ही में, हम एक नैनो-HEVNP का उपयोग कर मंच है कि रासायनिक theranostic अनुप्रयोगों के लिए लाइगैंडों या छोटे अणुओं संयुग्मी कर सकते है का प्रस्ताव किया । यह maleimide-लिंक्ड पेप्टाइड्स या अणुओं के साथ एक प्रतिक्रिया साइट के रूप में HEV-VLP के दखल डोमेन पर cysteine के साथ एक एकल एमिनो एसिड की जगह से प्राप्त किया गया था । HEV के पिछले संरचनात्मक विश्लेषण के आधार पर-VLP और अच्छी तरह से अध्ययन immunogenic epitopes8,9, निंनलिखित पांच HEV-VLP अमीनो एसिड संभावित उंमीदवारों के रूप में cysteine के साथ प्रतिस्थापित किया गया: Y485C, T489C, S533C, N573C, और T586C ( चित्र 1) । कीट कोशिकाओं से अभिव्यक्ति और शुद्धि के बाद, उनके VLP संरचनाओं संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) अवलोकन (चित्रा 2) द्वारा पुष्टि की गई, और उजागर cysteine साइटों maleimide से जुड़े बायोटिन के बाद पश्चिमी दाग द्वारा विश्लेषण किया गया विकार (चित्र 2) । पांच म्यूटेंट के अलावा, HEVNP-573C maleimide के सबसे मजबूत संकेत-बायोटिन विकार (चित्रा 2) प्रदर्शित और स्तन कैंसर सेल के लिए nanocarrier के रूप में प्रदर्शन का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था4 (चित्रा 3लक्ष्यीकरण ।

यह प्रोटोकॉल रासायनिक विकार तरीकों को दर्शाया गया है कि ट्यूमर-लक्ष्यीकरण अणुओं को सतह cysteine विकार के माध्यम से HEVNPs में संलग्न करें । हम विस्तार ट्यूमर लक्ष्यीकरण और रिकॉमबिनेंट HEVNPs के साथ ट्यूमर के वितरण के लिए पता लगाने के अणुओं के विकार पर एक cysteine युक्त N573 (HEVNP-573C). हम एक दो कदम पर क्लिक करें रसायन विज्ञान विकार प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक स्तन कैंसर ट्यूमर लक्ष्यीकरण पेप्टाइड, LXY30 के लिए10 HEVNPs करने के लिए फार्म LXY30-HEVNP (चित्रा 4) । इसके बाद, N-hydroxysuccimide (एन एच एस)-cy 5.5 HEVNPs पर अलग Lys साइट के लिए LXY30-HEVNP-cy 5.5 दोनों विट्रो में (चित्रा 5) और vivo में4 का पता लगाने के लिए बनाने के लिए संयुग्मित थे ।

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Protocol

1. कीट कोशिकाओं में HEVNP उत्पादन

नोट: सभी निंनलिखित कदम एक सेल संस्कृति हूड में किया जाना चाहिए । अधिक विस्तृत HEVNP उत्पादन प्रक्रियाओं के लिए हमारे पिछले प्रकाशन का संदर्भ लें11।

  1. संस्कृति कीट सेल मीडिया में Sf9 कोशिकाओं ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए ५०-७५% 6 में अच्छी तरह से प्लेटें संगम ।
  2. निर्माता के चलत के अनुसार कीट कोशिका अभिकर्मक रिएजेंटों का प्रयोग, 573C ORF2 के उत्पादन के लिए Sf99 कोशिकाओं में HEVNP-रिकॉमबिनेंट baculovirus युक्त transfect Bacmids है. 3-6 दिनों के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर transfected कोशिकाओं की मशीन, कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर निर्भर करता है ।
  3. 3-6 दिनों के बाद संक्रमण पर supernatant लीजिए (transfected कोशिकाओं के बाद baculovirus संक्रमण के कारण लीजड ड हैं) के रूप में P0 baculovirus स्टॉक.
  4. P0 शेयर के २०० µ l को ५० में लागू करने से पहले कल्चरल मीडियम निकालें-७५% एक 25 सेमी2 monolayer कुप्पी में धाराप्रवाह Sf9 कोशिकाओं. इनोक्युलम की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए हर 15 मिनट कुप्पी रॉक करें । दोहराने 4 बार, ६० मिनट की कुल के लिए ।
  5. कुप्पी के लिए कीट कोशिका संस्कृति मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 3-6 दिनों के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए, कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर निर्भर करता है, एक उच्च titer करने के लिए baculovirus बढ़ाना ।
  6. पट्टिका परख बाहर ले baculovirus12पढ़ने titer प्राप्त करने के लिए ।
  7. संस्कृति निलंबित Tn5 कीट कोशिकाओं (सामग्री की मेज) २५० मिलीलीटर कुप्पी में कीट कोशिका मध्यम की १०० मिलीलीटर और 27 ° c में १५० rpm को titer के लिए ०.५ x 105 -1 x 106 के लिए टीका के लिए शेक ।
  8. संक्रमण की बहुलता (MOI) में baculovirus को 5-10 से १०० मिलीलीटर Tn5 कोशिकाओं को २५० मिलीलीटर कुप्पी में जोड़ें । टीका के बाद, 27 ° c में १५० rpm पर 5-7 दिनों के लिए हिला ।
  9. एक बार सबसे कोशिकाओं के बुलबुले और ७०-कोशिकाओं के ९०% के लिए दिखाई ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप अवलोकन के तहत मर रहे हैं, Tn5 कोशिकाओं को इकट्ठा और ३३ मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूबों में स्थानांतरण । बाल्टी रोटर, संतुलन झूलते में ultracentrifuge ट्यूबों प्लेस, और सेल मलबे नीचे स्पिन और 25 डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए १०,००० x जी में रिकॉमबिनेंट baculoviruses ।
  10. supernatant कि आगे की शुद्धि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जारी HEVNPs शामिल रखें । baculovirus supernatant के विस्तारित भंडारण के लिए, चिढ़ाना अवरोधकों जोड़ें ।

2. HEVNP शुद्धिकरण

  1. गोली और सीज़ियम क्लोराइड (CsCl) ढाल जुदाई का उपयोग कर HEVNPs अलग:
    1. (चरण १.१० से) एकत्रित supernatant स्थानांतरित करें और किसी भी शेष सेलुलर झिल्ली को भंग करने के लिए ०.५% np-४० की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 20% np-४० जोड़ें । धीरे pipetting द्वारा मिश्रण और 25 डिग्री सेल्सियस से कम 30 मिनट के लिए गर्मी ।
    2. Ultracentrifuge 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए बाल्टी रोटर झूल में ११२,४०० एक्स जी में HEVNPs से नीचे supernatant से HEVNPs गोली । छोड़ना supernatant के बाद और धीरे से फिर से २०० µ एल में 10 मिमी एमईएस बफर पीएच ६.२ के 3 में क्रूड गोली रात भर (O/N) 4 डिग्री सेल्सियस पर सस्पेंड । भागो एसडीएस-पृष्ठ (चरण ३.१) एक ५२ केडीए बैंड के रूप में कच्चे गोली में HEVNP ORF2 की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए ।
    3. एक ३८.५% (डब्ल्यू/वी) CsCl ढाल १.९६ जी CsCl, फिर से निलंबित क्रूड गोली, और ~ ०.०१ एम एमईएस पीएच ६.२ के 4 मिलीलीटर में एक 5 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब मिश्रण से तैयार करें । एक झूलते बाल्टी रोटर में ट्यूबों और जगह संतुलन । Ultracentrifuge पर 16 ज के लिए १४७,००० x g पर 4 ° c ।
  2. CsCl ग्रेडिएंट के बाद अंशों को एकत्र करें:
    1. शीर्ष ५०० µ l अंश, जो मुख्य रूप से हल्के वजन कोशिका झिल्ली मलबे है त्यागें । इकट्ठा ५०० µ एल भागों, ट्यूब के ऊपर से शुरू, और प्रत्येक अंश के बीच में सुझावों को बदलने. प्रत्येक अंश को क्रमांकित/लेबल १.५ mL ट्यूबों में रखें ।
      नोट: CsCl ढाल से अलग भागों में HEVNP ORF2 की उपस्थिति CsCl की उच्च एकाग्रता के कारण एसडीएस पेज जैल चलाकर पता लगाया जा सकता । प्रत्येक अंश में CsCl को CsCl क्लीन-अप कार्यविधि का अनुसरण कर हटाया या पतला किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, CsCl ढाल एक 10-40% सुक्रोजढाल 13 से प्रतिस्थापित किया जा सकता है CsCl अवशिष्ट से बचने के लिए ।
    2. एक 5 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब के लिए प्रत्येक अंश हस्तांतरण और 10 मिमी एमईएस, पीएच ६.२ के ४.५ मिलीलीटर के साथ CsCl पतला । एक झूलते बाल्टी रोटर में ट्यूबों और जगह संतुलन । 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए १४७,००० x जी में Ultracentrifuge नीचे HEVNPs गोली ।
    3. supernatant त्यागें और धीरे से एक ट्यूब में 10 मिमी एमईएस पीएच ६.२ के १०० µ एल में HEVNPs फिर से निलंबित । 4 डिग्री सेल्सियस पर वाष्पीकरण और मशीन O/N से बचने के लिए ट्यूबों को कवर करें ।
    4. A280 पढ़ने और A260/A280 एनएम अनुपात एक spectrophotometer का उपयोग कर रिकॉर्ड । के रूप में ORF2 की अनुमानित एकाग्रता का निर्धारण:
      Equation
      प्रत्येक ORF2 में केमिकल विकार के लिए 1 Cys साइट और 1 Lys साइट शामिल होगी ।
      नोट: HEVNP ORF2 का दाढ़ विलुप्त गुणांक ६०,२८० है, जो १.०१९ मिलीग्राम/एमएल × A280 के बराबर है । यह तो 1:1 के करीब है कि HEVNPs की एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल) A280 द्वारा अनुमानित किया जा सकता है, और इसलिए, ऊपर समीकरण द्वारा ORF2 की एकाग्रता । उदाहरण के लिए, 1 के एक A280 पढ़ने के साथ एक HEVNP 1 मिलीग्राम/एमएल, जो १८.८ µ एम ORF2 के बराबर है की एकाग्रता होगा ।
    5. एक एसडीएस-पृष्ठ तैयार करें । ५३.३ केडीए HEVNP ORF2 प्रोटीन (step ३.१) युक्त अंशों का निर्धारण करने के लिए प्रत्येक अंश से 6 µ l का नमूना प्रयोग करें । HEVNPs अंश 3-5 में पाया जाना चाहिए, ~ १.२५ g/एमएल के घनत्व के साथ ।
    6. उपस्थिति और उनि अवलोकन द्वारा HEVNPs की पवित्रता की पुष्टि करें । HEVNP नमूनों को तैयार या पतला ०.५-२.० के लिए मिलीग्राम/ HEVNPs खाली icosahedral प्रोटीन, ~ व्यास में 27 एनएम (चित्रा 2) के रूप में उनि में दिखाई देते हैं । कुछ प्रोटीन दूषित भागों में रह सकता है और उनि के तहत मनाया जाएगा (चरण ३.२) ।
  3. इस मामले में, HEVNPs की शुद्धता के लिए 2.2.6 चरण 2.1.3-के तहत अशुद्धियां मौजूद हैं ।
    नोट: CsCl ग्रैडिएंट के माध्यम से अतिरिक्त शुद्धि HEVNPs की उपज हानि हो सकती है । वैकल्पिक रूप से, CsCl ग्रैडिएंट शुद्धि एक 10-40% सुक्रोज ढाल द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता अवशिष्टCsCl13 से बचने के लिए ।

3. HEVNP लक्षण वर्णन

  1. तैयार एसडीएस पृष्ठ 4-12% बीआईएस-Tris प्रोटीन जैल, १.० मिमी, 17-कुओं ( सामग्री की तालिकादेखें) उपयोगकर्ता के मैनुअल के अनुसार14:
    1. प्रोटीन सैंपल के 6 µ l को 4x लोडिंग बफर के 2 µ l को जोड़ें । प्रोटीन स्वभाव करने के लिए १०० डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक में नमूना मिश्रण की मशीन । जेल पर प्रोटीन नमूने लोड ।
    2. एसडीएस-पृष्ठ चलाने के लिए १०० v पर डीसी बिजली की आपूर्ति की स्थापना 10 मिनट के लिए, फिर १५० v ४५ मिनट के लिए जब तक नमूने के बारे में 1 सेमी जेल के नीचे ऊपर चला ।
    3. दाग Coomassie नीले (०.२५% (डब्ल्यू/वी) Coomassie शानदार नीले R250, 30% (v/v) मेथनॉल, 10% (v/v) एसिटिक एसिड) के साथ एसडीएस पृष्ठ जेल, 1 एच के लिए ।
    4. धुंधला प्रक्रिया के बाद, Coomassie नीले दाग को हटाने और de-धुंधला बफर लागू (30% (v/v) मेथनॉल, 10% (वी/वी) एसिटिक एसिड) के लिए प्रोटीन जेल पर > 12 ज कमरे के तापमान पर ।
    5. ५२ केडीए बैंड में HEVNP ORF2 की मौजूदगी की पुष्टि के लिए व्हाइट लाइट के तहत जेल का दस्तावेज ।
  2. HEVNPs का उपयोग कर उनि का निरीक्षण ।
    1. तैयार या HEVNP नमूनों को पतला करने के लिए ०.५-2 मिलीग्राम/एमएल के साथ 10 मिमी एमईएस पीएच ६.२ के लिए उनि इमेजिंग.
    2. एक हाइड्रोफिलिक कार्बन सतह का उत्पादन करने के लिए 30 एस के लिए ४० mA चमक निर्वहन के साथ कार्बन लेपित ग्रिड । चमक निर्वहन उपकरण सामग्री की तालिकामें वर्णित है ।
      नोट: ग्रिड के हाइड्रोफिलिक कार्बन सतह चमक निर्वहन उपचार के बाद केवल 30 मिनट के लिए पिछले कर सकते हैं ।
    3. चिमटी में पकड़ो और ग्रिड के लिए HEVNP नमूना के 2 µ एल जोड़ने के लिए, 15-30 एस के लिए रुको, और फिल्टर कागज के साथ दाग ।
    4. तुरंत ddH के साथ ग्रिड धो20 और दाग फिल्टर कागज के साथ ।
    5. तुरंत ग्रिड को 2% uranyl एसीटेट के 2 µ एल जोड़ने के लिए, 15 एस रुको, तो फिल्टर कागज के साथ दाग । एक इलेक्ट्रॉनिक हवा dehumidify सूखी कैबिनेट में उंहें ओ के लिए डाल द्वारा नमूना ग्रिड सूखी/
    6. 10-80k आवर्धन पर एक उनि और छवि में ग्रिड स्थानांतरण । HEVNPs खाली icosahedral प्रोटीन है कि व्यास में ~ 27 एनएम है, वायरल आरएनए के अभाव के कारण के रूप में उनि में दिखाई देते हैं ।

4. HEVNPs के बायोटिन के साथ रासायनिक विकार, कैंसर लक्ष्यीकरण Ligand, और Fluorophores

  1. HEVNPs और maleimide लिंक्ड बायोटिन की विकार एक चरण निष्पादित करें ।
    1. बफर परिवर्तन: मिनी डायलिसिस इकाइयों में HEVNPs लागू करें और 1 के लिए ०.०१ मीटर पंजाबियों पीएच ७.४ के लिए कमरे के तापमान पर dialyze के खिलाफ निर्माता के प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका) के अनुसार । १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए HEVNPs स्थानांतरण और एक spectrophotometer का उपयोग कर २८० एनएम पर प्रोटीन एकाग्रता उपाय ।
    2. HEVNP को 1 मिलीग्राम/एमएल, जो Cys प्रतिक्रिया साइटों के १८.८ µ मीटर के बराबर है मिश्रण (2.2.4 चरण में विवरण देखें), ०.०१ एम पंजाबियों में maleimide-बायोटिन (१०० µ मीटर) की एक बराबर राशि के साथ, पीएच ७.४, एक 1:5 दाढ़ अनुपात बनाने के लिए; 4 ° c पर प्रतिक्रिया O/ एक ४० K MWCO स्पिन के साथ असीम maleimide-बायोटिन निकालें कॉलम प्रक्रिया निर्माता के प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका) के अनुसार ।
    3. एक मानक को कम करने एसडीएस-पृष्ठ (चरण ३.१) के माध्यम से नमूनों का विश्लेषण ।
    4. मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर, एक chemiluminescent पश्चिमी एचआरपी-लिंक्ड Streptavidin का उपयोग दाग तैयार करते हैं । एक्स रे फिल्म (चित्रा 2) द्वारा chemiluminescent संकेत पर कब्जा ।
  2. HEV एनपीएस (चित्र 5) पर सतह उजागर cysteine के लिए दो चरण LXY30 विकार निष्पादित करें ।
    1. बफर एक्सचेंज: मिनी डायलिसिस इकाइयों में HEVNPs लागू करें और ०.०१ मीटर पंजाबियों पीएच ७.४ के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए HEVNPs स्थानांतरण १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए और एक spectrophotometer का उपयोग कर २८० एनएम पर प्रोटीन एकाग्रता उपाय ।
    2. जोड़ें ६५० µ m maleimide-azide और ६५० µ m alkyne-LXY3010 में ०.०१ m पंजाबि पीएच ७.४ के साथ २०० µ एम CuSO4 और 1 mM ascorbic एसिड के रूप में maleimide-लिंक्ड LXY30 (मल-LXY30) पर ६५० µ एम. O/N के लिए 4 ° c पर मिश्रण की मशीन ।
    3. HEVNP को 1 मिलीग्राम/एमएल, जो Cys रिएक्शन साइट के १८.८ µ मीटर के बराबर है (चरण 2.2.4 में विवरण देखें), मल के बारे में 10% मात्रा के साथ-LXY30 (६५० µ मीटर) ०.०१ मीटर पंजाबियों पीएच ७.४ में, एक 1:3 दाढ़ अनुपात बनाने के लिए मिश्रण; 4 ° c पर प्रतिक्रिया O/
      नोट: मल-LXY30 के अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता के कारण, reactants के अंतिम सांद्रता, जैसे CuSO4, मिश्रण के बाद के बारे में 10 बार कम कर रहे हैं, HEVNPs को उनके नुकसान से बचने के लिए । घन-मुक्त विकार विधि15अंय विकल्प है ।
    4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ४० K MWCO स्पिनिंग कॉलम के साथ अनबाउंड maleimide-क्लिक-LXY30 निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें) । LXY30-लिंक्ड HEVNPs (LXY30-HEVNPs) को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
  3. LXY30-HEVNPs और cy 5.5 एन एच एस एस्टर (एन एच एस-cy 5.5) के एक चरण विकार प्रदर्शन
    1. मिक्स LXY30-लिंक्ड HEVNPs (LXY30-HEVNPs) को 1 मिलीग्राम/एमएल, जो Cys प्रतिक्रिया साइट के १८.८ µ मीटर के बराबर है (चरण 2.2.4 में विवरण देखें), एन एच एस के बराबर मात्रा के साथ-cy 5.5 (१०० µ m) ०.०१ एम पंजाबियों पीएच ७.४ में एक 1:5 दाढ़ अनुपात बनाने के लिए; 4 ° c पर प्रतिक्रिया O/
    2. एक 40K MWCO स्पिन के साथ असीम cy 5.5-एन एच एस निकालें कॉलम प्रक्रिया निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ( सामग्री की तालिकादेखें). LXY30, cy 5.5-लिंक्ड HEVNPs (LXY30-HEVNP-cy 5.5) को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।

5. एमडीएस में HEVNP बाइंडिंग और Internalization-MB231 स्तन कैंसर की कोशिकाएं

  1. बीज एमडीए-MB231 एक ३५-mm ग्लास नीचे व्यंजन में स्तन कैंसर की कोशिकाओं (5 x 104 प्रति पकवान) एक स्तनधारी सेल संस्कृति कैबिनेट में ओ/
  2. कक्ष बाइंडिंग प्रयोग के लिए, LXY30-HEVNP-cy 5.5 चरणों का पालन करके तैयार करें ४.२-४.३ । पतला LXY30-HEVNP-cy 5.5 से ०.०१ मिलीग्राम/एमएल, जो HEVNP ORF2 के ०.१८८ µ मीटर के बराबर है (चरण 2.2.4 को देखें), में २५० µ l के 0-1% FBS/DMEM ।
    1. ०.०१ मिलीग्राम/एमएल HEVNP-cy 5.5 पर नकारात्मक नियंत्रण नमूना तैयार चरण ४.३ का पालन करके लेकिन एन एच एस-cy 5.5 डाई केवल, (HEV-cy 5.5) के साथ संयुग्मित । पतला HEVNP-cy 5.5 करने के लिए ०.०१ मिलीग्राम/एमएल, जो HEVNP ORF2 के ०.१८८ µ मीटर के बराबर है (चरण 2.2.4 को देखें), २५० µ एल में 10% FBS के साथ पूरक ।
  3. 1 मीटर पंजाबियों बफर, पीएच ७.४ के २५० µ एल लागू करने से एक बार कोशिकाओं को धो लें । धोने के बाद पंजाबियों बफर निकालें, जबकि सेल संस्कृति डिश में कुछ बफर रखते हुए ।
  4. लागू करें २५० µ l के LXY30-HEVNP-cy 5.5 में 10% FBS के साथ पूरक DMEM या HEVNP-cy 5.5 में 10% FBS के साथ पूरक DMEM के लिए संस्कृतिपूर्ण एमडीए-MB231 स्तन कैंसर कोशिकाओं. एल्यूमीनियम पंनी के साथ प्रकाश से सेल प्रसंस्कृत व्यंजन शील्ड ।
  5. internalization के लिए 1 एच के लिए एक ३७ ° c सेल संस्कृति कैबिनेट में सेल कल्चरल डिश रखें ।
  6. बर्फ पर प्रसंस्कृत कोशिकाओं धो 3 बार, धोने के प्रति 5 मिनट, 1 एम पंजाबियों के २५० µ एल के साथ, पीएच ७.४ ।
  7. 1 मीटर पंजाबियों में 4% पीएफए में कोशिकाओं को ठीक, 20 मिनट के लिए पीएच ७.४ और फिर 1 एम पंजाबियों, पीएच ७.४ के २५० µ एल के साथ एक बार धो लो ।
    नोट: कोशिकाओं को अब फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा imaged होने के लिए तैयार हैं । प्रतिनिधि डेटा चित्रा 5में दिखाया गया है ।

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Representative Results

HEV के सदृश-VLPs, सभी Cys संशोधित HEVNPs घुलनशील icosahedral capsids का गठन किया है और उत्पादन या शोधन के दौरान समाधान में समग्र नहीं था । इससे पहले कि और एक के बाद कदम maleimide-बायोटिन विकार, Cys संशोधित HEVNPs में से प्रत्येक HEV-VLPs से नकारात्मक दाग EM (चित्रा 2) में अंतरित किया गया था । Maleimide-बायोटिन विकार कुशलता को Cys संशोधित HEVNPs पहले पश्चिमी सोख्ता के साथ chemiluminescent streptavidin बंधन के जरिए परीक्षण किया गया. म् maleimide-बायोटिन विकार, Cys संशोधित HEVNPs गरिने streptavidin बाध्यकारी संकेत (आरेख 2) ।

प्रभावी दो-चरणीय cysteine विकार उस क्रम से प्रभावित हुआ जिसमें विकार किया गया था । क्योंकि α3β1 integrin स्तन कैंसर ट्यूमर कोशिकाओं में व्यक्त किया है, एक सिंथेटिक ligand, LXY30, α3β1 के लिए विशिष्ट संबंध के साथ10, एक ट्यूमर-लक्ष्यीकरण संयुग्मी अणु के रूप में चुना गया था । LXY30 का प्रत्यक्ष maleimide (MaI) functionalization साध्य नहीं था क्योंकि LXY30 एक आणविक डाइसल्फ़ाइड बंधन के माध्यम से चक्रित होता है; इसलिए, स्व-प्रतिक्रिया के लिए चिंता का विषय था । इसके बजाय, LXY30 एक alkyne समूह के साथ कार्यात्मक था और एक क्लिक रसायन प्रतिक्रिया के माध्यम से maleimide-azide के लिए बाध्य । जब HEV-573C एनपीएस को maleimide-azide पहले बाउंड किया गया था, तो LXY30-alkyne के लिए एक क्लिक केमिस्ट्री रिएक्शन के बाद, HEV-573C एनपीएस को उनि प्रेक्षण (फिगर 4c) के नीचे जुदा करने के लिए दिखाई दिया । हालांकि, LXY30-alkyne और maleimide-azide माई-LXY30, माई-LXY30 विकार करने के लिए Cys-संशोधित HEVNPs (LXY30-मल-cy 5.5) के बाद के बीच एक प्रारंभिक क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया अपनी संरचना (चित्र 4B) को प्रभावित नहीं किया । चित्रा 4 ट्यूमर सेल लक्ष्यीकरण के लिए HEVNPs के LXY30-functionalization की एक योजनाबद्ध दर्शाया गया है ।

HEVNPs स्तन कैंसर लक्ष्यीकरण ligand, LXY30 (LXY30-HEVNPs) बंधे को संयुग्मित और संस्कृति स्तन कैंसर की कोशिकाओं में आंतरिक थे । फ्लोरोसेंट पता लगाने के लिए, LXY30-HEVNPs और असीम HEVNP-573Cs cy पर cy के प्राथमिक अमीन युग्मन के माध्यम से lysine 5.5 फ्लोरोसेंट डाई (एन एच एस-HEVNP 5.5) कार्यात्मक एन एच एस के साथ लेबल किया गया-573Cs. LXY30-HEVNP-cy 5.5 और HEVNP-cy 5.5 के लिए लागू किए गए थे कल्चरल स्तन कैंसर की कोशिकाओं (एमडीए-एमबी-२३१), और फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया । फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा NIR प्रतिदीप्ति छवियों से संकेत मिलता है LXY30-HEVNP-cy 5.5 के लिए उच्च बाध्यकारी समानता थी और एमडीए में internalization-एमबी-२३१ स्तन कैंसर कोशिकाओं HEVNP-cy 5.5 के साथ तुलना (चित्रा 5) ।

Figure 1
चित्रा 1: हेपेटाइटिस ई वायरस nanoparticle की सतह दखल डोमेन पर Cysteine प्रतिस्थापन । Cysteine उत्परिवर्तनों Y485, T489, S533, N573 के अवशेषों के लिए प्रस्तावित किया गया था, और T586 HEV (ए) के माध्यमिक संरचना को गड़बड़ी को कम करने के लिए लचीला कुंडल क्षेत्र में । cysteine उत्परिवर्तन के लिए सभी चयनित अवशेषों (पी) डोमेन (ग्रे) की सतह पर स्थित हैं । अन्य डोमेन शेल (S)-डोमेन में नीले और मध्य (M)-डोमेन में गुलाबी), अवशेष Y485 (सियान), T489 (पीला), T586 (नारंगी) पर सबसे अधिक सतह, और अवशेष S533 (रानी) और N573 (लाल) HEVNP (B) की पांच गुना धुरी का सामना करना पड़ रहा है । यह आंकड़ा अनुमति के साथ चेन एट अल २०१६4 से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सभी Cys संशोधित HEVNPs के लिए एक उदाहरण के रूप में N573C ले जाने HEVNP के लक्षण वर्णन. HEVNP-573C इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (ए) पर गोलाकार अनुमानों के रूप में दिखाई दिया और मल-biotinylating विकार (बी) के बाद बरकरार कणों के रूप में बने रहे । Cys-संशोधित HEVNPs के विकार और epitope एक्सपोजर के प्रतिनिधि परिणाम । वे cysteine-maleimide युग्मन और बाद में streptavidin बाध्यकारी के लिए पश्चिमी दाग के माध्यम से परख के माध्यम से maleimide-बायोटिन के लिए बाध्य थे । N573 में cysteine उत्परिवर्तन अंय उत्परिवर्तन साइटों की तुलना में HEVNP को कुशल biotinylation की अनुमति दी, अर्थात्, Y485, T489, S533, और T586 (सी) । बार १०० एनएम के बराबर होती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: स्तन कैंसर कोशिकाओं है कि विशेष रूप से cy 5.5-लेबल LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-cy 5.5) के साथ लक्षित कर रहे है के योजनाबद्ध । LXY30-HEVNP-cy 5.5 चुनिंदा स्तन कैंसर कोशिकाओं को बांध (रानी) α3β1, जो एक से अधिक व्यक्त integrin स्तन कैंसर कोशिका झिल्ली पर है LXY30's विशिष्ट अपनत्व के कारण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: दो कदम रासायनिक विकार प्रक्रियाओं की एक योजनाबद्ध, एक thiol चयनात्मक प्रतिक्रिया और एक तांबे catalyzed azide-alkyne cycloaddition या ' क्लिक करें रसायन विज्ञान ' के निर्माण के लिए LXY30-HEVNPs प्रतिक्रिया भी शामिल है । दो विधियों का परीक्षण किया गया है । विधि 1: मल-azide और alkyne-LXY30 के लिए फार्म मल-लिंक्ड LXY30 (मल-LXY30) के बीच कॉपर catalyzed azide-alkyne cycloaddition रिएक्शन पहले किया गया । इसके बाद मल-LXY30 को HEV-573C एनपीएस (A) की Cys साइट के साथ प्रतिक्रिया में जोड़ा गया । LXY30 और cy 5.5 सजाया HEV-573C एनपीएस (LXY30-HEVNP-cy 5.5) इन सभी रासायनिक विकार प्रक्रियाओं (बी) के बाद बरकरार रहे । विधि 2: विकार प्रक्रिया से शुरू होता है लेबलिंग मल-लिंक्ड azide (मल-azide) के Cys स्थल पर HEV-573C एनपीएस का निर्माण करने के लिए thiol-चयनात्मक प्रतिक्रिया के माध्यम से azide-लिंक्ड HEVNPs (azide-HEVNPs), LXY30-alkyne, ascorbic एसिड और CuSO को जोड़कर4 LXY30-लिंक्ड HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (A) बनाने के लिए । हालांकि, सबसे LXY30-HEVNPs क्षतिग्रस्त या विकार प्रक्रियाओं, जो azide, ascorbic एसिड, और CuSO4 (सी) सहित प्रतिक्रियाशील reagents के कारण हो सकता है से जुदा थे । मल: Maleimide । इस आंकड़े को अनुमति के साथ चेन एट अल २०१६4 से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: सेल बाध्यकारी और internalization की फ्लोरोसेंट लेबल LXY30-HEVNPs, जो एमडीए को बांध-एमबी-२३१ स्तन कैंसर कोशिकाओं के प्रतिनिधि परिणाम । NIR प्रतिदीप्ति छवियों के LXY30-HEVNP-cy 5.5 को लक्ष्यीकरण एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं । नाभिक का संकेत है, जो DAPI (नीला), और cy 5.5 (लाल) के संकेत से दाग थे एक फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे । इस आंकड़े को अनुमति के साथ चेन एट अल २०१६4 से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

समय लेने आनुवंशिक इंजीनियरिंग प्रक्रिया है, जो आम तौर पर हफ्तों लगते है इसके विपरीत, यहां हम सरल दो कदम और एक कदम रासायनिक विकार प्रक्रियाओं, जो 3 दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है, कैंसर लक्ष्यीकरण जोड़ने के ligand और/ HEVNPs के Cys/Lys साइटों को प्रतिदीप्ति डिटेक्शन डाई । तकनीक के लिए सबसे अच्छा ligand लक्ष्य के लिए उंमीदवारों की एक पूल से स्क्रीन इस्तेमाल किया जा सकता है, और इस तरह एक उचित मूल्य और प्रसव के समय पर उपलब्ध पेप्टाइड/छोटे अणु संश्लेषण सेवाओं का लाभ लेता है ।

पारंपरिक आनुवंशिक इंजीनियरिंग, जो केवल ब्याज की प्रोटीन में polypeptides संमिलित कर सकते है विपरीत, रासायनिक विकार की सतह पर polypeptides, छोटे रासायनिक अणुओं, और नैनो कणों सहित विभिंन सामग्रियों को जोड़ने कर सकते है प्रोटीन ब्याज की, जब तक वहां एक Cys या Lys अवशेषों है प्रतिक्रियाशील साइट के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा । यदि रासायनिक विकार साइट पर ऐसी कोई अवशेष नहीं है, सरल Cys/Lys प्रतिस्थापन आनुवंशिक रूप से ब्याज की प्रोटीन पर संशोधित किया जा सकता है यह रासायनिक activatable के रूप में पिछले अनुसंधान में प्रदर्शन4।

नियंत्रण करने के लिए कि रासायनिक विकार केवल चयनात्मक प्रतिक्रिया साइटों पर होता है, दोनों संयुग्मी अणु और प्रोटीन की संरचना संयुग्मित होना करने के लिए अच्छी तरह से intramolecular जेट से बचने के लिए अध्ययन करने की आवश्यकता है । के रूप में स्तन कैंसर लक्ष्यीकरण पेप्टाइड LXY3010, एक महत्वपूर्ण डाइसल्फ़ाइड बांड चक्रीय ligand अनुरूप स्थिर के साथ साथ साथ साथ प्रदर्शन किया । maleimide की thiol-प्रतिक्रिया को देखते हुए, प्रत्यक्ष maleimide-functionalization LXY30 लाइगैंडों की संभावना intramolecular जेट में परिणाम होगा । इसके बजाय, दो चरण विकार (चरण ४.२) पर क्लिक करें रसायन प्रतिक्रिया के माध्यम से alkyne-लिंक्ड LXY30 के साथ maleimide-लिंक्ड azide प्रतिक्रिया द्वारा किया गया था । हालांकि, क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया और thiol-चयनित प्रतिक्रिया के अनुक्रम LXY30-HEVNPs (चित्रा 4) के गठन की अक्षुण्णता के लिए महत्वपूर्ण है. एक CuSO4 catalyzed क्लिक-रसायन प्रतिक्रिया के माध्यम से, LXY30 परोक्ष रूप से maleimide को माई-LXY30 बनाने के लिए बाध्य किया गया । तत्पश्चात् माई-LXY30 को संयुग्मित से HEVNP-573C कर रहे हैं ऐसी कि गठित LXY30-HEVNPs अपनी देशी icosahedral संरचना (चित्रा 4) को बरकरार रख सकते हैं.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक NIH अनुदान द्वारा RHC को धन के प्रायोजन स्वीकार # ' s: AI095382, EB021230, CA198880, राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान, साथ ही फिनलैंड के प्रतिष्ठित प्रोफेसर कार्यक्रम ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO Thermo Fisher Scientific 69572 mini dialysis unit
High Five Cells Thermo Fisher Scientific B85502 Tn5 cells
SF9 Cells  Thermo Fisher Scientific 11496015 Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Thermo Fisher Scientific A11101, A11100 Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Life Technologies 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 Bacmid
ESF921 Insect Cell Media Expression Systems LLC 96-001-01 insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg Lumiprobe Corp 27020 Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL Thermo Scientific 87766 spin desalting column
MES Hydrate Sigma-Aldrich Chemical Co M8250-250G MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes Beckman Coulter, Inc Depends on Rotor ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NPO321BOX SDS protein gel
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher Scientific 10362100 transfection reagent
EMS Glow Discharger Electron Microscopy Science glow discharger

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References

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जैव इंजीनियरिंग अंक १३५ Cysteine प्रतिस्थापन रासायनिक विकार हेपेटाइटिस ई वायरस जैसे कणों multivalent ligand प्रदर्शन लक्ष्यीकरण ligand
रासायनिक विकार विधियों के प्रयोग से हेपेटाइटिस ई वायरस नैनोकणों की सतह Functionalization
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Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli, M., Cheng, R. H. Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods. J. Vis. Exp. (135), e57020, doi:10.3791/57020 (2018).

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