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Bioengineering

Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden

Published: May 11, 2018 doi: 10.3791/57020
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis
* These authors contributed equally

Summary

Wir haben das Kapsid Protein von Hepatitis E Virus als Theranostik Nanopartikel (HEVNP) entwickelt. HEVNP montiert selbst in einen stabilen ikosaedrischen Käfig in Schleimhaut Lieferung. Hier beschreiben wir die Änderung des HEVNPs für Tumor gezielt durch Mutationen Oberfläche ausgesetzt Rückstände, Cysteine, die synthetische Liganden konjugieren, die Tumorzellen gezielt zu binden.

Abstract

Virusähnliche Partikel (untersuchten) wurden zur als darin ausländische Epitope Anzeige und/oder kleine Moleküle bei der Erkennung und Behandlung von verschiedenen Krankheiten zu liefern. Diese Anwendung basiert auf gentechnische Veränderung, Selbstmontage und Cystein Konjugation erfüllen die Tumor-targeting Anwendung der rekombinanten untersuchten. verglichen mit genetischen Modifikation allein, chemische Konjugation von fremden Peptiden, untersuchten bietet eine erheblichen Vorteil, weil es eine Vielzahl von Einrichtungen wie synthetische Peptide oder Oligosaccharide, um an die Oberfläche des untersuchten eine flexibel und moduliert und ohne Änderung der Assemblée VLP konjugiert werden können.

Hier zeigen wir wie das Hepatitis E Virus Nanopartikel (HEVNP), eine modularisierte Theranostik-Kapsel als multifunktionale Anlieferung Träger verwenden. Aufgaben des HEVNPs gehören Gewebe-targeting, Bildgebung und therapeutische Lieferung. Basierend auf den etablierten Strukturforschung HEVNP, wurden die strukturell unabhängige und Oberfläche ausgesetzt Rückstände für Cystein Ersatz als Konjugation Standorte für Maleimide verbunden chemische Gruppen über Thiol-selektive Verbindungen ausgewählt. Eine besondere Cystein-modifizierte HEVNP (Cys Ersatz von Asparagin bei 573 aa (HEVNP - 573C)) war konjugiert, eine Brust Krebs Zelle-spezifische Liganden, LXY30 und beschriftet mit Nah-Infrarot (NIR) Fluoreszenz-Farbstoff (Cy5.5), Rendern den Tumor gezielt HEVNPs als effektive diagnostische Kapseln (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Ähnliche technische Strategien können mit anderen makromolekulare Komplexe mit bekannten Atomstrukturen eingesetzt werden, Anwendungsmöglichkeiten im Theranostik Lieferung zu erkunden.

Introduction

Die Entwicklung der nanogrösse Vektoren in therapeutische und diagnostische Lieferung, bekannt als Nanotheranostics, hat viel von der Biomedizin vom generalisierten Behandlungen gegen gezielte Bereitstellung1verschoben. Gezielte Nanotheranostic Lieferung integriert nanogrösse Vektoren (Nanopartikel) mit Theranostik Moleküle stabil Theranostik-Moleküle zu einem bestimmten erkranktem Gewebe oder biochemischen Weg2,3,4 direkt . Nanomedizin ist an die Spitze der gezielte Bereitstellung gekommen, weil optimal dimensionierte Nanopartikel haben die Fähigkeit zur Auflage von Theranostik Moleküle stabilisieren und selektiv Ziel Zelle Oberfläche Moleküle präsentiert auf krankem Gewebe. Viele Nanotheranostic Plattformen leiden noch unter passive Zelle Aufnahme, vorzeitigen Abbau, Toxizität und unzureichende Verbindung mit Theranostik Moleküle. Untersuchten überwinden viele dieser Hindernisse in gezielte Bereitstellung. Sie dienten als darin zu ausländischen Epitope Anzeige und/oder kleine Moleküle liefern: eine Therapie, die gegen viele Krankheiten1eingesetzt werden kann. Diese Anwendung beruht hauptsächlich auf dem Gelände des Self-assembly sowie die Leichtigkeit der genetischen Veränderungen, die entworfene Anwendung für die gegebenen VLP zu erfüllen. Im Vergleich zu Gentechnik, chemische Konjugation von ausländischen Peptide, VLP zeigt einen deutlichen Vorteil, da es eine Vielzahl von Einrichtungen wie Peptide oder Oligosaccharide, um an der Oberfläche des untersuchten in einer modulierten konjugiert werden kann und flexibel ohne Änderung des VLP-Montage.

HEVNPs, abgeleitet aus der rekombinanten Proteins HEV Kapsid, 2Nd offen lesen Frame (ORF2), sind nicht ansteckend, selbst Montage Capsids fähig Zelle-Bindung und Eintrag. Weil HEV für Schleimhaut Getriebe entwickelt, ist das montierte Kapsid Protein in proteolytischen und sauren Schleimhaut Bedingungen5ähnlich stabil. HEVNPs bilden eine Mulde, T = 1 ikosaedrischen Kapsid, bestehend aus 60 identischen Einheiten6,7 der ORF2, Rendern hochstabile sowohl im harten physiologischen Bedingungen im Speicher. Alle viralen genetischen Elemente fehlen, wird die Produktion effizienter, ertragreich durch Baculovirus Expressionssystems in Insektenzellen erreicht. Wegen ihrer proteolytischen Stabilität sind selbstgebaute HEVNPs extrahiert und gereinigt aus Zelle überstand, notwendigen Reinigungsschritte erheblich zu reduzieren. Darüber hinaus besitzen HEVNPs eine Oberfläche exponierten Vorsprung Domäne (P Domäne) durch ein flexibles Scharnier zu einer stabilen ikosaedrischen Basis verbunden. Die P-Domäne bildet Oberfläche ausgesetzt Spikes auf der ikosaedrischen Basis, während das flexible Gelenk es möglich macht, wesentlich die P-Domäne zu ändern, ohne Kompromisse bei der ikosaedrischen Basisstruktur. Mit 60 wiederholte Einheiten führt einzelne standortspezifische Modifikation 60 symmetrischen Seiten für chemische Modulation. Vor kurzem vorgeschlagen wir eine Nano-Plattform mit HEVNP, die chemisch Liganden oder kleine Moleküle für Theranostik Anwendungen konjugieren kann. Dies wurde erreicht, indem eine einzelne Aminosäure mit Cystein in der Vorwölbung Domain der HEV-VLP als Reaktion Site mit Maleimide verknüpft Peptide oder Moleküle. Basierend auf früheren Strukturanalyse von HEV-VLP und gut untersuchte immunogen Epitope8,9, wurden die folgenden fünf HEV-VLP-Aminosäuren als potenzielle Kandidaten mit Cystein ersetzt: Y485C, T489C, S533C, N573C und T586C ( Abbildung 1). Nach Ausdruck und Reinigung von Insektenzellen, wurden ihre VLP-Formationen durch Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Beobachtung (Abbildung 2) bestätigt, und die exponierten Cystein Websites analysiert wurden durch Western blot nach Maleimide-linked Biotin Konjugation (Abbildung 2). Unter den fünf Mutanten HEVNP - 573C angezeigt das stärkste Signal des Maleimide-Biotin Konjugation (Abbildung 2) und diente zur Follow-up-Demonstration als die Nanocarrier für Brust Krebszelle gezielt4 (Abbildung 3).

Dieses Protokoll stellt chemische Konjugation Methoden zur Tumor-targeting Moleküle durch Oberfläche Cystein Konjugation HEVNPs beimessen. Wir ausführlich die Konjugation der Tumor targeting und Erkennung Moleküle für Tumor-Lieferung mit rekombinanten HEVNPs mit Cystein bei N573 (HEVNP - 573C). Wir konzentrieren auf Klick Chemie Konjugation Schritten, einen Brust-Krebs-Tumor gezielt Peptid, LXY3010 , HEVNPs Form LXY30-HEVNP (Abbildung 4) zu binden. Anschließend, N-Hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 wurden auf die separate Lys-Website auf HEVNPs LXY30-HEVNP-Cy5.5 für Fluoreszenz-Detektion sowohl in Vitro (Abbildung 5) bauen konjugiert und in-vivo4.

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Protocol

(1) HEVNP Produktion in Insektenzellen

Hinweis: Alle folgenden Schritte sollte in einer Zelle Kultur Haube durchgeführt werden. Beziehen sich auf unsere früheren Veröffentlichung für detailliertere HEVNP Produktion Verfahren11.

  1. Kultur Sf9 Zellen im Insekt Zelle Medien (siehe Tabelle der Materialien), 50-75 % Zusammenfluss in 6-Well Platten.
  2. Mit Insekten Zelle Transfektion Reagenzien entsprechend des Herstellers Protokollen, transfizieren Sie Bacmids mit HEVNP - 573 C ORF2 in Sf99 Zellen zur Herstellung rekombinanter Baculovirus. 3-6 Tage, abhängig von der Lebensfähigkeit der Zellen inkubieren Sie transfected Zellen bei 27 ° C.
  3. Sammeln Sie Überstand bei 3-6 Tage nach der Infektion (nach die transfizierten Zellen durch Baculovirus Infektion lysiert werden) als P0 Baculovirus bestand.
  4. Entfernen Sie Kulturmedium vor dem Auftragen von 200 µL P0 Lager auf 50-75 % konfluierende Sf9 Zellen in einem 25 cm2 Monolage Kolben. Rock die Flasche alle 15 min um die volle Deckung des Inokulums sicherzustellen. Wiederholen Sie 4 Mal, für eine Gesamtmenge von 60 Minuten.
  5. Der Kolben 2 mL Insekt Zellkulturmedium hinzu und halten Sie bei 27 ° C für ca. 3-6 Tage, abhängig von der Lebensfähigkeit der Zellen Baculovirus zu einem höheren Titer zu verstärken.
  6. Führen Sie Plaque Tests lesen12Baculovirus-Titer zu erhalten.
  7. Kultur der abgehängten Tn5 Insektenzellen (Table of Materials) mit 100 mL Insekt Zelle Medium in 250 mL Flasche und schütteln Sie in 27 ° C bei 150 u/min, ein Titer von 0,5 x 105 - 1 x 106 zum animpfen.
  8. Fügen Sie Baculovirus bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 5-10 bis 100 mL Tn5 Zellen in eine 250 mL Flasche. Nach der Inokulation schütteln Sie in 27 ° C bei 150 u/min für ca. 5-7 Tage.
  9. Sobald die meisten Zellen scheinen Vesikel haben und 70-90 % der Zellen sind tot Lichtmikroskop beobachtet, die Tn5 Zellen zu sammeln und in 33 mL Ultrazentrifugen Rohre übertragen. Ort der Ultrazentrifuge Rohre in schwingende Eimer Rotoren, Balance und Spin-down zellenrückstand und rekombinanten Baculoviren bei 10.000 x g 90 Minuten bei 25 ° C.
  10. Halten Sie den überstand, der die freigegebene HEVNPs bei 4 ° C für weitere Reinigung enthält. Fügen Sie für längere Lagerung des Baculovirus überstand Protease-Inhibitoren.

2. HEVNP-Reinigung

  1. Pellet- und die HEVNPs mit Cäsium-Chlorid (CsCl) gradient Trennung zu isolieren:
    1. Übertragen Sie die gesammelten überstand (aus Schritt 1.10) geben und 20 % NP-40 in jedes Rohr eine Endkonzentration von 0,5 % zu NP-40, alle übrigen Zellmembran aufzulösen. Sanft durch pipettieren mischen und mindestens 30 Minuten bei 25 ° c inkubieren
    2. Die HEVNPs bei 112.400 x g in schwingende Eimer Rotoren für 2 h bei 4 ° C, unten die HEVNPs aus der Überstand pellet Ultrazentrifugen. Verwerfen des Überstands nach Zentrifugation und sanft wieder auszusetzen das rohe Pellet in 200 µL 10 mM MES Puffer pH 6.2 in jedem Röhrchen über Nacht (O/N) bei 4 ° C. Laufen Sie SDS-PAGE (Schritt 3.1) bestätigen das Vorhandensein von HEVNP ORF2 in das Rohöl Pellet als 52 kDa Band.
    3. Bereiten Sie einen 38,5 % (w/V) CsCl-Gradienten durch Mischen 1,96 g CsCl neu suspendierten Rohöl Pellet und der ~ 4 mL 0,01 M MES pH 6.2 in einer 5 mL Ultrazentrifugen Röhre. Balancieren Sie die Röhren zu und in eine schwingende Eimer-Rotor. Ultrazentrifugen 147.000 x g 16 h bei 4 ° C.
  2. Sammeln Sie die Fraktionen nach CsCl-Gradienten:
    1. Die Top 500 µL-Fraktion, die in erster Linie leichte Zellmembran Schutt ist zu verwerfen. Sammeln Sie 500 µL Brüche, ausgehend von der Spitze des Rohres, und ändern Sie Tipps zwischen den einzelnen Fraktionen zu. Legen Sie jede Fraktion in nummeriert/mit der Bezeichnung 1,5 mL Röhrchen.
      Hinweis: Die Anwesenheit von HEVNP ORF2 in Bruchteilen von CsCl Gradienten nicht erkannt werden kann, durch Ausführen von SDS-PAGE Gelen aufgrund der hohen Konzentration von CsCl getrennt. Die CsCl in jede Fraktion kann entfernt oder durch nach einem CsCl-Bereinigung-Verfahren verdünnt. Alternativ kann die CsCl-Gradienten durch ein 10-40 % Saccharose gradient13 CsCl Rückstände zu vermeiden ersetzt werden.
    2. Übertragen Sie jede Fraktion auf eine 5 mL Ultrazentrifugen Rohr und verdünnen Sie die CsCl mit 4,5 mL 10 mM MES, pH 6.2. Balancieren Sie die Röhren zu und in eine schwingende Eimer-Rotor. Ultrazentrifugen 147.000 x g für 2 h bei 4 ° C, unten die HEVNPs pellet.
    3. Verwerfen Sie den überstand und aussetzen Sie sanft wieder der HEVNPs in 100 µL 10 mM MES pH 6.2 in jedem Röhrchen. Decken Sie die Rohre, um Verdunstung zu vermeiden und O/N bei 4 ° c inkubieren
    4. Notieren Sie die A280 Lesung und A260/A280 nm Verhältnis mit einem Spektralphotometer. Bestimmen Sie die ungefähre Konzentration der ORF2 als:
      Equation
      Jedes ORF2 enthält Cys Platz 1 und Platz für chemische Konjugation 1 Lys.
      Hinweis: Der molaren Aussterben Koeffizient der HEVNP ORF2 ist 60.280, das entspricht 1,019 mg/mL × A280. Dies ist so nahe an 1:1, die die Konzentration von HEVNPs (in mg/mL) kann durch die A280, und daher die Konzentration von ORF2 durch die obige Gleichung angenähert werden. Zum Beispiel eine HEVNP mit einem A280 Lesung von 1 haben eine Konzentration von 1 mg/mL, 18,8 µM entspricht ORF2.
    5. Bereiten Sie eine SDS-PAGE. Verwenden Sie eine 6 µL Probe aus jeder Fraktion um die Fraktionen mit 53,3 HEVNP ORF2-kDa-Protein (Schritt 3.1) zu bestimmen. Die HEVNPs sollte in Sekundenbruchteilen 3-5, mit einer Dichte von ~1.25 g/mL gefunden werden.
    6. Das Vorhandensein und die Reinheit des HEVNPs durch TEM Beobachtung zu bestätigen. Vorzubereiten oder zu 0,5 - 2,0 mg/mL für TEM HEVNP Proben zu verdünnen. Die HEVNPs erscheinen in TEM als leere ikosaedrischen Proteine, ~ 27 nm im Durchmesser (Abbildung 2). Einige Protein-Verunreinigungen verbleiben in den Fraktionen und unter TEM (Schritt 3.2) beobachtet werden.
  3. Wiederholen Sie im Fall, dass Verunreinigungen unter TEM vorhanden sind Schritt 2.1.3 - 2.2.6 für bessere Reinheit der HEVNPs.
    Hinweis: Zusätzliche Reinigung durch CsCl-Gradienten verursachen Ertragsverlusten von HEVNPs. Alternativ kann die CsCl-Gradienten-Reinigung durch einen 10-40 % Saccharose Verlauf verbleibende CsCl13vermeiden ersetzt werden.

3. HEVNP Charakterisierung

  1. Bereiten Sie SDS-PAGE 4-12 % Bis-Tris Protein Gele, 1,0 mm, 17-Brunnen (siehe Tabelle der Materialien) gemäß des Benutzers manuell14 vor:
    1. Fügen Sie 2 µL 4 x Ladepuffer zu 6 µL Protein Probe. Inkubieren Sie die Probe-Mischung in einem Hitze-Block für 10 min bei 100 ° C, um das Protein zu denaturieren. Laden Sie die Proteinproben auf das Gel.
    2. Laufen Sie die SDS-PAGE von Einstellung der DC-Versorgung bei 100 V für 10 min, dann 150 V 45 min bis die Proben bis ca. 1 cm über dem Boden des Gels laufen.
    3. Fleck das SDS-PAGE-Gel mit Coomassie-blau (0,25 % (w/V) Coomassie Brilliant Blue R250, 30 % (V/V) Methanol, 10 % (V/V) Essigsäure), für 1 h.
    4. Nach dem Färbeverfahren Coomassie blaue Fleck entfernen und anwenden de-Färbung Puffer (30 % (V/V) Methanol, 10 % (V/V) Essigsäure) auf das Protein Gel für > 12 h bei Raumtemperatur.
    5. Dokumentieren Sie das Gel unter weißem Licht, das Vorhandensein von HEVNP ORF2 am Band 52 kDa zu bestätigen.
  2. Beobachten Sie die HEVNPs mit TEM.
    1. Bereiten Sie vor oder verdünnen Sie die HEVNP Proben auf 0,5 - 2 mg/mL mit 10 mM MES pH 6.2 für TEM-Bildgebung.
    2. Ionisieren die Kohlenstoff-beschichtete Netze mit 40 mA Glimmentladung für 30 s, eine hydrophile Carbon-Oberfläche zu produzieren. Die Glut Entlastung Ausrüstung wird in der Tabelle der Materialienbeschrieben.
      Hinweis: Die hydrophilen Carbon-Oberfläche der Netze kann dauern nur für 30 min nach dem glühen Behandlung Entlastung.
    3. In einer Pinzette halten das Raster 2 µL HEVNP Probe hinzufügen, warten Sie 15-30 s und blot mit Filterpapier.
    4. Waschen Sie das Gitter mit DdH20 und Blot mit Filterpapier.
    5. Fügen Sie 2 µL 2 % Uranyl-Acetat sofort die Raster, warten 15 s, dann Fleck mit Filterpapier hinzu. Trocken die Probe-Gitter, indem man sie in einem elektronischen Entfeuchten Trockenschrank für O/N.
    6. Übertragen Sie das Raster in eine TEM und Bild bei 10-80k Vergrößerung. HEVNPs in TEM erscheinen als leere ikosaedrischen Proteine, ~ 27 nm im Durchmesser, aufgrund des Fehlens von viralen RNA.

4. chemische Konjugation von HEVNPs mit Biotin, Krebs gezielt Liganden und Fluorophore

  1. Führen Sie eine Schritt-Konjugation von HEVNPs und Maleimide Zusammenhang mit Biotin.
    1. Puffer-Änderung: wenden Sie die HEVNPs in Mini-Dialysezentren und Dialyse gegen 0,01 M PBS pH 7.4 bei Raumtemperatur 1 h nach der Hersteller-Protokoll (Table of Materials). Übertragen der HEVNPs auf 1,5 mL Tuben und messen die Proteinkonzentration bei 280 nm mit einem Spektralphotometer.
    2. Mischen Sie die HEVNP auf 1 mg/mL, die entspricht 18,8 µM Cys Reaktion Websites (siehe Details in Schritt 2.2.4), mit einer gleichen Menge von Maleimide-Biotin (100 µM) in 0,01 M PBS, pH 7,4, zu einem Molverhältnis von 1:5; O/N zu reagieren, bei 4 ° C. Entfernen Sie ungebundenen Maleimide-Biotin mit 40 K MWCO Spin Desalting Spalte Verfahren nach der Hersteller-Protokoll (Table of Materials).
    3. Analysieren Sie die Proben durch eine Verringerung der SDS-PAGE (Schritt 3.1) Standard.
    4. Mit Standardverfahren, bereiten Sie eine Chemolumineszenz Western Blot mit Streptavidin HRP verknüpft. Erfassen Sie die Chemolumineszenz Signal durch X-Ray Film (Abbildung 2).
  2. Führen Sie zwei Schritt LXY30 Konjugation, Oberfläche ausgesetzt Cystein für HEV NPs (Abbildung 5).
    1. Puffer-Austausch: HEVNPs in Mini Dialysezentren und Dialyse gegen 0,01 M PBS pH 7.4 bei Raumtemperatur für 1 h Übertragung der HEVNPs auf 1,5 mL Röhrchen und messen die Proteinkonzentration bei 280 nm mit einem Spektralphotometer.
    2. Fügen Sie 650 µM Maleimide-azid und 650 µM Alkinen-LXY3010 in 0,01 M PBS pH 7.4 mit 200 µM CuSO4 und 1 mM Ascorbinsäure, Maleimide verbunden LXY30 zu bilden (Mal-LXY30) die Mischung bei 4 ° C inkubieren bei 650 µM. O/N.
    3. Mischen Sie die HEVNP auf 1 mg/mL, 18,8 µM Cys Reaktion Website entspricht (siehe Details in Schritt 2.2.4), mit etwa 10 % Volumen der Mal-LXY30 (650 µM) in 0,01 M PBS pH 7.4, zu einem Molverhältnis von 1:3; O/N zu reagieren, bei 4 ° C.
      Hinweis: Aufgrund der relativ hohen Konzentration von Mal-LXY30, die Endkonzentrationen der Edukte, z. B. CuSO4, etwa 10 Mal sinken nach dem Mischen, um ihren Schaden zu HEVNPs zu vermeiden. Eine weitere Möglichkeit ist die Cu-freie Konjugation Methode15.
    4. Entfernen Sie ungebunden Maleimide-Klick-LXY30 mit einer 40 K MWCO Spin Entsalzung Spalte nach der Hersteller-Protokoll (siehe Tabelle der Materialien). Halten Sie die LXY30-Verbindung HEVNPs (LXY30-HEVNPs) bei 4 ° C.
  3. Führen Sie eine Schritt-Konjugation des LXY30-HEVNPs und Cy5.5-NHS Ester (NHS-Cy5.5)
    1. Mischen HEVNPs LXY30 verknüpft (LXY30-HEVNPs), 1 mg/mL, 18,8 µM des Standortes Cys Reaktion entspricht (siehe Details in Schritt 2.2.4), in gleicher Lautstärke des NHS-Cy5.5 (100 µM) in 0,01 M PBS pH 7.4 zu einem Molverhältnis von 1:5; O/N zu reagieren, bei 4 ° C.
    2. Entfernen Sie ungebunden Cy5.5-NHS mit 40K MWCO Spin Entsalzung Spalte Verfahren nach Protokoll des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien). Halten Sie die LXY30, HEVNPs Cy5.5 verknüpft (LXY30-HEVNP-Cy5.5) bei 4 ° C.

5. Bindung an HEVNP und Internalisierung in Brustkrebszellen MDA-MB231

  1. Samen MDA-MB231 Brustkrebs-Zellen in ein 35-mm-Glas unten Gerichte (5 x 104 pro Schale) O/N in einer säugerzelle Kultur Kabinett.
  2. Die Zelle Bindung Experiment bereiten Sie LXY30-HEVNP-Cy5.5 durch folgende Schritte 4.2-4.3 vor. Verdünnen Sie die LXY30-HEVNP-Cy5.5 auf 0,01 mg/mL, die 0.188 µM HEVNP ORF2 entspricht (siehe Schritt 2.2.4), in 250 µL von 0 - 1 % FBS/DMEM.
    1. Bereiten Sie die negative Kontrollprobe bei 0,01 mg/mL HEVNP-Cy5.5 für folgende Schritt 4.3 aber konjugierte mit NHS-Cy5.5 Farbstoff nur, (HEV-Cy5.5). Verdünnen Sie die HEVNP-Cy5.5 auf 0,01 mg/mL, die 0.188 µM HEVNP ORF2 entspricht (siehe Schritt 2.2.4), in 250 µL 10 % FBS mit DMEM ergänzt.
  3. Waschen Sie die Zellen durch die Anwendung von 1 M-PBS-Puffer, pH 7,4 250 µL einmal. Entfernen Sie die PBS-Puffer nach der Wäsche, wobei einige Puffer in der Kulturschale Zelle.
  4. Gelten Sie 250 µL LXY30-HEVNP-Cy5.5 bei 10 %, die FBS ergänzt mit DMEM oder HEVNP-Cy5.5 bei 10 %, die FBS mit DMEM, die kultivierten MDA-MB231 Brustkrebs-Zellen ergänzt. Schild der Zelle kultiviert Gerichte aus Licht mit Alu-Folie.
  5. Halten Sie die Zelle kultiviert Gerichte in einer Zellkultur 37 ° C Schrank für 1 h für Verinnerlichung.
  6. Waschen Sie die kultivierten Zellen auf Eis 3 mal 5 min pro Waschgang mit 250 µL 1 M PBS, pH 7.4.
  7. Fix die Zellen bei 4 % PFA in 1 M PBS, pH 7.4 für 20 min und dann waschen einmal mit 250 µL 1 M PBS, pH 7.4.
    Hinweis: Die Zellen sind nun bereit, confocal Mikroskop abgebildet werden. Repräsentative Daten sind in Abbildung 5dargestellt.

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Representative Results

Verwandt mit HEV-untersuchten alle Cys HEVNPs gebildeten löslichen ikosaedrischen Capsids modifiziert und nicht in Lösung während der Produktion oder Reinigung aggregiert. Vor und nach der einstufigen Maleimide-Biotin Konjugation, jeweils von der Cys geändert wurden HEVNPs von HEV-untersuchten in den negativen Fleck EM (Abbildung 2) zu unterscheiden. Maleimide-Biotin Konjugation Effizienz Cys modifizierte HEVNPs wurde erstmals mit Western blotting über Chemilumineszenz Streptavidin Bindung getestet. Nach Maleimide-Biotin Konjugation geändert Cys HEVNPs angezeigt Streptavidin Bindung Signale (Abbildung 2).

Effektive zweistufige Cystein Konjugation beeinflusste die Reihenfolge in der Konjugation durchgeführt wurde. Denn α3β1 Integrin ist überexprimieren Brustkrebs Tumor-Zellen, eine synthetische Liganden, LXY30, mit spezifischen Affinität zu α3β1 wurde10, ausgewählt als Tumor-targeting conjugate Molekül. Direkte Maleimide (MaI) Funktionalisierung der LXY30 war nicht möglich, weil LXY30 cyclisiert durch eine intermolekulare Disulfid Bindung ist; Daher gab es ein Problem für Self-reactivity. Stattdessen wurde LXY30 mit einer Gruppe von Alkinen funktionalisiert und Maleimide-azid durch eine Klick-Chemie-Reaktion gebunden. Als HEV - 573C NPs zuerst an Maleimide-azid gebunden wurden, erschien gefolgt von einem Klick Chemie Reaktion auf LXY30-Alkinen, der HEV - 573 C NPs unter TEM Beobachtung (Abbildung 4) zu zerlegen. Eine ersten Klick Chemie Reaktion zwischen LXY30-Alkinen und Maleimide-azid zu bilden MaI-LXY30, gefolgt von MaI-LXY30 Konjugation, Cys-modifizierte HEVNPs (LXY30-Mal-Cy5.5) hatte jedoch keinen Einfluss auf seine Struktur (Abbildung 4 b). Abbildung 4 zeigt eine schematische Darstellung des LXY30-Funktionalisierung von HEVNPs für Tumor Zelle targeting.

HEVNPs konjugiert, die Brustkrebs gezielt Liganden, LXY30 (LXY30-HEVNPs) gebunden und in kultivierten Brustkrebszellen verinnerlicht wurden. Für Fluoreszenz-Detektion, LXY30-HEVNPs und ungebundenen HEVNP-573Cs wurden beschriftet mit NHS funktionalisiert Cy5.5 Fluoreszenzfarbstoff (NHS-Cy5.5) durch primäre Amine Kopplung von Lysin auf HEVNP-573Cs. LXY30-HEVNP-Cy5.5 und HEVNP-Cy5.5 zu kultivierten angewendet wurden Brustkrebs-Zellen (MDA-MB-231) und konfokalen Mikroskopie beobachtet. Die NIR-Fluoreszenzbilder von confocal Mikroskop zeigen, dass LXY30-HEVNP-Cy5.5 hatte höhere verbindliche Affinität zu und erhöhte Internalisierung in MDA-MB-231 Brustkrebs-Zellen im Vergleich zu HEVNP-Cy5.5 (Abbildung 5).

Figure 1
Abbildung 1: Cystein-Ersatz auf der Oberfläche Vorsprung Domäne Hepatitis E Virus Nanopartikel. Cystein-Mutationen wurden vorgeschlagen für Rückstände, Y485, T489, S533, N573 und T586 im Bereich flexible Spule, die Störung, die Sekundärstruktur des HEV ORF2 zu minimieren (A). Alle ausgewählten Rückstände für Cystein Mutation befinden sich auf der Oberfläche des Geschäftsfeldes Protrusion (P) (grau; die anderen Domänen sind die Shell (S) - Domäne in blau und Mitte (M) - Domäne in rosa), mit Y485 (Cyan), T489 (gelb), T586 (orange) auf der äußersten Oberfläche, und Rückstände S533 (Magenta) und N573 (rot) auf der Seite mit Blick auf die fünffache Achse des HEVNP (B). Die Figur wurde von Chen Et Al. 20164 mit Erlaubnis verändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Charakterisierung der HEVNP tragen N573C als Vorbild für alle Cys HEVNPs geändert. Die HEVNP - 573C erschien als sphärische Projektionen auf Elektron mikrographen (A) und blieb als intakt Partikel nach Mal Biotinylating Konjugation (B). Repräsentative Ergebnisse der Konjugation und Epitop Exposition von Cys-modifizierte HEVNPs. Sie waren verpflichtet, Maleimide-Biotin über Cystein-Maleimide Kupplung und anschließend durch Western-Blot für Streptavidin Bindung untersucht. Die Cystein-Mutation bei N573 erlaubt effiziente biotinylierungen, die HEVNP im Vergleich zu den anderen Mutationsstellen, d. h., Y485, T489, S533 und T586 (C). Bar ist gleich 100 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische von Brustkrebszellen, die speziell mit Cy5.5-mit der Bezeichnung LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) ausgerichtet sind. LXY30-HEVNP-Cy5.5 binden selektiv an Brustkrebs-Zellen (Magenta) durch LXY30s spezifische Affinität zu α3β1, ist ein stark exprimierten Integrin auf der Brust-Krebs-Zellmembran. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: eine schematische Darstellung des zweistufigen chemische Konjugation Prozesse, einschließlich ein Thiol-selektive und einem Kupfer katalysierten azid-Alkinen Cycloaddition oder "Klick Chemie" Reaktion, LXY30-HEVNPs zu bauen. Zwei Methoden sind getestet worden. Methode 1: die Kupfer katalysierten azid-Alkinen Cycloaddition Reaktion zwischen Mal-azid und Alkinen-LXY30 Form Mal verbunden LXY30 (Mal-LXY30) uraufgeführt wurde. Dann wurde die Mal-LXY30 hinzugefügt, um mit der Cys-Website von HEV - 573 C NPs (A) reagieren. Die LXY30 und Cy5.5 dekoriert HEV - 573C NPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) intakt geblieben, nachdem alle diese chemische Konjugation Prozesse (B). Methode 2: die Konjugation-Prozess beginnt mit der Kennzeichnung Mal verknüpft azid (Mal-azid) auf dem Gelände der Cys des HEV - 573C NPs durch Thiol-selektiven Reaktion auf Natriumazid verbunden HEVNPs (azid-HEVNPs), gefolgt von Hinzufügen von LXY30-Alkinen, Ascorbinsäure und CuSO4 bauen , LXY30-Verbindung HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (A) zu bilden. Jedoch wurden die meisten LXY30-HEVNPs beschädigt oder zerlegt von der Konjugation Prozesse, die durch reaktive Reagenzien, einschließlich azid, Ascorbinsäure und CuSO4 (C) verursacht werden können. Mal: Maleimide. Diese Zahl wurde von Chen Et Al. 20164 mit Erlaubnis verändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse der Zelle binden und Internalisierung von eindringmittel mit der Bezeichnung LXY30-HEVNPs, die bindet an MDA-MB-231 Brustkrebszellen. NIR Fluoreszenzbilder von LXY30-HEVNP-Cy5.5 targeting auf MDA-MB-231-Zellen. Das Signal der Kerne, die durch DAPI (blau) gefärbt wurden, und das Signal des Cy5.5 (rot) erworben wurden, mit einem konfokale Fluoreszenzmikroskop. Diese Zahl wurde von Chen Et Al. 20164 mit Erlaubnis verändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Im Gegensatz zu der Zeit raubende Gentechnik-Verfahren, das dauert in der Regel Wochen zeigen wir hier in zwei einfachen Schritten und einstufige chemische Konjugation Verfahren, die innerhalb von 3 Tagen des Hinzufügens des Krebs gezielt Liganden abgeschlossen werden können und/oder Fluoreszenz-Erkennung zu Cys/Lys Seiten HEVNPs Farbstoff. Die Technik kann verwendet werden zum Bildschirm für die beste Liganden Ziel aus einem Pool von Kandidaten und damit nutzt die verfügbaren Peptid/kleine Molekül Synthese Dienste zu einer vernünftigen Kosten und Zeit.

Im Gegensatz zu herkömmlichen Gentechnik, die nur die Polypeptide in interessierenden Proteine eingefügt werden können, kann die chemische Konjugation verschiedenen Materialien einschließlich Polypeptide, kleine chemische Moleküle und Nano-Partikel auf der Oberfläche des verbinden die Protein des Interesses, solange gibt es ein Cys oder Lys Überrest als reaktive Standort verwendet werden. Am Standort chemische Konjugation gibt es keine solche Rückstände, kann einfache Cys/Lys Ersatz auf das Protein des Interesses zu machen, wie in früheren Forschung4chemisch aktivierbare genmanipuliert.

Dass die Kontrolle der chemische Konjugation tritt nur auf den selektiven Reaktion-Sites, die Struktur des conjugate Molekül und Protein zu konjugierten muss gründlich untersucht werden, um Intramolekulare Reaktion zu vermeiden. Wie hierin mit der Ausrichtung auf Peptid LXY3010Brustkrebs gezeigt hat, stabilisiert eine kritische Disulfid Bindung zyklische Liganden Konformation. Die Thiol-Reaktivität von Maleimide, direkte Maleimide-Funktionalisierung von LXY30 Liganden in Intramolekulare Reaktion wahrscheinlich gegeben. Stattdessen wurde zwei Schritt Konjugation (Schritt 4.2) durchgeführt, durch die Reaktion der Maleimide verknüpft Natriumazid mit Alkinen verknüpft LXY30 durch Klick-Chemie-Reaktion. Die Reihenfolge der Click-Chemie-Reaktion und Thiol-ausgewählte Reaktion ist jedoch entscheidend für die Konformationsänderungen Unversehrtheit des LXY30-HEVNPs (Abbildung 4). Durch eine CuSO4 katalysiert Click-Chemie Reaktion war LXY30 indirekt an Maleimide gebunden, MaI-LXY30 zu bauen. Anschließend sind die MaI-LXY30 konjugiert, HEVNP - 573C so, dass die gebildeten LXY30-HEVNPs ihre native ikosaedrischen Struktur (Abbildung 4) behalten können.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen die Patenschaft der Finanzierung zum RHC von NIH gewähren #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Nationales Institut für Ernährung und Landwirtschaft sowie Finnland Distinguished Professor Programm.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO Thermo Fisher Scientific 69572 mini dialysis unit
High Five Cells Thermo Fisher Scientific B85502 Tn5 cells
SF9 Cells  Thermo Fisher Scientific 11496015 Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Thermo Fisher Scientific A11101, A11100 Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Life Technologies 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 Bacmid
ESF921 Insect Cell Media Expression Systems LLC 96-001-01 insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg Lumiprobe Corp 27020 Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL Thermo Scientific 87766 spin desalting column
MES Hydrate Sigma-Aldrich Chemical Co M8250-250G MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes Beckman Coulter, Inc Depends on Rotor ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NPO321BOX SDS protein gel
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher Scientific 10362100 transfection reagent
EMS Glow Discharger Electron Microscopy Science glow discharger

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References

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Biotechnik Ausgabe 135 Cystein Ersatz chemische Konjugation Hepatitis E virusähnliche Partikel multivalente Liganden Display targeting Liganden
Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden
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Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli,… More

Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli, M., Cheng, R. H. Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods. J. Vis. Exp. (135), e57020, doi:10.3791/57020 (2018).

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