Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Overflate Functionalization av hepatitt E Virus nanopartikler bruke kjemiske Bøyning

Published: May 11, 2018 doi: 10.3791/57020
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis
* These authors contributed equally

Summary

Vi har konstruert kapsid protein av hepatitt E som en theranostic hydrogenion (HEVNP). HEVNP samler selv i en stabil icosahedral bur mucosal levering. Her beskriver vi endring av HEVNPs for svulst målretting etter mutere overflaten-eksponerte rester til cysteinene, hvilke bøy syntetiske ligander som spesifikt binder kreftceller.

Abstract

Virus-lignende partikler (VLPs) har blitt brukt som nanocarriers å vise utenlandske epitoper og/eller levere små molekyler i gjenkjenning og behandling av ulike sykdommer. Dette programmet bruker genetisk modifisering, selvstendig montering og cystein Bøyning å oppfylle svulst målretting anvendelse av rekombinant VLPs. sammenlignet med genetisk modifisering alene, kjemiske Bøyning av utenlandske peptider å VLPs tilbyr en betydelig fordel fordi det gir en rekke enheter, for eksempel syntetiske peptider eller oligosaccharides, å bli bøyd på overflaten av VLPs på en modulated og fleksibel måte uten endring av samlingen VLP.

Her viser vi hvordan du bruker hepatitt E virus hydrogenion (HEVNP), en modularized theranostic kapsel, som en multifunksjonell levering bærer. Funksjoner av HEVNPs inkluderer vev målretting, bildebehandling og terapeutiske levering. Basert på veletablerte strukturelle arbeidet til HEVNP, ble strukturelt uavhengig og overflaten-eksponerte rester valgt for cystein erstatning som Bøyning områder for maleimide-tilknyttet kjemiske grupper via thiol-selektiv sammenhengene. Ett bestemt cystein modifisert HEVNP (en Cys utskifting av asparagine på 573 aa (HEVNP - 573C)) var konjugert til en bryst kreft celle-spesifikke ligand, LXY30 og merket med nær infrarød (NIR) fluorescens fargestoff (Cy5.5), gjengivelse av svulst målrettede HEVNPs som effektive diagnostiske kapsler (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Lignende engineering strategier kan brukes med andre macromolecular komplekser med kjente atomic strukturer å utforske bruksmuligheter theranostic levering.

Introduction

Utviklingen av nano-størrelse vektorer i terapeutiske og diagnostiske levering, kjent som nanotheranostics, har flyttet mye av biomedisinsk feltet fra generalisert behandlinger til målrettet levering1. Målrettet nanotheranostic levering integrerer nano-størrelse vektorer (nanopartikler) med theranostic molekyler til stabilt direkte theranostic molekyler til en bestemt syke vev eller biokjemiske sti2,3,4 . Nanomedicine har kommet i forkant av målrettet levering fordi optimalt størrelse nanopartikler har kapasitet til å stabilisere sirkulasjon av theranostic molekyler og selektivt målet cellen overflaten molekyler på sykt vev. Mange nanotheranostic plattformer er fortsatt lider av passiv celle opptak, tidlig fornedrelse, giftighet og tilstrekkelig tilknytning theranostic molekyler. VLPs overvinne mange av disse hindringene i målrettede levering. De har blitt brukt som nanocarriers å vise utenlandske epitoper og/eller levere små molekyler: en diett som kan brukes til å bekjempe mange sykdommer1. Dette programmet bruker hovedsakelig for selv-montering og enkel genetiske modifikasjoner, å oppfylle utformede programmet for den gitte VLP. Sammenlignet med genetisk engineering, kjemiske Bøyning av utenlandske peptider å VLP viser en betydelig fordel fordi det tillater et stort utvalg av enheter, for eksempel peptider eller oligosaccharides, å bli bøyd på overflaten av VLPs i en modulated og fleksibel måte uten endring av VLP montering.

HEVNPs, avledet fra rekombinant HEV kapsid protein, 2nd åpne lesing frame (ORF2), er ikke-smittsomme, selv montering capsids celle-binding og oppføring. HEV utviklet for mucosal overføring, er samlet kapsid protein tilsvarende stabil i proteolytisk og sure mucosal forhold5. HEVNPs danner en hul, T = 1 icosahedral kapsid, består av 60 identiske enheter6,7 i ORF2, gjengi det svært stabile både i lagring og harde fysiologiske forhold. Mangler noen viral genetiske elementer, er effektiv, høy avkastning produksjon oppnådd gjennom baculovirus uttrykk i insekt celler. På grunn av deres proteolytisk stabilitet, er selv montert HEVNPs utdraget og renset fra cellen nedbryting, vesentlig reduserer nødvendige rensing trinnene. HEVNPs har i tillegg en overflate eksponert protrusion domene (P domene) via et fleksibelt hengsel til en stabil icosahedral base. P domenet danner overflaten-eksponerte toppene på icosahedral base mens fleksibel hengslene gjør det mulig å betydelig endre P domenet uten at base icosahedral strukturen. Med 60 gjentatte enheter, enkelt områdespesifikke endring resulterer i 60 symmetrisk nettsteder for kjemiske modulering. Nylig vi foreslått en nano-plattform med HEVNP som kan kjemisk bøy ligander eller små molekyler for theranostic programmer. Dette ble oppnådd ved å erstatte en enkelt aminosyre med cystein protrusion domenet av HEV-VLP som en reaksjon med maleimide-tilknyttet peptider eller molekyler. Basert på tidligere strukturelle analyser av HEV-VLP og godt studert immunogenic epitopes8,9, følgende fem HEV-VLP aminosyrer ble erstattet med cystein som potensielle kandidater: Y485C, T489C, S533C, N573C og T586C ( Figur 1). Etter uttrykk og rensing fra insekt celler, deres VLP formasjoner ble bekreftet av overføring elektronmikroskop (TEM) observasjon (figur 2), og utsatte cystein områdene ble analysert Western blot etter maleimide-tilknyttet biotin Bøyning (figur 2). Blant fem mutanter, HEVNP - 573C vises det sterkeste signalet til maleimide-biotin Bøyning (figur 2) og ble brukt for oppfølging demonstrasjon som nanocarrier for bryst kreftcelle målretting4 (Figur 3).

Denne protokollen viser kjemiske Bøyning metoder for å knytte svulst målretting molekyler til HEVNPs gjennom overflaten cystein Bøyning. Vi detalj Bøyning av svulst målretting og oppdagelsen molekyler for svulst levering med rekombinant HEVNPs som inneholder en cystein på N573 (HEVNP - 573C). Vi fokusert på en klikk kjemi Bøyning prosess å binde en bryst kreft svulst målretting peptid, LXY3010 til HEVNPs form LXY30-HEVNP (Figur 4). Deretter N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 var konjugert til eget Lys-området på HEVNPs å bygge LXY30-HEVNP-Cy5.5 for fluorescerende oppdagelsen både i vitro (figur 5) og i vivo4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. HEVNP produksjon i insekt celler

Merk: Alle følgende trinn skal utføres i celle kultur hette. Se vår tidligere publikasjon for mer detaljert HEVNP produksjon prosedyrer11.

  1. Kultur Sf9 celler i insekt celle media (se Tabell of Materials) til 50-75% samløpet i 6-og plater.
  2. Bruker insekt celle transfection reagenser i henhold til produsentens protokoller, transfect Bacmids som inneholder HEVNP - 573 C ORF2 i Sf99 celler å produsere rekombinant baculovirus. Inkuber transfekterte cellene ved 27 ° C i 3-6 dager, avhengig av levedyktigheten til cellene.
  3. Samle nedbryting på 3-6 dager etter smitte (etter transfekterte cellene er lysed på grunn av baculovirus infeksjon) som P0 baculovirus lager.
  4. Fjerne kultur medium før 200 µL av P0 lager på 50-75% confluent Sf9 celler i en 25 cm2 monolayer kolbe. Rock kolbe hvert 15 min for å sikre full dekning av inoculum. Gjenta 4 ganger, for totalt 60 min.
  5. Legge til 2 mL insekt celle kultur medium kolbe og beholde ved 27 ° C i 3-6 dager, avhengig av levedyktigheten til cellene, å forsterke baculovirus til en høyere titer.
  6. Utføre plakk analyser å få baculovirus titer lesing12.
  7. Kultur suspendert Tn5 insekt celler (Tabell for materiale) med 100 mL insekt celle medium i 250 mL flasken og riste i 27 ° C på 150 rpm til en titer 0.5 x 105 - 1 x 106 for vaksinering.
  8. Legge til baculovirus på et mangfold av infeksjon (MOI) i 5-10 til 100 mL Tn5 celler i en 250 mL kolbe. Etter vaksinasjon, riste i 27 ° C på 150 rpm for 5-7 dager.
  9. Når de fleste cellene synes å ha blemmer og 70-90% av cellene er døde under optisk mikroskop observasjon, samle Tn5 cellene og overføre til 33 mL ultracentrifuge rør. Sted ultracentrifuge rør i svingende bøtte rotorer, balanse og spinn ned celle rusk og rekombinant baculoviruses på 10 000 x g for 90 min på 25 ° C.
  10. Holde nedbryting som inneholder de utgitt HEVNPs på 4 ° C for videre rensing. For langvarig oppbevaring av baculovirus supernatant, legge proteasehemmere.

2. HEVNP rensing

  1. Pellets og isolere HEVNPs bruker cesium chloride (CsCl) gradient separasjon:
    1. Overføre samlet nedbryting (fra trinn 1,10) og legge til 20% NP-40 til hver rør å gjøre en siste konsentrasjon på 0,5% NP-40 å oppløse alle gjenværende mobilnettet membran. Forsiktig blanding av pipettering og Inkuber i minst 30 min på 25 ° C.
    2. Ultracentrifuge HEVNPs 112,400 x g i svingende bøtte rotorene for 2t 4 ° c til pellets ned HEVNPs fra nedbryting. Kaste nedbryting etter sentrifugering og forsiktig å avbryte den rå pellet 200 µL av 10 mM MES buffer pH 6.2 i hver rør over natten (O/N) på 4 ° C. Kjør SDS-siden (trinn 3.1) for å bekrefte tilstedeværelse av HEVNP ORF2 i rå pellet som en 52 kDa.
    3. Forberede 38,5% (w/v) CsCl gradering av blanding 1.96 g CsCl, nytt suspendert rå pellet og ~ 4 mL 0,01 M MES pH 6.2 i en 5 mL ultracentrifuge tube. Balansere rør og plasser i en svingende bøtte rotor. Ultracentrifuge 147,000 x g 16 h på 4 ° C.
  2. Samle fraksjoner etter CsCl gradering:
    1. Kast de topp 500 µL brøken, som er hovedsakelig lett cellemembranen rusk. Samle 500 µL fraksjoner, fra toppen av røret, og endre tips mellom hver fraksjon. Plass hver fraksjon i nummererte/merket 1,5 mL rør.
      Merk: Tilstedeværelsen av HEVNP ORF2 i fraksjoner atskilt fra CsCl graderingen ikke finner kjører SDS gels på grunn av den høye konsentrasjonen av CsCl. CsCl i hver fraksjon kan fjernet eller utvannet av fremgangsmåten en CsCl-opprydding. Eventuelt kan CsCl graderingen erstattes av en 10-40% sukrose gradient13 å unngå CsCl rester.
    2. Overføre hver fraksjon til et 5 mL ultracentrifuge rør og fortynne CsCl med 4,5 mL 10 mM MES, pH 6.2. Balansere rør og plasser i en svingende bøtte rotor. Ultracentrifuge 147,000 x g for 2t 4 ° c til pellets ned til HEVNPs.
    3. Forkast nedbryting og forsiktig å avbryte HEVNPs 100 µL av 10 mM MES pH 6.2 i hver retning. Dekke rør for å unngå fordampning og ruge O/N på 4 ° C.
    4. Registrere A280 lese- og A260/A280 nm forholdet med et spektrofotometer. Bestemme omtrentlig konsentrasjonen av ORF2 som:
      Equation
      Hver ORF2 inneholder 1 Cys og 1 Lys område for kjemiske Bøyning.
      Merk: Molar utryddelse koeffisient av HEVNP ORF2 er 60,280, noe som tilsvarer 1.019 mg/mL × A280. Dette er så nær 1:1 at konsentrasjonen av HEVNPs (i mg/mL) kan tilnærmes ved A280, og derfor konsentrasjonen av ORF2 av ovenstående ligningen. For eksempel en HEVNP med en A280 lesing 1 har en konsentrasjon av 1 mg/mL, som tilsvarer 18.8 µM ORF2.
    5. Forberede en SDS-side. Bruk et 6 µL utvalg av hver fraksjon for å bestemme fraksjoner som inneholder 53.3 kDa HEVNP ORF2 protein (trinn 3.1). HEVNPs bør finnes i fraksjoner 3-5, med en tetthet av ~1.25 g/mL.
    6. Bekrefte tilstedeværelse og renhet av HEVNPs av TEM observasjon. Klargjøre eller fortynne HEVNP prøvene til 0,5 - 2,0 mg/mL til TEM. I HEVNPs vises som Tom icosahedral proteiner, ~ 27 i TEM nm i diameter (figur 2). Noen protein miljøgifter kan forbli i fraksjoner og vil bli observert under TEM (trinn 3.2).
  3. I tilfelle at urenheter finnes under TEM, gjentar du trinn 2.1.3 - 2.2.6 for bedre renhet av HEVNPs.
    Merk: Ekstra rensing gjennom CsCl gradert kan forårsake yield tap av HEVNPs. Eventuelt kan CsCl gradient rensing erstattes av en 10-40% sukrose gradering å unngå gjenværende CsCl13.

3. HEVNP karakteristikk

  1. Forbered SDS side 4-12% Bis-Tris Protein geleer, 1.0 mm, 17-wells (se Tabell for materiale) i henhold til brukerens manuell14:
    1. Legg 2 µL av 4 x lasting 6 µL av protein prøve-buffer. Inkuber eksempel blandingen i en varme blokk i 10 minutter ved 100 ° C til denature protein. Last protein prøvene på gel.
    2. Kjøre SDS-siden ved å angi DC strømforsyning på 100 V i 10 minutter, deretter 150 V for 45 min til prøvene løpe til ca 1 cm over bunnen av gel.
    3. Flekken SDS siden gel med Coomassie blå (0,25% (w/v) Coomassie briljant blå R250, 30% (v/v) metanol, 10% (v/v) eddiksyre), 1t.
    4. Etter farging prosedyren, fjerne Coomassie blå flekken og bruke de flekker buffer (30% (v/v) metanol, 10% (v/v) eddiksyre) på protein gel for > 12t ved romtemperatur.
    5. Dokumentere gel under hvitt lys å påvise HEVNP ORF2 på 52 kDa bandet.
  2. Observere HEVNPs bruker TEM.
    1. Klargjøre eller fortynne HEVNP prøvene til 0,5 - 2 mg/mL med 10 mM MES pH 6.2 for TEM bildebehandling.
    2. Ionisere karbon-belagt rutenettet med 40 mA glød utslipp for 30 å produsere en hydrofile karbon overflate. Glød utslipp utstyret er beskrevet i Tabellen for materiale.
      Merk: Hydrofile karbon overflaten av rutenettet kan bare vare for 30 min etter glød utslipp behandling.
    3. Holde i pinsett og legge 2 µL av HEVNP prøve i rutenettet, vente 15-30 s og blot med filter papir.
    4. Vask straks rutenettet med ddH20 og blot med filter papir.
    5. Umiddelbart legge 2 µL av 2% uranyl acetate til rutenettet, vente 15 s, da blott med filter papir. Tørr eksempelliste nett ved å plassere dem i en elektronisk dehumidify tørr kabinett for O/N.
    6. Overføre rutenettet i en TEM og bilde på 10-80k forstørrelse. HEVNPs vises i TEM som Tom icosahedral proteiner som er ~ 27 nm diameter av viral RNA.

4. kjemisk Bøyning av HEVNPs med Biotin, kreft målretting Ligand og Fluorophores

  1. Utføre en trinn Bøyning av HEVNPs og maleimide koblet biotin.
    1. Bufre endring: bruke HEVNPs i mini dialyse enheter og dialyze mot 0,01 M PBS pH 7.4 ved romtemperatur 1t etter produsentens protokollen (Tabell for materiale). Overføre til HEVNPs til 1,5 mL rør og måle protein konsentrasjonen på 280 nm bruker et spektrofotometer.
    2. Bland HEVNP til 1 mg/mL, som tilsvarer 18.8 µM Cys reaksjon nettsteder (se detaljer i trinn 2.2.4), med en lik mengde maleimide-biotin (100 µM) i 0.01 M PBS, pH 7.4, å gjøre en 1:5 molar forhold; reagere O/N på 4 ° C. Fjerne ubundet maleimide-biotin med en 40 K MWCO Spin Desalting kolonnen prosedyre i henhold til produsentens protokollen (Tabell for materiale).
    3. Analysere prøver gjennom en standard reduserer SDS-side (trinn 3.1).
    4. Bruker standard prosedyrer, forberede en chemiluminescent Western Blot bruke HRP-tilknyttet Streptavidin. Fange chemiluminescent signalet av røntgen (figur 2).
  2. Utføre to trinn LXY30 Bøyning til overflaten-eksponerte cystein på HEV NPs (figur 5).
    1. Bufre exchange: bruke HEVNPs i mini dialyse enheter og dialyze mot 0,01 M PBS pH 7.4 ved romtemperatur for 1 h. overføring av HEVNPs til 1,5 mL rør og måle protein konsentrasjonen på 280 nm bruker et spektrofotometer.
    2. Legge til 650 µM maleimide-azide og 650 µM alkyne-LXY3010 i 0.01 M PBS pH 7.4 med 200 µM CuSO4 og 1 mM askorbinsyre til maleimide-koblede LXY30 (Mal-LXY30) på 650 µM. ruge blandingen på 4 ° C for O/N.
    3. Bland HEVNP til 1 mg/mL, som tilsvarer 18.8 µM Cys reaksjon området (se detaljer i trinn 2.2.4), med ca 10% volumet av Mal-LXY30 (650 µM) i 0.01 M PBS pH 7.4, å gjøre en 1:3 molar forholdet; reagere O/N på 4 ° C.
      Merk: På grunn av den relativt høye konsentrasjonen av Mal-LXY30, er de endelige konsentrasjonene av reaktantene, for eksempel CuSO4, redusert omtrent 10 ganger etter blanding, for å unngå deres skade HEVNPs. Et annet alternativ er Cu-fri Bøyning metoden15.
    4. Fjern ubundet maleimide-Klikk-LXY30 40 K MWCO Spin avsalte kolonnen i henhold til produsentens protokollen (se Tabell for materiale). Holde de koblede LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNPs) på 4 ° C.
  3. Utføre en trinn Bøyning av LXY30-HEVNPs og Cy5.5 NHS ester (NHS-Cy5.5)
    1. Bland de koblede LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNPs) til 1 mg/mL, som tilsvarer 18.8 µM av Cys reaksjon området (se detaljer i trinn 2.2.4), med samme volum på NHS-Cy5.5 (100 µM) i 0.01 M PBS pH 7.4 å gjøre en 1:5 molar forhold; reagere O/N på 4 ° C.
    2. Fjern ubundet Cy5.5-NHS med en 40K MWCO Spin avsalte kolonnen prosedyre i henhold til produsentens protokollen (se Tabell for materiale). Holde LXY30, Cy5.5-koblede HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) på 4 ° C.

5. HEVNP Binding til og internalisering i MDA-MB231 brystkreft celler

  1. Frø MDA-MB231 brystkreft celler i en 35 mm glass bunn retter (5 x 104 per fat) O/N i et pattedyr cellekultur kabinett.
  2. For cellen bindende eksperimentet, forberede LXY30-HEVNP-Cy5.5 av følgende trinn 4.2-4.3. Fortynne den LXY30-HEVNP-Cy5.5 til 0,01 mg/mL, som tilsvarer 0.188 µM av HEVNP ORF2 (se trinn 2.2.4), i 250 µL av 0 - 1% FBS/DMEM.
    1. Forberede negativ kontroll prøven på 0,01 mg/mL HEVNP-Cy5.5 ved å følge trinn 4,3 men konjugert med NHS-Cy5.5 fargestoff, (HEV-Cy5.5). Fortynn HEVNP-Cy5.5 til 0,01 mg/mL, som tilsvarer 0.188 µM av HEVNP ORF2 (se trinn 2.2.4), i 250 µL av 10% FBS supplert med DMEM.
  3. Vask cellene gang ved å bruke 250 µL av 1 M PBS buffer, pH 7.4. Fjerne PBS bufferen etter vask, mens noen buffer i celle kultur parabolen.
  4. Bruke 250 µL av LXY30-HEVNP-Cy5.5 i 10% FBS supplert med DMEM eller HEVNP-Cy5.5 i 10% FBS supplert med DMEM til de kultiverte MDA-MB231 brystkreft cellene. Skjerme cellen kultivert retter fra lys med aluminiumsfolie.
  5. Holde celle kultivert retter i en 37 ° C cellekultur CAB 1t for internalisering.
  6. Vask kulturperler cellene på is 3 ganger, 5 minutter per vask, med 250 µL av 1 M PBS, pH 7.4.
  7. Fastsette cellene i 4% PFA i 1 M PBS, pH 7.4 for 20 min og deretter vask en gang med 250 µL av 1 M PBS, pH 7.4.
    Merk: Cellene er nå klar til å avbildes av AC confocal mikroskop. Representant data er vist i figur 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som HEV-VLPs, alle Cys endret HEVNPs dannet løselig icosahedral capsids og samlet ikke i løsningen under produksjon eller rensing. Før og etter enkeltsteg maleimide-biotin Bøyning, hver av Cys endret ble HEVNPs utvisket fra HEV-VLPs i negativ flekken EM (figur 2). Maleimide-biotin Bøyning effektivitet Cys modifisert HEVNPs ble først testet med vestlige blotting via chemiluminescent streptavidin binding. Etter maleimide-biotin Bøyning endret Cys HEVNPs vises streptavidin binding signaler (figur 2).

Effektiv totrinns cystein Bøyning var påvirket av ordren hvor Bøyning ble utført. Fordi α3β1 integrin er være overexpressed i bryst kreft kreftceller, en syntetisk ligand, LXY30, med spesifikk affinitet til α3β1 ble10, valgt som en svulst målretting konjugat molekylet. Direkte maleimide (MaI) functionalization av LXY30 var ikke mulig fordi LXY30 er cyclized gjennom en intermolekylære disulfide obligasjon; Derfor var det en bekymring for self-reactivity. I stedet ble LXY30 functionalized med en alkyne gruppe og bundet til maleimide-azide gjennom et klikk kjemi reaksjon. Når HEV - 573C NPs var bundet til maleimide-azide først, syntes etterfulgt av en klikk kjemi reaksjon på LXY30-alkyne, HEV - 573C NPs å demontere under TEM observasjon (figur 4C). Men påvirke en første Klikk kjemi reaksjon mellom LXY30-alkyne og maleimide-azide på skjemaet MaI-LXY30, etterfulgt av MaI-LXY30 Bøyning til Cys modifisert HEVNPs (LXY30-Mal-Cy5.5) ikke strukturen (figur 4B). Figur 4 viser en skjematisk av LXY30-functionalization av HEVNPs for svulst celle målretting.

HEVNPs konjugert til brystkreft målretting ligand, LXY30 (LXY30-HEVNPs) bundet og ble internalisert i kulturperler brystkreft celler. For fluorescerende oppdagelsen, LXY30-HEVNPs og ubundet HEVNP-573Cs ble merket med NHS functionalized Cy5.5 fluorescerende farge (NHS-Cy5.5) gjennom primære Amin koblingen av lysin på HEVNP-573Cs. LXY30-HEVNP-Cy5.5 og HEVNP-Cy5.5 ble brukt til kulturperler brystkreft celler (MDA-MB-231) og observert av AC confocal mikroskopi. NIR fluorescens bildene av AC confocal mikroskop angir LXY30-HEVNP-Cy5.5 fikk høyere bindende affinitet for og økt internalisering i MDA-MB-231 brystkreft celler sammenlignet med HEVNP-Cy5.5 (figur 5).

Figure 1
Figur 1: cystein erstatning på overflaten protrusion domenet av hepatitt E virus hydrogenion. Cystein mutasjoner ble foreslått for rester Y485, T489, S533, N573 og T586 i regionen fleksibel coil å minimere inngrepene sekundære strukturen av HEV ORF2 (A). Alle valgte rester for cystein mutasjon finnes på overflaten av protrusion (P) domenet (grå, andre er skallet (S) - domene i blått og midten (M) - domenet i rosa), med rester Y485 (cyan), T489 (gul), T586 (oransje) på det ytterste overflaten, og rester S533 (magenta) og N573 (rød) på side mot fem ganger aksen av HEVNP (B). Figuren er endret fra Chen et al. 20164 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: karakterisering av HEVNP bærer N573C som et eksempel for alle Cys endret HEVNPs. HEVNP - 573C som sfærisk anslag på elektron micrographs (A) og forble intakt partikler etter Mal-biotinylating Bøyning (B). Representant resultatene av bøyning og epitope eksponering av Cys endret HEVNPs. De var bundet til maleimide-biotin via cystein-maleimide kobling og deretter assayed gjennom Western blot for streptavidin binding. Cystein mutasjon på N573 tillatt effektiv biotinylation til HEVNP sammenlignet med de andre mutasjon steder, dvs., Y485, T489, S533 og T586 (C). Bar er lik 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: skjematisk av brystkreft celler som er spesielt målrettet med Cy5.5-merket LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5). LXY30-HEVNP-Cy5.5 binde selektivt til brystkreft celler (rosa) på grunn av LXY30's spesifikk affinitet til α3β1, som er en over uttrykt integrin på bryst kreft cellemembranen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: en skjematisk raskt kjemiske Bøyning prosesser, inkludert en thiol-selektiv reaksjon og kobber catalyzed azide-alkyne cycloaddition eller "Klikk kjemi" reaksjon å bygge LXY30-HEVNPs. To metoder har blitt testet. Metode 1: kobber catalyzed azide-alkyne cycloaddition reaksjonen Mal-azide og alkyne-LXY30 skjema Mal-koblede LXY30 (Mal-LXY30) ble utført først. Deretter ble Mal-LXY30 lagt til reagere med Cys området av HEV - 573C NPs (A). LXY30 og Cy5.5 innredet HEV - 573C NPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) forble intakt etter alle disse kjemiske Bøyning prosesser (B). Metode 2: Bøyning prosessen begynner ved merking Mal-koblede azide (Mal-Azide) på Cys stedet av HEV - 573C NPs gjennom en thiol-selektiv reaksjon å bygge azide-koblede HEVNPs (Azide-HEVNPs), etterfulgt av å legge LXY30-alkyne, askorbinsyre og CuSO4 til LXY30-koblede HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (A). Men var de fleste LXY30-HEVNPs skadet eller demontert fra Bøyning prosesser, som skyldes de reaktive reagensene, inkludert azide, askorbinsyre og CuSO4 (C). Mal: Maleimide. Dette tallet er endret fra Chen et al. 20164 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representant resultatene av cellen bindende og internalization fluorescently merket LXY30-HEVNPs, som binder seg til MDA-MB-231 brystkreft celler. NIR fluorescens bilder av LXY30-HEVNP-Cy5.5 målretting MDA-MB-231 celler. Signalet av kjerner, som var farget av DAPI (blå), og signalet fra Cy5.5 (rød) ble kjøpt med AC confocal fluorescens mikroskop. Dette tallet er endret fra Chen et al. 20164 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I motsetning til tidkrevende genteknologi prosedyren, som vanligvis tar uker, her vi viser enkel totrinns og ettrinns kjemiske Bøyning prosedyrer, som kan fullføres innen 3 dager, å legge kreft målretting ligand og/eller fluorescens oppdagelsen fargestoff til Cys/Lys nettstedene til HEVNPs. Teknikken kan brukes til skjermen for beste ligand mål fra en pool av kandidater, og dermed drar nytte av tilgjengelige peptid/små molekyl syntese tjenester til en rimelig pris og leveringstider tid.

I motsetning til tradisjonelle genteknologi, som kan bare sette inn polypeptides i proteiner av interesse, den kjemiske Bøyning kan koble ulike materialer inkludert polypeptides, små kjemiske molekyler og nano-partikler på overflaten av den protein av interesse, så lenge det er en Cys eller Lys rester som reaktive området. Hvis det er ingen slike rester på området kjemisk Bøyning, kan enkel Cys/Lys erstatning genetisk endres på protein rundt å gjøre det kjemisk activatable som vist i tidligere forskning4.

Kontrollere at den kjemiske Bøyning bare oppstår på webområdene selektiv reaksjon, strukturen i både konjugat molekylet og protein skal konjugert måtte bli grundig studert for å unngå intramolekylære reaktivitet. Som vist her med brystkreft målretting peptid LXY3010, stabiliserer en kritisk disulfide obligasjon syklisk ligand konformasjon. Gitt thiol-reaktivitet av maleimide, direkte maleimide-functionalization av LXY30 ligander vil sannsynligvis føre til intramolekylære reaktivitet. I stedet ble to trinn Bøyning (trinn 4.2) utført av reagerer den koblede maleimide-azide med alkyne-tilknyttede LXY30 gjennom Klikk kjemi reaksjon. Sekvensen av Klikk kjemi reaksjon og thiol valgt reaksjon er imidlertid avgjørende for den conformational intactness av LXY30-HEVNPs (Figur 4). Gjennom en CuSO4 katalysert Klikk-kjemi reaksjon, var LXY30 indirekte bundet til maleimide å bygge MaI-LXY30. Deretter er MaI-LXY30 konjugert til HEVNP - 573C slik at de dannet LXY30-HEVNPs kan beholde sin opprinnelige icosahedral struktur (Figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne bekrefter sponsing av midler til RHC ved NIH gi #' s: AI095382, EB021230, CA198880, National Institute of mat og landbruk, i tillegg til Finland Distinguished Professor programmet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO Thermo Fisher Scientific 69572 mini dialysis unit
High Five Cells Thermo Fisher Scientific B85502 Tn5 cells
SF9 Cells  Thermo Fisher Scientific 11496015 Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Thermo Fisher Scientific A11101, A11100 Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Life Technologies 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 Bacmid
ESF921 Insect Cell Media Expression Systems LLC 96-001-01 insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg Lumiprobe Corp 27020 Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL Thermo Scientific 87766 spin desalting column
MES Hydrate Sigma-Aldrich Chemical Co M8250-250G MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes Beckman Coulter, Inc Depends on Rotor ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NPO321BOX SDS protein gel
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher Scientific 10362100 transfection reagent
EMS Glow Discharger Electron Microscopy Science glow discharger

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
  2. Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
  3. Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
  4. Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
  5. Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
  6. Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
  7. Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
  8. Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
  9. Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
  10. Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
  11. Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
  12. Technologies, I. bL. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System: User Manual. , Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf (2015).
  13. Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
  14. Technologies, N. bL. Vol. MAN0007891 1-2. , Life Technologies. (2013).
  15. Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).

Tags

Bioteknologi problemet 135 cystein erstatning kjemiske Bøyning hepatitt E virus-lignende partikler multivalent ligand display målretting ligand
Overflate Functionalization av hepatitt E Virus nanopartikler bruke kjemiske Bøyning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli,… More

Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli, M., Cheng, R. H. Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods. J. Vis. Exp. (135), e57020, doi:10.3791/57020 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter