Summary
우리 theranostic 나노 (HEVNP)으로 간염 E 바이러스 capsid 단백질을 설계 했습니다. HEVNP 자동으로 안정 된 icosahedral 점 막 배달에 조립. 여기, 시스테인, 특히 종양 세포를 묶는 합성 ligands 켤레를 표면 노출 잔류물을 변경 하 여 대상으로 하는 종양에 대 한 HEVNPs의 수정을 설명 합니다.
Abstract
바이러스 같은 입자 (VLPs) 외국 epitopes를 표시 및/또는 검색 및 다양 한 질병의 치료에 작은 분자를 제공 nanocarriers로 사용 되었습니다. 이 응용 프로그램 자기 조립, 유전 수정에 의존 하 고 재조합 VLPs. 종양을 대상으로 하는 응용 프로그램을 수행 하기 위해 시스테인 활용 유전자와 비교 제공 하는 VLPs에 외국 펩 티 드의 수정 혼자, 화학 활용 한 중요 한 다양 한 엔터티, 합성 펩 티 드 등 oligosaccharides, VLP 어셈블리의 변경 없이 변조 하 고 유연한 방식으로 VLPs의 표면에 활용 될 수 있기 때문에 이점.
여기, 다기능 배달 캐리어로 간염 E 바이러스 나노 (HEVNP), 모듈화 된 theranostic 캡슐을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. HEVNPs의 기능 조직 대상으로, 이미징, 및 치료 배달 포함 됩니다. HEVNP의 잘 설립 구조 연구에 따라, 구조적으로 독립적이 고 표면 노출 잔류물 thiol 선택적 연계를 통해 화학 그룹 maleimide 연결에 대 한 활용 사이트 시스테인 교체에 대 한 선정 됐다. 하나의 특정 시스테인 수정 HEVNP (573에 아스파라긴의 Cys 교체 aa (HEVNP-573 C)) 유 방 암 세포 특정 리간드, LXY30에 활용 되었고, 근처-적외선 (NIR) 형광 염료 (Cy5.5), 종양 대상 렌더링으로 표시 효과적인 진단 캡슐 (LXY30-HEVNP-Cy5.5)로 HEVNPs. 비슷한 엔지니어링 전략 theranostic 배달에 잠재적인 응용 프로그램을 탐험 잘 알려진 원자 구조와 다른 고분자 단지와 함께 사용할 수 있습니다.
Introduction
치료 및 진단 배달, nanotheranostics로 알려진에 나노 크기의 벡터의 개발 타겟된 배달1쪽으로 일반적인된 치료에서 생명 의학 분야의 대부분을 이동 했다. 안정적으로 특정 병에 걸리는 직물 또는 생 화 확 적인 통로2,3,4 theranostic 분자를 직접 theranostic 분자와 나노 크기의 벡터 (나노)를 통합 하는 타겟된 nanotheranostic 납품 . 때문에 최적으로 크기의 나노 입자 theranostic 분자의 순환을 안정 한 선택적으로 세포 표면 분자 병 조직에 용량 Nanomedicine 타겟된 배달의 최전선에 왔다. 많은 nanotheranostic 플랫폼은 여전히 수동 셀 이해, 사전 성숙한 저하, 독성, 그리고 theranostic 분자와 부족 한 협회에서 고통. VLPs 많은 타겟된 배달에 이러한 장애물을 극복. 그들은 외국 epitopes를 표시 및/또는 작은 분자를 제공 nanocarriers로 사용 되었습니다: 처방 많은 질병1전투 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 응용 프로그램의 속성에 주로 의존 자기 집합의 주어진된 VLP에 대 한 설계 된 응용 프로그램을 수행 하기 위해 유전 수정 용이성 뿐만 아니라. 유전 공학에 비해, VLP에 외국 펩 티 드의 화학 활용 표시 됩니다 중요 한 이점은 다양 한 엔터티, 펩 티 드 등 oligosaccharides, VLPs의 표면에 변조 활용을 허용 하기 때문에 고 VLP 어셈블리의 변경 없이 유연한 방식으로.
HEVNPs, 재조합 형 HEV capsid 단백질, 2nd 오픈에서 파생 된 프레임 (ORF2)를 읽고, 비 전염 성, 자기 조립 capsids 셀 바인딩 및 입장 가능. HEV 점 막 전송에 대 한 진화, 때문에 조립된 capsid 단백질 분해와 산 성 점 막 조건5마찬가지로 안정적입니다. HEVNPs 양식 빈, T = 1 icosahedral capsid, 60 동일한 단위6,7 ORF2의 구성 된 렌더링 매우 안정적인 스토리지 및 가혹한 생리 적인 조건에서. 어떤 바이러스 성 유전자 요소 부족, 효율, 높은 수율 생산 곤충 세포에서 잠재 식 시스템을 통해 이루어집니다. 그들의 분해 안정성 때문에 자기 조립된 HEVNPs 추출 하 고 실질적으로 필요한 정화 단계를 줄여 셀 상쾌한에서 정화. 또한, HEVNPs는 표면 노출된 돌출 도메인 (P) 안정적인 icosahedral 기반에 유연한 힌지 (hinge)를 통해 연결 된 소유. 유연한 힌지는 크게 기본 icosahedral 구조를 타협 하지 않고 P 도메인을 수정 가능 하 게 하는 동안 P 도메인 icosahedral 기지 꼭대기 표면 노출 스파이크를 형성 한다. 60 반복 단위, 단일 사이트 수정 화학 변조 60 대칭 사이트에서 발생합니다. 최근에, 우리는 나노 플랫폼 제안 ligands 또는 theranostic 응용 프로그램에 대 한 작은 분자 화학적 켤레 수 HEVNP를 사용 하 여. 이 maleimide에 연결 된 펩 티 드 또는 분자 반응 사이트로 단일 아미노산 시스테인 HEV VLP의 돌출 도메인에 대체 하 여 달성 되었다. HEV VLP 고 잘 공부 면역성 epitopes8,9의 이전 구조 분석을 바탕으로, 다음 5 HEV VLP 아미노산 잠재적인 후보자로 시스테인으로 교환 되었다: Y485C, T489C, S533C, N573C, 및 T586C ( 그림 1). 식 곤충 세포에서 정화 후에, 그들의 VLP 대형 전송 전자 현미경 (TEM) 관찰 (그림 2)에 의해 확인 되었다 고 노출된 시스테인 사이트 서쪽에 의해 분석 되었다 maleimide 연결 biotin 후 오 점 활용 (그림 2)입니다. 5 명의 돌연변이 중 C HEVNP-573 maleimide biotin 활용 (그림 2)의 강한 신호를 표시 하 고 후속4 (그림 3)를 대상으로 유 방 암 세포에 대 한 nanocarrier로 데모를 위해 사용 되었다.
이 프로토콜은 표면 시스테인 활용을 통해 종양을 대상으로 분자 HEVNPs에 연결할 화학 활용 방법을 묘사 한다. 우리 N573에 시스테인을 포함 하는 재조합 HEVNPs와 종양 대상 및 검출 분자 종양 배달의 활용을 자세히 (HEVNP-573 C). 우리는 펩 티 드, LXY3010 HEVNPs 양식 LXY30-HEVNP (그림 4)를 대상으로 유 방 암 종양을 바인딩할 2 단계 클릭 화학 활용 과정에 집중 했다. 그 후, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 HEVNPs LXY30-HEVNP-Cy5.5 형광 탐지를 위한 모두 구축 생체 외에서 (그림 5)에 별도 리스 사이트에 활용 했다 고 vivo에서4.
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Protocol
1. HEVNP 곤충 세포에서 생산
참고: 다음 단계를 모두 셀 문화 후드에서 수행 되어야 합니다. 더 자세한 HEVNP 생산 절차11에 대 한 우리의 이전 게시를 참조 하십시오.
- 곤충 세포 미디어 ( 재료의 표참조) 50-75% 합류 6 잘 플레이트에서 Sf9 셀 문화.
- 곤충 세포 transfection 시 약 제조업체의 프로토콜에 따라 사용 하 여, transfect 재조합 잠재 생산 HEVNP-573 C ORF2 Sf99 셀에 포함 된 Bacmids. 세포의 생존 능력에 따라 3-6 일 동안 27 ° C에서 transfected 세포를 품 어.
- P0 잠재 주식으로 감염 된 후 3-6 일에 상쾌한 (후 transfected 세포는 잠재 감염 lysed)를 수집 합니다.
- 50-75% confluent Sf9 셀 25 cm2 단층 플라스 크에 P0 재고의 200 µ L를 적용 하기 전에 문화 매체를 제거 합니다. inoculum의 전체 범위를 보장 하기 위해 플라스 크 매 15 분을 바위. 60 분 총 4 회를 반복 한다.
- 플라스 크에 곤충 세포 배양 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 증폭 높은 titer에 잠재 하는 세포의 생존 능력에 따라 3-6 일, 27 ° C에서 유지.
- 읽기12잠재 titer를 패 분석 실험을 실시 합니다.
- 250 mL 플라스 크에 곤충 세포 매체의 100 mL와 함께 정지 Tn5 곤충 세포 (자료 테이블) 문화 및 0.5 x 10의 titer 150 rpm에서 27 ° C에서 흔들어5 -1 x 106 접종에 대 한.
- 250 mL 플라스 크에 5-10 ~ 100 mL Tn5 셀의 잠재 감염 (MOI)의 다양성에 추가 합니다. 접종, 후 5-7 일 동안 150 rpm에서 27 ° C에서 흔들어.
- 일단 대부분 셀 소포를 나타나고 셀의 70-90%는 광학 현미경 관찰에서 죽은, Tn5 세포를 수집 하 고 33 mL ultracentrifuge 튜브로 전송. 장소는 ultracentrifuge 25 ° c.에 90 분 10000 x g에서 양동이 터, 균형, 그리고 세포 파편과 재조합 baculoviruses 아래로 회전 스윙에 관
- 더 정화 4 ° C에서 출시 된 HEVNPs를 포함 하는 상쾌한을 유지. 표면에 뜨는 잠재의 확장된 스토리지에 대 한 protease 억제제를 추가 합니다.
2. HEVNP 정화
- 펠 렛 및 세 슘 염화 물 (CsCl) 그라데이션 분리를 사용 하 여 HEVNPs를 분리:
- (1.10 단계)에서 수집 된 상쾌한을 전송 하 고 20% 추가 0.5%의 최종 농도 만들기 위해 각 관으로 NP-40 모든 나머지 세포 막 분해 NP-40. 부드럽게 pipetting으로 혼합 및 25 ° c.에 적어도 30 분 동안 품 어
- Ultracentrifuge는 상쾌한에서 HEVNPs 아래로 작은 하 4 ° C에서 2 시간에 대 한 양동이 터 스윙에 112,400 x g에서 HEVNPs. 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 하 고 부드럽게 200 µ L 10 mM MES 버퍼 pH 6.2 하룻밤 각 튜브의 (O/N) 4 ° c.에에서 다시 원유 펠 릿을 일시 중단 SDS 페이지 (3.1 단계) 52 kDa 밴드로 원유 펠 릿에 HEVNP ORF2의 존재 확인을 실행 합니다.
- 혼합 1.96 g CsCl 38.5% (w/v) CsCl 그라데이션, 다시 일시 중단 된 원유 펠 릿과 5 mL ultracentrifuge 튜브에 0.01 M MES pH 6.2 ~ 4 mL를 준비 합니다. 튜브를 균형과 진동 물통 회전자에 놓습니다. 4 ° c.에 16 h x g 147,000 ultracentrifuge
- CsCl 그라데이션 후 분수를 수집:
- 최고 500 µ L 분수는 주로 경량 세포 막 파편을 삭제 합니다. 튜브의 상단에서 시작 하는 500 µ L 분수를 수집 하 고 각 분수 사이 팁을 변경. 번호 표시 1.5 mL 튜브에 각 분수를 놓습니다.
참고: 존재의 HEVNP ORF2 분수 CsCl 그라데이션 젤 CsCl의 높은 농도 때문에 SDS 페이지를 실행 하 여 검출 될 수 없다에서 분리에. 각 분수에서 CsCl 제거 하거나 CsCl 정리 절차에 따라 희석 될 수 있습니다. 또는, CsCl 그라디언트는 10-40% 자당 그라데이션13 CsCl 잔류 방지를 교체할 수 있습니다. - 5 mL ultracentrifuge 관에 각 분수를 전송 및 10mm MES, pH 6.2 4.5 mL와 CsCl 희석. 튜브를 균형과 진동 물통 회전자에 놓습니다. Ultracentrifuge는 HEVNPs 아래 작은 하 4 ° C에서 2 h 147,000 x g에서.
- 삭제는 상쾌한 고 부드럽게 다시 각 관에서 10 mM MES pH 6.2의 100 µ L에는 HEVNPs를 일시 중단. 증발을 방지 하 고 O/N 4 ° c.에 품 어 튜브 커버
- A280 읽기 및 A260/A280 nm 비율을 분 광 광도 계를 사용 하 여 기록 합니다. 로 ORF2의 대략적인 농도를 결정 합니다.
각 ORF2 1 Cys 사이트 및 화학 활용에 대 한 1 리스 사이트 포함 됩니다.
참고: HEVNP ORF2의 어 금 니 소멸 계수는 60,280, 1.019 mg/mL × A280에 해당. 이것이 정말 1: 1에 가까운 HEVNPs의 농도 (mg/mL)에서 A280, 그리고 그러므로, 위의 방정식으로 ORF2의 농도 의해 접근 될 수 있는. 예를 들어 1 A280 읽기와 HEVNP의 18.8 µ M에 1 mg/mL 농도 해야한다 ORF2. - SDS 페이지를 준비 합니다. 각 부분에서 6 µ L 샘플을 사용 하 여 53.3 HEVNP ORF2 kDa 단백질 (3.1 단계)를 포함 하는 분수 결정. HEVNPs ~1.25 g/mL의 조밀도 가진 3-5, 분수에서 찾을 수 합니다.
- 존재와 가장 관찰에 의해 HEVNPs의 순도 확인 합니다. 준비 또는 0.5-2.0 mg/mL 가장에 대 한 HEVNP 샘플을 희석. HEVNPs 가장 빈 icosahedral 단백질, ~ 27로 표시 nm 직경 (그림 2). 일부 단백질 오염 물질 분수에 남아 있을 수 있습니다 그리고 가장 (3.2 단계)에서 관찰 될 것 이다.
- 최고 500 µ L 분수는 주로 경량 세포 막 파편을 삭제 합니다. 튜브의 상단에서 시작 하는 500 µ L 분수를 수집 하 고 각 분수 사이 팁을 변경. 번호 표시 1.5 mL 튜브에 각 분수를 놓습니다.
- 가장 아래 불순물 있는지 경우에 단계 2.1.3-2.2.6는 HEVNPs의 더 나은 순수성에 대 한 반복 합니다.
참고: 추가 정화 CsCl 그라디언트를 통해 HEVNPs의 수확량 손실을 발생할 수 있습니다. 또는, CsCl 그라데이션 정화를 피하기 위해 잔여 CsCl1310-40% 자당 그라데이션 하 여 교체할 수 있습니다.
3. HEVNP 특성
- SDS 페이지 4-12% 두번째-트리 스 단백질 젤, 1.0 m m, 17-웰 스 ( 재료의 표참조)에 따라 사용자의 수동14준비:
- 6 µ L의 단백질 견본 버퍼를 로드 x 4의 2 µ L를 추가 합니다. 단백질 변성을 100 ° C에서 10 분 동안 열 블록에 샘플 혼합물을 품 어. 젤에 단백질 샘플을 로드 합니다.
- 100 V 10 분, 45 분 샘플 젤의 바닥 위에 약 1 cm 실행 될 때까지 다음 150 V DC 전원 공급 장치를 설정 하 여 SDS 페이지를 실행 합니다.
- 얼룩 Coomassie 파란 (0.25% (w/v) Coomassie 화려한 블루 R250, 30% (v/v) 메탄올, 10% (v/v) 초 산), 1 시간에 대 한 SDS 페이지 젤.
- 얼룩 절차 후 Coomassie 파란 얼룩을 제거 하 고 적용에 대 한 단백질 젤 드 얼룩 버퍼 (30% (v/v) 메탄올, 10% (v/v) 초 산) > 실 온에서 12 h.
- 52 kDa 밴드에서 HEVNP ORF2의 존재를 확인 하는 하얀 빛 아래에서 젤을 문서화 합니다.
- 가장을 사용 하 여 HEVNPs를 관찰 합니다.
- 준비 또는 0.5-10 m m MES ph 6.2 편 영상 2 mg/mL HEVNP 샘플을 희석.
- 탄소 코팅 그리드 30 40 mA 글로우 방전으로 이온화 친수성 탄소 표면 생산 하는 s. 글로우 방전 장비 재료의 테이블에에서 설명 되어 있습니다.
참고: 격자의 친수성 탄소 표면 수 마지막만 놀 후 30 분 동안 방전 처리. - 족집게에 및 HEVNP 샘플의 2 µ L를 눈금에 추가, 15-30 s 때까지 기다리는 누른 필터 종이 되 리.
- 즉시 씻어 ddH20 그리드와 필터 종이 오.
- 바로 그리드, 대기 15 s, 다음 필터 종이 오 2 %uranyl 아세테이트의 2 µ L를 추가 합니다. 건조는 전자에 의해 샘플 격자 습기 없애십시오 건조 캐비닛을 O/북 아 일에 대 한
- 가장 및 10-80 k 확대 이미지에 그리드를 전송 합니다. HEVNPs ~ 27은 빈 icosahedral 단백질으로 가장에 나타납니다 nm 직경, 바이러스 성 RNA의 부재 때문에.
4. 화학 활용 Biotin, 암 타겟팅 Ligand와 Fluorophores HEVNPs
- HEVNPs 및 maleimide 연결 biotin의 한 단계 활용을 수행 합니다.
- 버퍼링 변경: 미니 투 석 단위에 HEVNPs를 적용 하 고 제조 업체의 프로토콜 (자료 테이블)에 따라 1 시간에 대 한 실 온에서 0.01 M PBS pH 7.4에 대 한 dialyze. 1.5 mL 튜브에는 HEVNPs를 전송 하 고 280에서 단백질 농도 측정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.
- 1 mg/ml, Cys 반응 (단계 2.2.4 세부 정보 참조), 사이트 maleimide-비타민 b 복합체 (100 µ M)에서 0.01 M PBS, pH 7.4, 어 금 니 비율 1:5; 수 있도록 동일한 금액의 18.8 µ M에 HEVNP를 혼합 O/N 4 ° c.에 반응 제조 업체의 프로토콜 (자료 테이블)에 따라 40 K MWCO 스핀 Desalting 열 절차와 언바운드 maleimide biotin을 제거 합니다.
- SDS 페이지 (3.1 단계) 감소 표준 통해 샘플을 분석 합니다.
- 표준 절차를 사용 하 여 한 chemiluminescent 서쪽 오 점 Streptavidin HRP 연결을 사용 하 여 준비 합니다. X 레이 필름 (그림 2)에 의해 chemiluminescent 신호를 캡처.
- HEV NPs (그림 5)에 표면 노출 시스테인을 LXY30 활용 2 단계를 수행 합니다.
- 교환 버퍼: 미니 투 석 단위에 HEVNPs를 적용 하 고 1 h. 1.5 mL 튜브에는 HEVNPs 전송에 대 한 실 온에서 0.01 M PBS pH 7.4에 대 한 dialyze 280에서 단백질 농도 측정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.
- 200 µ M CuSO4 와 1mm ascorbic 산 maleimide에 연결 된 LXY30를 0.01 M PBS pH 7.4에에서 650 µ M maleimide-아 지 드와 650 µ M alkyne LXY3010 추가 (말-LXY30) 650 µ M. O/북 아 일에 대 한 4 ° C에 혼합물을 품 어
- 1 mg/ml, Cys 반응 사이트의 18.8 µ M에 HEVNP 혼합 (단계 2.2.4 세부 정보 참조), 약 10% 말 LXY30의 볼륨 (650 µ M) 0.01 M PBS ph 7.4, 어 금 니 비율 1:3; 수 있도록 O/N 4 ° c.에 반응
참고: 말-LXY30의 상대적으로 높은 농도 때문 CuSO4, 같은 반응의 최종 농도 HEVNPs 그들의 손상을 방지 하려면 혼합 후 약 10 배를 감소 된다. 또 다른 옵션은 Cu 무료 활용 방법15. - 제거 언바운드 maleimide-클릭-LXY30 제조 업체의 프로토콜에 따라 40 K MWCO 스핀 담 열 ( 재료의 표참조). 4 ° c.에 LXY30 연결 HEVNPs (LXY30-HEVNPs)를 유지
- LXY30-HEVNPs 및 에스테 르 Cy5.5 보 건국 (NHS-Cy5.5)의 한 단계 활용 수행
- 1 mg/ml, Cys 반응 사이트의 18.8 µ M에 LXY30 연결 HEVNPs (LXY30-HEVNPs)을 혼합 (단계 2.2.4 세부 정보 참조), 보 건국 Cy5.5의 동등한 양으로 (100 µ M) 0.01 M PBS ph 7.4 1:5 어 금 니 비율; O/N 4 ° c.에 반응
- 제거는 제조 업체의 프로토콜에 따라 40 K MWCO 스핀 담 열 절차 Cy5.5 NHS 언바운드 ( 재료의 표참조). LXY30, HEVNPs Cy5.5 연결을 4 ° c.에 (LXY30-HEVNP-Cy5.5) 유지
5. HEVNP에 바인딩 및 MDA MB231 유방암 세포에 국제화
- 시드 MDA MB231 유방암 세포는 35 m m 유리로 요리 (5 x 104 접시 당) 바닥 캐비닛 포유류 세포 배양에 O/N.
- 셀 바인딩 실험에 대 한 다음 단계 4.2-4.3에 의해 LXY30-HEVNP-Cy5.5를 준비 합니다. 0.01 mg/ml, HEVNP ORF2의 0.188 µ M에 LXY30 HEVNP Cy5.5 희석 (2.2.4 단계로 참조), 0-250 µ L에 1 %FBS / DMEM.
- 0.01 mg/mL HEVNP Cy5.5 다음 단계 4.3 하지만 NHS Cy5.5 염료만, (HEV Cy5.5)와 활용에 부정적인 컨트롤 샘플을 준비 합니다. 0.01 mg/ml, HEVNP ORF2의 0.188 µ M에 HEVNP Cy5.5 희석 (2.2.4 단계로 참조), 10%의 250 µ L에서 FBS DMEM 보충.
- 1 M PBS 버퍼, pH 7.4의 250 µ L을 적용 하 여 셀을 한 번 씻어. 세포 배양 접시에 몇 가지 버퍼를 유지 하면서 세척 후 PBS 버퍼를 제거 합니다.
- 10% FBS DMEM 또는 HEVNP Cy5.5 10% FBS DMEM 배양된 MDA-MB231 유 방 암 세포를 보충에 보충에 LXY30-HEVNP-Cy5.5의 250 µ L를 적용 합니다. 방패는 셀 교양 알루미늄 호 일 빛에서 요리.
- 국제화에 대 한 1 시간에 대 한 캐비닛 37 ° C 세포 배양에서 세포 배양 접시를 유지.
- 씻어 얼음에 경작된 한 세포 3 번, 세척, 1 M PBS, pH 7.4의 250 µ L 당 5 분.
- 4%에서 셀을 수정 PFA 1 M PBS, pH 7.4 20 분 및 다음 씻어 1 M PBS, pH 7.4의 250 µ L 한번에.
참고: 셀 준비가 이제 confocal 현미경에 의해 수행해입니다. 대표적인 데이터는 그림 5에 나와 있습니다.
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Representative Results
HEV-VLPs, 유사 모든 Cys HEVNPs 형성 성 icosahedral capsids 수정 하 고 생산 또는 정화 하는 동안 솔루션에 집계 되지 않았다. 전과 Cys의 각 단일 단계 maleimide-biotin 활용 수정 후 HEVNPs 부정적인 얼룩 EM (그림 2)에서 HEV-VLPs에서 구별할 수 없었다. Cys 수정된 HEVNPs chemiluminescent streptavidin 바인딩을 통해 서 부 럽으로 처음 테스트에 Maleimide biotin 활용 효율성. Maleimide-비타민 b 복합체 활용, 다음 Cys 수정 표시 HEVNPs streptavidin 바인딩 신호 (그림 2).
효과적인 2 단계 시스테인 활용 활용 밖으로 실시 됐다 하는 순서에 의해 영향을 받았습니다. 때문에 α3β1 integrin은 overexpressed에서 유방암 종양 세포, 합성 리간드, LXY30, α3β1에 특정 선호도10로 선정 되었습니다 종양을 대상으로 어원이 분자. LXY30 intermolecular 이황화 결합; 통해 cyclized 때문에 LXY30의 직접 maleimide (마이) 기능화 실현 되지 않았습니다. 따라서, self-reactivity에 대 한 관심사가 있었다. 대신, LXY30 alkyne 그룹과 공업화 되었고 클릭 화학 반응을 통해 maleimide-아 지 드에 바인딩된. HEV-573 C NPs는 먼저 maleimide-아 지 드에 바운스 되었다 때 가장 관찰 (그림 4C) 분해 HEV-573 C NPs 나타났다 LXY30-alkyne를 클릭 화학 반응에 의해 따라. 그러나, 형태로 마이-LXY30, 마이-LXY30 활용 Cys 수정 HEVNPs (LXY30-말-Cy5.5) 다음 LXY30 alkyne와 maleimide-아 지 드 초기 클릭 화학 반응의 구조 (그림 4B) 영향을 주지 않았다. 그림 4 는 종양 세포를 대상으로 HEVNPs의 LXY30 기능화의 회로도 묘사 한다.
Ligand, LXY30을 대상으로 유방암을 활용 하는 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) 고 교양된 유방암 세포에는 내 면화 했다. 형광 탐지, LXY30 HEVNPs 및 언바운드 HEVNP-573Cs와 함께 표시 했다에 대 한 보 건국 기능성 HEVNP에 신의 1 차 아민 커플링을 통해 Cy5.5 형광 염료 (NHS-Cy5.5)-573Cs. LXY30-HEVNP-Cy5.5 및 HEVNP Cy5.5 경작에 적용 했다 유방암 세포 (MDA-MB-231), 그리고 confocal 현미경 검사 법에 의해 관찰. Confocal 현미경으로 NIR 형광 이미지는 LXY30-HEVNP-Cy5.5 높은 대 한 선호도 MDA-MB-231 유방암 세포 HEVNP-Cy5.5 (그림 5)에 비해 증가 국제화를 바인딩 했다 나타냅니다.
그림 1: 간염 E 바이러스 나노 입자의 표면 돌출 도메인에 시스테인 교체. 시스테인 돌연변이 잔류물 ORF2 HEV의 이차 구조에 방해를 최소화 하기 위해 Y485, T489, S533, N573, 그리고 유연한 코일 지역에서 T586에 대 한 제안 했다 (A). 시스테인 돌연변이 대 한 모든 선택 된 잔류물 돌출 (P) 도메인의 표면에 위치 하 고 있습니다 (회색; 다른 도메인은 쉘 (S)-도메인 블루와 중간 (M)-핑크에서 도메인), 찌 꺼 기는 가장 바깥쪽에 (오렌지) Y485 (사이안), T489 (노란색), T586와 함께 표면, 및 잔류물 S533 (마젠타색) 및 N573 (레드) HEVNP (B)의 배 축에 직면 하는 측에. 그림 첸 외 에서 20164 권한이 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: HEVNP 모든 Cys 예 수정 HEVNPs N573C를 나르는. HEVNP-573 C 둥근 돌출부 전자 현미경 사진 (A)에 등장 하 고 말-biotinylating 활용 (B) 후 그대로 입자로 남아 있었다. Cys 수정 HEVNPs의 활용 및 epitope 노출의 대표적인 결과. 그들은 시스테인-maleimide 커플링을 통해 maleimide biotin에 바인딩된 되었고 이후 통해 streptavidin 바인딩에 대 한 서쪽 오 점 분석. N573에서 시스테인 돌연변이 허용 되는 다른 돌연변이 사이트, 즉, Y485, T489, S533, 및 T586에 비해 HEVNP에 효율적인 biotinylation (C). Equals 100 nm 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 특별히 Cy5.5 분류 LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5)와 대상으로 유방암 세포의 도식. LXY30-HEVNP-Cy5.5 선택적으로 유 방 암 세포 막에 지나치게 표현된 integrin은 α3β1, LXY30의 특정 선호도 때문에 유방암 세포 (마젠타)에 바인딩합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: thiol 선택적 반응 및 구리 촉매 아 지 드 alkyne cycloaddition 또는 LXY30-HEVNPs 구축 '화학 클릭' 반응을 포함 하 여 2 단계 화학 활용 프로세스의 도식. 두 가지 방법은 테스트 되었습니다. 방법 1: 구리 촉매 아 지 드 alkyne cycloaddition 말-아 지 드와 alkyne-LXY30 사이 반응 양식 말 연결 LXY30 (말-LXY30)은 먼저 수행 되었다. 다음 말 LXY30 Cys 사이트 HEV-573 C NPs (A)의 반응에 추가 되었습니다. LXY30와 Cy5.5 장식 HEV-573 C NPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) 결국 온전 하 게 남아이 화학 활용 과정 (B). 방법 2: 아 지 드 연결 HEVNPs (아 지 드-HEVNPs), LXY30-alkyne, ascorbic 산 및 CuSO4 추가 하 여 다음을 구축 thiol 선택적 반응을 통해 HEV-573 C NPs의 Cys 사이트에서 말 연결 아 지 드 (말-아 지 드)의 라벨 활용 과정 시작 을 LXY30에 연결 된 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (A)를 형성. 그러나, 대부분 LXY30-HEVNPs는 손상 되거나 반응 시 약, 아 지 드, CuSO4 (C), 의약품, 등으로 발생할 수 있는 활용 프로세스에서 분해 했다. 말: Maleimide. 이 그림 동의 20164 첸 외 에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 셀 바인딩 및 국제화의의 대표적인 결과 붙일 표시 된 LXY30-HEVNPs는 MDA-MB-231 유방암 세포에 바인딩합니다. LXY30-HEVNP-Cy5.5 MDA-MB-231 셀에 대상의 NIR 형광 이미지. 했다 스테인드 DAPI에서 (파란색), 핵의 신호 및 Cy5.5 (빨간색)의 신호는 confocal 형광 현미경을 사용 하 여 인수 했다. 이 그림 동의 20164 첸 외 에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
시간이 걸리는 유전 공학 절차는 일반적으로 주, 달리 여기 설명 간단한 2 단계 및 암 ligand를 대상으로 추가의 3 일 안에 완료 될 수 있는 한 단계 화학 활용 절차 및 HEVNPs의 Cys/리스 사이트의 형광 탐지 염료 기술을 사용할 수 있습니다 후보자, 수영장 그리고 따라서 합리적인 비용 및 배달 시 사용할 수 있는 펩 티 드/작은 분자 합성 서비스의 활용에서 최고의 ligand 대상에 대 한 화면으로.
관심사의 단백질에는 polypeptides를 삽입할 수 있습니다만, 전통적인 유전자 공학, 달리 화학 활용 polypeptides, 작은 화학 분자의 표면에 나노 입자 등 다양 한 자료를 연결할 수 있는 관심, Cys 또는 리스 잔류물 반응 사이트로 사용 하는 만큼의 단백질. 화학 활용 사이트에서 같은 잔류물 경우 간단한 Cys/리스 교체 이전 연구4에서 같이 화학적으로 활성화 있도록 관심사의 단백질에 유전으로 수정할 수 있습니다.
제어를 화학 활용만 선택적 반응 사이트, 어원이 분자 활용된 필요 intramolecular 반응성을 피하기 위해 철저 하 게 공부 될 단백질의 구조에서 발생 합니다. 같이 본 펩 티 드 LXY3010를 대상으로 하는 유방암, 중요 한 이황화 결합 주기적 리간드 구조를 안정화. Maleimide의 thiol 반응성, 주어진 maleimide-기능화 LXY30 ligands는 가능성이 결과의 intramolecular 반응에 직접. 대신, 2 단계 활용 (4.2 단계) 클릭 화학 반응을 통해 alkyne 연결 된 LXY30와 maleimide에 연결 된 아 지 드 반응에 의해 수행 되었다. 그러나, 클릭 화학 반응과 thiol 선택 반응 순서는 LXY30-HEVNPs (그림 4)의 구조적 intactness에 대 한 중요 한. CuSO4 촉매 클릭 화학 반응을 통해 LXY30 직접 바인딩 되었습니다 하지 maleimide 하 마이-LXY30 구축. 그 후, 마이-LXY30는 형성된 LXY30 HEVNPs 그들의 네이티브 icosahedral 구조 (그림 4)를 유지할 수는 HEVNP-573 C에 활용 된.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.
Acknowledgments
저자 인정 NIH에 의해 RHC를 자금 후원 # 부여 ' s AI095382, EB021230, CA198880, 국립 연구소의 식품 및 농업, 뿐만 아니라 핀란드 존경 하는 교수 프로그램:.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
References
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