Summary
We hebben de Eiwitmantel proteïne van hepatitis E virus ontworpen als een theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP assembleert zelf in een stabiele icosahedrale kooi in mucosale levering. Hier beschrijven we de wijziging van de HEVNPs voor tumor gericht op door muteert residuen oppervlak-blootgesteld aan cysteines, die conjugaat van synthetische liganden die specifiek tumorcellen binden.
Abstract
Virusachtige deeltjes (experimentele) zijn gebruikt als nanocarriers weergeven van buitenlandse epitopes en/of leveren van kleine moleculen in de opsporing en behandeling van verschillende ziekten. Deze toepassing is afhankelijk van genetische modificatie, zelf-assemblage en cysteïne vervoeging te vervullen van de tumor-targeting toepassing van recombinant experimentele. vergeleken met genetische wijziging alleen, chemische vervoeging van buitenlandse peptiden aan experimentele biedt een belangrijk voordeel omdat het toestaat dat een aantal entiteiten, zoals synthetische peptides of oligosachariden bevatten, te worden op het oppervlak van experimentele geconjugeerd in een gedifferentieerde en flexibele wijze zonder wijziging van de VLP-vergadering.
We laten hier zien hoe met het hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), een modulair theranostic capsule, als een multifunctionele levering "vervoerder". Functies van HEVNPs omvatten weefsel-targeting, imaging en therapeutische levering. Gebaseerd op de reeds lang gevestigde structurele onderzoek van HEVNP, werden de structureel onafhankelijk en oppervlakte-blootgesteld residuen geselecteerd voor de vervanging van cysteïne als conjugatie sites voor maleimide-linked chemische groepen via thiol-selectieve verbanden. Een specifieke cysteïne-gewijzigd HEVNP (Cys ter vervanging van de asparagine op 573 aa HEVNP - 573C) was geconjugeerd met een borst kanker cel-specifieke ligand, LXY30 en voorzien van nabij-infrarood (NIR) fluorescentie kleurstof (Cy5.5), waardoor de tumor-gerichte HEVNPs als doeltreffende diagnostische capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Soortgelijke engineering strategieën kunnen worden toegepast met andere macromoleculaire complexen met bekende atomaire structuren te verkennen mogelijke toepassingen in theranostic levering.
Introduction
De ontwikkeling van de nano-sized vectoren in therapeutische en diagnostische levering, bekend als nanotheranostics, is veel van de biomedische veld uit de buurt van gegeneraliseerde behandelingen naar gerichte levering1verschoven. Gerichte nanotheranostic levering integreert nano-sized vectoren (nanodeeltjes) met theranostic moleculen om stabiel theranostic moleculen naar een specifieke zieke weefsel of biochemische traject2,3,4 . Nanogeneeskunde is gekomen op de voorgrond van gerichte levering omdat optimaal formaat nanodeeltjes de capaciteit hebben om verkeer van theranostic moleculen stabiliseren en selectief target cel oppervlakte moleculen gepresenteerd op zieke weefsels. Nog steeds lijden vele nanotheranostic platformen passieve cel opname, pre volwassen afbraak en toxiciteit onvoldoende vereniging met theranostic moleculen. Experimentele overwinnen veel van deze belemmeringen in gerichte levering. Ze zijn gebruikt als nanocarriers om buitenlandse epitopes weergeven en/of leveren van kleine moleculen: een regime dat kan worden gebruikt ter bestrijding van vele ziekten1. Deze toepassing steunt voornamelijk op de eigenschap van zelf-assemblage en het gemak van genetische modificaties, om te voldoen aan de ontworpen toepassing voor de gegeven VLP. Vergeleken met genetische manipulatie, chemische vervoeging van buitenlandse peptides te VLP wordt weergegeven, een aanzienlijk voordeel omdat daardoor een groot aantal entiteiten, zoals peptiden of oligosachariden, aan zijn geconjugeerd aan de oppervlakte van experimentele in een gemoduleerde en flexibel op te treden zonder wijziging van VLP vergadering.
HEVNPs, afgeleid van de recombinante HEV Eiwitmantel eiwit, 2nd open frame (ORF2) lezen, zijn niet-infectieuze, zelf monteren capsids staat van cel-bindende en post. Omdat HEV geëvolueerd voor mucosal transmissie, is de geassembleerde Eiwitmantel eiwit ook stabiel in Proteolytische en zure mucosal voorwaarden5. HEVNPs vormen een hol, T = 1 icosahedrale Eiwitmantel, samengesteld uit 60 identieke eenheden6,7 ORF2, waardoor zij zeer stabiele zowel in opslag Barre fysiologische omstandigheden. Bij gebrek aan een virale genetische elementen, wordt de productie van efficiënte, hoge opbrengst bereikt door baculovirus expressie systeem in insect cellen. Vanwege hun Proteolytische stabiliteit, zijn zelf geassembleerde HEVNPs gewonnen en gezuiverd van cel supernatant, aanzienlijk verminderen nodig zuivering stappen. Bovendien bezitten HEVNPs een oppervlak blootgestelde uitsteeksel domein (P domein) verbonden door middel van een flexibele scharnier aan een stabiele icosahedrale base. Het domein P vormt spikes oppervlak-blootgesteld bovenop de icosahedrale base, terwijl het flexibele scharnier het mogelijk maakt om het domein P aanzienlijk te wijzigen zonder afbreuk te doen aan de basis van de icosahedrale structuur. Met 60 herhaalde eenheden, enkele specifieke wijziging resulteert in 60 symmetrische sites voor chemische modulatie. Onlangs, hebben wij voorgesteld een nano-platform met behulp van HEVNP die chemisch liganden of kleine molecules voor theranostic toepassingen conjugaat kan. Dit werd bereikt door het te vervangen een één aminozuur cysteïne op het domein van de uitsteeksel van HEV-VLP als een reactie site met maleimide-linked peptiden of moleculen. Op basis van eerdere structuuranalyse van HEV-VLP en goed bestudeerde immunogene epitopes8,9, de volgende vijf HEV-VLP-aminozuren werden vervangen door cysteïne als mogelijke kandidaat-lidstaten: Y485C, T489C, S533C, N573C en T586C ( Figuur 1). Na expressie en reiniging van insect cellen, hun VLP-formaties werden bevestigd door Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) observatie (Figuur 2), en de blootgestelde cysteïne sites werden geanalyseerd door Western blot na maleimide-linked Biotine vervoeging (Figuur 2). Onder de vijf mutanten, HEVNP - 573C weergegeven van het sterkste signaal van maleimide-Biotine geconjugeerde (Figuur 2) en werd gebruikt voor de follow-up van de demonstratie als de nanocarrier voor borst kankercel gericht op4 (Figuur 3).
Dit protocol beschrijft chemische vervoeging methoden om tumor-targeting moleculen aan te HEVNPs via oppervlakte cysteïne Woordherkomst en-opbouw. We detail de vervoeging van tumor targeting en detectie moleculen voor de levering van de tumor met recombinant HEVNPs met een cysteïne bij N573 (HEVNP - 573C). We gericht op een proces van twee stappen Klik chemie vervoeging te binden een borst kanker tumor gericht op peptide, LXY3010 te HEVNPs aan formulier LXY30-HEVNP (Figuur 4). Vervolgens, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 waren geconjugeerd met de afzonderlijke Lys-site op HEVNPs te bouwen LXY30-HEVNP-Cy5.5 voor fluorescerende detectie beide in vitro (Figuur 5) en in vivo4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HEVNP productie in Insect cellen
Opmerking: Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een cel cultuur kap. Verwijs naar onze vorige publicatie voor meer gedetailleerde HEVNP productie-procedures11.
- Cultuur Sf9 cellen in insect cell media (Zie Tabel van materialen) tot 50-75% samenkomst in 6-Wells-platen.
- Met behulp van insecten cel transfectie reagentia volgens de fabrikant protocollen, transfect Bacmids met HEVNP - 573 C ORF2 in cellen van de Sf99 voor de productie van recombinante baculovirus. Incubeer de transfected cellen bij 27 ° C gedurende 3-6 dagen, afhankelijk van de levensvatbaarheid van de cellen.
- Het verzamelen van supernatant bij 3-6 dagen na infectie (nadat transfected cellen zijn lysed vanwege baculovirus infectie) als P0 baculovirus voorraad.
- Kweekmedium verwijderen voordat u 200 µL van P0 voorraad op 50-75% confluente Sf9 cellen in een maatkolf van 25 cm2 enkelgelaagde toepast. Rock de kolf elke 15 min om ervoor te zorgen de volledige dekking van het entmateriaal. Herhaal 4 keer, voor een totaal van 60 min.
- Voeg 2 mL insect cel kweekmedium aan op de maatkolf en houd bij 27 ° C gedurende 3-6 dagen, afhankelijk van de levensvatbaarheid van cellen, om aan te vullen met een hogere titer baculovirus.
- Plaque testen te verkrijgen van de titer van de baculovirus lezen12uitvoeren.
- De zwevende Tn5 insect cellen (Tabel of Materials) cultuur met 100 mL voor insect cel medium in de kolf van 250 mL en schud in 27 ° C bij 150 tpm tot een titer van 0,5 x 105 - 1 x 10,6 voor inenting.
- Voeg baculovirus op een veelheid van infectie (MOI) van 5-10 tot 100 mL Tn5 cellen in een maatkolf van 250 mL. Na inoculatie, laat in 27 ° C bij 150 t/min gedurende 5-7 dagen.
- Zodra de meeste cellen lijken te hebben van de blaasjes en 70-90% van de cellen zijn dood onder optische Microscoop observatie, verzamelen de Tn5 cellen en Pipetteer in 33 mL ultracentrifuge buizen. Plaats de ultracentrifuge buizen in emmer rotoren, evenwicht en draai de cel puin en recombinant baculoviruses swingende op 10.000 x g gedurende 90 minuten bij 25 ° C.
- Bewaar het supernatant waarin de vrijgegeven HEVNPs bij 4 ° C voor verdere zuivering. Voor uitgebreide opslag van baculovirus supernatant, toevoegen proteaseinhibitors.
2. HEVNP zuivering
- Pellet en isoleren van de HEVNPs met behulp van cesium chloride (CsCl) verlopende scheiding:
- Overdracht van het verzamelde supernatant (uit stap 1.10) en 20% toevoegen NP-40 in elke buis om een eindconcentratie van 0,5% NP-40 te ontbinden van eventuele resterende cellulaire membraan. Voorzichtig mengen door pipetteren en incubeer gedurende ten minste 30 min. bij 25 ° C.
- Ultracentrifuge de HEVNPs bij 112,400 x g in swingende emmer rotoren gedurende 2 uur bij 4 ° C naar beneden de HEVNPs vanaf het supernatant pellet. Verwijder het supernatant na het centrifugeren en zachtjes resuspendeer de pellet van ruwe in 200 µL van 10 mM MES buffer pH 6.2 in elke buis 's nachts (O/N) bij 4 ° C. SDS-pagina (stap 3.1) om te bevestigen de aanwezigheid van HEVNP ORF2 in de ruwe pellet als een 52 kDa-band worden uitgevoerd.
- Bereiden een helling CsCl 38,5% (m/v) door mengen 1.96 g CsCl opnieuw gesuspendeerde ruwe pellet en ~ 4 mL 0,01 M MES pH 6.2 in een tube van 5 mL ultracentrifuge. Evenwicht van de buizen en plaats in een swingende emmer rotor. Ultracentrifuge bij 147,000 x g gedurende 16 uur bij 4 ° C.
- Het verzamelen van de breuken na CsCl verloop:
- Gooi de top 500 µL breuk, die is vooral lichtgewicht celmembraan puin. Verzamelen van 500 µL breuken, vanaf de bovenkant van de buis, en wijzigen van tips tussen elke fractie. Plaats elke breuk in genummerde/label 1,5 mL tubes.
Opmerking: De aanwezigheid van HEVNP ORF2 in breuken van CsCl verloop kan niet worden gedetecteerd door het uitvoeren van SDS-pagina gelen te wijten aan de hoge concentratie van CsCl gescheiden. De CsCl in elke fractie kan worden verwijderd of verdund door een CsCl sanering procedure te volgen. Anderzijds kan het verloop CsCl worden vervangen door een 10-40% sucrose kleurovergang13 te vermijden CsCl residuele. - Elke fractie overbrengen in een tube van 5 mL ultracentrifuge en Verdun de CsCl met 4.5 mL 10 mM MES, pH 6.2. Evenwicht van de buizen en plaats in een swingende emmer rotor. Ultracentrifuge bij 147,000 x g gedurende 2 uur bij 4 ° C tot beneden de HEVNPs pellet.
- Verwijder het supernatant en zachtjes resuspendeer de HEVNPs in 100 µL van 10 mM MES pH 6.2 in elke buis. Dekking van de buizen om te vermijden van verdamping en O/N Incubeer bij 4 ° C.
- Noteer de A280 lezing en A260/A280 nm verhouding met een spectrofotometer. Bepaal de geschatte concentratie van ORF2 als:
Elke ORF2 bevat 1 Cys site en 1 Lys site voor chemische Woordherkomst en-opbouw.
Opmerking: De coëfficiënt van de molaire extinctie van HEVNP ORF2 is 60,280, hetgeen gelijk is aan 1.019 mg/mL × A280. Dit is so close to 1:1 dat de concentratie van HEVNPs (in mg/mL) kan worden benaderd door de A280, en dus de concentratie van ORF2 door de bovenstaande vergelijking. Bijvoorbeeld, een HEVNP met een lezing van de A280 van 1 zal hebben een concentratie van 1 mg/mL, wat overeenkomt met 18,8 µM ORF2. - Voorbereiden van een SDS-pagina. Gebruik een 6 µL monster uit elke fractie om de breuken die 53.3 kDa HEVNP ORF2 eiwitten (stap 3.1) bevatten. De HEVNPs moeten worden gevonden in breuken 3-5, met een dichtheid van ~1.25 g/mL.
- Controleer de aanwezigheid en de zuiverheid van HEVNPs door TEM observatie. Bereiden of verdunnen van de HEVNP monsters tot 0,5 - 2,0 mg/mL voor TEM. De HEVNPs in TEM weergegeven als lege icosahedrale eiwitten, ~ 27 nm in diameter (Figuur 2). Sommige eiwitten verontreinigingen kunnen blijven in de breuken en zal worden waargenomen onder TEM (stap 3.2).
- Gooi de top 500 µL breuk, die is vooral lichtgewicht celmembraan puin. Verzamelen van 500 µL breuken, vanaf de bovenkant van de buis, en wijzigen van tips tussen elke fractie. Plaats elke breuk in genummerde/label 1,5 mL tubes.
- In het geval dat onzuiverheden aanwezig onder TEM zijn, herhaalt u stap 2.1.3 - 2.2.6 voor betere zuiverheid van de HEVNPs.
Opmerking: Extra zuivering door CsCl verloop kan opbrengst verlies van HEVNPs veroorzaken. Anderzijds kan de CsCl kleurovergang zuivering worden vervangen door een 10-40% sucrose verloop te voorkomen resterende CsCl13.
3. HEVNP karakterisering
- Opstellen van SDS-pagina 4-12% Bis-Tris eiwit Gels, 1,0 mm, 17-wells (Zie Tabel van materialen) volgens de gebruiker handmatig14:
- Voeg 2 µL van 4 x 6 µL van eiwitSteekproef buffer laden. Incubeer het monster mengsel in een blok van de warmte gedurende 10 minuten bij 100 ° C tot de eiwitten denatureren. Laad de eiwitsteekproeven op de gel.
- Voer de SDS-pagina door het instellen van de DC voeding bij 100 V voor 10 min, dan 150 V gedurende 45 minuten totdat de monsters worden uitgevoerd tot ongeveer 1 cm boven de onderkant van de gel.
- Vlek de SDS-pagina gel met Coomassie blue (0,25% (m/v) briljante Coomassie Blue R250, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) azijnzuur), gedurende 1 uur.
- Na de kleuring procedure, verwijderen van de vlek Coomassie blue en toepassen-kleuring buffer (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) azijnzuur) op de eiwit-gel voor > 12u bij kamertemperatuur.
- Het document van de gel onder wit licht ter bevestiging van de aanwezigheid van HEVNP ORF2 de 52 kDa band.
- Let op de HEVNPs met behulp van TEM.
- Bereiden of verdunnen van de HEVNP monsters tot 0,5 - 2 mg/mL met 10 mM MES pH 6.2 voor TEM imaging.
- De koolstof-gecoate rasters met 40 mA gloed kwijting voor 30 ioniseren s tot het produceren van een hydrofiele koolstof oppervlak. De gloed geen kwijting apparatuur wordt beschreven in de Tabel van materialen.
Opmerking: Het oppervlak van de hydrofiele koolstof van de rasters kan alleen laatste voor 30 min na gloed kwijting behandeling. - Houden in pincet en 2 µL van HEVNP monster aan het raster toevoegen, 15-30 s wachten en blot met filtreerpapier.
- Onmiddellijk wassen het raster met ddH20 en vlek met filtreerpapier.
- Onmiddellijk vergroten met 2 µL van 2% uranyl acetaat het raster, de wacht 15 s, dan de vlek met filtreerpapier. Droog de rasters van het monster door ze te plaatsen in een elektronische ontvochtigen droge kabinet voor O/N.
- Breng het raster in een TEM en beeld op vergroting van de 10-80k. HEVNPs in TEM weergegeven als lege icosahedrale proteïnen toe die ~ 27 nm in diameter, vanwege het ontbreken van viraal RNA.
4. chemische vervoeging van HEVNPs met biotine, kanker Targeting Ligand en Fluorophores
- Het uitvoeren van één stap vervoeging van HEVNPs en maleimide gekoppeld biotine.
- Verandering van de buffer: toepassen van de HEVNPs in mini dialyseeenheden en dialyze tegen 0,01 M PBS pH 7.4 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur volgens de fabrikant protocol (Tabel van materialen). Overdracht van de HEVNPs 1,5 mL buizen en meten van de eiwitconcentratie op 280 nm met behulp van een spectrofotometer.
- Meng de HEVNP tot 1 mg/mL, wat overeenkomt met 18,8 µM van Cys reactie plaatsen (zie details in stap 2.2.4), met een gelijke hoeveelheid van maleimide-Biotine (100 µM) in 0,01 M PBS pH 7.4, om een molaire ratio van 1:5; O/N reageren bij 4 ° C. Verwijder niet-afhankelijke maleimide-Biotine met een 40 K MWCO Spin Desalting kolom procedure volgens de fabrikant protocol (Tabel van materialen).
- Analyseer de monsters door een vermindering van de SDS-pagina (stap 3.1) standaard.
- Met behulp van standaardprocedures, bereiden een chemiluminescentie Western Blot met HRP-linked daar. Vangen het chemiluminescentie signaal door X ray film (Figuur 2).
- Voer twee stap LXY30 vervoeging naar oppervlakte-blootgesteld cysteïne op HEV NPs (Figuur 5).
- Uitwisseling van de buffer: toepassing HEVNPs in mini dialyseeenheden en dialyze tegen 0,01 M PBS pH 7.4 bij kamertemperatuur voor 1 h. overdracht de HEVNPs 1,5 mL buizen en meten van de eiwitconcentratie op 280 nm met behulp van een spectrofotometer.
- Toevoegen van 650 µM maleimide-azide en 650 µM alkyn-LXY3010 in 0,01 M PBS pH 7.4 met 200 µM CuSO4 en 1 mM ascorbinezuur te vormen maleimide-linked LXY30 (Mal-LXY30) op 650 µM. Incubeer het mengsel bij 4 ° C voor O/N.
- Meng de HEVNP tot 1 mg/mL, wat overeenkomt met 18,8 µM van Cys reactie site (zie details in stap 2.2.4), met ongeveer 10% volume van de Mal-LXY30 (650 µM) in 0,01 M PBS pH 7.4, om een molaire ratio van 1:3; O/N reageren bij 4 ° C.
Opmerking: Als gevolg van de relatief hoge concentratie van de Mal-LXY30, worden de eindconcentraties van de reactanten, zoals CuSO4, ongeveer 10 keer verlaagd na het mengen, om te voorkomen dat hun schade aan HEVNPs. Een andere optie is de Cu-gratis e-conjugatie methode15. - Verwijderen niet-afhankelijke maleimide-Klik-LXY30 met een 40 K MWCO Spin ontzouten kolom volgens protocol van de fabrikant (Zie Tabel van materialen). Houden van de LXY30-linked HEVNPs (LXY30-HEVNPs) bij 4 ° C.
- Uitvoeren van één stap Woordherkomst en-opbouw van de LXY30-HEVNPs en Cy5.5 NHS ester (NHS-Cy5.5)
- Meng de LXY30 alternerende HEVNPs (LXY30-HEVNPs) tot 1 mg/mL, wat overeenkomt met 18,8 µM van de Cys reactie site (zie details in stap 2.2.4), met gelijke hoeveelheid NHS-Cy5.5 (100 µM) in 0,01 M PBS pH 7.4 te maken een molaire ratio van 1:5; O/N reageren bij 4 ° C.
- Verwijderen niet-afhankelijke Cy5.5-NHS met een 40K MWCO Spin ontzouten kolom procedure volgens protocol van de fabrikant (Zie Tabel van materialen). Hou de LXY30, Cy5.5-linked HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) bij 4 ° C.
5. HEVNP binden aan en internalisering in borstkankercellen MDA-MB231
- Zaad MDA-MB231 borstkankercellen in een 35-mm glas onderste gerechten (5 x 10,4 per schotel) O/N in een kabinet cultuur van zoogdiercellen.
- Voorbereiden voor de cel bindende experiment, LXY30-HEVNP-Cy5.5 door volgende stappen 4.2-4.3. Verdun de LXY30-HEVNP-Cy5.5 tot 0,01 mg/mL, overeenkomend met 0.188 µM van HEVNP ORF2 (zie stap 2.2.4), in 250 µL van 0 - 1% FBS/DMEM.
- De negatieve controlemonster op 0,01 mg/mL HEVNP-Cy5.5 door stap 4.3 maar geconjugeerd met kleurstof van de NHS-Cy5.5 alleen (HEV-Cy5.5) voor te bereiden. Verdun de HEVNP-Cy5.5 tot 0,01 mg/mL, overeenkomend met 0.188 µM van HEVNP ORF2 (zie stap 2.2.4), in 250 µL van 10% FBS aangevuld met DMEM.
- De cellen keer wassen door 250 µL van 1 M PBS buffer, pH 7.4 toe te passen. Verwijder de PBS-buffer na het wassen, terwijl sommige buffer in de cel cultuur schotel.
- Breng 250 µL LXY30-HEVNP-Cy5.5 in 10% FBS aangevuld met DMEM of HEVNP-Cy5.5 in 10% FBS aangevuld met DMEM aan de gekweekte MDA-MB231 borstkankercellen. Schild de cel gekweekt gerechten uit licht met aluminiumfolie.
- Houd de cel gekweekte gerechten in een celkweek 37 ° C kabinet voor 1 h voor internalisering.
- Wassen van de gekweekte cellen op ijs 3 keer, 5 min per wasbeurt, met 250 µL van 1 M PBS, pH 7.4.
- Bevestigen van de cellen in 4% PFA in 1 M PBS, pH 7.4 voor 20 min en daarna wassen met 250 µL van 1 M PBS, pH 7.4.
Opmerking: De cellen zijn nu klaar om te worden beeld door confocal microscoop. Representatieve gegevens worden weergegeven in Figuur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verwant aan HEV-experimentele, alle Cys gemodificeerde HEVNPs gevormd oplosbare icosahedrale capsids en deed niet aggregaat in oplossing tijdens productie of zuivering. Voor en na-voor-stapmodus maleimide-Biotine conjugatie, elk van de Cys bewerkt waren HEVNPs niet te onderscheiden van HEV-experimentele in de negatieve vlek EM (Figuur 2). Maleimide-Biotine vervoeging efficiëntie Cys gemodificeerde HEVNPs werd voor het eerst getest met het westelijke bevlekken via chemiluminescentie daar bindend. Na maleimide-Biotine conjugatie bewerkt Cys HEVNPs weergegeven daar bindende signalen (Figuur 2).
Effectieve tweestaps cysteïne vervoeging werd beïnvloed door de volgorde waarin de vervoeging werd uitgevoerd. Want α3β1 integrine is overexpressie tumor borstkankercellen, een synthetische ligand, LXY30, met specifieke affiniteit met α3β1 werd10, geselecteerd als een tumor-targeting geconjugeerde molecuul. Directe maleimide (MOI) functionalization van LXY30 was niet haalbaar, want LXY30 cyclized door een intermoleculaire Zwavelbrug is; Vandaar, was er een zorg voor self-reactivity. In plaats daarvan was LXY30 matiemaatschappij met een alkyn-groep en gebonden aan maleimide-azide door een klik op chemie reactie. Wanneer HEV - 573C NPs aan maleimide-azide eerst gebonden waren, leek gevolgd door een reactie van de Scheikunde Klik op LXY30-alkyn, de NPs HEV - 573C te demonteren onder TEM observatie (figuur 4C). Een reactie van de eerste klik-chemie tussen LXY30-alkyn en maleimide-azide op formulier MaI-LXY30, gevolgd door MaI-LXY30 vervoeging naar Cys gemodificeerde HEVNPs (LXY30-Mal-Cy5.5) heeft echter geen invloed op de structuur (figuur 4B). Figuur 4 ziet u een schematische voorstelling van de LXY30-functionalization van HEVNPs voor het targeten van de cel van de tumor.
HEVNPs geconjugeerd met de kanker van de borst targeting ligand, LXY30 (LXY30-HEVNPs) gebonden en waren geïnternaliseerd in gekweekte borstkankercellen. Voor fluorescerende detectie, LXY30-HEVNPs en niet-afhankelijke HEVNP-573Cs waren gelabeld met NHS matiemaatschappij Cy5.5 fluorescente kleurstof (NHS-Cy5.5) door middel van primaire amine koppeling van lysine op HEVNP-573Cs. LXY30-HEVNP-Cy5.5 en HEVNP-Cy5.5 werden toegepast om gekweekte borstkanker cellen (MDA-MB-231) en waargenomen door confocale microscopie. De beelden van de fluorescentie NIR door confocal microscoop geven dat lxy30-HEVNP-Cy5.5 had hoger bindende affiniteit voor en grotere internalisering in MDA-MB-231 borstkankercellen in vergelijking met HEVNP-Cy5.5 (Figuur 5).
Figuur 1: cysteïne vervanging op het domein van de oppervlakte uitsteeksel van hepatitis E virus nanoparticle. Cysteïne mutaties werden voorgesteld voor residuen, Y485, T489, S533, N573 en T586 op de flexibele spoel regio om te minimaliseren van de verstoring van de secundaire structuur van HEV ORF2 (A). Alle geselecteerde residuen voor cysteïne mutatie bevinden zich op het oppervlak van het uitsteeksel (P) domein (grijze; de andere domeinen zijn de shell (S) - domein in blauw en Midden (M) - domein in het roze), met residu Y485 (cyaan), T489 (geel), T586 (oranje) op de uiterste oppervlakte, en residu S533 (magenta) en N573 (rood) op de zijde naar de vijfvoudige as van HEVNP (B). De figuur is gewijzigd van Chen et al. 20164 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: karakterisering van HEVNP uitvoering N573C als een voorbeeld voor alle Cys HEVNPs bewerkt. De HEVNP - 573C verschenen als bolvormige projecties op electron microfoto (A) en bleef intact deeltjes na conjugatie Mal-biotinylating (B). Representatieve resultaten voor de vervoeging en epitoop blootstelling van Cys gemodificeerde HEVNPs. Ze waren gebonden aan maleimide-Biotine via cysteïne-maleimide koppeling en vervolgens vehiculumcontrolegroep door westelijke vlek voor daar bindend. De cysteïne-mutatie op N573 toegestaan efficiënte biotinylation aan de HEVNP in vergelijking met de andere mutatie sites, d.w.z., Y485, T489, S533 en T586 (C). Bar is gelijk aan 100 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: schematische van borstkankercellen die specifiek zijn gericht met Cy5.5-geëtiketteerden LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5). LXY30-HEVNP-Cy5.5 binden selectief aan borstkankercellen (magenta) als gevolg van de LXY30 van specifieke affiniteit met α3β1, die is een overdreven uitgedrukt integrine op de celmembraan van de borst-kanker. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: een schematische voorstelling van de uit twee stappen bestaande chemische vervoeging processen, waaronder een thiol-selectieve reactie en een koperen gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie of 'Klik chemie' reactie op het bouwen van LXY30-HEVNPs. Twee methoden hebben getest. Methode 1: de koperen gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie reactie tussen Mal-azide en alkyn-LXY30 op formulier Mal alternerende LXY30 (Mal-LXY30) werd eerst uitgevoerd. Waarna de Mal-LXY30 werd toegevoegd om te reageren met de Cys site van HEV - 573C NPs (A). De LXY30 en de Cy5.5 ingericht HEV - 573C NPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) intact gebleven na al deze chemische vervoeging processen (B). Methode 2: de vervoeging proces begint door het labelen van de Mal-linked azide (Mal-Azide) op de site van de Cys van HEV - 573C NPs door een thiol-selectieve reactie te bouwen azide alternerende HEVNPs (Azide-HEVNPs), gevolgd door toevoeging van LXY30-alkyn, ascorbinezuur en CuSO4 LXY30-linked HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (A) vormen. Echter werden de meeste LXY30-HEVNPs beschadigd of gedemonteerd uit de vervoeging processen, die kunnen worden veroorzaakt door de reactieve reagentia, waaronder azide, ascorbinezuur en CuSO4 (C). Mal: Maleimide. Dit cijfer is gewijzigd van Chen et al. 20164 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: representatieve resultaten van cel bindende en internalisering van fluorescently met het label LXY30-HEVNPs, die zich bindt aan MDA-MB-231 borstkankercellen. NIR fluorescentie beelden van LXY30-HEVNP-Cy5.5 gericht op naar MDA-MB-231 cellen. Het signaal van de kernen, die werden gekleurd door DAPI (blauw), en het signaal van de Cy5.5 (rood) werden verkregen met behulp van een confocal fluorescentie Microscoop. Dit cijfer is gewijzigd van Chen et al. 20164 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In tegenstelling tot de procedure tijdrovend genetische manipulatie, wat gewoonlijk weken duurt, hier tonen we eenvoudige twee stappen en one-step chemische vervoeging procedures, die kunnen worden voltooid binnen 3 dagen, van het toevoegen van de kanker targeting ligand en/of fluorescentie detectie kleurstof de Cys/Lys sites van HEVNPs. De techniek kan worden gebruikt aan het scherm voor de beste ligand-doelstelling van een pool van kandidaten, en dus maakt gebruik van de beschikbare peptide/kleine molecuul synthese diensten tegelijk redelijke kosten en levering.
In tegenstelling tot traditionele gentechnologie, die alleen de polypeptiden proteïnen van belang invoegen kan, de chemische vervoeging verbinding kan maken van verschillende materialen met inbegrip van polypeptiden, kleine chemische moleculen en nano-deeltjes op het oppervlak van de proteïne van belang, zolang er een Cys of Lys residu moet worden gebruikt als de reactieve site. Als er geen dergelijke residuen op de site van chemische conjugatie, kan eenvoudig Cys/Lys vervanging genetisch worden gewijzigd op de proteïne van belang om er chemisch gevechts zoals aangetoond in het vorige onderzoek4.
Om te controleren of de chemische vervoeging doet zich alleen voor op de selectieve reactie sites, de structuur van de geconjugeerde molecuul zowel het eiwit als geconjugeerd moet grondig worden onderzocht om te voorkomen dat intramoleculaire reactiviteit. Zoals aangetoond hierin met het borstkanker targeting peptide LXY3010, stabiliseert een kritische Zwavelbrug cyclische ligand bevleesdheid. Gegeven de thiol-reactiviteit van maleimide, directe maleimide-functionalization van LXY30 liganden zal waarschijnlijk resulteren in intramoleculaire reactiviteit. In plaats daarvan werd twee stap-conjugatie (stap 4.2) uitgevoerd door de azide maleimide-linked met alkyn-linked LXY30 door klik chemie reactie te reageren. De volgorde van de klik chemie reactie en thiol-geselecteerde reactie is echter essentieel voor de conformationele intactheid van de LXY30-HEVNPs (Figuur 4). Door een CuSO4 gekatalyseerd Klik-chemie reactie, LXY30 niet indirect moest maleimide om te bouwen van MaI-LXY30. Vervolgens zijn de MaI-LXY30 aan HEVNP - 573C geconjugeerd zodanig dat de gevormde LXY30-HEVNPs kunnen behouden hun oorspronkelijke icosahedrale structuur (Figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de sponsoring van de financiering voor RHC door NIH verlenen #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Rijksinstituut voor voedsel en landbouw, alsmede het programma Finland Distinguished Professor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
References
- Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
- Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
- Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
- Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
- Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
- Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
- Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
- Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
- Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
- Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
- Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
- Technologies, I. bL. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System: User Manual. , Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf (2015).
- Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
- Technologies, N. bL. Vol. MAN0007891 1-2. , Life Technologies. (2013).
- Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).
