Summary
Abbiamo progettato la proteina del capside del virus di epatite E come una nanoparticella di teranostici (HEVNP). HEVNP auto-assembla in una gabbia icosahedral stabile nella consegna delle mucose. Qui, descriviamo la modifica di HEVNPs per tumore targeting modificando la superficie esposta residui di cisteine, che coniuga ligandi sintetici che legano specificamente le cellule del tumore.
Abstract
Particelle simili al virus (VLPs) sono state usate come nanovettori Visualizza epitopi stranieri e/o consegnare piccole molecole nella rilevazione e nel trattamento di varie malattie. Questa applicazione si basa sulla modificazione genetica, auto-assemblaggio e coniugazione di cisteina per soddisfare l'applicazione targeting tumorale del ricombinante VLP. paragonati genetica coniugazione di chimica, da sola modificazione di peptidi stranieri a VLPs offre un significativo vantaggio, perché permette una varietà di soggetti, quali peptidi sintetici o oligosaccaridi, per essere coniugato alla superficie di VIP in modo modulato e flessibile senza alterazione dell'Assemblea VLP.
Qui, noi dimostrare come utilizzare l'epatite E virus nanoparticelle (HEVNP), una capsula di teranostici modularizzato, come un vettore di consegna multifunzionale. Funzioni di HEVNPs includono tessuto-targeting, imaging e consegna terapeutico. Basato sulla consolidata ricerca strutturale di HEVNP, i residui strutturalmente indipendenti e superficie-esposta sono stati selezionati per la sostituzione di cisteina come siti di coniugazione per gruppi chimici maleimide-collegato tramite legami tiolo-selettivo. Un particolare cisteina-modificato HEVNP (una sostituzione di Cys dell'asparagina a 573 aa (HEVNP - 573C)) è stato coniugato ad un ligando di cellula-specifico di cancro di seno, LXY30 e marcati con vicino infrarosso (NIR) fluorescenza colorante (CY 5.5), rendendo il targeting per tumore HEVNPs come efficace diagnostiche capsule (LXY30-HEVNP-CY 5.5). Simili strategie di ingegneria possono essere impiegate con altri complessi macromolecolari con ben noti strutture atomiche per esplorare potenziali applicazioni in teranostici consegna.
Introduction
Lo sviluppo di vettori di dimensioni nanometriche in consegna terapeutica e diagnostica, conosciuto come nanotheranostics, ha spostato gran parte del campo biomedico lontano da trattamenti generalizzate verso mirati consegna1. Nanotheranostic mirati consegna integra dimensioni nano vettori (nanoparticelle) con molecole teranostici stabilmente dirigere teranostici molecole di uno specifico tessuto malato o via biochimica2,3,4 . La nanomedicina è venuto alla ribalta della somministrazione mirata perché in modo ottimale dimensioni nanoparticelle hanno la capacità di stabilizzare la circolazione delle molecole teranostici e mirare selettivamente molecole di superficie cellulare presentati su tessuti malati. Molte piattaforme di nanotheranostic soffrono ancora di uptake cellulare passiva, degradazione prematura, tossicità e insufficiente collaborazione con molecole teranostici. VLP superare molti di questi ostacoli in somministrazione mirata. Sono stati utilizzati come nanovettori Visualizza epitopi stranieri e/o consegnare piccole molecole: un regime che può essere usato per combattere molte malattie1. Questa applicazione si basa principalmente sulla proprietà di auto-assemblaggio così come la facilità di modificazioni genetiche, per soddisfare l'applicazione progettata per il determinato VLP. Rispetto all'ingegneria genetica, coniugazione chimica dei peptidi stranieri a VLP Visualizza un vantaggio significativo perché permette una grande varietà di soggetti, quali peptidi o oligosaccaridi, per essere coniugata con la superficie di VIP in un modulato e modo flessibile senza alterazione dell'Assemblea VLP.
HEVNPs, derivati dalla proteina del capside HEV ricombinante, 2nd aperto lettura telaio (ORF2), sono non-infettiva, auto-assemblanti capsidi capace di cella-associazione e voce. Perché HEV evoluto per la trasmissione della mucosa, la proteina del capside assemblato è allo stesso modo stabile in condizioni mucoso proteolitici e acide5. HEVNPs formare una cavità, T = 1 capside icosaedrica, composto da 60 unità identiche6,7 di ORF2, rendendolo altamente stabile sia in condizioni fisiologiche in deposito. In mancanza di qualsiasi elemento genetico virale, la produzione efficiente, ad alto rendimento si ottiene attraverso il sistema di espressione di baculovirus in cellule di insetto. A causa della loro stabilità proteolitica, HEVNPs auto-assemblati vengono estratti e purificati dal surnatante delle cellule, riducendo notevolmente la procedura di purificazione necessaria. Inoltre, HEVNPs possiedono un superficie esposta protrusione dominio (P) collegato attraverso una cerniera flessibile ad una stabile base icosaedrica. Il dominio P forma picchi di superficie-esposta sopra la base icosahedral mentre la cerniera flessibile rende possibile modificare sensibilmente il dominio P senza compromettere la struttura icosaedrica. Con 60 unità ripetute, singola modifica site-specific si traduce in 60 siti simmetriche per modulazione chimica. Recentemente, abbiamo proposto una nano-piattaforma usando HEVNP che sappia coniugare chimicamente ligandi o piccole molecole per applicazioni teranostici. Questo è stato ottenuto sostituendo un singolo aminoacido con cisteina nel dominio di protrusione di HEV-VLP come un sito di reazione con molecole o peptidi maleimide-collegata. Sulla base di precedenti analisi strutturali di HEV-VLP e ben studiati gli epitopi immunogenici8,9i seguenti cinque di aminoacidi HEV-VLP sono stati sostituiti con cisteina come potenziali candidati: Y485C, T489C, S533C, N573C e T586C ( Figura 1). Dopo espressione e purificazione da cellule di insetto, loro formazioni VLP sono stati confermati tramite l'osservazione di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione (Figura 2), e i siti di cisteina esposta sono stati analizzati mediante Western blot dopo biotina legata al maleimide Coniugazione (Figura 2). Tra i cinque mutanti, HEVNP - 573C visualizzato il segnale più forte di coniugazione maleimide-biotina (Figura 2) ed è stato usato per follow-up dimostrazione come il nanocarrier per cellule di cancro al seno destinazione4 (Figura 3).
Questo protocollo descrive metodi di coniugazione chimica per allegare molecole targeting tumorale HEVNPs attraverso la coniugazione di cisteina superficiale. Dettagliamo la coniugazione di molecole di targeting e di rilevazione del tumore per la consegna del tumore con HEVNPs ricombinante contenente una cisteina a N573 (HEVNP - 573C). Ci siamo concentrati su un processo di coniugazione chimica clic in due passaggi per associare un tumore di cancro del seno targeting peptide, LXY3010 per HEVNPs al modulo LXY30-HEVNP (Figura 4). Successivamente, N-hydroxysuccimide (NHS)-CY 5.5 sono state coniugate al sito Lys separato su HEVNPs per costruire LXY30-HEVNP-CY 5.5 per rilevazione fluorescente sia in vitro (Figura 5) e in vivo4.
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Protocol
1. HEVNP produzione in cellule di insetto
Nota: Tutti i passaggi seguenti dovrebbero essere eseguite in una cappa di cultura cellulare. Fare riferimento alla nostra precedente pubblicazione per procedure più dettagliate produzione di HEVNP11.
- Cellule in insetto Sf9 cella media (Vedi Tabella materiali) alla confluenza di 50-75% in piastre da 6 pozzetti.
- Utilizzando i reagenti di transfezione delle cellule di insetto secondo i protocolli del produttore, transfect Bacmids contenente HEVNP - 573 C ORF2 in Sf99 cellule per produrre baculovirus ricombinanti. Incubare le cellule transfected a 27 ° C per 3-6 giorni, a seconda la vitalità delle cellule.
- Raccogliere il supernatante a 3-6 giorni post-infezione (dopo il transfected le cellule vengono lisate dovuto l'infezione di baculovirus) P0 baculovirus stock.
- Rimuovere il mezzo di cultura prima di applicare 200 µ l di P0 stock al 50-75% cellule Sf9 confluenti in un fiasco di monostrato di2 cm 25. Per garantire la copertura completa dell'inoculo della roccia il matraccio ogni 15 min. Ripetere 4 volte, per un totale di 60 min.
- Aggiungere 2 mL di terreno di coltura delle cellule dell'insetto al pallone e mantenere a 27 ° C per 3-6 giorni, a seconda di attuabilità delle cellule, per amplificare baculovirus per un più alto titolo.
- Eseguire analisi di placca per ottenere il titolo di baculovirus lettura12.
- Coltura le cellule di insetto Tn5 sospese (Tabella materiali) con 100 mL di mezzo di insetto cellulare in pallone da 250 mL e agitare a 27 ° C a 150 rpm ad un titolo di 0,5 x 105 - 1 x 106 per inoculazione.
- Aggiungere baculovirus ad una molteplicità di infezione (MOI) delle cellule di Tn5 5-10 a 100 mL in un pallone da 250 mL. Dopo l'inoculazione, agitare a 27 ° C a 150 rpm per 5-7 giorni.
- Una volta che la maggior parte delle cellule sembrano avere vescicole e 70-90% delle cellule sono morti sotto osservazione del microscopio ottico, raccogliere le cellule Tn5 e trasferire nelle provette ultracentrifuga 33 mL. Posto l'ultracentrifuga tubi in oscillazione secchio rotori, equilibrio e spin-down i detriti cellulari e Baculoviridae ricombinante a 10.000 x g per 90 minuti a 25 ° C.
- Mantenere il supernatante contenente il HEVNPs rilasciato a 4 ° C per ulteriore purificazione. Per un prolungato stoccaggio di baculovirus surnatante, aggiungere gli inibitori della proteasi.
2. HEVNP purificazione
- Pellet e isolare il HEVNPs utilizzo della separazione dei gradienti al cesio cloruro (CsCl):
- Trasferire il surnatante raccolto (dal punto 1.10) e aggiungere 20% NP-40 in ciascuna provetta per rendere una concentrazione finale di 0,5% NP-40 per sciogliere qualsiasi restante membrana cellulare. Delicatamente mescolare pipettando e incubare per almeno 30 minuti a 25 ° C.
- Ultracentrifuga HEVNPs a 112.400 x g in oscillazione secchio rotori per 2 h a 4 ° C a pellet giù il HEVNPs dal surnatante. Eliminare il supernatante dopo centrifugazione e delicatamente risospendere il pellet di greggio a 200 µ l di tampone 10 mM MES pH 6.2 in ciascuna provetta durante la notte (O/N) a 4 ° C. Eseguire SDS-PAGE (punto 3.1) per confermare la presenza di HEVNP ORF2 nel pellet grezza come una fascia di kDa 52.
- Preparare una sfumatura di CsCl 38,5% (p/v) di miscelazione g 1,96 CsCl, il greggio risospeso e ~ 4 mL di 0,01 M a pH MES 6.2 in una provetta da 5 mL ultracentrifuga. Bilanciare i tubi e posizionare in un rotore oscillante. Ultracentrifuga a 147.000 x g per 16 h a 4 ° C.
- Raccogliere le frazioni dopo CsCl gradiente:
- Scartare la frazione superiore di 500 µ l, che è principalmente membrana cellulare leggero detriti. Raccogliere 500 frazioni µ l, a partire dalla parte superiore del tubo e cambiare suggerimenti tra ciascuna frazione. Inserire ogni frazione in provette numerate/etichettato 1,5 mL.
Nota: La presenza di HEVNP ORF2 in frazioni separate da CsCl gradiente non può essere rilevato mediante l'esecuzione SDS PAGE gel dovuta all'alta concentrazione di CsCl. Il CsCl in ogni frazione può essere rimosso o diluito seguendo una procedura di pulitura di CsCl. In alternativa, il gradiente di CsCl può essere sostituito da un gradiente di saccarosio13 di 10-40% per evitare residui CsCl. - Ogni frazione di trasferimento ad un tubo di ultracentrifuga di 5 mL e diluire il CsCl con 4,5 mL di 10 mM MES, pH 6,2. Bilanciare i tubi e posizionare in un rotore oscillante. Ultracentrifuga a 147.000 x g per 2 ore a 4 ° C a pellet giù il HEVNPs.
- Scartare il surnatante e Risospendere delicatamente il HEVNPs in 100 µ l di 10 mM a pH MES 6.2 in ciascun tubo. Coprire le provette per evitare l'evaporazione e incubare O/N a 4 ° C.
- Registrare la lettura A280 ed il rapporto A260/A280 nm rapporto utilizzando uno spettrofotometro. Determinare la concentrazione approssimata di ORF2 come:
Ogni ORF2 conterrà 1 sito di Cys e 1 sito di Lys per coniugazione chimica.
Nota: Il coefficiente di estinzione molare di HEVNP ORF2 è 60.280, che equivale a 1,019 mg/mL × A280. Questo è così vicino a 1:1 che la concentrazione di HEVNPs (in mg/mL) può essere approssimata dall'A280 e di conseguenza, la concentrazione di ORF2 dalla suddetta equazione. Ad esempio, un HEVNP con una lettura di A280 di 1 avrà una concentrazione di 1 mg/mL, che è equivalente a 18,8 µM ORF2. - Preparare una SDS-PAGE. Utilizzare un 6 µ l di campione da ogni frazione per determinare le frazioni contenenti 53,3 proteina di kDa HEVNP ORF2 (punto 3.1). Il HEVNPs dovrebbe essere trovato in frazioni 3-5, con una densità di ~1.25 g/mL.
- Confermare la presenza e la purezza della HEVNPs tramite l'osservazione di TEM. Preparare o diluire i campioni HEVNP a 0,5 - 2,0 mg/mL per il TEM. I HEVNPs appaiono nel TEM come proteine icosahedral vuote, ~ 27 nm di diametro (Figura 2). Alcuni contaminanti di proteina possono rimanere nelle frazioni e saranno osservati sotto TEM (punto 3.2).
- Scartare la frazione superiore di 500 µ l, che è principalmente membrana cellulare leggero detriti. Raccogliere 500 frazioni µ l, a partire dalla parte superiore del tubo e cambiare suggerimenti tra ciascuna frazione. Inserire ogni frazione in provette numerate/etichettato 1,5 mL.
- Nel caso che le impurità sono presenti sotto TEM, ripetere il punto 2.1.3 - 2.2.6 per migliore purezza della HEVNPs.
Nota: Purificazione Extra attraverso CsCl gradiente può causare perdita di resa di HEVNPs. In alternativa, la purificazione di gradienti di CsCl può essere sostituita da un gradiente di saccarosio di 10-40% per evitare residui di CsCl13.
3. HEVNP caratterizzazione
- Preparare gel proteina Bis-Tris di 4-12% del SDS PAGE, 1.0 mm, 17-wells (Vedi Tabella materiali) secondo il manuale dell'utente14:
- Aggiungere 2 µ l di 4 x caricamento buffer per 6 µ l di campione della proteina. Incubare la miscela del campione in un blocco di calore per 10 min a 100 ° C per denaturare la proteina. Caricare i campioni della proteina sul gel.
- Eseguire la SDS-PAGE impostando l'alimentatore CC a 100 V per 10 min, poi 150 V per 45 min fino a quando gli esempi eseguiti a circa 1 cm sopra il fondo del gel.
- Macchia del gel di SDS PAGE con blue di Coomassie (0,25% (p/v) Coomassie Brilliant Blue R250, 30% (v/v) metanolo, acido acetico 10% (v/v)), per 1 h.
- Dopo la procedura di colorazione, rimuovere la macchia blu di Coomassie e applicare la de-colorazione buffer (30% (v/v) metanolo, acido acetico 10% (v/v)) in gel di proteina per > 12 h a temperatura ambiente.
- Documentare il gel sotto luce bianca per confermare la presenza di HEVNP ORF2 presso la band 52 kDa.
- Osservare il HEVNPs utilizzando TEM.
- Preparare o diluire i campioni HEVNP di 0.5 - 2 mg/mL con 10 mM a pH MES 6.2 per l'imaging di TEM.
- Ionizzare le griglie rivestite di carbonio con scarico di incandescenza 40 mA per 30 s per produrre una superficie idrofila carbonio. Le attrezzature di scarico di incandescenza sono descritta nella Tabella materiali.
Nota: La superficie idrofila carbonio delle griglie può solo ultima per 30 min dopo bagliore di scarico trattamento. - Tenere a pinzette e aggiungere 2 µ l di campione HEVNP alla griglia, attendere per 15-30 s e tamponare con carta da filtro.
- Lavare immediatamente la griglia con ddH20 e tamponare con carta da filtro.
- Immediatamente aggiungere 2 µ l di acetato di uranile 2% alla griglia, aspettare 15 s, poi tamponare con carta da filtro. A secco le griglie di esempio mettendoli in un formato elettronico deumidificare Governo asciutto per O/N.
- Trasferire la griglia in un TEM e immagine all'ingrandimento 10 - 80K. HEVNPs appaiono in TEM come vuote icosahedral proteine che sono ~ 27 nm di diametro, a causa dell'assenza di RNA virale.
4. chimica coniugazione del HEVNPs con biotina, cancro Targeting ligando e fluorofori
- Eseguire una coniugazione di passaggio di HEVNPs e biotina maleimide collegato.
- Cambiamento del buffer: applicare il HEVNPs nelle unità di dialisi mini e Dializzare contro PBS 0,01 M a pH 7.4 a temperatura ambiente per 1 h secondo il protocollo del produttore (Tabella materiali). Trasferire la HEVNPs per provette da 1,5 mL e misurare la concentrazione di proteina a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro.
- Mescolare il HEVNP a 1 mg/mL, che è equivalente a 18,8 µM di Cys reazione siti (Vedi dettagli al punto 2.2.4), con una quantità uguale di maleimide-biotina (100 µM) in PBS 0,01 M, pH 7.4, per rendere un rapporto molare 1:5; reagire O/N a 4 ° C. Rimuovere la biotin-maleimide non con una procedura di colonna 40K MWCO Spin desalazione secondo il protocollo del produttore (Tabella materiali).
- Analizzare i campioni attraverso standard riduzione dello SDS-PAGE (punto 3.1).
- Utilizzando le procedure standard, preparare un chemiluminescente Western Blot utilizzando streptavidina HRP-collegata. Catturare il segnale chemiluminescente dalla pellicola di raggi X (Figura 2).
- Eseguire il passaggio due LXY30 coniugazione a cisteina superficie esposta su HEV NPs (Figura 5).
- Cambio del buffer: applicare HEVNPs in dialisi mini e Dializzare contro PBS 0,01 M a pH 7.4 a temperatura ambiente per 1 h. trasferimento del HEVNPs per provette da 1,5 mL e misurare la concentrazione di proteina a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro.
- Aggiungere 650 µM maleimide-azide e 650 µM alchino-LXY3010 in 0,01 M PBS pH 7.4 con 200 µM CuSO4 e 1 mM acido ascorbico per formare LXY30 maleimide-collegato (Mal-LXY30) a 650 µM. Incubare la miscela a 4 ° C per O/N.
- Mescolare il HEVNP a 1 mg/mL, che è equivalente a 18,8 µM di Cys sito di reazione (Vedi dettagli al punto 2.2.4), con circa il 10% volume di Mal-LXY30 (650 µM) in PBS 0,01 M a pH 7.4, per rendere un rapporto molare 1:3; reagire O/N a 4 ° C.
Nota: A causa della concentrazione relativamente alta di Mal-LXY30, le concentrazioni finali dei reagenti, ad esempio CuSO4, sono ridotti circa 10 volte dopo la miscelazione, per evitare loro danni al HEVNPs. Un'altra opzione è la Cu-libera coniugazione metodo15. - Rimuovere unbound maleimide-clicca-LXY30 con una colonna K MWCO Spin desalificazione 40 secondo il protocollo del produttore (Vedi Tabella materiali). Mantenere il HEVNPs LXY30-collegato (LXY30-HEVNPs) a 4 ° C.
- Eseguire una coniugazione di passo della LXY30-HEVNPs e CY 5.5 NHS estere (NHS-CY 5.5)
- Mescolare il HEVNPs LXY30-collegato (LXY30-HEVNPs) a 1 mg/mL, che è equivalente a 18,8 µM del sito reazione Cys (Vedi dettagli al punto 2.2.4), con un volume uguale di NHS-CY 5.5 (100 µM) in PBS 0,01 M a pH 7.4 per rendere un rapporto molare 1:5; reagire O/N a 4 ° C.
- Rimuovere unbound CY 5.5-NHS con una procedura di colonna MWCO Spin desalificazione 40K secondo il protocollo del produttore (Vedi Tabella materiali). Tenere le LXY30, CY 5.5-collegato HEVNPs (LXY30-HEVNP-CY 5.5) a 4 ° C.
5. HEVNP associazione a e internalizzazione in cellule di cancro al seno MDA-MB231
- Cellule di cancro al seno MDA-MB231 semi in un bicchiere da 35 mm fondo piatti (5 x 104 per ogni piatto) O/N in una coltura di cellule di mammifero armadietto.
- Per l'esperimento di associazione di cella, è possibile preparare LXY30-HEVNP-CY 5.5 dai seguenti passaggi 4.2-4.3. Diluire il LXY30-HEVNP-CY 5.5 a 0,01 mg/mL, che è equivalente a 0,188 µM di HEVNP ORF2 (fare riferimento al punto 2.2.4), a 250 µ l di 0 - 1% FBS/DMEM.
- Preparare il campione di controllo negativo a 0,01 mg/mL HEVNP-CY 5.5 eseguendo il passaggio 4.3 ma coniugati con NHS-CY 5.5 tintura solo, (HEV-CY 5.5). Diluire il HEVNP-CY 5.5 a 0,01 mg/mL, che è equivalente a 0,188 µM di HEVNP ORF2 (fare riferimento al punto 2.2.4), a 250 µ l di 10% FBS completati con DMEM.
- Lavare le cellule una volta applicando 250 µ l di tampone PBS di 1 M, pH 7,4. Rimuovere il tampone PBS dopo il lavaggio, mantenendo alcuni buffer nella piastra di coltura delle cellule.
- Applicare 250 µ l di LXY30-HEVNP-CY 5.5 in 10% FBS completati con DMEM o HEVNP-CY 5.5 in 10% FBS completati con DMEM per le cellule di cancro al seno MDA-MB231 coltivate. Scudo della cella coltivate piatti dalla luce con carta stagnola.
- Mantenere i piatti delle cellule coltivate in una coltura cellulare di 37 ° C per 1 h per internalizzazione armadietto.
- Lavare le cellule coltivate sul ghiaccio 3 volte, 5 min per lavaggio, con 250 µ l di PBS di 1 M, pH 7,4.
- Fissare le cellule in 4% PFA in 1m PBS, pH 7.4 per 20 minuti e poi lavare una volta con 250 µ l di PBS di 1 M, pH 7,4.
Nota: Le cellule sono ora pronte per essere ripreso da microscopio confocale. Dati rappresentativi sono illustrati nella Figura 5.
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Representative Results
Simile a HEV-VLP, Cys tutti modificato HEVNPs formata solubile icosahedral capsidi e non ha fatto aggregare in soluzione durante la produzione o purificazione. Prima e dopo coniugazione passo singolo maleimide-biotina, ciascuno della Cys modificato HEVNPs erano indistinguibili da HEV-VLP nella macchia negativa EM (Figura 2). Efficienza di coniugazione di maleimide-biotina di Cys HEVNPs modificate in primo luogo è stato testato con Western blotting attraverso il legame streptavidina chemiluminescente. Dopo coniugazione maleimide-biotina, Cys modificato HEVNPs visualizzato streptavidina associazione segnali (Figura 2).
Coniugazione di cisteina efficace in due fasi è stato influenzato dall'ordine in cui è stato effettuato coniugazione. Perché α3β1 integrina è essere overexpressed in cellule di tumore cancro al seno, un ligando sintetico, LXY30, con affinità specifica per α3β110, è stata selezionata come una molecola coniugata targeting tumorale. Funzionalizzazione di maleimide diretto (MaI) di LXY30 non era fattibile, perché LXY30 è ciclizzato attraverso un ponte disolfuro intermolecolari; quindi, ci era una preoccupazione per self-reactivity. Invece LXY30 funzionalizzati con un gruppo di alchini e associato a maleimide-azide attraverso una reazione chimica di clic. Quando NPs HEV - 573C erano tenuti ad maleimide-azide prima, seguita da una reazione chimica clicca per LXY30-alchino, NPs HEV - C 573 sembravano smontare sotto osservazione TEM (Figura 4). Tuttavia, una reazione chimica di clic iniziale tra LXY30-alchino e maleimide-azide a forma MaI-LXY30, seguita da coniugazione di MaI-LXY30 a HEVNPs Cys-modificato (LXY30-Mal-CY 5.5) non ha colpito la sua struttura (Figura 4B). Figura 4 descrive lo schema di LXY30-funzionalizzazione delle HEVNPs per il targeting di cellula tumorale.
HEVNPs coniugato al cancro al seno targeting ligando, LXY30 (LXY30-HEVNPs) associato e sono stati interiorizzati in cellule di cancro al seno coltivate. Per rilevazione fluorescente, LXY30-HEVNPs e non associato HEVNP-573Cs sono stati etichettati con NHS funzionalizzati CY 5.5 colorante fluorescente (NHS-CY 5.5) attraverso l'accoppiamento di ammina primaria di lisina su HEVNP-573Cs. LXY30-HEVNP-CY 5.5 e HEVNP-CY 5.5 sono stati applicati a colta cancro al seno cellule (MDA-MB-231) e osservati al microscopio confocale. Le immagini di fluorescenza NIR da microscopio confocale indicano che lxy30-HEVNP-CY 5.5 aveva associazione maggiore affinità per e internalizzazione aumentata in cellule di cancro al seno MDA-MB-231 confrontato con HEVNP-CY 5.5 (Figura 5).
Figura 1: sostituzione di cisteina nel dominio di protrusione di superficie del virus di epatite E nanoparticelle. Mutazioni di cisteina sono stati proposti per i residui Y485, T489, S533, N573 e T586 presso la regione di bobina flessibile per ridurre al minimo il disturbo per la struttura secondaria di HEV ORF2 (A). Tutti i residui selezionati per mutazione di cisteina si trovano sulla superficie del dominio protrusione (P) (grigio; gli altri domini sono la shell (S) - dominio in blu e medio (M) - dominio in rosa), con residuo Y485 (ciano), T489 (giallo), T586 (arancione) sull'estremo superficie e residui S533 (magenta) e N573 (rosso) sul lato rivolto verso l'asse quintuplo del HEVNP (B). La figura è stata modificata da Chen et al 20164 con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: caratterizzazione di HEVNP trasporto N573C come un esempio per tutti i Cys modificato HEVNPs. Il HEVNP - 573C è comparso come proiezioni sferiche su micrografi elettronici (A) e rimasto come particelle intatte dopo coniugazione Mal-alchilanti (B). Risultati rappresentativi dell'esposizione coniugazione ed epitopo di Cys-modificato HEVNPs. Erano vincolati a maleimide-biotina tramite l'accoppiamento di cisteina-maleimide e successivamente analizzati mediante Western blot per l'associazione di streptavidina. La mutazione di cisteina alle N573 ammessi biotinylation efficiente per la HEVNP rispetto agli altri siti di mutazione, cioè, Y485, T489, S533 e T586 (C). Barra è uguale a 100 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: schema delle cellule di cancro al seno che mirano specificatamente con Cy 5.5-etichetta LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-CY 5.5). LXY30-HEVNP-CY 5.5 legare selettivamente alle cellule di cancro del seno (magenta) a causa di affinità specifica di LXY30 a α3β1, che è un'integrina sovra-espressa sulla membrana delle cellule di cancro al seno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: schema dei processi di coniugazione chimica in due fasi, tra cui una reazione tiolo-selettiva e una cicloaddizione catalizzata rame azide-alchino o 'click chemistry' reazione di costruire LXY30-HEVNPs. Due metodi sono stati testati. Metodo 1: il rame catalizzato azide-alchino reazione di cicloaddizione tra Mal-azide e alchino-LXY30 a forma LXY30 Mal-collegato (Mal-LXY30) è stata effettuata prima. Quindi il Mal-LXY30 è stato aggiunto a reagire con il sito di Cys di HEV - C 573 NPs (A). Il LXY30 e CY 5.5 decorato HEV - C 573 NPs (LXY30-HEVNP-CY 5.5) è rimasta intatta dopo tutto questi processi di coniugazione chimica (B). Metodo 2: il processo di coniugazione inizia identificando azoturo di Mal-collegato (Mal-Azide) presso il sito di Cys di HEV - C 573 NPs attraverso una reazione tiolo-selettivo per costruire HEVNPs azide-collegato (Azide-HEVNPs), seguita dalla aggiunta di LXY30-alchino, acido ascorbico e CuSO4 per formare legata al LXY30 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (A). Tuttavia, la maggior parte LXY30-HEVNPs sono state danneggiate o smontati dai processi di coniugazione, che possono essere causati dai reagenti reattivi, compreso azide, acido ascorbico e CuSO4 (C). Mal: Maleimide. Questa figura è stata modificata da Chen et al 20164 con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: risultati rappresentativi dell'associazione cellulare e interiorizzazione di fluorescente etichettati LXY30-HEVNPs, che si lega alle cellule di cancro del seno MDA-MB-231. Immagini di fluorescenza NIR di LXY30-HEVNP-CY 5.5 targeting per cellule MDA-MB-231. Il segnale dei nuclei, che si erano macchiati di DAPI (blu), e il segnale di CY 5.5 (rosso) sono stati acquisiti utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale. Questa figura è stata modificata da Chen et al 20164 con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
A differenza della procedura di ingegneria genetica che richiede tempo, che prende di solito settimane, Qui dimostriamo in due semplici passaggi e le procedure di coniugazione chimica One-Step, che possono essere completate entro 3 giorni, aggiungendo il cancro ligando di targeting e/o fluorescenza della tintura di rilevamento per i siti di Cys/Lys di HEVNPs. La tecnica può essere utilizzata a schermo per la migliore destinazione di legante da un pool di candidati e quindi sfrutta i servizi di sintesi disponibili peptide/piccola molecola in un tempo ragionevole costo e consegna.
A differenza della tradizionale ingegneria genetica, che può solo inserire i polipeptidi in proteine di interesse, la coniugazione chimica può collegare vari materiali tra cui polipeptidi, piccole molecole chimiche e nano-particelle sulla superficie della proteina di interesse, fintanto che c'è un residuo di Cys o Lys per essere utilizzato come il sito reattivo. Se non c'è nessun tale residuo presso il sito di coniugazione chimica, sostituzione di Cys/Lys semplice può essere geneticamente modificato sulla proteina di interesse per renderlo chimicamente attivabili come illustrato nella precedente ricerca4.
Per controllare che la coniugazione chimica si verifica solo sui siti di reazione selettiva, la struttura della molecola coniugata e proteina di essere coniugati necessità di essere studiato a fondo per evitare la reattività intramolecolare. Come dimostrato nel presente documento con il cancro di seno targeting peptide LXY3010, un legame bisolfurico critico stabilizza conformazione ciclica ligando. Dato il tiolo-reattività di maleimide, diretta maleimide-funzionalizzazione di ligandi LXY30 probabilmente porterà nella reattività intramolecolare. Invece, coniugazione di due step (passo 4.2) è stato effettuato facendo reagire l'azoturo di maleimide-collegato con LXY30 alchini-collegato attraverso reazione chimica clicca. Tuttavia, la sequenza della reazione chimica clicca e reazione tiolo-selezionato è fondamentale per l'integrità conformazionale del LXY30-HEVNPs (Figura 4). Attraverso una reazione chimica-clicca di CuSO4 catalizzata, LXY30 era indirettamente associato a maleimide per costruire MaI-LXY30. Successivamente, la MaI-LXY30 sono coniugati a HEVNP - 573C tale che il formato LXY30-HEVNPs può mantenere la loro struttura icosaedrica nativa (Figura 4).
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono la sponsorizzazione del finanziamento a RHC di NIH concedere #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Istituto nazionale di cibo e agricoltura, nonché il programma Finlandia Distinguished Professor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
References
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