Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Functionalization פני השטח של חלקיקי וירוס הפטיטיס E בשיטות כימיות ההטיה

Published: May 11, 2018 doi: 10.3791/57020
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis
* These authors contributed equally

Summary

שתכננו את החלבון capsid של וירוס הפטיטיס E כמו ננו-חלקיק theranostic (HEVNP). HEVNP עצמי מרכיבה לתוך כלוב icosahedral יציב במשלוח הרירית. כאן, אנו מתארים את השינוי של HEVNPs לגידול מיקוד על ידי מוטציה השטח החשופים שאריות אל cysteines, אשר נזווג סינתטי ליגנדים שקושרים במיוחד תאים סרטניים.

Abstract

חלקיקים דמויי וירוס (האח מים) שימשו nanocarriers להציג epitopes זרים ו/או לספק מולקולות קטנות זיהוי וטיפול במחלות שונות. יישום זה מסתמך על ההנדסה הגנטית, הרכבה עצמית, ציסטאין ההטיה כדי למלא את היישום פילוח הגידול של האח מים רקומביננטי. לעומת גנטי מציע שינוי לבד, כימיה ההטיה של פפטידים זרים כדי האח מים משמעותי יתרון משום שהיא מאפשרת מגוון רחב של גופים, כגון peptides סינתטי או oligosaccharides, כדי להיות מצומדת השטח של האח מים בצורה מווסתת ו גמיש ללא שינוי של מכלול האח מים.

. הנה, נדגים כיצד להשתמש את הפטיטיס E וירוס ננו-חלקיק (HEVNP), modularized theranostic קפסולה, כנשא משלוח רב תכליתיים. פונקציות של HEVNPs כוללים פילוח רקמות, הדמיה ומסירת טיפולית. בהתבסס על המחקר המבני ומבוססת של HEVNP, משקעי מבנית עצמאית, השטח החשופים נבחרו עבור החלפת ציסטאין כאתרי ההטיה לקבוצות מקושרים maleimide כימי באמצעות קישורים תיול-סלקטיבית. אחד מסוים ציסטאין-השתנה HEVNP (תחליף Cys של אספרגין-573 aa (HEVNP - 573C)) היה מצומדת השד סרטן תאים ספציפיים ליגנד, LXY30 ומוענקת -סגול (ניר) זריחה צבען (Cy5.5), עיבוד של הגידול, ממוקדות HEVNPs כמו קפסולות אבחון יעיל (LXY30-HEVNP-Cy5.5). אסטרטגיות הנדסיות דומה יכול להיות מועסק עם שאר מכלולי macromolecular עם הבראבה ידועים לחקור יישומים פוטנציאליים משלוח theranostic.

Introduction

הפיתוח של וקטורים בגודל ננו במשלוח איבחוניות, המכונה nanotheranostics, השתנתה הרבה בתחום הביו-רפואי מן הטיפולים כללית לקראת משלוח ממוקד1 משלוח nanotheranostic יישוב משתלב בגודל ננו וקטורים (חלקיקים) עם מולקולות theranostic לכוון stably theranostic מולקולות ספציפיות רקמה חולה או מסלול ביוכימי2,3,4 . ננו-רפואה הגיע לחזית של משלוח ממוקד כי חלקיקים בגודל אופטימלי יש את היכולת לייצב את זרימת הדם של מולקולות theranostic, באופן סלקטיבי היעד מולקולות על פני התא המוצג לרקמות החולות. פלטפורמות nanotheranostic רבות עדיין סובלים ספיגת תא פסיבי, השפלה טרום בוגרת, רעילות, האגודה לא מספיקות מולקולות theranostic. האח מים להתגבר על הרבה מכשולים אלה במשלוח ממוקד. הם שימשו nanocarriers להציג epitopes זרים ו/או לספק מולקולות קטנות: משטר יכול לשמש כדי להילחם במחלות רבות1. יישום זה מסתמך בעיקר על הרכוש של הרכבה עצמית כמו גם להקל על שינויים גנטיים, כדי למלא את היישום תוכנן עבור האיש החשוב נתון. בהשוואה להנדסה גנטית, ההטיה כימי של פפטידים זרים כדי האח מים מציג יתרון משמעותי משום שהוא מאפשר מגוון גדול של ישויות, כגון פפטידים או oligosaccharides, כדי להיות מצומדת השטח של האח מים ב מאופנן ו באופן גמיש ללא שינוי של האח מים הרכבה.

HEVNPs, נגזר HEV capsid חלבון רקומביננטי, 2nd פתח קריאה מסגרת (ORF2), הם שאינן זיהומיות, הרכבה עצמית capsids מסוגל התא מחייב כניסה. כי HEV התפתח לשידור הרירית, החלבון capsid שהורכב יציב באופן דומה הפרוטאוליטי ותנאי הרירית חומצי5. HEVNPs טופס חלול, T = 1 icosahedral capsid, המורכב 60 יחידות זהות6,,7 , של ORF2, טיוח זה יציב מאוד גם אחסון וגם בתנאים פיזיולוגיים קשים. חסר כל מרכיבים גנטיים ויראלי, תשואה גבוהה, יעילות הייצור מושגת באמצעות מערכת baculovirus ביטוי בתאי חרקים. בגלל היציבות הפרוטאוליטי שלהם, HEVNPs עצמית שהורכב חילוץ, מטוהרים מן התא תגובת שיקוע, נחוץ טיהור צעדים לצמצום משמעותי. בנוסף, HEVNPs בעלי תחום בליטה חשוף שטח (תחום P) מחובר באמצעות ציר גמיש כדי icosahedral בסיס יציב. התחום P צורות השטח החשופים קוצים על גבי הבסיס icosahedral בזמן הציר גמישה מאפשרת לך לשנות באופן משמעותי את התחום P מבלי להתפשר על מבנה icosahedral בסיס. עם 60 יחידות חוזרות ונשנות, שינוי בייעודי לאתר יחיד התוצאה 60 אתרים סימטרי עבור אפנון כימי. לאחרונה, הצענו ננו-פלטפורמה באמצעות HEVNP זה יכול מבחינה כימית נזווג ליגנדים או מולקולות קטנות עבור יישומים theranostic. זה הושג על-ידי החלפת חומצה אמינית בודדת של ציסטאין על תחום בליטה של HEV-הוי כאתר התגובה עם פפטידים מקושרים maleimide או מולקולות. בהתבסס על ניתוח מבנה הקודם של HEV-הוי ו-8,epitopes immunogenic למד היטב9, חומצות אמינו HEV-הוי חמש הבאה הוחלפו ציסטאין כמו מועמדים פוטנציאליים: Y485C, T489C, S533C, N573C ו- T586C ( איור 1). לאחר ביטוי וטיהור מתאי חרקים, תצורות האח מים שלהם שאושרו על-ידי שידור מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) תצפית (איור 2), ואת האתרים ציסטאין חשוף נותחו על ידי המערב כתם לאחר ביוטין מקושר-maleimide ההטיה (איור 2). בין המוטציות חמש, HEVNP - 573C את האות החזק ביותר של maleimide-ביוטין ההטיה (איור 2), מוצגים שימש להמשך להוכחה nanocarrier עבור תא סרטני השד מיקוד4 (איור 3).

פרוטוקול זה מתאר שיטות ההטיה כימי כדי לצרף פילוח הגידול מולקולות HEVNPs דרך משטח ציסטאין ההטיה. אנחנו פירוט את ההטיה של מולקולות מיקוד וזיהוי הגידול למסירה הגידול עם HEVNPs רקומביננטי המכיל של ציסטאין-N573 (HEVNP - 573C). אנחנו התמקדנו תהליך ההטיה דו-שלבי כימיה לחץ כדי לאגד גידול סרטן השד מיקוד פפטיד, LXY3010 כדי HEVNPs להיווצר LXY30-HEVNP (איור 4). לאחר מכן, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 היו מצומדת לאתר Lys נפרד HEVNPs לבנות LXY30-HEVNP-Cy5.5 לגילוי פלורסנט הן במבחנה (איור 5), ויוו4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. HEVNP ייצור בתאי חרקים

הערה: כל הפעולות הבאות צריכה להתבצע בשכונה התרבות תאים. מתייחסים לפרסום הקודם שלנו מפורט יותר HEVNP ייצור הליכים11.

  1. תרבות Sf9 בתאי חרקים תא מדיה (ראה טבלה של חומרים) 50-75% למפגש ב- 6-ובכן צלחות.
  2. באמצעות תא חרקים ריאגנטים תרביות תאים על פי הפרוטוקולים של היצרן, transfect Bacmids המכיל ORF2 HEVNP - 573 C לתאים Sf99 כדי לייצר baculovirus רקומביננטי. דגירה התאים transfected ב 27 מעלות צלזיוס במשך 3-6 ימים, בהתאם הכדאיות של תאים.
  3. לאסוף תגובת שיקוע ב- 3-6 ימים לאחר הפגיעה (לאחר התאים transfected הם lysed עקב זיהום baculovirus) ככל P0 baculovirus מניות.
  4. הסר בינוני תרבות לפני החלת µL 200 מניות P0 לתאים Sf9 confluent 50-75%, בבקבוקון חד שכבתי2 25 ס מ. סלע את הבקבוק כל 15 דקות על מנת להבטיח את כיסוי מלא inoculum. חזור על 4 פעמים, עבור סכום כולל של 60 דקות.
  5. להוסיף 2 מ של חרקים תא תרבות בינוני הבקבוק ולשמור ב 27 מעלות צלזיוס במשך 3-6 ימים, בהתאם הכדאיות של תאים, כדי להגביר את baculovirus כייל נוגדנים גבוה יותר.
  6. לבצע מבחני פלאק כדי להשיג את כייל נוגדנים baculovirus קריאה12.
  7. תרבות על תנאי Tn5 חרקים התאים (טבלה של חומרים) עם 100 מ של התא חרקים בינוני את הבקבוק 250 מ ל. וללחוץ ב 27 ° C-150 סל ד ל כייל של 0.5 x 105 - עונה 1 פרק 106 עבור חיסון.
  8. הוסף baculovirus-ריבוי של זיהום (MOI) של תאים Tn5 5-10 ל- 100 מ ל בקבוקון 250 מ. לאחר חיסון לרעוד 27 ° C-150 סל ד 5-7 ימים.
  9. לאחר רוב התאים מופיעים יש שלפוחית, 70-90% של תאים מתים תחת מיקרוסקופ אופטי תצפית, איסוף התאים Tn5 ולהעביר לתוך צינורות ultracentrifuge 33 mL. המקום ultracentrifuge צינורות פנימה דלי הרוטורים, איזון, ספין למטה את שאריות תאים וכן baculoviruses רקומביננטי ב g x 10,000 במשך 90 דקות ב 25 º C.
  10. שמור את תגובת שיקוע המכיל את HEVNPs שפורסמו ב 4 ° C לטיהור עוד יותר. עבור אחסון מורחב של baculovirus supernatant, מוסיפים מעכבי פרוטאז.

2. HEVNP טיהור

  1. גלולה ולבודד את HEVNPs באמצעות ההפרדה הדרגתיות צסיום כלוריד (CsCl):
    1. להעביר את תגובת שיקוע שנאספו (מתוך שלב 1.10) ולהוסיף 20% NP-40 לתוך כל שפופרת כדי להפוך ריכוז סופי של 0.5% NP-40 כדי להמיס כל הממברנה התאית הנותרים. בעדינות לערבב על-ידי pipetting, תקופת דגירה של פחות 30 דקות ב 25 º C.
    2. Ultracentrifuge HEVNPs ב g x 112,400 פנימה דלי הרוטורים עבור 2 h ב 4 ° C כדי הצניפה למטה HEVNPs מן תגובת שיקוע. למחוק את תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה, בעדינות מחדש להשהות בגדר גולמי ב- µL 200 של 10 מ מ MES מאגר pH 6.2 כל צינור לילה (O/N) ב 4 º C. לפעול למען חברה דמוקרטית-דף (שלב 3.1) כדי לאשר את הנוכחות של HEVNP ORF2 ב בגדר גולמי כלהקה kDa 52.
    3. להכין הדרגתי CsCl 38.5% (w/v) על ידי ערבוב 1.96 g CsCl, גלולה גולמי מחדש על תנאי ו ~ 4 מ"ל של 0.01 M MES pH 6.2 צינור ultracentrifuge מ. לאזן את הצינורות ולמקם רוטור דלי מתנדנדים. Ultracentrifuge-g x 147,000 עבור 16 h-4 מעלות צלזיוס.
  2. לאסוף את השברים לאחר מעבר צבע CsCl:
    1. למחוק את השבר µL העליון 500, אשר הוא בעיקר קרום התא קל משקל פסולת. לאסוף את השברים µL 500, החל העליון של הרכבת התחתית, ושנה טיפים בין כל שבר. מקם כל שבר לתוך צינורות ממוספרים/תווית mL 1.5.
      הערה: הנוכחות של HEVNP ORF2 בחלקים הופרדו CsCl הדרגה לא ניתן לאתרם באמצעות משטחים מרחביות דף בשל הריכוז הגבוה של CsCl. ניתן להסיר CsCl של כל שבר או מדולל על-ידי ביצוע הליך לנקות CsCl. לחלופין, ניתן להחליף את המילוי ההדרגתי CsCl 10-40% סוכרוז הדרגתיות13 כדי להימנע CsCl שיורית.
    2. להעביר את כל השבר צינור ultracentrifuge מ ל ו לדלל את CsCl עם 4.5 מ ל 10 מ מ MES, pH 6.2. לאזן את הצינורות ולמקם רוטור דלי מתנדנדים. Ultracentrifuge-147,000 g x עבור 2 h-4 ° C עד הצניפה למטה HEVNPs.
    3. למחוק את תגובת שיקוע, בעדינות מחדש להשעות את HEVNPs ב µL 100 של pH MES 10 מ מ 6.2 ב כל שפופרת. לכסות את הצינורות כדי למנוע אידוי דגירה O/N ב 4 º C.
    4. להקליט את הקריאה A280 ויחס A260/A280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים. לקבוע את הריכוז משוער של ORF2 כמו:
      Equation
      כל ORF2 יכיל 1 Cys האתר והאתר Lys 1 עבור ההטיה כימי.
      הערה: המקדם טוחנת הכחדה של HEVNP ORF2 הוא 60,280, שהוא שווה ערך ל 1.019 מ"ג/מ"ל × A280. זה כל כך קרוב ל- 1:1 זה ניתן לקרב את ערכיהן ריכוז HEVNPs (ב- mg/mL) מאת את A280, ולכן, הריכוז של ORF2 על ידי המשוואה הנ ל. לדוגמה, HEVNP עם קריאת A280 1 יש ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל, אשר מקבילה מיקרומטר 18.8 ORF2.
    5. הכן של מרחביות-עמוד. השתמש מדגם 6 µL מתוך כל שבר כדי לקבוע שברים המכיל kDa HEVNP ORF2: 53.3 חלבון (שלב 3.1). צריך למצוא את HEVNPs שברים 3-5, עם צפיפות של ~1.25 g/mL.
    6. לאשר הנוכחות והטוהר של HEVNPs על ידי התבוננות TEM. להכין או לדלל את דגימות HEVNP 0.5 - 2.0 mg/mL עבור TEM. HEVNPs מופיעים ב- TEM חלבונים icosahedral ריקים, ~ 27 nm קוטר (איור 2). מזהמים חלבונים מסוימים עשויים להישאר בהשברים, יתקיימו תחת TEM (שלב 3.2).
  3. במקרה כי זיהומים נמצאים תחת TEM, חזור על שלב 2.1.3 - 2.2.6 עבור טוהר טוב יותר HEVNPs.
    הערה: טיהור נוסף דרך מעבר CsCl עלול לגרום אובדן תשואה של HEVNPs. לחלופין, ניתן להחליף הטיהור הדרגתיות CsCl 10-40% סוכרוז מעבר צבע כדי להימנע CsCl שיורית13.

3. HEVNP אפיון

  1. להכין דף מרחביות 4-12% Bis-טריס חלבון ג'ל, 1.0 מ מ, 17-ולס (ראה טבלה של חומרים) על פי ידנית של המשתמש14:
    1. להוסיף 2 µL של 4 x טעינת מאגר כדי µL 6 מדגם חלבון. דגירה התערובת מדגם בתוך גוש חום למשך 10 דקות ב- 100 ° C כדי denature החלבון. לטעון את דגימות חלבון על גבי הג'ל.
    2. הפעל מרחביות-הדף על-ידי הגדרת את אספקת החשמל DC ב- 100 וולט למשך 10 דקות, ואז 150 V למשך 45 דקות עד הדגימות נוסעות כ-1 ס מ מעל החלק התחתון של הג'ל.
    3. כתם הג'ל מרחביות דף עם Coomassie כחול (0.25% (w/v) R250 כחול מבריק Coomassie, מתנול 30% (v/v), 10% (v/v) חומצה אצטית), עבור 1 h.
    4. לאחר הניתוח מוכתמים, להסיר את הכתם הכחול Coomassie ולהחיל מאגר מבטל את ההגדלה (30% (v/v) מתנול, 10% (v/v) חומצת חומץ) על גבי הג'ל חלבון עבור > 12 שעות בטמפרטורת החדר.
    5. תעד את הג'ל תחת אור לבן כדי לאשר את הנוכחות של HEVNP ORF2-הלהקה 52 kDa.
  2. לבחון את HEVNPs באמצעות TEM.
    1. להכין או לדלל את דגימות HEVNP 0.5 - 2 מ"ג/מ"ל עם pH MES 10 מ מ 6.2 עבור TEM הדמיה.
    2. Ionize את רשתות מצופים פחמן עם אמא 40 זוהר פריקה 30 s כדי לייצר משטח פחמן הידרופילית. ציוד פריקה זוהר מתוארת בטבלה של חומרים.
      הערה: השטח פחמן הידרופילית של הרשתות יכול רק האחרון במשך 30 דקות אחרי זוהר פרוק טיפול.
    3. החזק בפינצטה, להוסיף את µL 2 מדגם HEVNP לרשת, לחכות 15-30 s ולאחר כתם עם נייר סינון.
    4. מיד לשטוף את הרשת עם ddH20 כתם עם נייר סינון.
    5. מיד להוסיף 2 µL של 2% uranyl אצטט הרשת, חכה 15 s ולאחר מכן כתם עם נייר סינון. יבש רשתות דוגמת מאת מכניס אותם אלקטרונית dehumidify ארון יבש עבור O/ש
    6. העבר הרשת לתוך TEM התמונה בהגדלה 10-80k. HEVNPs מופיעים ב- TEM חלבונים icosahedral ריק, כי הם ~ 27 nm בקוטר, בשל היעדר RNA נגיפי.

4. כימי ההטיה של HEVNPs עם ביוטין, סרטן ליגנד מיקוד Fluorophores

  1. לבצע ההטיה צעד אחד של HEVNPs ושל maleimide מקושר ביוטין.
    1. מאגר שינוי: להחיל את HEVNPs ביחידות דיאליזה מיני, dialyze נגד 0.01 M PBS pH 7.4 בטמפרטורת החדר במשך 1 h על-פי הפרוטוקול של היצרן (טבלה של חומרים). להעביר את HEVNPs 1.5 mL צינורות ולמדוד את ריכוז חלבון ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים.
    2. לערבב את HEVNP כדי 1 מ"ג/מ"ל, אשר שווה ל- 18.8 מיקרומטר Cys התגובה אתרים (ראה פירוט בשלב 2.2.4), עם כמות שווה של maleimide-ביוטין (100 מיקרומטר) ב- 0.01 M PBS, pH 7.4, כדי להפוך את יחס של 1:5 טוחנת; מגיבים O/N ב 4 º C. הסר maleimide-ביוטין לא מאוגד עם הליך עמודה 40 K MWCO ספין Desalting לפי הפרוטוקול של היצרן (טבלה של חומרים).
    3. לנתח את הדגימות באמצעות תקן הפחתת מרחביות-דף (שלב 3.1).
    4. באמצעות הליכים סטנדרטיים, להכין chemiluminescent המערבי כתם באמצעות Streptavidin HRP-מקושרים. ללכוד את האות chemiluminescent על ידי רנטגן הסרט (איור 2).
  2. בצע צעד שני LXY30 ההטיה ציסטאין השטח החשופים HEV NPs (איור 5).
    1. מאגר exchange: החל HEVNPs ביחידות דיאליזה מיני ואת dialyze נגד 0.01 M PBS pH 7.4 בטמפרטורת החדר 1 ה העברת HEVNPs 1.5 mL צינורות למדוד ריכוז חלבון ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים.
    2. להוסיף maleimide מיקרומטר 650-אזיד ו מיקרומטר 650 אלקין-LXY3010 0.01 M PBS pH 7.4 עם 200 מיקרומטר CuSO4 ו- 1 מ מ חומצה אסקורבית כדי ליצור מקושרים-maleimide LXY30 (Mal-LXY30) ב 650 מיקרומטר. תקופת דגירה התערובת ב 4 ° C של O/ש
    3. לערבב את HEVNP כדי 1 מ"ג/מ"ל, אשר שווה ל- 18.8 מיקרומטר Cys תגובה באתר (ראה פירוט בשלב 2.2.4), כ- 10% נפח של מאל-LXY30 (650 מיקרומטר) ב- 0.01 M PBS pH 7.4, כדי להפוך את יחס של 1:3 שן טוחנת; מגיבים O/N ב 4 º C.
      הערה: בשל הריכוז הגבוה יחסית של מאל-LXY30, הריכוזים הסופי של שני המגיבים, כגון CuSO4, מופחתים בערך 10 פעמים לאחר ערבוב, כדי למנוע פגיעה שלהם HEVNPs. אפשרות נוספת היא נטולת Cu ההטיה שיטת15.
    4. הסר לא מאוגדים maleimide-לחץ-LXY30 עם 40 K MWCO ספין Desalting עמודה על-פי הפרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים). לשמור את HEVNPs מקושרים-LXY30 (LXY30-HEVNPs) ב 4 º C.
  3. לבצע ההטיה צעד אחד של LXY30-HEVNPs, Cy5.5 NHS אסתר (NHS-Cy5.5)
    1. לערבב את מקושרים-LXY30 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) כדי 1 מ"ג/מ"ל, אשר שווה ל- 18.8 מיקרומטר של אתר התגובה Cys (ראה פירוט בשלב 2.2.4), עם נפח שווה NHS-Cy5.5 (100 מיקרומטר) ב- 0.01 M PBS pH 7.4 כדי להפוך יחס של 1:5 טוחנת; מגיבים O/N ב 4 º C.
    2. הסר לא מאוגדים Cy5.5-NHS בשגרה 40K MWCO ספין Desalting עמודה על-פי הפרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים). שמור את LXY30, HEVNPs Cy5.5-מקושרים (LXY30-HEVNP-Cy5.5) ב 4 º C.

5. HEVNP איגוד, הפנמה בתאי סרטן השד מד א-MB231

  1. תאים סרטניים בשד מד א-MB231 זרע לתוך כוס 35 מ מ למטה מנות (5 x 104 לכל מנה) O/N בתרבות בתרבית של תאים בארון.
  2. עבור הניסוי מחייב תא, הכן LXY30-HEVNP-Cy5.5 על ידי 4.2 שלבים הבאים-4.3. לדלל את LXY30-HEVNP-Cy5.5 עד 0.01 מ"ג/מ"ל, אשר מקבילה מיקרומטר 0.188 של HEVNP ORF2 (עיין שלב 2.2.4), ב- µL 250 0 - 1% FBS/DMEM.
    1. הכנת המדגם שליטה שלילי ב 0.01 מ"ג/מ"ל HEVNP-Cy5.5 צעד בעקבות 4.3 אבל מצומדת עם צבע NHS-Cy5.5 בלבד, (HEV-Cy5.5). לדלל את HEVNP-Cy5.5 עד 0.01 מ"ג/מ"ל, אשר מקבילה מיקרומטר 0.188 של HEVNP ORF2 (עיין שלב 2.2.4), ב- 250 µL של 10% FBS בתוספת DMEM.
  3. לשטוף את התאים פעם אחת על-ידי החלת µL 250 מ' 1 PBS מאגר, pH 7.4. להסיר את המאגר PBS לאחר כביסה, תוך שמירה על מאגר בצלחת התרבות תאים.
  4. החל µL 250 של LXY30-HEVNP-Cy5.5 ב- 10% FBS בתוספת DMEM או HEVNP-Cy5.5 ב- 10% FBS בתוספת DMEM על התאים בתרבית של סרטן השד מד א-MB231. מגן התא תרבותי מאכלים מאזור אור ברדיד אלומיניום.
  5. שמור את הכלים תא תרבותי תרבית תאים 37 ° C ארון עבור 1h לציון הפנמה.
  6. לשטוף את התאים בתרבית על הקרח 3 פעמים, 5 דקות לכל שטיפת, עם 250 µL של 1 מ' ל- PBS, pH 7.4.
  7. לתקן את התאים ב- 4% מחברים ב- 1 מ' ל- PBS, pH 7.4 במשך 20 דקות ולאחר מכן לשטוף פעם אחת עם 250 µL של 1 מ' ל- PBS, pH 7.4.
    הערה: התאים הם עכשיו מוכנה לדימות על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי. נציג נתונים מוצגים באיור5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דומה HEV-האח מים, Cys כל ששינה HEVNPs הנוצרת capsids icosahedral מסיסים, ולא צבורים בתמיסה במהלך הייצור או טיהור. לפני ואחרי נטיה צעד אחר צעד maleimide-ביוטין, כל אחד Cys שונה HEVNPs היו להבחין מגניחותיה HEV-האח מים בתוך הכתם שלילי EM (איור 2). Maleimide-ביוטין יעילות ההטיה ל Cys ששונה HEVNPs נבחנה לראשונה עם סופג המערבי דרך איגוד chemiluminescent streptavidin. בעקבות נטיה maleimide-ביוטין, Cys ששינה HEVNPs מוצגים streptavidin מחייב אותות (איור 2).

שני שלבים יעיל ציסטאין ההטיה הושפע את הסדר שבו בוצע ההטיה. כי α3β1 אינטגרין הוא overexpressed ב השד סרטן תאים סרטניים, ליגנד סינתטי, LXY30, עם זיקה מסוימת α3β110, נבחר כ מולקולה תרכיב פילוח הגידול. Functionalization ישירה maleimide (מאי) של LXY30 לא היה ריאלי כי LXY30 הוא cyclized דרך דיסולפידי הבין-מולקולרי; לפיכך, הייתה דאגה self-reactivity. במקום זאת, LXY30 היה functionalized עם קבוצה אלקין, קשור maleimide-אזיד דרך תגובה כימיה לחץ. כאשר NPs HEV - 573C. היינו חייבים maleimide-אזיד תחילה, ולאחר מכן לחץ על כימיה תגובה LXY30-אלקין, NPs HEV - 573C הופיע לפרק תחת השגחה TEM (איור 4C). עם זאת, לתגובה כימיה הראשונית לחץ בין LXY30-אלקין maleimide-אזיד לטופס מאי-LXY30, ואחריו ההטיה מאי-LXY30 כדי HEVNPs Cys-לאחרונה (LXY30-מאל-Cy5.5) לא השפיע על מבנהו (איור 4B). איור 4 מתאר תיאור סכמטי של LXY30-functionalization של HEVNPs הכוונת תאי הגידול.

HEVNPs מצומדת לסרטן השד מיקוד ליגנד, LXY30 (LXY30-HEVNPs) מאוגדים, הופנמו לתוך תאים סרטניים בשד בתרבית. עבור זיהוי פלורסנט, LXY30-HEVNPs ו- HEVNP לא מאוגד-573Cs היו המסומנת NHS functionalized Cy5.5 הפלורסנט (NHS-Cy5.5) באמצעות צימוד amine העיקרי של ליזין-HEVNP-573Cs-LXY30-HEVNP-Cy5.5 ו- HEVNP-Cy5.5 יושמו עד תרבותי סרטן השד תאים (מד א-MB-231), מיקרוסקופיה קונפוקלית (פירושונים). התמונות פלורסצנטיות ניר על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי מציינים ש-lxy30-HEVNP-Cy5.5 היה גבוה יותר איגוד אהדה ו הפנמה מוגברת של תאים סרטניים בשד מד א-MB-231 בהשוואה HEVNP-Cy5.5 (איור 5).

Figure 1
איור 1: החלפת ציסטאין בתחום השטח בליטה של ננו-חלקיק וירוס הפטיטיס E. ציסטאין מוטציות הוצעו על שאריות Y485, T489, S533, N573 ו T586-האזור סליל גמיש כדי למזער את ההפרעה המבנה משני של HEV ORF2 (א). כל שאריות שנבחר עבור ציסטאין מוטציה ממוקמים על פני השטח של התחום בליטה (P) (אפור; תחומים אחרים הם המעטפת (S) - תחום הביניים (ז) ובכחול - תחום בוורוד), עם שאריות T586 T489 (צהוב), Y485 (ציאן), (כתום)-החיצוני ביותר השטח, ואת שאריות S533 (מגנטה) N573 (אדום) בצד מול הציר מחומשת של HEVNP (B). האיור השתנה מ. חן ואח 20164 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: אפיון HEVNP נושא N573C כפי שהוא דוגמא עבור כל Cys שונה HEVNPs. HEVNP - 573C הופיע בתור כדורית תחזיות על אלקטרון micrographs (א) ונשארו כחלקיקים ללא פגע לאחר ההטיה מאל-biotinylating (B). התוצאות נציג של חשיפת ההטיה, epitope HEVNPs Cys-השתנה. הם היו מאוגדים maleimide-ביוטין באמצעות צימוד ציסטאין-maleimide, לאחר מכן לבדיקה דרך תספיג עבור איגוד streptavidin. המוטציה ציסטאין-N573 מותר biotinylation יעיל HEVNP לעומת אחרים מוטציה אתרים, קרי, Y485, T489, S533, T586 (ג). בר שווה 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: סכימטי של תאים סרטניים בשד המיועדים באופן ספציפי עם התווית על-ידי Cy5.5 LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5). LXY30-HEVNP-Cy5.5 באופן סלקטיבי לאגד תאים סרטניים בשד (מגנטה) עקב זיקה מסוימת של LXY30 α3β1, וזו אינטגרין ביטוי יתר על קרום התא של סרטן השד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: תיאור סכמטי של התהליכים ההטיה כימי בשני שלבים, כולל תגובה סלקטיבית תיול, נחושת מזורז אזיד-אלקין cycloaddition או 'לחץ כימיה' התגובה לבנות LXY30-HEVNPs. נבדקו שתי שיטות. שיטה 1: נחושת מזורז אזיד-אלקין cycloaddition התגובה בין מאל-אזיד אלקין-LXY30 טופס מקושרים-Mal LXY30 (Mal-LXY30) בוצעה לראשונה. ואז מאל-LXY30 נוספה להגיב עם האתר Cys של NPs HEV - 573C (A). LXY30 ואת Cy5.5 מעוצבים NPs HEV - 573C (LXY30-HEVNP-Cy5.5) נשארה אחרי כל אלה תהליכים כימיים ההטיה (B). שיטה 2: מתחיל תהליך ההטיה על-ידי תיוג אזיד מאל-מקושרים (Mal-אזיד) באתר Cys של NPs HEV - 573C דרך תגובה סלקטיבית תיול לבנות מקושרים אזיד HEVNPs (אזיד-HEVNPs), ולאחר מכן על-ידי הוספת LXY30-אלקין, חומצה אסקורבית, CuSO4 כדי ליצור מקושרים-LXY30 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (א). עם זאת, רוב LXY30-HEVNPs נפגעו או לפרק מפני תהליכי ההטיה, אשר עלולה להיגרם על ידי ריאגנטים תגובתי, כולל אזיד, חומצה אסקורבית ו- CuSO4 (ג). מל: Maleimide. איור זה השתנה מ. חן ואח 20164 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: תוצאות נציג איגוד תא הפנמה של fluorescently הנקרא LXY30-HEVNPs, אשר נקשר תאים סרטניים בשד מד א-MB-231. ניר פלורסצנטיות תמונות של LXY30-HEVNP-Cy5.5 מיקוד לתאים מד א-MB-231. את האות של הגרעינים, אשר היו מוכתמות מאת דאפי (כחול), האות של Cy5.5 (אדום) נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. איור זה השתנה מ. חן ואח 20164 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בניגוד ההליך זמן רב הנדסה גנטית, אשר בדרך כלל לוקח שבועות, כאן אנחנו להדגים שני שלבים פשוטים והליכי צעד אחד ההטיה כימי, אשר יכולה להסתיים בתוך 3 ימים, של הוספת הסרטן מיקוד ליגנד ו/או קרינה פלואורסצנטית צבע זיהוי לאתרים Cys/ליס של HEVNPs. ניתן להשתמש בטכניקה המסך עבור היעד ליגנד הטוב ביותר מתוך מאגר של מועמדים, ובכך מנצל השירותים סינתזה של מולקולה פפטיד זמין/קטן במועד סביר ועלות משלוח.

בניגוד המסורתי הנדסה גנטית, אשר תוכל רק להכניס את polypeptides לחלבונים עניין, הבניין כימי יכול להתחבר חומרים שונים כולל polypeptides, מולקולות כימיות קטנות של ננו-חלקיקים על פני חלבון של עניין, כל עוד יש משקע Cys או Lys כדי לשמש כאתר תגובתי. אם לא נמצאו שאריות כזה באתר ההטיה כימי, החלפת Cys/Lys פשוטה ניתן לשנות גנטית על חלבון עניין לעשות את זה מבחינה כימית activatable כפי שמתואר במחקר הקודם4.

כדי לשלוט זה הבניין כימית מתרחשת רק באתרים תגובה סלקטיבית, המבנה של מולקולת תרכיב והן חלבון כדי להיות מצומדת צריך להילמד באופן יסודי כדי להימנע תגובתיות התפלגות. כפי שמתואר במסמך זה עם סרטן השד מיקוד פפטיד LXY3010, קשר דיסולפידי קריטי מייצבת קונפורמציה ליגנד מחזורית. נתון תיול-תגובתיות של maleimide, maleimide-functionalization ישיר של ליגנדים LXY30 עלול לגרום תגובתיות התפלגות. במקום זאת, שלב שני ההטיה (שלב 4.2) בוצע על ידי מגיב של אזיד מקושרים-maleimide עם LXY30 אלקין-מקושרים באמצעות לחץ על כימיה התגובה. אולם, הרצף של לחץ כימיה תגובה ותגובה תיול שנבחר הוא קריטי עבור intactness הסתגלותי של LXY30-HEVNPs (איור 4). באמצעות תגובת לחץ-כימיה4 מזורז CuSO, LXY30 בעקיפין על הרומן maleimide לבנות מאי-LXY30. לאחר מכן, מאי-LXY30 הם מצומדת כדי HEVNP - 573C כך יצרו LXY30-HEVNPs יכול לשמור על המבנה icosahedral מקורי שלהם (איור 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים לאשר חסות המימון כדי RHC על ידי NIH להעניק #' s: AI095382, EB021230, CA198880, המכון הלאומי מזון, חקלאות, כמו גם את התוכנית מן המניין פינלנד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO Thermo Fisher Scientific 69572 mini dialysis unit
High Five Cells Thermo Fisher Scientific B85502 Tn5 cells
SF9 Cells  Thermo Fisher Scientific 11496015 Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Thermo Fisher Scientific A11101, A11100 Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Life Technologies 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 Bacmid
ESF921 Insect Cell Media Expression Systems LLC 96-001-01 insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg Lumiprobe Corp 27020 Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL Thermo Scientific 87766 spin desalting column
MES Hydrate Sigma-Aldrich Chemical Co M8250-250G MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes Beckman Coulter, Inc Depends on Rotor ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NPO321BOX SDS protein gel
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher Scientific 10362100 transfection reagent
EMS Glow Discharger Electron Microscopy Science glow discharger

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
  2. Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
  3. Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
  4. Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
  5. Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
  6. Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
  7. Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
  8. Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
  9. Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
  10. Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
  11. Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
  12. Technologies, I. bL. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System: User Manual. , Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf (2015).
  13. Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
  14. Technologies, N. bL. Vol. MAN0007891 1-2. , Life Technologies. (2013).
  15. Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 135 החלפת ציסטאין ההטיה כימי הפטיטיס E חלקיקים דמויי וירוס התצוגה ליגנד multivalent מיקוד ליגנד
Functionalization פני השטח של חלקיקי וירוס הפטיטיס E בשיטות כימיות ההטיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli,… More

Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli, M., Cheng, R. H. Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods. J. Vis. Exp. (135), e57020, doi:10.3791/57020 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter