Summary
Мы инженерии капсульных белков вируса гепатита Е как наночастиц theranostic (HEVNP). HEVNP самостоятельно собирает в стабильной икосаэдра клетку в слизистой доставки. Здесь мы описываем изменения HEVNPs для ориентации, мутирует поверхности подвергаются остатков, к которым, которые конъюгат синтетическими лигандами, конкретно привязанные опухолевых клеток опухоли.
Abstract
Вирусоподобных частиц (VLP) использовали как nanocarriers для отображения иностранных эпитопов или доставить небольшие молекулы в обнаружения и лечения различных заболеваний. Это приложение полагается на генетической модификации, самостоятельной сборки, и хвоща спряжение выполнить против опухоли применение рекомбинантного VLP. по сравнению с генетической модификации одиночку, химические спряжение иностранных пептидов VLP предлагает значительное преимущество, потому что она позволяет целый ряд организаций, таких как синтетических пептидов или олигосахариды, чтобы конъюгированных на поверхности VLP модулированных и гибким образом без изменений VLP Ассамблеи.
Здесь мы продемонстрируем использование наночастиц вирус гепатита E (HEVNP), Модульная theranostic капсулу, как многофункциональный доставки перевозчиком. Функции HEVNPs включают ткани таргетинг, визуализации и терапевтические доставки. На основе устоявшихся структурных исследований HEVNP, структурно независимым и открытые поверхности остатки были отобраны для хвоща замены как спряжение сайты для maleimide связаны химических групп через тиоловых селективный связей. Один частности хвоща модифицированных HEVNP (замена Cys аспарагина в 573 aa (HEVNP - 573C)) был конъюгированных к груди рак клеток конкретных лиганд, LXY30 и помечены с ближней ИК-области спектра (NIR) флуоресценции краситель (Cy5.5), визуализации, опухоль целевой HEVNPs как эффективный диагностический капсулы (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Подобные инженерной стратегии могут быть использованы с другими макромолекулярных комплексов с известным атомных структур для изучения потенциальных приложений в theranostic доставки.
Introduction
Развитие нано размера векторов в лечебных и диагностических доставки, известный как nanotheranostics, изменилось многое из области биомедицины от обобщенных процедур к целенаправленной доставки1. Целевые nanotheranostic доставки интегрирует нано размера вектора (наночастиц) с theranostic молекулами стабильно прямого theranostic молекулы к конкретным больные ткани или биохимические пути2,3,4 . Наномедицина пришел на первый план целенаправленной доставки, потому что оптимально размеров наночастиц имеют способность стабилизировать распространение theranostic молекул и выборочно целевых клеток поверхности молекул, представленные на пораженные ткани. Многие nanotheranostic платформах по-прежнему страдают от пассивного клеток поглощения, предварительно пожилые деградации, токсичности и недостаточно ассоциации с theranostic молекулами. VLP преодолеть многие из этих препятствий в целенаправленной доставки. Они использовали как nanocarriers для отображения иностранных эпитопов или доставить небольшие молекулы: режим, который может использоваться для борьбы с многих заболеваний1. Это приложение полагается главным образом на имущество самостоятельной сборки, а также простота генетических изменений, выполнить разработанные приложения для данного VLP. По сравнению с генной инженерии, химические спряжение иностранных пептидов в ВЛП отображает значительное преимущество, потому что она позволяет множество сущностей, например пептидов или олигосахариды, чтобы конъюгированных на поверхности VLP в модулированных и гибко без изменений VLP Ассамблеи.
HEVNPs, производные от Рекомбинантный белок капсид ГЭМ, 2-й открытый чтение фрейма (ORF2), неинфекционных, самостоятельной сборки capsids, способный клеток привязки и вход. Потому что HEV эволюционировали для слизистой передачи, собранный капсид белок аналогично стабилен в протеолитические и кислой слизистой условия5. HEVNPs образуют дупло, T = 1 икосаэдра капсида, состоящий из 60 идентичных блоков6,7 ORF2, делает его весьма стабильным, как хранения, так и в суровых условиях физиологических. Отсутствие любой вирусный генетические элементы, производство эффективной, высокая урожайность достигается через бакуловирусы выражение системы в клетках насекомых. Из-за их протеолитических стабильности, собственн-собранные HEVNPs извлекаются и очищенной от клеток супернатанта, существенно снижая необходимой очистки шагов. Кроме того HEVNPs обладают поверхности подвергаются выступ домена (P) подключен через гибкий шарнир стабильную базу икосаэдра. P домен формы поверхности подвергаются шипы на вершине икосаэдра базы в то время как гибкая петля позволяет значительно изменить домен P без ущерба для базовой структуры икосаэдра. С 60 неоднократные единиц один участкам модифицирование приводит в 60 симметричный сайтов для химического модуляции. Недавно мы предложили нано платформу с помощью HEVNP, которая может химически конъюгат лигандами или малых молекул для theranostic приложений. Это было достигнуто путем замены одной Аминокислоты цистеина на выступ домена HEV-VLP как реакция сайт с связаны maleimide пептидами или молекул. Основываясь на предыдущих структурный анализ HEV-VLP и хорошо изучена иммуногенность epitopes8,9, следующих пяти HEV-VLP аминокислоты были заменены хвоща как потенциальных кандидатов: Y485C, T489C, S533C, N573C и T586C ( Рисунок 1). После очистки от насекомых клеток и выражение, их VLP образований были подтверждены передачи электронной микроскопии (ТЕА) наблюдения (рис. 2), и подвергаются хвоща сайты были проанализированы Западной пятно после maleimide связаны биотин Спряжение (рис. 2). Среди пяти мутантов HEVNP - 573C отображается сильный сигнал maleimide биотин спряжение (рис. 2) и был использован для последующих демонстрации как nanocarrier для клетки рака груди на4 (рис. 3).
Этот протокол описывает методы химической спряжение придавать HEVNPs опухоль ориентация молекул путем сопряжения поверхности цистеина. Мы подробно спряжение опухоли обнаружения и ориентации молекул для доставки опухоли с рекомбинантным HEVNPs, содержащий цистеина в N573 (HEVNP - 573C). Мы сосредоточились на двухэтапный нажмите химии спряжение процесс привязки опухоли рака молочной железы, ориентация пептид, LXY3010 HEVNPs в форме LXY30-HEVNP (рис. 4). Впоследствии, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 были конъюгированных на отдельный сайт Lys на HEVNPs построить LXY30-HEVNP-Cy5.5 флуоресцентного обнаружения как в пробирке (рис. 5) и в естественных условиях4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HEVNP производство в клетках насекомых
Примечание: Все следующие шаги должны быть выполнены в капюшоне культуры клеток. Обратитесь к нашей предыдущей публикации для более подробной HEVNP производства процедуры11.
- Культура клетки Sf9 в СМИ насекомых клеток (см. Таблицу материалы) до 50-75% слияния в 6-ну пластины.
- Использование насекомых клеток трансфекции реагентов по данным производителя протоколы, transfect Bacmids, содержащих HEVNP - 573 C ORF2 в Sf99 клетки производить рекомбинантные бакуловирусы. Инкубируйте transfected клеток при 27 ° C 3-6 дней, в зависимости от жизнеспособности клеток.
- Соберите супернатант в 3-6 дней после заражения (после transfected клетки лизированы бакуловирусы инфекции) как запас бакуловирусы P0.
- Удаление питательной среды перед применением 200 мкл акций P0 до 50-75% вырожденная Sf9 клеток в колбе монослоя2 25 см. Рок колбу каждые 15 мин для обеспечения полного охвата посевным материалом. Повторите 4 раза, в общей сложности 60 мин.
- Добавить 2 мл насекомых клеток питательной среды в колбу и держать на 27 ° C 3-6 дней, в зависимости от жизнеспособность клеток, чтобы усилить бакуловирусы высокий титр.
- Проведения анализов доска для получения бакуловирусы титр, читать12.
- Культура взвешенных Tn5 клетки насекомых (Таблица материалов) 100 мл среды насекомых клеток в 250 мл флакон и встряхните в 27 ° C 150 об/мин до титра 0,5 x 105 -6 1 x 10 для прививки.
- Добавление бакуловирусы на разносторонности инфекции (МВД) 5-10 до 100 мл Tn5 клеток в 250 мл флакон. После прививки встряхните в 27 ° C 150 об/мин за 5-7 дней.
- Как только большинство клеток, как представляется, имеют везикулы и 70-90% клеток мертвых под наблюдением оптический микроскоп, собирать Tn5 клеток и передачи в 33 мл ультрацентрифуга трубы. Место ультрацентрифуга трубы в свинге ведро роторов, баланс и спин вниз ячейки мусор и рекомбинантные baculoviruses на 10 000 g x 90 мин при 25 ° C.
- Держите супернатанта, содержащий выпустила HEVNPs на 4 ° C для дальнейшей очистки. Для длительного хранения бакуловирусы супернатанта добавьте ингибиторов протеазы.
2. HEVNP очистки
- Гранулы и изолировать HEVNPs, с использованием градиента разделения цезия хлорид (CsCl):
- Передавать собранные супернатант (из шага 1.10) и добавить 20% NP-40 в каждую пробирку, чтобы сделать окончательный концентрации 0,5% NP-40 распустить все оставшиеся клеточной мембраны. Аккуратно перемешать, закупорить и Инкубируйте по крайней мере 30 мин при температуре 25 ° C.
- Ультрацентрифуги HEVNPs на 112,400 x g в свинге ведро роторов втечение 2 ч при температуре 4 ° C для пеллет вниз HEVNPs от супернатант. Отменить надосадке после центрифугирования и нежно вновь приостановить сырой гранул в 200 мкл 10 мм MES буфер рН 6,2 в каждой тюбике на ночь (O/N) при 4 ° C. Запустите SDS-PAGE (шаг 3.1) для подтверждения присутствия HEVNP ORF2 в сырой гранул как 52 kDa группа.
- Подготовьте градиент CsCl 38,5% (w/v) путем смешивания 1.96 g CsCl, вновь приостановлено сырой гранул и ~ 4 мл 0,01 М MES pH 6.2 в 5 мл ультрацентрифугирования. Баланс трубы и место в размахивая ведро ротора. Ультрацентрифуги на 147 000 x g для 16 h при 4 ° C.
- После CsCl градиент сбор фракций:
- Выбросите Топ 500 мкл фракция, которая является главным образом легкие клеточной мембраны мусора. Сбор 500 мкл фракций, начиная с верхней части трубки и изменить советы между каждой фракции. Поместите каждую долю в пронумерованных/меткой 1,5 мл пробирок.
Примечание: Наличие HEVNP ORF2 в долях, отделены от CsCl градиент не могут быть обнаружены путем запуска страницы SDS гели из-за высокой концентрации CsCl. CsCl в каждой фракции могут быть удалены или разбавленный следуя процедуре очистки CsCl. Кроме того CsCl градиента могут быть заменены на 10-40% сахарозы градиента13 чтобы избежать CsCl остаточных. - Передать 5 мл ультрацентрифуга каждой фракции и разбавленных CsCl с 4,5 мл 10 мм МЧС, pH 6.2. Баланс трубы и место в размахивая ведро ротора. Ультрацентрифуги на 147 000 x g за 2 ч при 4 ° C до Пелле вниз HEVNPs.
- Отменить супернатант и нежно вновь приостановить HEVNPs в 100 мкл 10 мм MES рН 6,2 в каждой тюбике. Обложка трубы, чтобы избежать испарения и инкубировать O/N при 4 ° C.
- Запись A280 чтения и соотношение A260/A280 Нм, с помощью спектрофотометра. Определите Приблизительные концентрации ORF2 как:
Каждый ORF2 будет содержать 1 сайт Cys и 1 Lys сайт для химического спряжение.
Примечание: Коэффициент молярной вымирания HEVNP ORF2 является 60,280, что эквивалентно 1.019 мг/мл × A280. Это так близко к 1:1, концентрация HEVNPs (в мг/мл) могут быть аппроксимированы A280 и, следовательно, концентрация ORF2 выше уравнение. К примеру, HEVNP с A280 чтение 1 будет иметь концентрации 1 мг/мл, что эквивалентно 18,8 мкм ORF2. - Подготовьте SDS-PAGE. Для определения фракций, содержащих 53,3 кДа HEVNP ORF2 белка (шаг 3.1) используйте 6 мкл пример от каждой фракции. HEVNPs должно быть найдено в фракции 3-5, с плотностью ~1.25 г/мл.
- Подтвердите наличие и чистоты HEVNPs ТЕА наблюдения. Подготовка или развести образцы HEVNP 0,5 - 2,0 мг/мл для ТЕА. HEVNPs появляются в ТЕА в виде пустой икосаэдра белки, ~ 27 Нм в диаметре (рис. 2). Некоторые белковых загрязнений могут оставаться во фракциях и будет соблюдаться в рамках ТЕА (шаг 3.2).
- Выбросите Топ 500 мкл фракция, которая является главным образом легкие клеточной мембраны мусора. Сбор 500 мкл фракций, начиная с верхней части трубки и изменить советы между каждой фракции. Поместите каждую долю в пронумерованных/меткой 1,5 мл пробирок.
- В случае, что примесей присутствуют под ТЕА повторите шаг 2.1.3 - 2.2.6 для улучшения чистоты HEVNPs.
Примечание: Загородный очищение через CsCl градиента может привести к потере урожая HEVNPs. Кроме того CsCl градиента очистки могут быть заменены 10-40% сахарозы градиент избежать остаточного CsCl13.
3. HEVNP характеристика
- Подготовьте бис-трис белка гелях SDS PAGE 4-12%, 1,0 мм, 17-Уэллс (см. Таблицу материалы) по данным пользователя вручную14:
- 2 мкл 4 x загрузки буфера 6 мкл образец протеина. Инкубируйте образца смесь в блоке тепла на 10 минут при 100 ° C до денатурировать протеина. Загрузите образцы протеина на геле.
- Запустите, установив источник питания постоянного тока на 100 V за 10 мин, затем 150 V за 45 минут до тех пор, пока образцы запустить примерно на 1 см выше нижней части геля SDS-PAGE.
- Пятно геля SDS-страницы Кумасси синим цветом (0,25% (w/v) блестящий синий R250 Кумасси, 30% (v/v) метанола, 10% (v/v) уксусная кислота), за 1 ч.
- После окрашивания процедуры, удалить пятно Кумасси синий и применять исключения окрашивания буфера (30% (v/v) метанола, 10% (v/v) уксусная кислота) на гель белка для > 12 ч при комнатной температуре.
- Документ гель под белый свет, чтобы подтвердить наличие HEVNP ORF2 в полосе 52 кДа.
- Наблюдать за использованием ТЕА HEVNPs.
- Подготовка или развести образцы HEVNP 0,5 - 2 мг/мл с 10 мм MES pH 6.2 для изображений ТЕА.
- Ионизировать углерода покрытием сетки с 40 мА тлеющего разряда для 30 s производить поверхности гидрофильных углерода. Свечение разгрузки оборудования описан в Таблице материалов.
Примечание: Поверхности гидрофильных углерода сеток может только последние 30 мин после свечения разряда лечения. - Держите в пинцета и 2 мкл пример HEVNP к сетке, ждать 15-30 s и пятно с фильтровальной бумаги.
- Немедленно промывайте сетку с ddH20 и пятно с фильтровальной бумаги.
- Сразу же мкл 2 уранила 2% ацетат сетке, подождите 15 s, а затем пятно с фильтровальной бумаги. Сухой образца сетках, поместив их в электронный сушка сухой кабинет для O/N.
- Перевести сетку в ТЕА и изображения в масштабе 10-80k. HEVNPs появляются в ТЕА в виде пустой икосаэдра белков, которые являются ~ 27 Нм в диаметре, из-за отсутствия вирусной РНК.
4. Химическая спряжение HEVNPs с биотина, лигандом против рака и флуорофоров
- Выполните один шаг спряжение HEVNPs и maleimide связаны биотин.
- Буфер изменений: применять HEVNPs в мини-диализа и dialyze против 0,01 М PBS рН 7,4 при комнатной температуре за 1 ч по данным производителя протокол (Таблица материалов). Передача HEVNPs 1,5 мл пробирок и измерить концентрацию белка на 280 Нм, используя спектрофотометр.
- Смешайте HEVNP 1 мг/мл, что эквивалентно 18,8 мкм Cys реакции сайтов (см. подробности в шаге 2.2.4), с равным количеством maleimide-биотин (100 мкм) в 0,01 М PBS, рН 7,4, чтобы молярное соотношение 1:5; реагировать O/N при 4 ° C. Удаление несвязанных maleimide биотина 40 K MWCO спина Desalting столбец процедурой по данным производителя протокол (Таблица материалов).
- Анализируйте образцы через стандарт сокращение SDS-PAGE (шаг 3.1).
- С помощью стандартных процедур, подготовьте хемилюминесцентный западной помарке с помощью стрептавидина HRP-связаны. Захват хемилюминесцентный сигнал X ray фильмов (Рисунок 2).
- Выполните два шаг LXY30 сопряжения поверхности подвергаются хвоща на HEV NPs (рис. 5).
- Буфер обмена: применение HEVNPs в мини-диализа и dialyze против 0,01 М PBS рН 7,4 при комнатной температуре за 1 ч. Передача HEVNPs 1,5 мл пробирок и измерять концентрацию белка на 280 Нм, используя спектрофотометр.
- Добавить 650 мкм maleimide азид и 650 мкм алкины LXY3010 в 0,01 М PBS рН 7,4 с 200 мкм CuSO4 и 1 мм аскорбиновой кислотой сформировать связанный с maleimide LXY30 (Mal-LXY30) на 650 мкм. Инкубируйте смеси на 4 ° C для O/N.
- Смешайте HEVNP 1 мг/мл, что эквивалентно 18,8 мкм Cys реакции сайта (см. подробности в шаге 2.2.4), около 10% объем мал-LXY30 (650 мкм) в 0,01 М PBS рН 7,4, чтобы молярное соотношение 1:3; реагировать O/N при 4 ° C.
Примечание: Из-за относительно высокой концентрацией мал-LXY30, окончательный концентрации реагентов, например CuSO4, уменьшается примерно в 10 раз после смешивания, чтобы избежать их повреждения HEVNPs. Другим вариантом является метод Cu бесплатно спряжение15. - Удаление несвязанных maleimide клик LXY30 с 40 K MWCO спина обессоливания столбца в зависимости от производителя протокол (см. Таблицу материалы). Держите связаны LXY30 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) при 4 ° C.
- Выполнить один шаг спряжение LXY30-HEVNPs и Эстер Cy5.5 NHS (ГСЗ-Cy5.5)
- Смешать связаны LXY30 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) до 1 мг/мл, что эквивалентно 18,8 мкм Cys реакции сайта (см. подробности в шаге 2.2.4), с равным объемом ГСЗ-Cy5.5 (100 мкм) в 0,01 М PBS рН 7,4 чтобы молярное соотношение 1:5; реагировать O/N при 4 ° C.
- Удаление несвязанных Cy5.5-NHS с 40K MWCO спина обессоливания столбца процедуры согласно протоколу производителя (см. Таблицу материалы). Держите LXY30, Cy5.5 связаны HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) при 4 ° C.
5. привязка к HEVNP и интернализации в MDA-MB231 клеток рака молочной железы
- Семя MDA-MB231 клеток рака молочной железы в 35-мм стекла дно блюда (5 х 104 за блюдо) O/N в культуре клеток млекопитающих кабинета.
- Ячейка привязки эксперимент Подготовьте LXY30-HEVNP-Cy5.5 следующие шаги 4.2-4.3. Разбавить LXY30-HEVNP-Cy5.5 0,01 мг/мл, что эквивалентно 0,188 мкм HEVNP ORF2 (см. шаг 2.2.4) в 250 мкл 0 - 1% FBS/DMEM.
- Подготовка образца отрицательный контроль на 0,01 мг/мл HEVNP-Cy5.5, выполнив шаг 4.3 но сопряжённых с ГСЗ-Cy5.5 краска только, (HEV-Cy5.5). Разбавить HEVNP-Cy5.5 0,01 мг/мл, что эквивалентно 0,188 мкм HEVNP ORF2 (см. шаг 2.2.4) в 250 мкл 10% FBS дополнена DMEM.
- Вымойте клетки однажды применив 250 мкл буфера PBS 1 М, рН 7,4. Удалите в буфер PBS после стирки, сохраняя некоторые буфера в ячейку культуры блюдо.
- Примените 250 мкл LXY30-HEVNP-Cy5.5 в 10%, что FBS дополнена DMEM или HEVNP-Cy5.5 в 10%, что FBS дополнена DMEM для культивируемых клеток рака молочной железы MDA-MB231. Щит клетки культивировали блюда от света с алюминиевой фольгой.
- Держите клетки культивировали блюда в культуре клеток 37 ° C кабинета на 1 ч для интернализации.
- Вымойте культивируемых клеток на льду 3 раза, 5 мин на мыть, с 250 мкл 1 М PBS, рН 7,4.
- Исправить ячейки в 4% ПФА в 1 М PBS, рН 7,4 на 20 минут и затем смыть с 250 мкл 1 М PBS, рН 7,4.
Примечание: Клетки теперь готовы быть imaged конфокального микроскопа. Репрезентативных данных показано на рисунке 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сродни HEV-VLP все Cys изменение растворимых икосаэдра capsids HEVNPs сформированы и не статистической обработки в растворе в ходе производства или очистки. До и после изменения одноступенчатых maleimide биотин спряжение, каждый из Cys HEVNPs были неотличимы от HEV-VLP в негативных пятно EM (рис. 2). Maleimide биотин спряжение эффективность Cys, модифицированных HEVNPs впервые был протестирован с Западный blotting через хемилюминесцентный стрептавидина привязки. После maleimide биотин спряжение Cys изменение HEVNPs отображается стрептавидина привязки сигналов (рис. 2).
Эффективное двухэтапный хвоща спряжение находился под влиянием порядок, в котором была проведена спряжение. Поскольку α3β1 Интегрин является гиперэкспрессия клеток опухоли рака молочной железы, синтетические лиганд, LXY30, с конкретными сродством к α3β110, был выбран в качестве опухоль таргетинг конъюгата молекулы. Функционализация прямой maleimide (МАИ) LXY30 не представляется возможным, потому что LXY30 cyclized через межмолекулярных дисульфидными облигаций; Следовательно существует озабоченность для self-reactivity. Вместо этого LXY30 функционализированных с группой алкины и привязан к maleimide азид через клик химии реакция. Когда HEV - 573C NPs были связаны с maleimide азид сначала, а затем нажмите химии реакция LXY30-алкины, HEV - 573C NPs появился разобрать под наблюдением ТЕА (рис. 4 c). Однако первоначальный нажмите химии реакция между LXY30-алкина и maleimide азид форме маи-LXY30, а затем маи-LXY30 спряжение Cys модифицированных HEVNPs (LXY30-Mal-Cy5.5) не затрагивает его структуру (рис. 4В). На рисунке 4 изображена схема LXY30-функционализации HEVNPs для ориентации клетки опухоли.
HEVNPs, конъюгированных рака молочной железы, ориентация лиганд, LXY30 (LXY30-HEVNPs) связаны и были включены в культурный груди раковые клетки. Для флуоресцентного обнаружения, LXY30-HEVNPs и свободные HEVNP-573Cs были помечены NHS функционализированных Cy5.5 Люминесцентную краску (ГСЗ-Cy5.5) через Первичные амины муфта лизина на HEVNP-573Cs. LXY30-HEVNP-Cy5.5 и HEVNP-Cy5.5 были применены к искусственный Рак молочной железы клетки (MDA-MB-231) и соблюдать confocal микроскопии. NIR флуоресценции изображения Конфокальный микроскоп указывают, что LXY30-HEVNP-Cy5.5 выше обязательных сродство для и увеличение интернализации в MDA-MB-231 клеток рака молочной железы по сравнению с HEVNP-Cy5.5 (рис. 5).
Рисунок 1: замена цистеина в домене поверхности выступ наночастиц вирус гепатита Е. Цистеин мутации были предложены для остатков, Y485, T489, S533, N573 и T586 в регионе гибкая катушка для сведения к минимуму помехи в вторичной структуре HEV ORF2 (A). Все выбранные остатков цистеина мутации расположены на поверхности области протрузии (P) (серый; другие домены являются оболочки (S) - домен в голубой и средний (M) - домен в розовом), с остатками Y485 (голубой), T489 (желтый), T586 (оранжевый) на крайнем поверхность и остатки S533 (пурпурный) и N573 (красный) на стороне, обращенной пятикратное оси HEVNP (B). Рисунок был изменен с Чэнь et al. 20164 с разрешением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: характеристика HEVNP, перевозящих N573C как пример для всех Cys измененный HEVNPs. HEVNP - 573C появилась как сферических проекций на электронной микроскопии (A) и остались как нетронутыми частиц после ТЗА biotinylating спряжение (B). Представитель результаты спряжение и epitope воздействия Cys модифицированных HEVNPs. Они были связаны с maleimide биотин через хвоща maleimide муфта и впоследствии assayed через западную помарку для привязки стрептавидина. Цистеин мутации в N573 допускается эффективный biotinylation для HEVNP, по сравнению с другими сайты мутации, т.е., Y485, T489, S533 и T586 (C). Бар равен 100 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: схема клеток рака молочной железы, которые специально ориентированы с Cy5.5 меченых LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5). LXY30-HEVNP-Cy5.5 выборочно связать клеток рака молочной железы (пурпурный) из-за LXY30 в конкретных сродством к α3β1, который является чрезмерно выраженная Интегрин на мембраны клеток рака молочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: схема двухступенчатого химических сопряжения процессов, включая тиоловых селективный и медные катализируемой азид алкины циклоприсоединения или «нажмите химия» реакций для построения LXY30-HEVNPs. Два метода были протестированы. Метод 1: медь катализируемой азид алкины циклоприсоединения реакции между Mal азид и алкины LXY30 форме Mal связаны LXY30 (Mal-LXY30) была исполнена впервые. Затем был добавлен мал-LXY30 реагировать с сайтом Cys HEV - 573C ЯИЭ (A). LXY30 и Cy5.5 стиле HEV - 573C NPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) остались нетронутыми после всех этих процессов химического спряжение (B). Метод 2: спряжение процесс начинается с маркировки Mal связаны азид (Mal-азид) на сайте Cys HEV - 573C NPs через тиоловых селективная реакция построить азид связаны HEVNPs (азид-HEVNPs), а затем путем добавления LXY30-алкины, аскорбиновая кислота и CuSO4 сформировать связанный с LXY30 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (A). Однако большинство LXY30-HEVNPs были повреждены или разобраны от сопряжения процессов, которые могут быть вызваны реактивной реагентов, включая азид, аскорбиновая кислота и CuSO4 (C). Мал: Maleimide. Эта цифра была изменена с Чэнь et al. 20164 с разрешением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: представитель результаты ячейку привязки и интернализации дневно помечены LXY30-HEVNPs, который связывает клетки рака груди MDA-MB-231. NIR флуоресценции изображения LXY30-HEVNP-Cy5.5 ориентации клетки MDA-MB-231. Ядер, которые были запятнана DAPI (синий), и сигнал Cy5.5 (красный) были приобретены с помощью микроскопа конфокальный флуоресценции. Эта цифра была изменена с Чэнь et al. 20164 с разрешением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В отличие от времени генной инженерии процедура, которая обычно занимает недели, здесь мы демонстрации простой двухэтапный и одношаговые химических спряжение процедур, которые могут быть завершены в течение 3 дней, добавления рака, ориентация лиганда и/или флуоресценции обнаружения красителя на Cys/Lys сайты HEVNPs. Метод может быть использован для экрана для лучших лигандом цели из числа кандидатов и таким образом использует имеющиеся пептида и малые молекулы синтеза услуг на разумную стоимость и время доставки.
В отличие от традиционных генной инженерии, которые могут только вставьте полипептиды белки интереса, химическая спряжение могут подключаться различные материалы, включая полипептидов, малые химические молекулы и нано частиц на поверхность протеин интереса, покуда есть Cys или Lys остатков для использования в качестве реактивной сайта. Если есть нет таких остатков на сайте химического спряжение, простая замена Cys/Lys можно изменять на протеин интереса сделать химически активации, как показано в предыдущих исследований4генетически.
Для управления, химические спряжение происходит только на сайтах селективного реакции, структура белка конъюгированных необходимость тщательно изучаться во избежание внутримолекулярной реактивности и сопряженных молекул. Как показано здесь, с раком молочной железы, ориентация пептидные LXY3010, критических дисульфидными облигаций стабилизирует конформация циклической лиганда. Учитывая тиоловых реактивности maleimide прямой maleimide функционализация LXY30 лигандами воля вероятный результат в внутримолекулярной реактивности. Вместо этого два шага спряжение (шаг 4.2) была выполнена путем реагирования азид maleimide связаны с алкины, связанных LXY30 через нажмите химии реакция. Однако последовательность нажмите химии реакции и выбран тиоловых реакции имеет решающее значение для конформационного целостности LXY30-HEVNPs (рис. 4). Через CuSO4 катализатором реакции клик химия LXY30 был косвенно привязан к maleimide построить маи-LXY30. Впоследствии маи-LXY30 сопряжены для HEVNP - 573C таким образом, что сформированные LXY30-HEVNPs можно сохранить их родной икосаэдра структуру (рис. 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Авторы признают спонсорство финансирование RHC по НИЗ Грант #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Национальный институт продовольствия и сельского хозяйства, а также Финляндия заслуженный профессор программы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
References
- Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
- Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
- Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
- Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
- Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
- Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
- Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
- Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
- Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
- Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
- Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
- Technologies, I. bL. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System: User Manual. , Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf (2015).
- Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
- Technologies, N. bL. Vol. MAN0007891 1-2. , Life Technologies. (2013).
- Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).
