Summary
Протокол для изоляции первичных микроглии из мышиных мозги представлены. Этот метод помогает в углублении нынешнего понимания Неврологические заболевания. Плотность градиентного центрифугирования и магнитной сепарации объединяются для получения достаточного урожая высоки чисто образца. Кроме того мы наметим шаги для характеризации микроглии.
Abstract
Микроглии, резидентов иммунные клетки в головном мозге, являются первыми реагируют воспаление или травмы в центральной нервной системе. Недавние исследования показали микроглии быть динамичной, способны взять на себя про воспалительных и противовоспалительным фенотипов. (Про воспалительных) М1 и м2 (pro репаративной) фенотипов играть важную роль в neuroinflammatory условиях, таких как перинатальной черепно-мозговой травмы и выставка различные функции в ответ на определенные экологические стимулы. Модуляция микроглии активации было отмечено придать нейропротекции, таким образом предлагая микроглии может иметь терапевтический потенциал в черепно-мозговой травмы. Однако дополнительные исследования необходимо лучше понять роль микроглии в болезни, и этот протокол облегчает что. Протокол описанных ниже сочетает плотность градиентного центрифугирования процесс уменьшения сотовой мусора, с магнитной сепарации, производить очень чистый образец первичных Микроглии клеток, которые могут использоваться для экспериментов в пробирке , без потребность в 2-3 недели культивирования. Кроме того характеристика шаги дают надежные функциональные данные о микроглии, пособничество исследования для улучшения нашего понимания поляризации и грунтовки этих клеток, которая имеет серьезные последствия в области регенеративной медицины.
Introduction
Ущерб, приобретенные в перинатальный период от воспаления, гипоксическая ишемия и кровотечение может иметь массив долгосрочных осложнений. Привлечь воспаления и ишемии с последовавшей смерти нейронов и аксональной1предположил комплекс патофизиологии перинатальной черепно-мозговой травмы. Врожденный иммунный ответ играет важную роль в каскад событий, приведших к травмы2.
Микроглии, резидентов иммунные клетки в пределах центральной нервной системы (ЦНС), являются первыми реагируют на травмы3. Микроглии являются типы пластиковых клеток с способность быть защитные или токсичными, зависит от окружающей среды4. Они участвуют в хемотаксис, фагоцитоз, презентации антигена и производство цитокинов и реактивнооксигенных видов4,5. Стареющей микроглии постоянно обследования окружающей среды и активируются присутствие иностранных или вредные вещества,4. Активация приводит к про воспалительной реакции, критические в ЦНС защиты4. Эти М1 «про воспалительных» фенотип микроглии главным образом участвуют в презентации антигена и гибель патогенов4. Несмотря на решающую роль воспалительной реакции в нейропротекции неконтролируемое или длительное воспаление может быть вредным и привести к повреждения нейронов4. Однако при воздействии определенных экологических раздражителей, микроглии могут exhibit противовоспалительные фенотип. Эти про репаративной микроглии м2 имеют решающую роль в заживление ран и ремонт6, освобождение ряда цитокинов и других растворимых медиаторов, что помощью воспаления, усиливают фагоцитоз и поощрять ремонт4, 7. роли микроглии разнообразны и включают вождения Олигодендроциты дифференциация во время ре миелинизации8, защищая нейроны во время истощения кислорода и глюкозы в ход модели9 и поощрение neurite нарост в травмы спинного мозга моделей10.
Изучение этих глиальных клеток представляет собой важный аспект в понимании и манипулирования ответ на neuroinflammation. Описывается протокол позволяет для дальнейшего расследования терапевтический потенциал микроглии модуляции в neuroinflammatory расстройств.
Модуляция микроглии активации к роли нейропротекторной наблюдается в диапазоне условий11,12,13. Таким образом улучшение нынешнего понимания и дальнейшего изучения модуляции микроглии активации является критическим, требующих использования различных моделей, включая в пробирке и в естественных условиях. В vitro исследования представляют собой важный инструмент из-за их большей эффективности, Нижняя стоимость и возможность исследовать популяции изолированных клеток.
Существует целый ряд протоколов, описанные в литературе для изоляции микроглии из мышиных мозги, вызов эффективно производить высокий урожай образца с хорошей жизнеспособность и высокой чистоты. Часто используемые методы изоляции первичных Микроглии являются магнитной сепарации и длительной тряски смешанные глиальных культур. Через личный опыт было установлено, что существует высокая степень сотовой мусора, который препятствовали столбце магнитные. Таким образом был использован следующий протокол, который включает в себя шаг градиентного центрифугирования Начальная плотность, следуют CD11b магнитной сепарации. Производить очень чистый образец в достаточном количестве был оптимизирован протокол, описанные ниже. Это выгодно из-за его высокой чистоты и короткий период времени — одно можно выполнения анализов в течение 2 дней без культуры для 2-3 недели. Этот протокол потенциально может быть адаптирована для изоляции первичных мышиных астроциты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующие процедуры были одобрены Комитет этики животных университета Монаш. C57Bl6/J P3-6 здорового без лечения новорожденных мышей были использованы для создания представительных результатов.
1. ферментативный пищеварения
Примечание: Важно рассмотреть стерильности при изоляции и культивирования клеток первичной. Хотя обеспечение окружающей среды является стерильной, насколько это возможно, первоначальных диссекции и урожай мышиных мозги может комплектоваться вне капотом Ламинальный потока, все последующие шаги, выполняемые в рамках Ламинарный шкаф.
- С помощью стерильных инструментов, усыпить мыши на шейки матки дислокации, обезглавить животного и сполосните 100% этанола. С помощью небольших стерильными ножницами, сделайте небольшие разрезы вдоль правой и левой стороны головы. В этом возрасте пилинг кожи прочь легко. Используя советы Изогнутый пинцет, аккуратно вставьте ткани к трибуне подвергать черепа, включая Bregma.
- Вставьте наконечник ножницы в открытии позвоночного канала и сделать боковой разрез в ушной канал. Сделать надрез вдоль сагиттального шва Bregma, мягко указывая кончиком ножниц вверх, чтобы предотвратить повреждение мозга. Вставьте наконечник ножницы в Bregma и сделать боковые разрезы в правой и левой стороны головы вдоль шва корональный.
- С помощью щипцов, осторожно удаляйте черепа, чтобы разоблачить мозга. Чтобы сделать это, возьмите края черепа, предоставляемые боковой разрез и осторожно потяните черепа в сторону. Череп следует очистить от легко. С помощью Изогнутый пинцет, нежно совок в мозг, чтобы удалить его.
- Мозг в 5 мл стерильного контейнера, мыть 2 - 3 раза с ледяной мыть СМИ (низкий глюкозы Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) дополнены 1% пенициллин стрептомицином), примерно в 5 мл СМИ за вымыть, удалить крови.
- В капюшоне ламинарного воздушного потока Поместите содержимое контейнера 5 мл в небольшой Петри (35 мм), опираясь на льду. С помощью лезвия стерильным скальпель или стерильными ножницами, удалите мозжечка и обонятельные луковицы. Сделайте срединной разрезается с целью разделения двух полушарий.
- Тщательно очистите от менингеальные слой с тонкой щипцами, стараясь не повредить коре. Идентифицировать менингеальные слой как очень тонкий слой клеток с красным оттенком на поверхности мозга, с видимым кровеносных сосудов. Сохраняя мозга холодной имеет важное значение для надлежащего мозговых оболочек удаления. Если менингеальные слой влезает, продолжают пилинг от разорванной фрагментов до тех пор, пока она полностью удаляется.
- Передать полушарий новой небольшой Петри (на льду) и заполнить с мыть СМИ. Мозг нарезать на мелкие кусочки с стерильным скальпель лезвие/ножницы.
Примечание: Они должны быть2 ~ 1 мм в размер, и следует позаботиться не их слишком мелко нарезать как это может снизить доходность. - Добавить 100 мкл папаин (17 U/мг запасов) и 150 мкл DNase I в СМИ и Инкубируйте 30 минут при 37 ° C
- После переваривания нарезанных ткани с помощью пипетки P1000. Если куски ткани слишком велики, чтобы войти пипеткой, рассмотрите возможность использования пара или стерильными ножницами расширить наконечник пипетки. В ходе этого процесса заботиться не ввести пузыри в средства массовой информации, как это может уменьшить жизнеспособность клеток.
2. миелина мусора
- Под капотом ламинарного потока используют стерильные оборудование, подготовить 50 мл Конические трубки с 100 мкм клеток сетчатый фильтр, для каждого мозга. Залейте содержимое Петри, содержащий дайджест среднего и мозг штук на сито. Протолкнуть части мозга с помощью поршень 3 мл стерильного шприца в шлифовальных движения до тех пор, пока не больше ткани видна. После переваривания ткани мозга должна понизиться врозь легко.
- Постоянно стирать фильтр с мыть СМИ, долива ситечко клеток на протяжении всего этого процесса. Это будет мыть через любой клетки, захваченных в сетчатый фильтр.
Примечание: Это следует сделать до тех пор, пока существует примерно ~ 15 мл в трубе. Это обеспечить, что фильтр достаточно мыть через и увеличить количество собранных клеток. -
Центрифуга для одной ячейки подвеска на 500 x g 5 мин при 4 ° C. В это время подготовьте средний градиент плотности, как описано.
- Подготовка запасов изотонический percoll (SIP), который плотность градиента среды используется. Сделать это путем добавления 10 x стерильные Хэнкс сбалансированного солевого раствора (HBSS) соотношение 9:1 градиента плотности среды.
- Подготовить градиентов как 30% SIP в среде DMEM и 70% SIP в 1 x HBSS. Например, чтобы подготовить 10 мл 30% SIP, добавить 3 мл SIP 7 мл DMEM.
- Аспирационная супернатант конические трубы и Ресуспензируйте клетки лепешка с 8 мл 30% SIP в среде DMEM. Полном объеме передать свежие 15 мл Конические трубки.
- Подложки решение SIP 70%. Для этого, заполните передачи пипетки с 70% SIP и тщательно push путем передачи пипетку в нижней части Конические трубки. После того, как кончик приближается к нижней, аккуратно вставьте через содержимое передачи пипеткой.
Примечание: Делать это медленно так, чтобы не нарушить интерфейс 30/70. Должны существовать четкие линии, разделяющей два слоя. - Центрифуга SIP слои, включая клетки, на 650 x g с тормоз 0 и ускорение 4, 25 мин при комнатной температуре.
Примечание: Важно завершить спин с тормозом OFF и позволить центрифуги медленно прийти к остановке, как применение тормозов нарушить интерфаза и резко сократить коллекции ячеек между слоями SIP. - Аспирационная сотовой мусора в верхней части трубки и извлеките из верхней примерно 4 мл. Это позволит облегчить удаление мононуклеарных клеток в следующем шаге. С помощью пипетки P1000, осторожно опустите кончик пипетки к интерфазе. Изолируйте мононуклеарных клеток от 30/70 плотность градиента средних интерфейса. Соберите около 3 мл облачно интерфейс и передача новой 15 мл Конические трубки. После этого разбавьте смесь с 9 мл HBSS помощи удаления градиента плотности среды.
- Центрифуга разреженных плотность градиента средних интерфаза, содержащие мононуклеарных клеток на 500 g x 5 мин аспирационная супернатант и Ресуспензируйте с 1 мл среднего роста (DMEM дополнена 10% плода bovine сыворотки и 1% антибиотиков). После этого краситель ресуспензированы клетки с Трипановый синий и выполнить подсчет клеток с помощью haemocytometer.
3. магнитные активированных клеток сортировка
Примечание: Эти шаги изменяются от производителей протокола.
- Центрифуга собранных мононуклеарных клеток на 300 g x 10 мин при 4 ° C для удаления среднего роста, как это будет вмешиваться с магнитной изоляцией. Использование же отсчет клетки, полученные из шаг 2.8, Ресуспензируйте 1 x 10-8 тому клеток/мл в PBS (++ Ca и Mg++ бесплатно) содержащие ЭДТА FBS и 1 мм 2%, в том диапазоне 0.1-2,5 мл.
- Добавьте полный объем ядерных клеток в PBS из предыдущего шага к трубе полистирольные круглые нижней свежий 5 мл (12 x 75 мм). Добавьте 50 мкл CD11b PE маркировки реагент на 1 мл образца. Инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин, защищенном от света.
- Мкл 70 отбора коктейль (сочетание моноклональных антител против CD11b в PBS) в 1 мл образца. Инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин, защищенном от света.
- Смешайте магнитные частицы, закупорить вверх и вниз более чем 5 раз. Добавьте 50 мкл/мл на образец. Инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин, защищенном от света.
Примечание: Эти частицы затем образуют комплекс tetrameric с антителами и будут привязываться к магнитной столбец. - Если общий объем ячейки смесь менее чем 2,5 мл, сверху до этого тома с PBS (++ Ca и Mg++ бесплатно) содержащие ЭДТА FBS и 1 мм 2% и смешайте нежно закупорить 2 - 3 раза. Положите трубку (без крышки) в магнит и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
- В одном непрерывном движении полностью Переверните магнит, содержащие трубки для 2-3 s, наливание покинуть супернатант. Возвращение магнит в вертикальном положении и извлеките трубку от магнита. Подготовка промыть остальные ячейки в столбце.
Примечание: Супернатант содержит немаркированных и нежелательных клеток, которые удаляются путем инвертирования трубки еще в магнит. Трубка содержит вложенные Cd11b+ клеток. - Вымойте клетки, повторив шаги 3.5 и 3.6 вдвое больше. Если образец имеет больше чем 1 мл, рекомендуется далее повторите шаги 3.5 и 3.6.
- Ресуспензируйте клеток в среде желаемого роста. Промойте стороны коллекции судна также (например. 15 мл) для сбора клеток от сторон трубки и увеличить урожайность.
4. Проверка чистоты Микроглия
Примечание: Основная микроглии, изолированных от 3 Л (n = 5 животных всего) были проверены через флуоресцентные активированных клеток, сортируя (FACS) для определения чистоты для представителя результаты.
- Культура клеток в T-25 колбу в среднего роста, содержащие 10% FBS в одночасье, посев на плотности 1-2 х 106 клеток за флакон.
- Вымыть клетки в T-25 колбы с PBS 3 x на 5 минут, чтобы удалить любые оставшиеся роста СМИ, которые могут помешать с trypsinization.
- Добавьте 2 мл 0,25% трипсина для отсоединения клетки из колбы. Убедитесь, что объем трипсин является достаточной для покрытия всей поверхности колбы. После нежной закрученного Фляга для обеспечения единообразного трипсина, инкубировать на 5 минут при 37 ° C.
- Утолить trypsinization процесс, добавив 2 мл питательных сред, содержащих 10% FBS в колбу.
- Соберите супернатанта, содержащий trypsinized клеток и центрифуги на 500 x g 5 минут при температуре 4 ° C для сбора клеток.
- Удалить супернатант, содержащий среднего роста и трипсина и Ресуспензируйте гранулы в 500 мкл буфера СУИМ. Выполнения подсчета клеток с помощью Трипановый синий.
- Центрифуга на 500 x g 5 мин при 4 ° C. Выполните Fc рецептор блок, добавляя 50 мкл буфера СУИМ + 1 мкл FcR блокиратор за 5 х 106 клеток. Инкубируйте 15 мин при 4 ° C.
Примечание: Fc рецептор блок является важнейшим шагом в процедуре окрашивания для предотвращения привязки неспецифических иммуноглобулинов Fc рецепторов в популяции иммунных клеток. Эта блокада затрагивает не ниже по течению привязки других антител. - Завершите процесс блокировки путем разбавления с 500 мкл буфера СУИМ. После этого центрифуга смеси, содержащие клетки на 500 g x 5 мин при 4 ° C.
- Ресуспензируйте свежие 500 мкл буфера СУИМ.
- Поместите в образец трубки большинство клеток (например если resuspending клетки в 500 мкл буфера СУИМ, использование 400 мкл). Распределить оставшиеся клетки среди управления трубы и топ до 100 мкл на управления трубки (например для 6 контроля труб, мириться 16,67 мкл в каждой управления трубки и топ с 83,33 мкл буфера FACS). Сделайте группы (управления трубы выделены жирным шрифтом), как Unstained, сингл Витражи (CD45, CD11b), единого жить/мертвые пятна, FMOs и образец трубки.
- Пелле клетки всех трубок центрифугированием на 500 g x 5 мин при 4 ° C.
- Пятно клетки в трубку с 1 мкл антител на 100 мкл буфера СУИМ за 5 х 106 клеток. Проинкубируйте втечение 20 мин при 4 ° C.
Примечание: Используйте 50 мкл антител коктейль, если используются менее 2 х 106 клеток. - Вымойте клетки с 500 мкл буфера СУИМ. Центрифуга клетки на 500 g x 5 мин при 4 ° C.
- Ресуспензируйте клетки в 300 мкл буфера СУИМ.
Примечание: Используйте ~ 100 мкл, если меньше чем 2 x 106клеток. - С помощью анализа цитометрия потоков, количественно клетки, которые CD45низкой и позитивным для CD11b окрашивания. Этот показатель соответствует изолированной первичного микроглии.
5. иммуногистохимическое окрашивание первичных Микроглия
- Пластина клетки в 96-луночных пластины на плотности 1 х 105 клеток с среднего роста и инкубировать на ночь.
- Удалить супернатант и мыть 3 раза с PBS.
- Исправить клетки с параформальдегида 4% в PBS на 15 мин удалить PFA с P1000 пипеткой, а затем вымыть их 3 раза с PBS + 0.1% тритон-X.
- Блок для неспецифической привязки с бычьим сывороточным альбумином 3% за 1 час при комнатной температуре.
- Проинкубируйте с кролик Iba-1 (1: 100) за 24 ч при 4 ° C. После этого снимите смесь основного антитела и мыть 3 раза с PBS.
- Проинкубируйте с вторичной конъюгат анти кролик GFP (1: 200) за 1 ч при комнатной температуре. После этого снимите смесь вторичного антитела и мыть 3 раза с PBS.
- Крепление слайды с флуоресцентных монтажа средних и захвата изображения с помощью флуоресцентный Микроскоп.
6. Количественная оценка микроглии с использованием pHrodo Assay
Примечание: PHrodo assay позволяет выявить уровень фагоцитоза в культивируемых клеток. После поглощения через эндоцитоза интернализации в более кислой среде увеличивает уровни флюоресценции bioparticle конъюгатов. Уровни флюоресценции затем может быть определена количественно, СУИМ. Следующие шаги изменяются от производителей протокола.
- Культура клетки в T-25 колбу в среднего роста в одночасье, посев на плотности 1-2 х 106 клеток за флакон. Вымойте клетки в T-25 колбы с PBS 3 раза за 5 мин.
- Отсоедините ячейки, используя 2 мл 0,25% трипсина. Инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
- Утолить trypsinisation процесс, добавив 2 мл питательных сред, содержащих 10% FBS в колбу.
- Центрифуга суспензию клеток на 500 g x 5 мин при 4 ° C для пеллет клетки.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте пеллет, содержащий основной микроглии в питательной среды на 106 клеток/мл.
Примечание: в качестве альтернативы, плита клетки в плиту 96-ну по крайней мере за день до и цель для 1 х 105 жизнеспособных клеток в колодец на тот день, когда проба должна выполняться. - Плита клетки в 96-луночных пластины на 1 х 105 клеток/Ну, 100 мкл в колодец. Пластина управления и экспериментальной скважины в трех экземплярах и оставить один пустой колодец за положительный контроль для вычитание фона нет-ячейки.
- Добавьте 100 мкл роста средств массовой информации к скважинам, оставить пустым для вычитание фона без ячейки.
Примечание: Как любой другой в vitro пробирного, соответствующие элементы управления имеют жизненно важное значение для точности показаний. Наряду с без ячейки управления (фон чтения), также включают в себя негативные управления хорошо (pHrodo конъюгата добавил, но помещен на льду). - Крышка и инкубировать в течение 1 ч в инкубаторе с 5% CO2 при 37 ° C.
- Подготовка экспериментальной скважины путем добавления стимулятор и лечения. Добавьте элементы управления транспортного средства (только для СМИ роста) неочищенные скважин.
Примечание: Липополисахарида 1 мкг/мл [стимулятор] и эпителиальных клеток человека амнион (hAEC)-кондиционером СМИ [лечения] были использованы для создания представительных результатов. - Оттепель флакон конъюгированных красителя, добавить 2 мл поглощение буфер и кратко вихря. Перенесите содержимое трубки в чистой стеклянной трубки и sonicate за 5 минут, чтобы равномерно рассеяны частицы.
- Аспирационная питательной среды из микропланшетов скважин и быстро заменить 100 мкл суспензии красителей. Накрыть крышкой и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
Примечание: Не забудьте пятно управления трубы также. - С помощью анализа цитометрия потоков, количественно клетки, окрашивание позитивные для конъюгированных pHrodo бусы и представить в процентах (родительского) от активно phagocytosing микроглии.
7. Количественная оценка апоптоза микроглии после воспалительных оскорбление
- Повторите шаги 1-7 из раздела «Проверка микроглии чистоты».
- Поместите в образец трубки большинство клеток (например если вы высокомобильна клетки в 500 мкл буфера СУИМ, использование 400 мкл). Распределить оставшиеся клетки среди управления трубы и топ 100 мкл на управления трубки (например для трубки 6 управления, мириться 16,67 мкл в каждой управления трубки и топ с СУИМ 83,33 мкл буфера). Группы (управления трубы выделены жирным шрифтом): безупречная, одного пятна (AnnexinV, пропидий йодидом), Одноместный жить/мертвые пятна, FMOs, пробоотборные трубки.
- Пелле клетки все трубы центрифугированием на 500 g x 5 мин.
- Инкубировать 1 мкл антител/100 мкл СУИМ буфера/5 х 106 клеток для 20 мин при 4 ° C.
Примечание: Используйте 50 мкл, если меньше чем 2 х 106 клеток. - Вымойте клетки путем добавления 500 мкл буфера СУИМ и центрифуги на 500 g x 5 мин.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 300 мкл буфера СУИМ.
Примечание: ~ 100 мкл, если меньше чем 2 x 106клеток. - Подсчитать ячейки в течение каждого квадранта (Q1: некротические, Q2: поздно apoptotic, Q3: жизнеспособным, Q4: ранние apoptotic).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя методы, описанные здесь, чисто популяций микроглии могут быть изолированы и могут быть готовы для характеристик, используя in vitro и анализ СУИМ. С самого начала до 18 животных может использоваться за калл, с ожидаемой доходности примерно 450 000-600 000 Микроглии клеток. Важно, чтобы сначала подтвердить чистоту изолированных клеток, и сделать анализ СУИМ была выполнена путем пятнать для двух маркеров CD45 и CD11b. выявление микроглии может оказаться хлопотно, как многие маркеры, выраженные Микроглии являются также выраженную макрофаги и использование этих двух маркеров позволяет точной и надежной количественной оценки. В частности, микроглии имеют низкий выражение CD45, по сравнению с высокой выражение в ЦНС и периферических макрофагов и также являются позитивными для CD11b (рис. 1). От этой конкретной изоляции было сообщено чистоту 89,3%. После окрашивания для CD11b, мы отмечаем, что наша основная микроглии разделяют аналогичные морфологические особенности, с широкий спектр морфологии от отчетливо unramified (большой сферические клетки тела с мало или вообще не Расширенные процессы) для более разветвленной (с меньших, более овальные somata и обычно до вторичного порядка процессов) сопоставление ряда государств активации, как ожидалось увидеть в естественных условиях (рис. 2).
После этого были запущены два характеристика анализов для функции Микроглия и выживания. Микроглии являются крупные фагоцитирующих клеток в ЦНС, и pHrodo assay позволяет количественной оценки данного конкретного функциональные свойства. Было отмечено рядом вывозимому увеличение фагоцитарную функцию после того, как 24-h совместно культуры с hAEC кондиционером средний (рис. 3), как измеряется количественная оценка флуоресцентный pHrodo частиц. Наконец AnnexinV-PI окрашивание следующее совместное культура была проведена для выявления выживания микроглии после воспалительных оскорбление. Снижение апоптоза микроглии после лечения с кондиционером среднего (рис. 4) было отмечено. Эти результаты показывают, что средний hAEC кондиционером защищает Микроглия и повышает их фагоцитарной активности, которые могут иметь терапии в перинатальной мозга травмы и neuroinflammatory расстройства.
Рисунок 1 : Выражение CD45 и CD11b, микроглии. Каждая точка представляет ячейку помечены и анализ СУИМ позволяет разъяснения отдельных клеточных популяций. Микроглии есть выражение ниже по сравнению с периферической моноцитарных макрофагов антиген CD45 и позитивные для CD11b. цифры ниже антитела метки указывают доля условного клеток, выражается в процентах населения родительского. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Морфология изолированных первичной микроглии. Как видно на рисунке, микроглии сохраняют свои сферические клетки тела и собственный разветвленную структуру. Шкалы бар = 20 мкм.
Рисунок 3 : Количественное определение фагоцитарной функции в изолированных первичной микроглии. pHrodo, меченного частицы флуоресцировать только когда в кислых средах, таких как сотовые endosomes после фагоцитоза. Здесь наблюдается увеличение поглощения частицы pHrodo в микроглии, относились с кондиционером hAEC среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Анализ микроглии выживаемости после воспалительных оскорбление. (A) представитель СУИМ участков изолированных микроглии. Комбинированные окрашивание AnnexinV и пропидий йодидом позволяет категоризации в apoptotic, некротические, или живой клетки после стимуляции с ПЛАСТИНОК. (B) hAEC кондиционером средних значительно сокращена микроглии апоптоз относительно элементов управления, предлагая формы защиты на этого типа ячейки. * означает p < 0,05, t критерия Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Вымойте среднего |
| Низкий глюкозы Дульбекко модифицированная Eagle среднего |
| 1% v/v пенициллин стрептомицином |
| Дайджест среднего (за мозга) |
| 150 мкл DNase I |
| 100 мкл папаин (17U/мг запасов) |
| 3 мл мыть среднего |
| Средний рост |
| Низкий глюкозы Дульбекко модифицированная Eagle среднего |
| Фетальные бычьим сывороточным 10% |
| 1% v/v пенициллин стрептомицином |
Таблица 1: Таблица решений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Микроглии имеют способность быть про - и противовоспалительными, изменено на стимулы окружающей среды. Предыдущие исследования показали, что модуляции микроглии активации может придать нейропротекции. Их способность обеспечивать защиту нейронов и ремонт повреждений требует дополнительных исследований для дальнейшего нынешнего понимания этих сложных клеток. Таким образом изоляция высокой чистоты первичного микроглии является важным и полезным техника. Это сравнительно быстрый метод для получения чистой первичной микроглии готовы в vitro экспериментов в течение 2 дней.
Существует целый ряд протоколов, описанные в литературе для изоляции первичных микроглии из мышиных мозги. Основная задача эффективно производить достаточно образца, высокой эффективности и чистоты. Основным преимуществом этого протокола является доходность высоки чисто образца без необходимости в то время в культуре. Таким образом метод сокращается от 2 недель до 2 дней, это облегчает быстрые результаты. Характеристика шаги дают надежные функциональные данные о микроглии, укрепление нынешнего понимания этих сложных клеток. Протокол сочетает в себе две текущие подходы - плотность градиентного центрифугирования и магнитной сепарации. Магнитная сепарация хорошо протестирована в литературе для изоляции микроглии в относительно мягко по сравнению с другими изоляции методы14,,1516. Хотя есть, несомненно, изменения функциональных характеристик отдельных первичных микроглии, по сравнению с их собственного государства в естественных условиях, любые изменения в свойства микроглии, как отмечено в анализов, разработанными выше рассчитываются от после переваривания базовой и как таковые являются Светоотражающий прямой модуляции этот иммунитет подмножества.
Хотя протокол является относительно простым, уход во время критических шагов поможет обеспечить хороший урожай. Во-первых важно использовать низкий глюкозы СМИ для поддержки глиальных роста. Кроме того мышиных мозги должны храниться лед холодной на все времена в изоляции. Таким образом рекомендуется предварительно chill все среды, а также инструменты, если это возможно, и выполнить процедуру на льду. Главное длительной изоляции раз приведет к бедным здоровье клеток и урожайности, поэтому важно работать быстро. Кроме того надлежащее удаление менингеальные слой представляет собой решающий шаг при работе с взрослых мышей, в противном случае фибробласты будет переиграть глиальные клетки с точки зрения роста. Во время ферментативного пищеварения мозги важно не в мозг слишком мелко нарезать как это может увеличить гибель клеток, в идеале стремиться для 1 мм2 куски ткани. Когда шлифовка ткани через стрейнер клетки, тщательно ополоснуть СМИ отмываются через каждые несколько минут, чтобы обеспечить все клетки и не попасть в ловушку в сетчатый фильтр, дополнительно рекомендуется использовать стрейнер ячейки 100 мкм, меньше фильтры привести в снижение урожайности. Другим важным шагом является нижележащего 70% плотность градиента среднего слоя, выполняя этот шаг тщательно и медленно с тем, чтобы убедиться, что видели ясно межфазной имеет важное значение, рекомендуется использовать пипетку Pasteur. Кроме того рекомендуется использовать 15 мл конические трубы, как разделение клеток было менее эффективным, когда 50 мл конические трубы были использованы. И наконец градиентного центрифугирования плотности должны быть выполнены при комнатной температуре, как температура может влиять на градиент плотности.
Этот протокол описывает надежный способ производства чистой первичной Микроглии клеток как показано как высокая экспрессия CD45, так и позитивные выражение Cd11b (по сравнению с низкой CD45 выражение в периферийных моноцитов). Клетки могут быть изолированы относительно быстро, таким образом он имеет область значительно возросшее понимание этих клеток глии. Он может использоваться для идентификации различных микроглии населения из разных слоев общества, позволяя для исследований, которые могут выявить различия между микроглии изолированы от больных/раненых и здоровых животных. Путем изоляции населения чистой микроглии можно оценить терапевтический модуляции этого населения иммунных клеток. Например было установлено, что кондиционером hAEC СМИ увеличилась фагоцитоза, а также улучшение микроглии выживания во время воспалительных стимул, таким образом предоставляя терапевтические преимущества17. Это коррелирует с сокращены apoptotic мусора и таким образом предполагает, что разминирование этих мусора могут иметь нейропротекторной эффекты.
Протокол может применяться для новорожденных и взрослых мышей, однако более старые мыши будет производить сокращение урожайности. Кроме того она может быть адаптирована для изоляции первичных астроциты от новорожденных и взрослых мышей, снова старых мышей приведет к снижению урожайности. Кроме того модификации механических диссоциации шаг с заказной нейлоновая сетка с больших размеров пор в отличие от 100 мкм ячейки фильтра, могут совершенствовать клеток доходность18.
Ограничения этого протокола включают снижению урожайности и время, необходимое для этого протокола. Урожайность составляет примерно 150 000-200 000 ячеек на браковать шести животных, по сравнению с миллионами, которые могут быть получены через недели культуры клеток. Кроме того в то время как клетки могут быть получены в течение двух дней, процедура в первый день довольно много времени, около шести часов.
Тем не менее этот метод является весьма полезным инструментом в понимании роли микроглии в болезни, способных изолировать и характеризующих клетки в течение двух дней. Она производит высокой чистоты первичного Микроглии клеток, облегчения точного и эффективного исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
