Summary
Ett protokoll för isolering av primära mikroglia från murina hjärnor presenteras. Denna teknik hjälper främja aktuell kunskap om neurologiska sjukdomar. Densitet gradient centrifugering och magnetisk separering kombineras för att producera tillräcklig avkastning av ett högt rena urval. Dessutom beskriver vi stegen för karaktärisering av mikroglia.
Abstract
Mikroglia, bosatt immuncellerna i hjärnan, är de första responders till inflammation eller skada i centrala nervsystemet. Nyare forskning har avslöjat mikroglia vara dynamisk, kan förutsatt att både proinflammatoriska och antiinflammatoriska fenotyper. Både M1 (pro-inflammatoriska) och M2 (pro-reparativa) fenotyper spela en viktig roll i neuroinflammatoriska tillstånd som perinatal hjärnskada och uppvisar olika funktioner som svar på vissa stimuli från omgivningen. Moduleringen av mikrogliala aktivering har noterats för att ge neuroprotektion vilket tyder på mikroglia kan ha terapeutiska potential i hjärnskada. Dock mer forskning krävs att bättre förstå rollen av mikroglia i sjukdomen, och detta protokoll underlättar som. Protokollet beskrivs nedan kombinerar en täthet lutning centrifugering process för att minska cellulära skräp, med magnetisk separering, producerar ett högt rena prov av primära mikrogliaceller som kan användas för in vitro experiment, utan den behöver för 2-3 veckor odling. Dessutom ger karakterisering stegen robusta funktionella data om mikroglia, medhjälp studier till bättre förståelse av polariseringen och grundning av dessa celler, som har stark konsekvenser inom regenerativ medicin.
Introduction
Skador som förvärvats under den perinatala perioden från inflammation, hypoxisk-ischemi och blödning kan ha en rad långsiktiga följdtillstånd. Den komplicerade patofysiologin vid perinatal hjärnskada är teoretiserade för att involvera inflammation och ischemi med efterföljande neuronala och axonal död1. Det medfödda immunsvaret spelar en viktig roll i kaskaden av händelser som leder till skada2.
Mikroglia, bosatt immuncellerna inom det centrala nervsystemet (CNS), är de första responders till skada3. Mikroglia är plast celltyper med förmågan att vara både skyddande eller giftiga, beroende på miljön4. De är inblandade i Kemotaxis, fagocytos, antigen-presentation och produktion av cytokiner och reaktivt syre arter4,5. Senescent mikroglia ständigt kartlägga miljön och aktiveras av närvaron av en utländsk eller skadliga ämne4. Aktiveringen leder till en pro-inflammatoriska svar, kritiska i CNS skydd4. Dessa M1 ”pro-inflammatoriska” fenotyp mikroglia är primärt inblandade i antigen-presentation och döden av patogener4. Trots den avgörande rollen i den inflammatoriska reaktionen i neuroprotektion, kan okontrollerad eller långvarig inflammation vara skadlig och leda till nervcellskador4. Men när de utsätts för vissa stimuli från omgivningen, mikroglia kan ställa ut en anti-inflammatorisk fenotyp. Dessa pro-reparativa M2 mikroglia har en avgörande roll i sårläkning och reparera6, släppa en rad cytokiner och andra lösliga medlare att downregulate inflammation, öka fagocytos och främja reparera4, 7. mikroglia roller är varierande och inkluderar drivande oligodendrocyte differentiering under re-myelinisering8, skydda nervceller under syre och glukos utarmning i stroke modeller9 och främja neurite utväxt i ryggmärgsskada modeller10.
Studien av dessa gliaceller representerar en viktig aspekt i att förstå och manipulera neuroinflammation svar. Protokollet beskrivs tillåter för vidare utredning till den terapeutiska potentialen av mikroglia modulering i neuroinflammatoriska sjukdomar.
Moduleringen av mikrogliala aktivering mot en nervskyddande roll har observerats i en rad villkor11,12,13. Således är att förbättra nuvarande förståelse och ytterligare studera modulering av mikrogliala aktivering kritiska, kräver användning av olika modeller inklusive både in vitro och in-vivo. In vitro studier utgör ett viktigt verktyg på grund av deras större effektivitet, lägre kostnad och förmåga att utreda en isolerad cell befolkning.
I området i närheten finns det en rad protokoll som beskrivs i litteraturen för isolering av mikroglia från murina hjärnor, utmaningen att effektivt producera en hög kapacitet prov med god lönsamhet och hög renhet. Vanliga metoder för isolering av primära mikroglia är av magnetisk separering och långvarig skakar av blandade gliaceller kulturer. Genom personlig erfarenhet konstaterades att det fanns en hög grad av cellulära skräp som blockerat den magnetiska kolumnen. Således utnyttjades följande protokoll, vilken inlemmar en inledande täthet lutning centrifugeringssteget följt av CD11b magnetisk separering. Protokollet beskrivs nedan har optimerats för att producera ett högt rena prov i tillräcklig mängd. Det är en fördel på grund av dess hög renhet och kort tidsperiod — man kan utföra analyser inom 2 dagar utan att behöva kultur för 2-3 veckor. Detta protokoll kan potentiellt anpassas för isolering av primära murina astrocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande procedurer har godkänts av djur etikkommittén vid Monash University. Friska obehandlade nyfödda C57Bl6/J P3-6 möss användes för att generera de representativa resultat.
1. enzymatisk nedbrytning
Obs: Det är viktigt att beakta sterilitet när isolera och odla primära celler. Samtidigt miljön är så sterilt som möjligt, den första dissektion och skörden av murina hjärnor kan slutföras utanför en laminal flöde huva, med alla efterföljande steg utförs inom en LAF.
- Med hjälp av sterila instrument, avliva musen av cervikal dislokation, halshugga djuret och skölj med 100% etanol. Använda liten steril sax, göra små snitt längs höger och vänster sida av huvudet. I den här åldern peeling huden bort enkelt. Med hjälp av tips av böjda pincetten, Skjut försiktigt vävnaden mot pannhornets att exponera skallen, inklusive Bregma.
- Sätt spetsen på sax i öppnandet av ryggradskanalen och gör en laterala snitt till hörselgången. Gör ett snitt längs sagittal suturen till den Bregma, försiktigt peka saxen uppåt för att förhindra skada hjärnan. Sätt spetsen på sax på Bregma och göra laterala snitt till höger och vänster sidor av huvudet längs koronala suturen.
- Med pincett, dra försiktigt bort skallen för att exponera hjärnan. Till gör så, ta tag i kanterna på skallen som exponeras av laterala snittet och dra försiktigt skallen åt sidan. Skallen ska skala bort enkelt. Använda böjda pincetten, försiktigt scoop under hjärnan att ta bort den.
- Placera hjärnan i en 5 mL steril behållare, tvätta 2 - 3 gånger med iskall wash media (låg glukos Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 1% penicillin-streptomycin), cirka 5 mL media per tvätt, ta bort blod.
- I ett laminärt luftflöde huva, placera innehållet i behållaren 5 mL i en liten petriskål (35 mm), vilar på is. Med en steril skalpell blad eller steril sax, bort lillhjärnan och luktbulben. Göra en mittlinjen skär för att separera de två hjärnhalvorna.
- Dra försiktigt bort det meningeal lagret med fin pincett, noga med att inte skada cortices. Identifiera det meningeal lagret som ett mycket tunt skikt av celler med en röd nyans på ytan av hjärnan, med synliga blodkärl. Att hålla hjärnan kall är viktigt för korrekt hjärnhinnorna borttagning. Om det meningeal lagret bryter, Fortsätt peeling bort trasiga fragment tills den är helt bort.
- Överföra hjärnhalvorna till en ny liten petriskål (på is) och fyll med wash media. Hacka hjärnan i små bitar med en steril skalpell kniv/sax.
Obs: Bör dessa ~ 1 mm2 i storlek, och försiktighet bör iakttas att inte klippa dem i alltför små bitar eftersom detta kan minska avkastningen. - Tillsätt 100 µL papain (17 U/mg lager) och 150 µL DNAS jag i media och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C
- Efter matsmältningen, pulverisera vävnad med P1000 pipett. Om vävnad bitar är för stor för att ange pipetten, överväga att använda ett par eller steril sax för att bredda pipettspetsen. Under denna process, se till att inte införa bubblor i media eftersom detta kan minska cellernas viabilitet.
2. myelin avlägsnande av skräp
- Använd steril utrustning under en LAF, förbereda en 50 mL konisk slang med en 100 µm cell SIL, för varje hjärna. Häll innehållet i petriskål, som innehåller sammanfattad medium och hjärnan bitar på en sil. Driva igenom delarna av hjärnan med hjälp av kolven i en steril 3 mL spruta i en malande rörelse tills det syns ingen mer vävnad. Efter matsmältningen, hjärnvävnaden bör falla sönder lätt.
- Kontinuerligt tvätta filtret med wash media, av topping upp cell silen under hela denna process. Detta kommer att tvätta genom celler fastnar i Silen.
Obs: Detta bör göras tills det finns ungefär ~ 15 mL i röret. Detta är att säkerställa att silen är tillräckligt tvättas genom och att maximera mängden celler samlas in. -
Centrifugera den enda cellsuspensionen vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Under denna tid, att förbereda täthet lutning medium som beskrivs.
- Förbereda den lager isoton percoll (SIP), som är den täthet lutning medium som används. Gör detta genom att lägga till 9:1-förhållande av täthet lutning medium 10 x sterila Hanks balanserad saltlösning (HBSS).
- Förbereda övertoningar som 30% SIP i DMEM och 70% smutta i 1 x HBSS. Till exempel, att förbereda 10 mL 30% SIP, tillsätt 3 mL SIP 7 ml DMEM.
- Aspirera supernatanten från koniska rör och resuspendera cellpelleten med 8 mL 30% smutta i DMEM. Över den full volymen till ett färskt 15 mL koniska rör.
- Underfång 70% SIP lösningen. Till gör så, Fyll en överföring pipett med 70% SIP och noggrant push via överföring pipetten till botten av koniska röret. När spetsen är nära botten, tryck försiktigt igenom innehållet i pipetten överföring.
Obs: Gör det långsamt så att inte störa gränssnittet 30/70. Det måste finnas en tydlig linje som separerar de två lagrarna. - Centrifugera SIP lager, inklusive celler, på 650 x g broms 0 och acceleration 4, för 25 min i rumstemperatur.
Obs: Det är viktigt att slutföra spin med broms OFF och tillåta centrifugen att långsamt komma till tvärstopp, som tillämpningen av broms kommer att störa interphasen och dramatiskt minska samlingen cell mellan SIP lager. - Aspirera cellulära skräp på toppen av röret, och ta bort cirka 4 mL media från toppen. Detta kommer att underlätta avlägsnande av mononukleära celler i följande steg. Med P1000 pipett noggrant lägre pipettspetsen mot interphasen. Isolera de mononukleära cellerna från gränssnittet 30/70 täthet lutning medium. Samla ca 3 mL från den grumlig gränssnitt och överföring till en ny 15 mL koniska tub. Späd blandningen med 9 mL HBSS stöd borttagning av täthet lutning medium efter detta.
- Centrifugera utspädda täthet lutning medium interphasen, som innehåller mononukleära celler vid 500 x g i 5 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera med 1 mL odlingsmedium (DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum och 1% antibiotika). Efter detta färga de återsuspenderade cellerna med trypan blå och utföra en cell sammanräkning med hjälp av en haemocytometer.
3. magnetiska aktiverad Cell sortering
Obs: Dessa steg är ändrade från tillverkarnas protokoll.
- Centrifugera de insamlade mononukleära cellerna vid 300 x g i 10 minuter vid 4 ° C att ta bort odlingsmedium som detta kommer att störa magnetiska isolering. Använder det samma celltalet som erhållits från steg 2,8, Omsuspendera på 1 x 108 nucleated celler/mL i PBS (Ca+ ++ och Mg++ gratis) som innehåller 2% FBS och 1 mM EDTA, inom ett volym 0,1-2,5 mL.
- Tillsätt hela volymen av kärnförsedda celler i PBS från föregående steg till en fräsch 5 mL (12 x 75 mm) polystyren rund botten röret. Tillsätt 50 µL CD11b PE märkning reagens per 1 mL av provet. Odla i rumstemperatur i 15 min skyddas från ljus.
- Tillsätt 70 µL av urval cocktail (en kombination av monoklonala antikroppar mot CD11b i PBS) per 1 mL av provet. Odla i rumstemperatur i 15 min skyddas från ljus.
- Blanda magnetiska partiklar genom pipettering upp och ner mer än 5 gånger. Tillsätt 50 µL/mL. Odla i rumstemperatur i 10 min skyddas från ljus.
Obs: Dessa partiklar sedan bilda ett tetrameriskt komplex med antikropparna och kommer få knutna till kolumnen magnetiska. - Om den totala volymen av cell blandningen är mindre än 2,5 mL, topp upp till denna volym med PBS (Ca+ ++ och Mg++ gratis) som innehåller 2% FBS och 1 mM EDTA och blanda genom att försiktigt pipettering 2 - 3 gånger. Placera röret (utan lock) i magneten och odla i rumstemperatur i 5 min.
- I en kontinuerlig rörelse, fullt Invertera magneten som innehåller röret för 2-3 s, hälla bort supernatanten. Tillbaka magneten till upprätt läge och ta bort röret från magneten. Förbered att tvätta återstående cellerna från kolumnen.
Obs: Supernatanten innehåller omärkta och oönskade celler, som avlägsnas genom att vända tuben medan fortfarande i magneten. Tuben innehåller den bifogade Cd11b+ celler. - Tvätta cellerna genom att upprepa steg 3.5 och 3.6 dubbelt mer. Om provet är större än 1 mL, rekommenderas en ytterligare Upprepa steg 3.5 och 3.6.
- Att resuspendera cellerna i en önskad odlingsmedium. Skölj sidan av uppsamlingskärlet samt (t.ex. en 15 mL tub) att samla in celler från sidorna av röret och maximera avkastningen.
4. kontroll av mikroglia renhet
Obs: Den primära mikroglia isolerade från 3 L (n = 5 djur totalt) kontrollerades via fluorescerande aktiverad cell sortering (FACS) för att fastställa renhetskriterier för de representativa resultat.
- Kultur celler i en T-25 kolv i odlingsmedium som innehåller 10% FBS över natten, sådd med en täthet på 1-2 x 106 celler per kolv.
- Tvätta cellerna i T-25 kolvar med PBS 3 x 5 min att ta bort alla återstående tillväxt medier som kan störa trypsinization.
- Tillsätt 2 mL av 0,25% trypsin att lossa cellerna från kolvar. Se till att volymen av trypsin är tillräckliga för att täcka hela ytan av kolven. Efter försiktig omskakning av kolven att säkerställa enhetlig täckning av trypsin, inkubera i 5 minuter vid 37 ° C.
- Släcka trypsinization processen genom att lägga till 2 mL av tillväxtmassmedia innehållande 10% FBS i kolven.
- Samla in supernatanten innehållande trypsinized celler och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter vid 4 ° C att samla in celler.
- Ta bort supernatanten som innehåller odlingsmedium och trypsin och återsuspendera pelleten i 500 μL FACS buffert. Utföra det celltalet med trypan blå.
- Centrifugera vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Utföra Fc receptor block genom att lägga till 50 μL FACS buffert + 1 μL FcR blockerare per 5 x 106 celler. Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C.
Obs: Fc receptor blocket är ett kritiskt steg i förfarandet färgning för att förhindra icke-specifik bindning av immunglobuliner till Fc receptorer i immunceller populationer. Denna blockad påverkar inte efterföljande bindningen av andra antikroppar. - Avsluta den blockerande processen genom spädning med 500 μL FACS buffert. Efter detta, Centrifugera blandningen som innehåller celler vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendera i färska 500 μL FACS buffert.
- Placera flertalet celler (t.ex. om omblandning cellerna i 500 μL av FACS buffert, använda 400 μL) i en prov tub. Fördela de resterande cellerna bland kontroll rören och topp upp till 100 μl per kontrollrör (t.ex. för 6 kontroll rör, sätta 16.67 μL i varje kontrollrör och toppa upp med 83.33 μL FACS buffert). Göra grupperna (kontroll rör i fetstil) som Unstained, enstaka målat (CD45, CD11b), enda live/dead fläcken, ram av ömsesidiga åtaganden och provrör.
- Pellet cellerna i alla rör genom centrifugering vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Färga cellerna i röret med 1 μL antikropp per 100 μL FACS buffert per 5 x 106 celler. Inkubera i 20 min vid 4 ° C.
Obs: Använd 50 μL antikroppar cocktail om mindre än 2 x 106 celler används. - Tvätta cellerna med 500 μL FACS buffert. Centrifugera cellerna vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Att resuspendera cellerna i 300 μL FACS buffert.
Obs: Använd ~ 100 μl om celltal är mindre än 2 x 10-6. - Med hjälp av flödescytometri Flödesanalys, kvantifiera de celler som är positivt för CD11b färgning och CD45låg . Procentsatsen motsvarar den isolerade primära mikroglia.
5. immunhistokemisk färgning av primära mikroglia
- Platta celler i en plattan med 96 brunnar på en densitet på 1 x 105 celler med odlingsmedium och inkubera över natten.
- Avlägsna supernatanten och tvätta 3 gånger med PBS.
- Fixa cellerna med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS för 15 min. ta bort PFA med P1000 pipett, sedan tvätta dem 3 gånger med PBS + 0,1% Triton-X.
- Block för icke-specifik bindning med 3% bovint serumalbumin för 1 h i rumstemperatur.
- Inkubera med kanin Iba-1 (1: 100) i 24 timmar vid 4 ° C. Efter detta ta bort primär antikropp blandningen och tvätta 3 gånger med PBS.
- Inkubera med sekundära anti-kanin GFP konjugat (1: 200) för 1 h i rumstemperatur. Efter detta ta bort sekundär antikropp blandningen och tvätta 3 gånger med PBS.
- Montera bilder med en fluorescerande montering medium och fånga bilder med fluorescerande Mikroskop.
6. kvantifiering av mikroglia använder pHrodo Assay
Obs: PHrodo analysen möjliggör identifiering av nivåer av fagocytos i odlade celler. Vid upptag via endocytos ökar internalisering i surare miljön nivåerna av fluorescens av de bioparticle konjugat. Fluorescens nivåer kan då kvantifieras av FACS. Följande steg är ändrade från tillverkarnas protokoll.
- Kultur cellerna i en T-25 kolv i odlingsmedium övernattning, sådd med en täthet på 1-2 x 106 celler per kolv. Tvätta cellerna i T-25 kolvar med PBS 3 gånger för 5 min.
- Lossa cellerna använder 2 mL 0,25% trypsin. Inkubera i 5 minuter vid 37 ° C.
- Släcka trypsinisation processen genom att lägga till 2 mL av tillväxtmassmedia innehållande 10% FBS i kolven.
- Centrifugera cellsuspension vid 500 x g i 5 minuter vid 4 ° C till pellet celler.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten som innehåller den primära mikroglia i odlingsmedium på 106 celler/mL.
Obs: Alternativt platta celler i en plattan med 96 brunnar minst en dag innan och sikta på 1 x 105 viabla celler per brunn på den dag analysen ska utföras. - Platta celler in i plattan med 96 brunnar på 1 x 105 celler per brunn, 100 μl per brunn. Kontroller och experimentella brunnar i tre exemplar, och lämna en tom brunn per positiv kontroll för en no-cell kontroll bakgrunden subtraktion.
- Tillsätt 100 μL av tillväxtmassmedia till brunnarna tomt för no-cellbakgrund subtraktion.
Obs: Som någon annan in vitro- test, lämpliga kontroller är avgörande för riktigheten av avläsning. Tillsammans med no-cellen kontroll (bakgrund läsning), även den negativa kontrollen väl (pHrodo konjugat lagt, men placeras på is). - Täcka plattan och inkubera i 1 h i en inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C.
- Förbereda experimentella brunnar genom att lägga till stimulerande och behandling. Lägga till fordonets reglage (endast Tillväxtmassmedia) obehandlad brunnar.
Obs: Lipopolysackarid 1 µg/mL [stimulerande] och mänskliga amnionen epitelceller (hAEC)-konditionerat media [behandling] användes för att generera de representativa resultat. - Tina en injektionsflaska av konjugerade färgämne, tillsätt 2 mL upptag buffert och kort vortex. Överför rör innehållet i en ren glasrör och Sonikera i 5 min, för att säkerställa att partiklarna sprids jämnt.
- Aspirera odlingssubstratet från mikroplattan wells och snabbt ersätta med 100 μL av färgämne suspension. Täcka och inkubera vid 37 ° C i 1 h.
Obs: Kom ihåg att färga kontroll rören samt. - Med hjälp av flödescytometri Flödesanalys, kvantifiera celler färgning positivt för konjugerade pHrodo pärlor och presentera som en procentandel (av förälder) av aktivt phagocytosing mikroglia.
7. kvantifiering av mikroglia apoptos efter inflammatoriska förolämpning
- Upprepa steg 1-7 från ”verifiering av mikroglia renhet” avsnitt.
- Placera flertalet celler (t.ex. om du resuspended cellerna i 500 μL av FACS buffert, använda 400 μL) i en prov tub. Fördela de resterande cellerna bland kontroll rören och topp upp till 100 μl per kontrollrör (t.ex. för 6 kontroll rör, sätta 16.67 μL i varje kontrollrör och toppa upp med 83.33 μL FACS buffert). Grupper (kontroll rör i fetstil): ofärgade, enstaka fläckar (AnnexinV, Propidium jodid), enstaka live/dead fläcken, ram av ömsesidiga åtaganden, provrör.
- Pellet cellerna i alla rören genom centrifugering vid 500 x g i 5 min.
- Inkubera med 1 μL antikropp/100 μL FACS buffert/5 x 106 celler i 20 min vid 4 ° C.
Obs: Använd 50 μL om mindre än 2 x 106 celler. - Tvätta cellerna genom att lägga till 500 μL FACS buffert och centrifugera vid 500 x g i 5 min.
- Återsuspendera cellpelleten i 300 μL FACS buffert.
Obs: ~ 100 μL om celltal är mindre än 2 x 10-6. - Kvantifiera celler inom varje kvadrant (Q1: nekrotisk, Q2: sena apoptotiska, Q3: livskraftiga, Q4: tidig apoptotiska).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med metoderna som beskrivs här, ren populationer av mikroglia kan isoleras och kan vara redo för karakterisering med hjälp av in vitro- och FACS analys. Till att börja med kan upp till 18 djur användas per utgallrade, med en förväntad avkastning på cirka 450.000-600,000 mikrogliaceller. Det är viktigt att först bekräfta renheten av de isolerade cellerna och gör så FACS analysen utfördes av färgning för de två markörerna CD45 och CD11b. identifiering av mikroglia kan bevisa besvärande, eftersom många markörer uttryckt av mikroglia uttrycks också av makrofager och användning av dessa två markörer tillåter korrekt och tillförlitlig kvantifiering. Specifikt, mikroglia har ett lågt uttryck av CD45, jämfört med hög uttrycket ses i CNS och perifera makrofager, och är också positivt för CD11b (figur 1). Från denna särskilda isolering rapporterades en renhet av 89,3%. Efter färgning för CD11b, vi noterar att vår primära mikroglia dela liknande morfologiska egenskaper, med en rad olika morfologier från tydligt unramified (stora sfäriska cellkroppen med liten eller ingen utökad processer) till den mer förgrenat (med mindre, mer oval somata och vanligtvis upp till sekundär ordning processer) korrelera till en rad aktiveringen stater, som förväntat att se i vivo (figur 2).
Efter detta kördes två karakterisering analyser för mikroglia funktion och överlevnad. Mikroglia är stora fagocytos cellen i CNS, och pHrodo analysens tillåter kvantifiering av detta särskilt funktionellt boende. En nära 3-faldig ökning av fagocytos funktion efter 24-h Co kultur med hAEC luftkonditionerade medium (figur 3) noterades, mätt med kvantifiering av fluorescerande pHrodo partiklar. Slutligen, en AnnexinV-PI färgning följande samtidig kultur utfördes för att identifiera överlevnad av mikroglia efter en inflammatorisk förolämpning. En minskning av mikroglia apoptos efter behandling med luftkonditionerade medium (figur 4) observerades. Dessa rön tyder detta hAEC luftkonditionerade medium skyddar mikroglia och förstärker deras fagocytisk aktivitet, vilket kan ha terapi vid perinatal hjärnan skada och neuroinflammatoriska sjukdomar.
Figur 1 : Uttryck för CD45 och CD11b av mikroglia. Varje prick representerar en märkt cell och FACS analys tillåter förtydligandet av separata cellpopulationer. Mikroglia har ett lägre uttryck för CD45 antigenet jämfört med perifer monocyt-derived makrofager och är positiva för CD11b. Siffrorna nedan antikropp etikett anger andelen gated celler uttryckt i procent av den överordnade befolkningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Morfologi av isolerade primära mikroglia. Som kan ses i denna figur, mikroglia behålla sina sfäriska cellkroppen och distinkta förgrenat struktur. Skalstapeln = 20 µm.
Figur 3 : Kvantifiering av fagocytos funktion i isolerade primära mikroglia. pHrodo-märkta partiklar fluorescerar endast när i sura miljöer, såsom i cellulär endosomes efter fagocytos. Här, observeras en ökning av pHrodo partikel upptag i mikroglia behandlas med hAEC luftkonditionerade medium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Analys av mikroglia överlevnad efter inflammatoriska förolämpning. (A), representativa FACS tomter av isolerade mikroglia. Den kombinerade färgning av AnnexinV och propidium jodid tillåter kategorisering till antingen apoptotiska, nekrotiska, eller levande celler efter stimulering med LPS. (B) hAEC luftkonditionerade medium betydligt reducerad mikroglia apoptos i förhållande till kontroller, vilket tyder på en form av skydd på denna celltyp. * betecknar p < 0,05, Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tvätta medium |
| Lågt glukos Dulbecco ändrade Eagle Medium |
| 1% v/v penicillin-streptomycin |
| Smälta medium (per hjärnan) |
| 150 µL DNAS jag |
| 100 µL papain (17U/mg lager) |
| 3 ml tvätta medium |
| Odlingsmedium |
| Lågt glukos Dulbecco ändrade Eagle Medium |
| 10% fetalt bovint serum |
| 1% v/v penicillin-streptomycin |
Tabell 1: Tabell över lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroglia har förmågan att vara både pro- och antiinflammatoriska, ändras genom miljön stimuli. Tidigare studier har visat moduleringen av mikroglia aktivering kan ge neuroprotektion. Deras förmåga att ge skydd till nervceller och reparera skadan kräver mer forskning för att ytterligare aktuell kunskap om dessa komplexa celler. Isolering av hög renhet primära mikroglia är alltså en viktig och användbar teknik. Detta är en relativt snabb metod att få högt rena primära mikroglia redo för in vitro- experiment inom 2 dagar.
I området i närheten finns det en rad protokoll som beskrivs i litteraturen för isolering av primära mikroglia från murina hjärnor. Den främsta utmaningen är att effektivt producera tillräckligt prov, hög lönsamhet och renhet. Den största fördelen med detta protokoll är avkastningen av ett högt rena prov utan behov av tiden i kultur. Således metoden förkortas från 2 veckor till 2 dagar, detta underlättar snabba resultat. Karakterisering stegen ger robusta funktionella data om mikroglia, förbättra nuvarande förståelse av dessa komplexa celler. Protokollet kombinerar två nuvarande metoder - täthet lutning centrifugering och magnetisk separering. Magnetisk separering och det har validerats i litteraturen för isolering av mikroglia väl på ett relativt skonsamt sätt jämfört med andra isolering tekniker14,15,16. Medan det finns utan tvekan ändringar av funktionella egenskaper hos den isolerade primära mikroglia jämfört med i deras infödda statligt i vivo, eventuella ändringar av mikroglia boenden som observerats i de analyser som utvecklats ovan beräknas från en efter matsmältningen baslinjen, och som sådan är reflekterande av direkta modulering av immun delmängden.
Protokollet är relativt okomplicerad, kommer att omsorg under kritiska steg bidra till en bra avkastning. För det första är det viktigt att använda låg glukos media för att stödja gliaceller tillväxt. Dessutom måste murina hjärnor hållas is kallt på alla gånger under isoleringen. Således, det rekommenderas att före chill alla medium, liksom instrument om möjligt, och utföra proceduren på is. Ännu viktigare, långvarig isolering gånger kommer att leda till sämre cell hälsa och ge, därför är det viktigt att arbeta snabbt. Dessutom är korrekt avlägsnande av meningeal skiktet ett avgörande steg när du arbetar med vuxna möss, annars fibroblaster kommer konkurrera ut gliacellerna i termer av tillväxt. Under enzymatisk nedbrytning av hjärnan, det är inte viktigt att skära hjärnor i alltför små bitar eftersom detta kan öka celldöd, idealiskt sikta 1 mm2 bitar av vävnad. När slipning vävnaden genom cell silen, skölj noggrant med media varje några minuter för att säkerställa alla celler tvättas genom och inte får fastna i silen, dessutom rekommenderas att använda en sil med 100 μm i cellen, mindre filter resultera i en reducerad kapacitet. Ett annat viktigt steg är underlaying av 70% densitet gradient medelstora lager, utför detta steg försiktigt och långsamt för att säkerställa en tydlig interphase ses är nödvändigt, rekommenderas användning av en Pasteur-pipett. Dessutom rekommenderas användning av 15 mL koniska rör som avskiljandet av celler var mindre effektiva när 50 mL koniska rör utnyttjades. Slutligen måste den täthet lutning centrifugeringen utföras vid rumstemperatur, eftersom temperaturen kan påverka täthetlutningen.
Det här protokollet beskriver en pålitlig metod för att producera högt rena primära mikroglia celler som visas av både hög uttryck för CD45 och positivt uttryck för Cd11b (jämfört med låg CD45 uttryck sett i perifera monocyter). Cellerna kan också isoleras relativt snabbt, det har således räckvidden till betydligt ökad förståelse för dessa gliaceller. Det kan användas för att identifiera olika mikroglia populationer från olika bakgrunder, vilket möjliggör studier som kan avslöja skillnader mellan mikroglia isolerade från sjuka/skadade och friska djur. Genom isolering av en ren mikroglia befolkning, kan terapeutiska modulering av denna immunceller befolkning bedömas. Till exempel fann man att hAEC denvillkorade media ökade fagocytos samt förbättrad mikroglia överlevnad under ett inflammatoriskt stimulus, således ger terapeutiska fördelar17. Detta korrelerade till minskad apoptotiska skräp och därmed antyder clearance av dessa skräp kan ha neuroprotektiva effekter.
Protokollet kan användas till både neonatal eller vuxna möss, men äldre möss kommer att producera en minskad avkastning. Dessutom kan det anpassas till isolera primära astrocyter från neonatal eller vuxna möss, igen äldre möss kommer att resultera i en minskad avkastning. Ändring av den mekaniska dissociation stegen med en skräddarsydd nylon mesh med större porstorlek i motsats till 100 μm cell silen, kan dessutom ytterligare förbättra cell kapacitet18.
Begränsningar i detta protokoll är den lägre avkastningen och den tid som krävs för detta protokoll. Avkastningen är cirka 150 000-200 000 celler per utgallring av sex djur, kontra de miljoner som kan erhållas genom veckorna i cellkultur. Dessutom, medan celler kan erhållas inom två dagar, är förfarandet som den första dagen ganska tidskrävande, tar ca sex timmar.
Denna metod är dock ett mycket användbart verktyg för att förstå rollen av mikroglia i sjukdom, kan isolera och karakterisera cellerna inom två dagar. Det ger hög renhet primära mikroglia celler, underlätta korrekt och effektiv forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
