Summary
Un protocole pour l’isolement des microglies primaire du cerveau murin est présenté. Cette technique contribue à faire avancer la compréhension actuelle des maladies neurologiques. Centrifugation en gradient de densité et de la séparation magnétique sont combinés pour produire une récolte suffisante d’un échantillon très pur. En outre, nous exposent les étapes pour la caractérisation des cellules microgliales.
Abstract
La microglie, les cellules immunitaires résidents dans le cerveau, sont les premiers intervenants à l’inflammation ou de lésions au système nerveux central. Recherches récentes ont révélé des microglies d’être dynamique, capable d’assumer des phénotypes pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Les M1 (pro-inflammatoires) et M2 phénotypes (pro-réparatrice) jouer un rôle important dans les conditions thérapeutiques tels que les lésions cérébrales périnatales et différant de la pièce fonctionne en réponse à certains stimuli de l’environnement. La modulation de l’activation des microglies a été notée pour conférer la neuroprotection, suggérant ainsi la microglie peut avoir potentiel thérapeutique dans les traumatismes crâniens. Cependant, plus de recherches sont nécessaires pour mieux comprendre le rôle des microglies dans la maladie, et qui facilite le présent protocole. Le protocole décrit ci-dessous associe un procédé de centrifugation en gradient de densité afin de réduire les débris cellulaires, avec séparation magnétique, produisant un échantillon très pur des microglies primaire qui peut être utilisé pour l’expérimentation in vitro , sans le besoin de 2-3 semaines de culture. En outre, les étapes de la caractérisation d’obtenir des données fonctionnelles robustes sur la microglie, aidant les études afin d’améliorer notre compréhension de la polarisation et l’amorçage de ces cellules, qui a des implications fortes dans le domaine de la médecine régénérative.
Introduction
Dommages acquis durant la période périnatale de l’inflammation, hypoxie-ischémie et hémorragie peuvent avoir un tableau des séquelles à long terme. La physiopathologie complexe de lésion cérébrale périnatale est théorisée à impliquer l’inflammation et l’ischémie avec qui a suivi la mort neuronale et axonale1. La réponse immunitaire innée joue un rôle important dans la cascade d’événements menant à dommage2.
La microglie, les cellules immunitaires résidents dans le système nerveux central (CNS), sont les premiers intervenants à3de la blessure. La microglie sont des types de cellules en plastique avec la capacité d’être protectrice ou toxique, dépendant de l' environnement4. Ils sont impliqués dans la chimiotaxie, phagocytose, présentation de l’antigène et production de cytokines et de4,espèces réactives de l’oxygène5. La microglie sénescente constamment enquête sur l’environnement et sont activés par la présence d’une substance étrangère ou nocive4. Activation entraîne une réponse pro-inflammatoire, critique à la CNS protection4. Ces microglies de phénotype « pro-inflammatoires » M1 sont principalement liés à la présentation des antigènes et la mort des agents pathogènes4. Malgré le rôle crucial de la réponse inflammatoire dans la neuroprotection, inflammation incontrôlée ou prolongée peut être dangereux et causer des dommages neuronaux4. Toutefois, lorsqu’ils sont exposés à certains stimuli de l’environnement, la microglie peut exposer un phénotype anti-inflammatoires. Ces cellules microgliales les M2 pro-réparatrice ont un rôle essentiel dans la guérison des plaies et de réparer les6, libérant une gamme des cytokines et autres médiateurs solubles qu’atténuent l’inflammation, augmenter la phagocytose et promouvoir la réparation4, 7. le rôle des microglies sont divers et comprennent la conduite différenciation des oligodendrocytes lors de re-myélinisation8, protection des neurones au cours de l’épuisement d’oxygène et de glucose dans la course des modèles9 et promouvoir la croissance des neurites dans 10les modèles de la moelle épinière.
L’étude de ces cellules gliales représente un aspect important dans la compréhension et la manipulation de la réponse à la neuro-inflammation. Le protocole décrit permet pour complément d’enquête sur le potentiel thérapeutique de la modulation de la microglie dans neuroinflammatoire troubles.
La modulation de l’activation microgliale vers un rôle neuroprotecteur a été observée dans une gamme de conditions11,12,13. Ainsi, l’amélioration de notre compréhension actuelle et encore étudiant modulation d’activation microgliale est critique, nécessitant l’utilisation de différents modèles, y compris les deux in vitro et in vivo. Des études in vitro représentent un outil important en raison leur plus grande efficacité, coût et de capacité d’enquêter sur une population de cellules isolées.
Il y a une gamme de protocoles décrits dans la littérature pour l’isolement des cellules microgliales du cerveau murin, le défi de produire efficacement un échantillon de rendement élevé avec bonne viabilité et de grande pureté. Les méthodes couramment utilisées de l’isolement des microglies primaire sont par séparation magnétique et secouant prolongée des cultures mixtes de gliales. Par son expérience personnelle, il a été constaté qu’il y avait un degré élevé de débris cellulaires qui a empêché la colonne magnétique. Ainsi, le protocole suivant a été utilisé, qui comporte une étape de centrifugation en gradient de densité initiale suivie CD11b séparation magnétique. Le protocole décrit ci-dessous a été optimisé pour produire un échantillon très pur en quantité suffisante. Il est avantageux en raison de sa grande pureté et la courte période de temps — on peut effectuer des essais en 2 jours sans avoir à la culture pendant 2-3 semaines. Ce protocole peut être potentiellement adapté pour l’isolation des astrocytes murines primaires.
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Protocol
Les procédures suivantes ont été approuvés par le Comité d’éthique animale à l’Université de Monash. Des souris C57Bl6/J P3-6 nouveau-né non traitée en bonne santé ont servi à produire les résultats représentatifs.
1. enzymatique Digestion
Remarque : Il est important de tenir compte de la stérilité en isolant et en cultivant des cellules primaires. Tout en assurant que l’environnement est aussi stérile que possible, la dissection initiale et la récolte des cerveaux murins peuvent être complétés à l’extérieur d’une hotte à flux alvéolaire, avec toutes les étapes effectuées dans une hotte à flux laminaire.
- À l’aide d’instruments stériles, euthanasier la souris par dislocation cervicale, décapiter l’animal et rincer avec de l’éthanol à 100 %. À l’aide de petits ciseaux stériles, faire des petites incisions le long des côtés droite et gauche de la tête. A cet âge, la peau pèle loin facilement. À l’aide de la pointe de la pince courbe, faites glisser doucement le tissu vers la tribune pour exposer le crâne, y compris le Bregma.
- Insérer la pointe des ciseaux dans l’ouverture du canal rachidien et faire une incision latérale dans le conduit auditif. Faites une incision le long de la suture sagittale pour le Bregma, pointant doucement la pointe des ciseaux vers le haut pour éviter d’endommager le cerveau. Introduire la pointe des ciseaux au Bregma et faire des incisions latérales sur les côtés droite et gauche de la tête le long de la suture coronale.
- À l’aide de pinces, décollez doucement le crâne pour exposer le cerveau. Pour ce faire, saisissez les bords du crâne exposés par l’incision latérale et tirer doucement le crâne sur le côté. Le crâne doit décoller facilement. Avec une pincette courbée, évider délicatement sous le cerveau de l’enlever.
- Placer le cerveau dans un récipient stérile 5 mL, laver 2 ou 3 fois avec lavage glacee médias (de faible concentration de glucose Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 1 % la pénicilline-streptomycine), environ 5 mL de milieu / cycle de lavage, pour enlever le sang.
- Sous une hotte à flux d’air laminaire, placez le contenu du récipient 5 mL dans une petite boîte de Pétri (35 mm), reposant sur la glace. À l’aide d’une lame de bistouri stériles ou des ciseaux stériles, retirez le cervelet et le bulbe olfactif. Faites une ligne médiane coupe pour séparer les deux hémisphères.
- Soigneusement, Décollez la couche méningée avec une pince fine, en prenant soin de ne pas endommager le cortex. Identifier la couche méningée comme une très mince couche de cellules avec une teinte rouge sur la surface du cerveau, avec les vaisseaux sanguins visibles. Garder le cerveau froid est essentielle pour l’élimination appropriée de méninges. Si la couche méningée se brise, continuer épluchant loin les fragments déchirés, jusqu'à ce qu’il est totalement supprimé.
- Transférer les hémisphères dans un nouvelle petite boîte de Pétri (sur glace) et remplissez-le de lavage médias. Hacher le cerveau en petits morceaux avec des ciseaux/lame de bistouri stérile.
NOTE : Ceux-ci doivent être ~ 1 mm2 en taille, et il faut ne pas de les couper en morceaux trop petits car cela pourrait réduire le rendement. - Ajouter 100 µL papaïne (stock de 17 U/mg) et 150 µL de DNase I dans les médias et incuber 30 min à 37 ° C
- Après digestion, triturer les tissus à l’aide d’une pipette P1000. Si les morceaux de tissus sont trop volumineux pour entrer dans la pipette, envisagez d’utiliser une paire ou des ciseaux stériles pour élargir l’embout de la pipette. Au cours de ce processus, prenez soin de ne pas pour introduire des bulles dans les médias car cela pourrait réduire la viabilité des cellules.
2. l’enlèvement des débris de la myéline
- Sous une hotte à flux laminaire, utiliser du matériel stérile, préparer un tube conique de 50 mL avec une bonde de cellule 100 µm, pour chaque cerveau. Versez le contenu de la boîte de Pétri, contenant les pièces de moyen et le cerveau de digérer sur une passoire. Faire passer les morceaux de cerveau en utilisant le piston d’une seringue stérile 3 mL dans un mouvement de broyage jusqu'à ce qu’il n’y a aucun tissu plus visible. Suite à la digestion, le tissu cérébral devrait se désagrège facilement.
- En permanence, lavez le filtre avec les médias de lavage, de recharger la crépine de la cellule tout au long de ce processus. Cela donnera au lavage par le biais de n’importe quelle cellule pris au piège dans la crépine.
Remarque : Cela devrait être fait dans le tube, il y a environ ~ 15 mL. C’est pour s’assurer que la crépine est suffisamment lavée à travers et pour maximiser la quantité de cellules recueillies. -
Centrifuger la suspension monocellulaire à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Pendant ce temps, préparer le milieu de gradient de densité tel que décrit.
- Préparer le stock percoll isotonique (SIP), qui est le milieu de gradient de densité utilisé. Cela en ajoutant 9:1 ratio de milieu de gradient de densité à 10 x stérile Hanks de solution saline équilibrée (HBSS).
- Préparer les dégradés que 30 SIP en DMEM et 70 % SIP dans 1 x HBSS. Par exemple, pour préparer 10 mL de 30 % SIP, ajouter 3 mL de SIP à 7 mL DMEM.
- Aspirer le surnageant des tubes coniques et remettre le culot cellulaire avec 8 mL de 30 % SIP en DMEM. Transférer tout le volume dans un tube conique frais 15 mL.
- Sous-tendent la solution SIP de 70 %. Pour ce faire, remplir une pipette de transfert avec 70 % de SIP et soigneusement push grâce à la pipette de transfert vers le bas du tube conique. Une fois la pointe près du fond, poussez doucement à travers le contenu de la pipette de transfert.
Remarque : Ce faire lentement pour ne pas perturber l’interface 30/70. Il doit y avoir une ligne claire qui sépare les deux couches. - Centrifuger les couches de la SIP, y compris les cellules, à 650 x g avec frein 0 et 4, une accélération pendant 25 min à température ambiante.
Remarque : Il est essentiel de remplir le spin avec frein OFF et permettre à la centrifugeuse pour lentement s’arrêtent, comme application du frein va perturber l’interphase et de réduire considérablement le prélèvement de cellules entre les couches SIP. - Aspirer les débris cellulaires dans la partie supérieure du tube et retirer environ 4 mL de milieu sur le dessus. Ceci facilitera l’élimination des cellules mononucléaires dans l’étape suivante. À l’aide d’une pipette P1000, Déposez délicatement l’embout de la pipette vers l’interphase. Isoler les cellules mononucléaires de l’interface moyenne gradient de densité 30/70. Recueillir environ 3 mL de l’interface nuageux et le transfert dans un nouveau tube conique de 15 mL. Suite à cela, diluer le mélange avec 9 mL de HBSS pour faciliter la dépose du support de gradient de densité.
- Centrifuger l’interphase moyen gradient de densité dilué, contenant les cellules mononucléaires à 500 g pendant 5 min. aspirer le surnageant et remettre en suspension avec 1 mL de milieu de croissance (DMEM additionné de 10 % fœtale bovine sérique et 1 % antibiotiques). Suite à cela, détachant les cellules resuspendues avec trypan blue et effectuer un nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
3. magnétique cellulaire activé tri
Remarque : Ces étapes sont modifiés du protocole des constructeurs.
- Centrifuger les cellules mononucléaires recueillies à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C, enlever le milieu de croissance qu’il n’interférera pas avec l’isolement magnétique. En utilisant le même nombre d’éléments obtenu à partir de 2.8 étape, remettre à 1 x 108 nucléées cellules/mL dans du PBS (Ca++ et Mg++ gratuit) contenant 2 % FBS et 1 mM EDTA, dans une fourchette de volume de 0,1 à 2,5 mL.
- Ajouter tout le volume de cellules nucléées dans du PBS à l’étape précédente dans un tube de polystyrène fond rond frais 5 mL (12 x 75 mm). Ajouter 50 µL de réactif d’étiquetage CD11b PE par 1 mL d’échantillon. Incuber à température ambiante pendant 15 min, abri de la lumière.
- Ajouter 70 µL de sélection cocktail (une combinaison d’anticorps monoclonaux contre CD11b dans du PBS) par 1 mL d’échantillon. Incuber à température ambiante pendant 15 min, abri de la lumière.
- La composition de particules magnétiques de pipetage en haut et en bas plus de 5 fois. Ajouter 50 µL/mL à l’échantillon. Incuber à température ambiante pendant 10 min, abri de la lumière.
Remarque : Ces particules puis forment un tétramère complexe avec les anticorps et seront attachés à la colonne magnétique. - Si le volume total du mélange de la cellule est inférieure à 2,5 mL, haut jusqu'à présent volume avec du PBS (Ca++ et Mg++ gratuit) contenant 2 % FBS et 1 mM EDTA et mélanger par pipetage doucement 2 ou 3 fois. Placer le tube (sans couvercle) dans l’aimant et incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Dans un mouvement continu, complètement inverser l’aimant contenant le tube pendant 2-3 s, décanter le liquide surnageant. Regagner l’aimant en position verticale et retirer le tube de l’aimant. Préparez-vous à estomper le reste des cellules de la colonne.
Remarque : Le surnageant contient des cellules non étiquetés et non désirés, qui sont éliminés en renversant le tube tout en restant dans l’aimant. Le tube contient la Cd11b ci-joint+ cellules. - Laver les cellules en répétant les étapes 3.5 et 3.6 deux fois plus. Si l’échantillon est supérieure à 1 mL, une répétition plus d’étapes 3.5 et 3.6 est recommandé.
- Remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance désirée. Rincez le côté du bateau collection ainsi (par exemple. un tube de 15 mL) à prélever des cellules des parois du tube et de maximiser les rendements.
4. vérification de la pureté de la microglie
Remarque : Les microglies primaire isolée de 3 L (n = total 5 animaux) ont été vérifiées par l’intermédiaire de fluorescence cellulaire activé triant (FACS) pour déterminer la pureté pour les résultats représentatifs.
- Cellules en culture dans une fiole de T-25 dans le milieu de culture contenant 10 % FBS du jour au lendemain, semer à une densité de 1-2 x 106 cellules par flacon.
- Laver les cellules dans les fioles de T-25 avec du PBS 3 x pendant 5 min retirer tout support de croissance restants qui peut-être entraver la trypsinisation.
- Ajouter 2 mL de 0,25 % de trypsine pour détacher les cellules de ces flacons. Assurez-vous que le volume de la trypsine est suffisant pour couvrir toute la surface du ballon. Suite douce tourbillonnantes du ballon pour assurer une couverture uniforme de trypsine, incuber pendant 5 min à 37 ° C.
- Étancher le processus de la trypsinisation en ajoutant 2 mL de milieu de culture contenant 10 % FBS dans le ballon.
- Récupérer le surnageant contenant les cellules trypsinisés et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C à prélever des cellules.
- Retirez le surnageant contenant le milieu de croissance et de la trypsine et Resuspendre le culot dans un tampon de FACS 500 μL. Effectuer le nombre d’éléments à l’aide de bleu trypan.
- Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Effectuer bloc récepteur Fc en ajoutant 50 tampon FACS μL + bloqueur FcR 1 μL par 5 x 106 cellules. Incuber pendant 15 min à 4 ° C.
Remarque : Le bloc de récepteur Fc est une étape essentielle dans la procédure de marquage afin d’empêcher la liaison non spécifique des immunoglobulines aux récepteurs Fc dans les populations de cellules immunitaires. Ce blocus n’affecte pas la liaison aval d’autres anticorps. - Terminer le processus de blocage par dilution avec du tampon de FACS 500 μL. Suite à cela, centrifuger le mélange contenant les cellules à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Resuspendre dans frais 500 μL FACS de tampon.
- Placez la majorité des cellules (par exemple si resuspendant les cellules de 500 μL de tampon de FACS, utilisation 400 μL) dans un tube à essais. Distribuer les cellules restantes entre les tubes de contrôle et d’albums jusqu'à 100 μL / tube témoin (par exemple pour 6 tubes de contrôle, conditionnés 16,67 μL dans chaque tube témoin et recouvrez avec le tampon de FACS 83,33 μL). Rendre les groupes (contrôle des tubes en caractères gras) comme Unstained, single colorés (CD45, CD11b), seule tache de vivre/morts, OGP et tubes d’échantillons.
- Les cellules de tous les tubes de granule par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Colorer les cellules dans le tube 1 anticorps μL par tampon de FACS 100 μL par 5 x 106 cellules. Incuber pendant 20 min à 4 ° C.
Remarque : Utilisez 50 μL anticorps cocktail si moins de 2 x 106 cellules sont utilisées. - Laver les cellules avec le tampon de FACS 500 μL. Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension les cellules dans le tampon de FACS 300 μL.
Remarque : Utilisez ~ 100 μl si cell count est inférieur à 2 x 106. - Par analyse en cytométrie en flux, quantifier les cellules CD45faible et positif pour CD11b souiller. Ce pourcentage correspond à la microglie isolée primaire.
5. Immunohistochemical souillant des microglies primaire
- Plaque des cellules dans une plaque à 96 puits à une densité de 1 x 105 cellules avec le milieu de croissance et incuber pendant la nuit.
- Retirez le surnageant et laver 3 fois avec du PBS.
- Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4 % dans du PBS pendant 15 min. retirer du programme d’action avec une pipette P1000, puis lavez-les 3 fois avec PBS + 0,1 % Triton-X.
- Bloc pour la liaison non spécifique avec 3 % d’albumine sérique bovine pendant 1 h à température ambiante.
- Incubez avec lapin Iba-1 (1/100) pendant 24 h à 4 ° C. Suite à cela, retirez le mélange de l’anticorps primaire et laver 3 fois avec du PBS.
- Incuber avec secondaire conjugué GFP anti-lapin (1 : 200) pendant 1 h à température ambiante. Suite à cela, retirez le mélange de l’anticorps secondaire et laver 3 fois avec du PBS.
- Monter les diapositives avec un fluorescent montage moyen et capture des images à l’aide d’un microscope à fluorescence.
6. quantification des microglies utilisant la pHrodo Assay
Remarque : Le test de pHrodo permet l’identification des niveaux de phagocytose dans des cellules cultivées. Après absorption par endocytose, internalisation dans le milieu plus acide augmente les niveaux de fluorescence des conjugués bioparticle. Niveaux de fluorescence peuvent ensuite être quantifiés en FACS. Les étapes suivantes sont modifiées du protocole des constructeurs.
- Culture des cellules dans une fiole de T-25 dans le milieu du jour au lendemain, semer à une densité de 1-2 x 106 cellules par flacon. Laver les cellules dans des flacons de T-25 avec PBS 3 fois pendant 5 min.
- Détacher les cellules à l’aide de trypsine 0,25 % 2 mL. Incuber 5 min à 37 ° C.
- Étancher le processus trypsinisation en ajoutant 2 mL de milieu de culture contenant 10 % FBS dans le ballon.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C pour granuler des cellules.
- Retirez le surnageant et Resuspendre le culot contenant les microglies primaire dans un milieu de culture à 106 cellules/mL.
NOTE : Alternativement, plaque cellules dans une plaque à 96 puits au moins un jour avant et 1 x 105 cellules viables / puits viser le jour de l’essai doit être effectué. - Cellules de plaque en plaque 96 puits à 1 x 105 cellules/puits, 100 μL par puits. Plaque de contrôles et puits expérimentaux en triple exemplaire et laisser un puits vide par témoin positif pour une soustraction de fond non-cellule contrôle.
- Ajouter 100 μL de milieux de culture dans les puits laissés vides pour la soustraction de fond non-cellule.
Remarque : Comme tout autre essai in vitro avec, des contrôles appropriés sont essentiels pour l’exactitude de l’affichage. Aux côtés de la non-cellule contrôle (lecture en arrière-plan), inclut également le contrôle négatif bien (conjugué pHrodo ajouté, mais mis dans la glace). - Couvrir la plaque et incuber pendant 1 heure dans un incubateur avec 5 % de CO2 à 37 ° C.
- Préparer les puits expérimentales en ajoutant stimulant et traitement. Ajouter des contrôles de véhicule (milieux de croissance seulement) aux puits non traitées.
NOTE : Lipopolysaccharide 1 µg/mL [stimulant] et cellules épithéliales humaines amnion (hAEC)-milieux conditionnés [traitement] ont servi à produire des résultats représentatifs. - Décongeler un flacon de teinture conjugué, ajouter vortex et brièvement 2 mL de tampon de capture. Transvaser le contenu du tube dans un tube en verre propre et laisser agir pendant 5 min, pour faire en sorte que les particules sont également disséminés.
- Aspirer le milieu de culture de la microplaque et remplacer rapidement par 100 μl de suspension de colorant. Couvrir et laisser incuber à 37 ° C pendant 1 h.
Remarque : N’oubliez pas de colorer les tubes de contrôle aussi bien. - Par analyse en cytométrie en flux, quantifier les cellules coloration positive pour les perles de conjugués pHrodo et présenter comme un pourcentage (de parent) de phagocytants activement les cellules microgliales.
7. quantification de l’apoptose de cellules microgliales suite insulte inflammatoire
- Répétez les étapes 1 à 7 de la section « Vérification de la pureté de la microglie ».
- Placez la majorité des cellules (par exemple si vous remis en suspension les cellules de 500 μL de tampon de FACS, utilisation 400 μL) dans un tube à essais. Distribuer les cellules restantes entre les tubes de contrôle et garnir jusqu'à 100 μL / tube de contrôle (par exemple pour les tubes de contrôle 6, conditionnés 16,67 μL dans chaque tube témoin et recouvrez avec du tampon de FACS 83,33 μL). Groupes (contrôle des tubes en caractères gras) : taches colorées ou non, une seule (AnnexinV, l’iodure de Propidium), single live/dead teinté, OGP, tubes d’échantillons.
- Les cellules de tous les tubes de granule par centrifugation à 500 g pendant 5 min.
- Incuber 1 μL anticorps/100 μL FACS tampon/5 x 106 cellules pendant 20 min à 4 ° C.
Remarque : Utilisez 50 μL si moins de 2 x 106 cellules. - Laver les cellules en ajoutant 500 tampon FACS μL et centrifuger à 500 g pendant 5 min.
- Resuspendre le culot dans un tampon de FACS 300 μL.
NOTE : ~ 100 μL si cell count est inférieur à 2 x 106. - Quantifier les cellules dans chaque quadrant (Q1 : nécrotiques, Q2 : apoptose tardive, Q3 : viable, Q4 : apoptose précoce).
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Representative Results
Utilisant les méthodes décrites ici, les populations pures des microglies peuvent être isolées et peuvent être prêtes pour la caractérisation à l’aide de in vitro et analyse de FACS. Dans un premier temps, jusqu'à 18 animaux peut être utilisé par l’abattage sélectif, avec un rendement attendu d’environ 450 000-600 000 de cellules microgliales. Il est crucial d’abord s’assurer de la pureté des cellules isolées, et pour ce faire, FACS analyse a été réalisée par coloration pour les deux marqueurs CD45 et CD11b. Identification des microglies peut s’avérer gênante, comme de nombreux marqueurs exprimés par les cellules microgliales sont également exprimées par macrophages et l’utilisation de ces deux marqueurs permet une quantification précise et fiable. Plus précisément, la microglie ont une faible expression de CD45, comparée à l’expression élevée dans le système nerveux central et périphériques macrophages et sont également positif pour CD11b (Figure 1). De cet isolement particulier, une pureté de 89,3 % a été rapportée. Après coloration pour CD11b, nous remarquons que nos cellules microgliales primaire partagent des caractéristiques morphologiques similaires, avec un éventail de morphologies du distinctement non ramifiée (grand sphérique corps cellulaire avec peu ou pas de processus étendus) à la plus ramifié (avec un plus petit, plus corps ovales et généralement jusqu'à processus d’ordre secondaire) corrélation à un éventail d’États d’activation, comme attendu à voir in vivo (Figure 2).
Suite à cela, deux essais de caractérisation de la microglie fonction et la survie ont été exécutés. Microglies sont la cellule phagocytaire importante dans le système nerveux central, et le dosage de pHrodo permet la quantification de cette propriété fonctionnelle. Un court 3 fois dans la fonction phagocytaire après que 24 h co-culture avec hAEC conditionné moyenne (Figure 3) a augmenté, tel que mesuré par la quantification des particules fluorescentes pHrodo. Enfin, une co-culture suivant coloration de AnnexinV-PI a été réalisée afin d’identifier la survie des microglies après une insulte inflammatoire. Une réduction dans l’apoptose des cellules microgliales après que traitement avec milieu conditionné (Figure 4) a été observé. Ces résultats suggèrent que moyen hAEC conditionné protège la microglie et augmente leur activité phagocytaire, susceptibles d’avoir un traitement cérébrale périnatale blessures et thérapeutiques des troubles.
Figure 1 : Expression de CD45 et CD11b par la microglie. Chaque point représente une cellule marquée et FACS analyse permet d’élucidation de populations cellulaires distincts. La microglie ont une plus faible expression de l’antigène CD45 par rapport aux périphériques macrophages dérivés de monocytes et sont positif pour CD11b. numéros sous étiquette anticorps indiquent la proportion de cellules fermées, exprimée en pourcentage de la population parente. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Morphologie des microglies primaire isolé. Comme peut être vu dans ce chiffre, la microglie conservent leur corps de cellule sphérique et la structure ramifiée distincte. Echelle = 20 µm.
Figure 3 : Quantification de la fonction phagocytaire des microglies primaire isolé. les particules marquées pHrodo réagissent en seulement lorsque dans les milieux acides, comme dans les endosomes cellulaire suite à la phagocytose. Ici, on observe une augmentation pHrodo capture de particules dans la microglie traitée avec hAEC conditionné moyen. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse de survie des microglies après insulte inflammatoire. (A), FACS représentant parcelles de microglie isolée. La coloration combinée de l’iodure de propidium et de AnnexinV permet de catégorisation en apoptose, nécrotique, ou des cellules vivantes après stimulation par le LPS. (B) hAEC conditionné moyenne apoptose microglie sensiblement réduite par rapport aux témoins, ce qui suggère une forme de protection sur ce type de cellule. * signifie p < 0,05, test t de student. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Support de lavage |
| Faible concentration de Glucose Dulbecco modifiée milieu Eagle |
| 1 % v/v pénicilline-streptomycine |
| Moyen de Digest (par le cerveau) |
| 150 µL DNase I |
| 100 µL papaïne (stock 17U/mg) |
| 3 ml de milieu de lavage |
| Milieu de croissance |
| Faible concentration de Glucose Dulbecco modifiée milieu Eagle |
| 10 % de sérum bovin fœtal |
| 1 % v/v pénicilline-streptomycine |
Tableau 1 : Tableau des solutions.
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Discussion
Microglies ont la capacité d’être pro - et anti-inflammatoires, altéré par des stimuli de l’environnement. Des études antérieures ont montré que la modulation de l’activation des microglies peut conférer la neuroprotection. Leur capacité à protéger les neurones et réparer les blessures nécessite plus de recherche pour approfondir la compréhension actuelle de ces cellules complexes. Ainsi, isolement des microglies primaire de haute pureté est une technique importante et utile. Il s’agit d’une méthode relativement rapide à l’obtention des microglies primaire extrêmement pur prêt pour in vitro l’expérimentation en 2 jours.
Il y a une gamme de protocoles décrits dans la littérature pour l’isolement des microglies primaire de cerveaux murins. L’enjeu principal est de produire efficacement des échantillon suffisant, élevé dans la viabilité et la pureté. Le principal avantage de ce protocole est le rendement d’un échantillon très pur, sans avoir à la fois en culture. Ainsi, la méthode est raccourcie de 2 semaines à 2 jours, ce qui facilite des résultats rapides. Les étapes de la caractérisation d’obtenir des données fonctionnelles robustes sur la microglie, améliorer notre compréhension actuelle de ces cellules complexes. Le protocole combine deux approches actuelles - centrifugation en gradient de densité et de la séparation magnétique. Séparation magnétique a été bien validée dans la littérature pour l’isolement des microglies dans une manière relativement douce par rapport aux autres isolement techniques14,15,16. Alors qu’il y a sans aucun doute des modifications aux caractéristiques fonctionnelles de la microglie primaire isolée par rapport à leur état natif en vivo, des modifications apportées aux propriétés de microglie tel qu’observé dans les essais développés ci-dessus sont calculées à partir un départ après la digestion et comme tels sont le reflet de modulation directe de ce sous-ensemble du système immunitaire.
Alors que le protocole est relativement simple, soins lors des étapes critiques contribuera à assurer un bon rendement. Tout d’abord, il est essentiel d’utiliser des médias de la faible concentration de glucose pour soutenir la croissance gliale. Par ailleurs, le cerveau murin doit rester glace froid à tout moment lors de l’isolation. Ainsi, il est recommandé de refroidir préalablement tous les moyen, ainsi que des instruments si possible, puis effectuez la procédure sur la glace. Surtout, fois isolement prolongé mènera à la mauvaise santé de la cellule et donnent, par conséquent, il est essentiel de travailler rapidement. En outre, un bon démontage de la couche méningée est une étape cruciale quand travaillant avec des souris adultes, sinon les fibroblastes va supplanter les cellules gliales en termes de croissance. Au cours de la digestion enzymatique des cerveaux, il est important pas pour couper le cerveau en trop petits morceaux car cela peut augmenter la mort cellulaire, idéalement viser 1 mm2 pièces de tissu. Lorsque le tissu de meulage à travers le tamis de la cellule, rincer soigneusement avec les médias toutes les quelques minutes pour s’assurer que toutes les cellules sont lavées à travers et ne pas être coincés dans la passoire, en outre il est recommandé d’utiliser une passoire de cellule de 100 μm, petits filtres entraînent une réduction de rendement. Une autre étape critique est la sous-jacente de la couche moyenne dégradé 70 % densité, exécutez l’étape soigneusement et lentement afin d’assurer qu'une interphase clair est vu est essentiel, est recommandé d’utiliser une pipette Pasteur. En outre, l’utilisation de tubes coniques 15 mL est recommandée comme la séparation des cellules a été moins efficace lorsque les tubes coniques 50 mL ont été utilisés. Enfin, la centrifugation en gradient de densité doit être effectuée à la température ambiante, car la température peut affecter le gradient de densité.
Ce protocole décrit une méthode fiable de produire les cellules de la microglie primaire très pure, comme en témoigne à la fois forte expression de CD45 et expression positive de Cd11b (par rapport à la faible expression de CD45 vue dans les monocytes périphériques). Cellules peuvent aussi être isolées relativement rapidement, il a donc la possibilité de compréhension considérablement accrue de ces cellules gliales. Il peut être utilisé pour identifier les différentes cellules microgliales les populations d’origines différentes, permettant des études qui peuvent révéler des différences entre les cellules microgliales isolées d’animaux sains et malades ou blessée. Isolement d’une population de cellules microgliales pure, modulation thérapeutique de cette population de cellules immunitaires peut être évaluée. Par exemple, il a été constaté que conditionné hAEC médias augmente la phagocytose, mais aussi améliore la survie des cellules microgliales pendant un stimulus inflammatoire, offrant ainsi des avantages thérapeutiques17. Cette corrélation avec réduit apoptotic débris et suggère ainsi le dégagement de ces débris peut-être avoir des effets neuroprotecteurs.
Le protocole peut être appliqué à des souris adultes ou néonatales, toutefois plus souris vont produire un rendement réduit. En outre, il peut être adapté pour isoler des astrocytes primaires de souris néonatales ou adultes, encore une fois des souris âgées seront traduira par un rendement a diminué. En outre, la modification de l’étape de dissociation mécanique avec une maille en nylon sur mesure avec la taille des pores plus gros par opposition à la crépine de cellule 100 μm, pourrait améliorer encore la cellule rendement18.
Limites du présent protocole comprennent le rendement plus faible et le temps requis pour ce protocole. Le rendement est environ 150 000-200 000 cellules par abattage des six animaux, contre les millions qui peuvent être obtenues grâce à des semaines de culture cellulaire. En outre, tandis que les cellules peuvent être obtenues dans les deux jours, la procédure sur le premier jour est assez longue, prenant environ six heures.
Néanmoins, cette méthode est un outil très utile pour comprendre le rôle des microglies dans la maladie, capable d’isoler et de caractériser les cellules dans les deux jours. Il produit des cellules de la microglie primaire haute pureté, facilitant une recherche rigoureuse et efficace.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
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