Summary
Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.
Abstract
Microglia, beyin, yerleşik bağışıklık hücreleri iltihap veya Merkezi sinir sistemine yaralanmaya ilk yardım ekipleri vardır. Son araştırma dinamik, pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar fenotipleri varsayarak kabil olmak microglia ortaya koymuştur. Hem (pro-inflamatuar) M1 ve M2 (pro-onarıcı) fenotipleri oyun neuroinflammatory koşulları perinatal beyin hasarı ve sergi farklı gibi önemli bir rol belirli çevresel uyaranlara yanıt olarak işlev görür. Mikroglial harekete geçirmek modülasyon böylece microglia tedavi edici potansiyeli beyin hasarı olabilir düşündüren neuroprotection görüşmek için Not edildi. Ancak, daha fazla araştırma microglia hastalığında rolünün daha iyi anlamak için gereklidir ve bu iletişim kuralı bu kolaylaştırır. Protokol altında birleştiren son derece saf bir örnek içinde vitro deneyler için olmadan kullanılabilir birincil mikroglial hücre üreten manyetik ayırma ile hücresel enkaz azaltmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü işlemi açıklanmıştır. 2-3 hafta kültür gerek. Ayrıca, karakterizasyonu adımları rejeneratif tıp alanında güçlü etkileri vardır polarizasyon anlayışımızı geliştirmek için çalışmalar yardım ve bu hücrelerin priming microglia hakkında sağlam işlevsel veri verim.
Introduction
İnflamasyon, hipoksik iskemisi ve kanaması perinatal dönemde edinilen hasar uzun vadeli sekel bir dizi olabilir. Perinatal beyin hasarı karmaşık Patofizyoloji inflamasyon ve ardından gelen nöronal ve aksonal ölüm1iskemi dahil etmek teorisini. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı olaylar yaralanma2' ye çağlayan önemli bir rol oynar.
Microglia, merkezi sinir sistemi (MSS), içinde yerleşik bağışıklık hücreleri yaralanma3ilk yardım ekipleri vardır. Microglia plastik hücre türü kapasiteli çevre4koruyucu veya toksik, bağımlı olmak vardır. Onlar Kemotaksis, fagositoz, antijen sunumu ve üretim sitokinler ve Reaktif oksijen türleri4,5yer alırlar. Senescent microglia sürekli çevre anket ve bir yabancı veya zararlı madde4varlığı ile aktif hale gelir. Harekete geçirmek bir pro-inflamatuar yanıt, CNS koruma4' te kritik yol açar. Bu M1 "pro-inflamatuar" fenotip microglia öncelikle antijen sunumu ve patojenler4ölüm söz konusu. Neuroprotection inflamatuvar yanıtta önemli rol rağmen zararlı ve nöronal hasar4kurşun kontrolsüz veya uzun süreli iltihap olabilir. Ancak, bazı çevresel uyaranlara maruz kaldığında, microglia bir anti-inflamatuar fenotip sergi. Bu pro-onarıcı M2 microglia iyileşmesi ve sitokinler bir dizi bırakmadan6, onarım kritik bir rol var ve diğer çözünür arabulucu tümleyici inflamasyon, fagositoz artırmak ve teşvik4, tamir 7. microglia roller çeşitlidir ve sürüş oligodendrocyte farklılaşma sırasında oksijen ve glikoz tükenmesi kontur modelleri9 sırasında nöronlar korunması ve neurite yapılan teşvik re-myelination8, dahil Medulla Spinalis Yaralanmalarında10modelleri.
Bu gliyal hücreler çalışma anlamakta ve neuroinflammation cevaben işleme önemli bir yönü temsil eder. Daha fazla araştırma yapılması tedavi potansiyel bir microglia modülasyon neuroinflammatory hastalıkları için açıklanan Protokolü sağlar.
Mikroglial etkinleştirme nöroprotektif rolü doğru modülasyon koşulları11,12,13aralıkta gözlenmiştir. Böylece, şimdiki anlayış ve daha fazla eğitim modülasyon mikroglial etkinleştirme içinde in vitro ve in vivode dahil olmak üzere çeşitli modellerinin kullanımı gerektiren kritik geliştirmektedir. Vitro çalışmalar nedeniyle daha fazla etkinlik, daha düşük maliyet ve yeteneği bir izole hücre nüfus araştırmak için önemli bir araç temsil eder.
Edebiyat microglia fare beyni, kimden verimli bir şekilde iyi canlılığı ve yüksek saflıkta ile yüksek verim örnek üretmeye meydan yalıtım için açıklanan protokoller bir dizi vardır. Manyetik Ayırma ve uzun süreli karma gliyal kültürleri sallayarak tarafından birincil microglia yalıtım sık kullanılan yöntemlerdir. Kişisel deneyim sayesinde, manyetik sütun tıkalı hücresel enkaz yüksek derecede oldu bulundu. Böylece, aşağıdaki iletişim kuralı, hangi CD11b manyetik ayırma tarafından takip bir ilk yoğunluk gradient Santrifüjü adım içermektedir kullanılmıştır. Aşağıda açıklanan protokol son derece saf bir örnek yeterli miktarda üretmek için optimize edilmiştir. Yüksek saflığı ve kısa sürede nedeniyle avantajlıdır — bir gerçekleştirebilir deneyleri 2 gün içinde 2-3 hafta kültür için gerek kalmadan. Bu iletişim kuralı potansiyel olarak birincil fare astrocytes yalıtım için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki yordamlar Monash Üniversitesi'nde hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması. Sağlıklı tedavi edilmezse kardiyolojik C57Bl6/J P3-6 fareler temsilcisi sonuçları oluşturmak için kullanılan.
1. Enzimatik sindirim
Not: Yalıtma ve Primer hücre kültürü çalışmalarının kısırlık dikkate almak önemlidir. Çevre olarak steril olduğunu kontrol ettikten iken ilk diseksiyon ve fare beyni hasat laminal akışı başlık dışında bir laminar akış başlık içinde gerçekleştirilen sonraki tüm adımlar ile tamamlanabilir.
- Steril aletler kullanarak, fare tarafından servikal çıkığı ötenazi, hayvan başını kesmek ve % 100 etanol ile durulayın. Küçük steril makas kullanırken, başın sağ ve sol kenarlarında küçük kesiler olun. Bu yaşta, Cilt kolayca uzağa soyar. Kıvrımlı pensler ipuçlarını kullanarak, doku Bregma de dahil olmak üzere kafatası, ortaya çıkarmak için Kürsü doğru yavaşça kaydırın.
- Spinal kanal açılış makas ucunu takın ve doğrudan kulak kanalınıza yanal bir kesi yapmak. Bir kesik sagittal dikiş boyunca hafifçe yukarı doğru beyin zarar önlemek için makas ucu işaret Bregma için yapmak. Makas ucu Bregma takın ve koronal sütür boyunca baş sağ ve sol tarafı için yanal insizyon olun.
- Forseps kullanarak, yavaşça kafatası beyin ortaya çıkarmak için peel away. Bunu yapmak için yan kesi tarafından maruz kafatası kenarları tutun ve hafifçe kafatası kenara çek. Kafatası peel away kolayca. Eğri forseps kullanarak, yavaşça kaldırmak için altında beyin Kepçe.
- Beyin bir 5 mL steril kapsayıcısına getirin, 2 - 3 kez yaklaşık 5 mL medya yıkama kan kaldırmak için ücret ile buz gibi yıkama medya (düşük glikoz Dulbecco'nın modifiye kartal orta (%1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM)), yıka.
- Bir laminar hava akımı başlık, buz üstünde dinlenme küçük petri kabına (35 mm), 5 mL kapsayıcısında içeriğini yerleştirin. Steril neşter bıçak veya steril makas kullanılarak, beyincik ve olfaktör ampul kaldırın. Bir orta hat iki hemisferlerin ayırmak için kesim yapmak.
- Dikkatle meninjeal katman cortices zarar vermemeye dikkat çekici iyi Forseps ile peel away. Meninjeal katman görünür kan damarları ile beyin yüzeyinde kırmızı bir belirti hücreleri çok ince bir tabaka tanımlar. Beynini soğuk tutmak için uygun meninkslerde kaldırılması esastır. Meninjeal katman tatili, tamamen kaldırılana kadar yırtık parçaları uzak kabuk soyma devam.
- Yeni küçük petri kabına (buzda) ve doldurma ile yıkama kitle iletişim araçları hemisferlerin aktarın. Beyin steril neşter bıçak/makas ile küçük parçalar halinde doğrayın.
Not: Bunlar ~ 1 mm2 boyutunda olmalıdır ve bu verim azaltabilir gibi onları çok küçük parçalar halinde kesilmiş değil için özen gösterilmelidir. - 100 µL papain (17 U/mg hisse senedi) ve 150 µL ekleyin Dnaz ben medya içine ve 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
- Sindirim P1000 pipet kullanarak doku triturate. Doku parçaları pipet girmeniz için fazla büyüktür, pipet ucu genişletmek için bir çift veya steril makas kullanarak göz önünde bulundurun. Bu işlem sırasında bu hücre canlılığı azaltabilir kabarcıklar medya içine tanıtmadım için dikkat ediniz.
2. miyelin enkaz kaldırma
- Laminar akış başlığı altında steril ekipman kullan, 50 mL konik tüp her beyin için bir 100 µm hücre süzgeç ile hazır olun. Petri dish, Özet orta ve beyin parçaları üzerine bir süzgeç içeren içeriğini dökün. Beyin parçaları kadar görünür hiçbir daha fazla doku bileme çekimde bir steril 3 mL şırınga pistonu kullanarak itin. Sindirim, beyin dokusu dışında kolayca düşmek gerekir.
- Sürekli yıkama medya filtresiyle bu süreci boyunca hücre süzgeç kadar topping yıkayın. Bu süzgeç tuzağa hücreler aracılığıyla temizler.
Not: tüp yaklaşık ~ 15 mL kadar yapılması gerekir. Bu süzgeç aracılığıyla yeterince yıkanır, toplanan hücre miktarını en üst düzeye çıkarmak üzere. -
Tek hücre süspansiyon vasıl 500 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Bu süre boyunca, yoğunluk gradient orta açıklandığı şekilde hazırlayın.
- Kullanılacak yoğunluğu Degrade aracını olan hisse senedi izotonik percoll (SIP), hazır olun. Bu steril Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) x 10 9:1 oranı yoğunluk gradient orta ekleyerek yaparsınız.
- Degradeler 30 olarak hazırlamak % 70 ve % DMEM YUDUM YUDUM 1 x HBSS. Örneğin, 10 mL 30 hazırlamak için % YUDUM YUDUM 3 mL 7 mL DMEM ekle.
- Süpernatant 8 mL % 30 ile hücre Pelet YUDUM DMEM içinde konik boru ve resuspend Aspire edin. Tam birim taze 15 mL konik tüp aktarın.
- % 70 SIP çözüm altına koymak. Bunu yapmak için bir transfer pipet %70 SIP ve dikkatli bir şekilde konik tüp altına transfer pipet ile itme ile doldurun. İpucu alt yakın olduğunda, transfer pipet içeriği ile yavaşça itin.
Not: Bunu yavaş yavaş 30/70 arabirimi kesintiye uğratmak değil için. İki katmanı ayıran net bir çizgi olması gerekir. - 650 x g 25 dakika oda sıcaklığında 4, hızlanma ve fren 0 ile de hücreleri de dahil olmak üzere SIP katmanları santrifüj kapasitesi.
Not: Fren OFF spin tamamlamak ve santrifüj fren uygulanmasına Interphase bozabilir ve hücre toplama SIP katmanlar arasında önemli ölçüde azaltmak olarak durdurmak için yavaş yavaş gelmek izin vermek için önemlidir. - Tüp üstündeki hücresel enkaz Aspire edin ve yaklaşık 4 mL medya en baştan çıkarmak. Bu aşağıdaki adımı mononükleer hücrelerde çıkarılması kolay olmayacaktır. P1000 pipet kullanarak, dikkatle pipet ucu Interphase doğru indirin. 30/70 yoğunluk gradient orta arayüzü mononükleer hücreler yalıtmak. Yaklaşık 3 mL bulutlu arabirimi ve transfer için yeni 15 mL konik tüp toplamak. Bu karışımı ile yoğunluk gradient orta kaldırılmasını yardım etmek için HBSS 9 mL seyreltik.
- Santrifüj kapasitesi sulandırılmış yoğunluk gradient orta interfaz, mononükleer hücreler içeren 5 dakika süreyle 500 x g de süpernatant Aspire edin ve 1 mL büyüme orta (% 10 fetal sığır serum ve % 1 antibiyotik ile desteklenmiş DMEM) ile resuspend. Bunu takiben trypan resuspended hücrelerle mavi leke ve bir haemocytometer kullanan bir hücre sayısı gerçekleştirin.
3. manyetik aktif hücre sıralama
Not: Aşağıdaki adımları üreticilerin iletişim kuralından değiştirilir.
- Kendine hakim mononükleer hücre vasıl 300 x g 4 ° C'de bu manyetik yalıtım ile müdahale edecek gibi büyüme orta kaldırmak için 10 dakika santrifüj kapasitesi. Adım 2.8 elde edilen aynı hücre sayısı kullanarak, resuspend 1 x 108 hücre/mL PBS (++ Ca ve Mg++ ücretsiz) parçalanmayabilir %2 0,1-2.5 tonluk bir birim içindeki FBS ve 1 mM EDTA içeren mL.
- Çekirdekli hücre tam birim PBS içinde bir taze 5 mL (12 x 75 mm) polistren yuvarlak alt tüp önceki adımda ekleyin. 50 ekleyin µL CD11b PE etiketleme reaktif 1 mL örnek başına. Oda sıcaklığında ışıktan korunan 15dk için kuluçkaya.
- 70 µL seçimin kokteyl (PBS CD11b karşı Monoklonal antikor birleşimi) 1 mL örnek başına ekleyin. Oda sıcaklığında ışıktan korunan 15dk için kuluçkaya.
- Manyetik parçacıklar aşağı yukarı 5 katından fazla pipetting tarafından karıştırın. 50 µL/mL örnek için ekleyin. 10 dk ışıktan korunan için oda sıcaklığında kuluçkaya.
Not: Bu parçacıklar daha sonra antikorlar ile tetrameric bir kompleks oluştururlar ve manyetik sütuna bağlı olsun. - Hücre karışımı hacmi az 2.5 mL ise, bu birimin PBS (++ Ca ve Mg++ ücretsiz) ile üst % 2 FBS ve 1 mM EDTA içeren ve hafifçe 2 - 3 kez pipetting tarafından karıştırın. (Kapak) olmadan tüp mıknatıs yerleştirin ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Bir sürekli çekimde tam olarak 2-3 s, süpernatant dökme için tüp içeren mıknatıs tersine çevirin. Mıknatıs bir dik konuma getirin ve tüp mıknatıs kaldırın. Sütundan kalan hücreleri yıkamak için hazır olun.
Not: Süpernatant hala içinde iken mıknatıs tüp ters çevirme tarafından kaldırılır etiketsiz ve istenmeyen hücreler içeriyor. Ekli Cd11b tüp içerir+ hücreleri. - Hücreleri 3.5 ve 3.6 iki kez daha fazla adımları tekrar ederek yıkayın. Örnek 1 mL büyükse, daha fazla yineleme adımları 3.5 ve 3.6 önerilir.
- İstenen büyüme orta hücrelerde resuspend. Koleksiyon gemi de tarafında durulama (e.g. 15 mL tüp) tüp iki tarafından hücreleri toplamak ve verimi en üst düzeye çıkarmak için.
4. Microglia saflık doğrulanması
Not: birincil microglia 3 L izole (n = 5 hayvanlar toplam) yolu ile floresan aktif hücre (FACS) temsilcisi sonuçları için saflık belirlemek için sıralama doğrulandı.
- Kültür hücreleri içeren FBS gecede, 1-2 x şişe başına 106 hücre yoğunluğu, tohum % 10 büyüme orta bir T-25 şişesi.
- PBS 3 ile T-25 şişeler hücrelerde yıkama x trypsinization ile etkileşebilir kalan herhangi bir büyüme medya kaldırmak 5 min için.
- 2 mL % 0.25 tripsin şişeler hücrelerden ayırmak için ekleyin. Tripsin hacmi şişeye tüm yüzeyine karşılamak için yeterli olduğundan emin olun. Nazik tripsin Tekdüzen kapsama sağlamak için balonun ardından dönen, 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
- 2 mL % 10 içeren büyüme ortamının ekleyerek trypsinization işlemi gidermek FBS balonun içine.
- Trypsinized hücreleri ve 4 ° C'de hücreleri toplamak için 5 min için 500 x g, santrifüj içeren süpernatant toplamak.
- Büyüme orta ve tripsin içeren süpernatant kaldırmak ve Pelet 500 μL FACS arabellekte resuspend. Trypan mavi kullanan hücre sayısı gerçekleştirin.
- 4 ° C'de 5 min için 500 x g, santrifüj FC reseptör blok ekleme 50 μL FACS tampon + 1 μL FcR engelleyici 5 x 106 hücre başına yerine getirilir. 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
Not: Fc reseptör blok boyama yordamdaki non-spesifik bağlama immünglobulin bağışıklık hücre popülasyonlarının Fc reseptörleri engellemek için kritik bir adımdır. Bu abluka aşağı akım bağlama diğer antikorların etkilemez. - Engelleme işlemi ile 500 μL FACS tampon sulandrarak sonlandırmak. Bunu, 500 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri içeren karışım santrifüj kapasitesi
- 500 taze μL FACS arabellekte resuspend.
- Hücreleri (FACS arabelleği, kullanım 400 μL 500 μL hücrelerde resuspending Eğerörneğin ) çoğunluğu bir örnek tüp içine yerleştirin. Kalan hücreleri kontrol tüpleri arasında dağıtmak ve denetim tüp başına 100 μL top (örneğin 6 kontrol tüpleri için 16.67 μL her denetim tüp ve üst ile 83.33 μL FACS tampon koymak). Gruplar (kalın kontrol tüpleri) Unstained, lekeli tek (CD45, CD11b), tek canlı/ölü leke, FMOs ve örnek tüpleri yapmak.
- 500 x g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından tüm tüpler hücrelerde cips
- 5 x 106 hücre başına 100 μL FACS arabellek başına 1 μL antikor ile tüp hücrelerde leke. 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
Not: 2 x 10 daha az6 hücreler kullanılır 50 μL antikor kokteyl kullanın. - 500 μL FACS arabellek hücrelerle yıkayın. 500 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi
- 300 μL FACS arabellek hücrelerde resuspend.
Not: hücre sayısı az 2 x 106~ 100 μl kullanın. - Akış Sitometresi Analizi kullanarak, CD45düşük ve CD11b boyama için pozitif hücreler ölçmek. Bu yüzde izole birincil microglia karşılık gelir.
5. immunohistokimyasal birincil Microglia boyama
- 1 x 105 hücre yoğunluğu bir 96-şey plaka hücrelerde büyüme orta ile plaka ve gecede kuluçkaya.
- Süpernatant kaldırmak ve 3 kez PBS ile yıkayın.
- 15 dk. Kaldır PFA P1000 pipet ile PBS içinde %4 paraformaldehyde ile hücreleri saptamak, sonra onları 3 kere yıkamak PBS + % 0.1 ile Triton-X.
- Non-spesifik bağlama için blok ile % 3 sığır serum albümin oda sıcaklığında 1 h için.
- Tavşan Iba-1 (1: 100) 4 ° C'de 24 h için kuluçkaya Bunu takiben birincil antikor karışımı çıkarın ve 3 kez PBS ile yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 h için ikincil Anti-tavşan GFP eşlenik (1: 200) ile kuluçkaya. Bunu takiben ikincil antikor karışımı çıkarın ve 3 kez PBS ile yıkayın.
- Slaytlar floresan mikroskop kullanarak orta ve yakalama görüntüleri montaj bir floresan ile bağlayın.
6. miktar Microglia kullanarak pHrodo tahlil
Not: PHrodo tahlil fagositoz kültürlü hücrelerdeki düzeyde tanımlanması için izin verir. Endositoz ile alımı içselleştirilmesi daha asidik ortamı içine floresan bioparticle conjugates bir düzeyde artar. Floresans düzeyleri sonra FACS tarafından sayısal. Aşağıdaki adımları üreticilerin iletişim kuralından değiştirilir.
- 1-2 x şişe başına 106 hücre yoğunluğu, tohum büyüme orta bir T-25 şişesi hücrelerde bir gecede, kültür. T-25 şişeler 5 min için PBS 3 kez ile hücrelerde yıkayın.
- 2 mL % 0.25 tripsin kullanarak hücre bağlantısını kesin. 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
- 2 mL % 10 içeren büyüme ortamının ekleyerek trypsinisation işlemi gidermek FBS balonun içine.
- 500 x g 4 ° C'de hücreler cips için 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve kültür orta 106 hücre/mL, birincil microglia içeren Pelet resuspend.
Not: Alternatif olarak, plaka bir 96-şey tabak içinde en az bir gün önce hücreleri ve 1 x 105 hücrelerin iyi ücret için tahlil gerçekleştirilecek olan günde nişan al. - 1 x 105 hücreleri/iyi 96-şey plaka, iyi başına 100 μL plaka hücrelere. Denetimleri ve deneysel wells nüsha plaka ve her bir no-hücre kontrol arka plan çıkarma için olumlu denetim bir boş şey bırakın.
- Hayır-hücre arka plan çıkarma için boş bıraktı wells için büyüme ortamının 100 μL ekleyin.
Not: diğer vitro tahlil gibi uygun kontrollerin dökümanları doğruluk için hayati önem taşımaktadır. Hayır hücrenin yanında denetim (arka plan) okuma, ayrıca negatif kontrol de içerir (pHrodo eşlenik ekledim, ancak buz üzerinde yerleştirilir). - Plaka kapak ve bir kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 1 h için kuluçkaya
- Deneysel wells uyarıcı ve tedavi ekleyerek hazırlayın. Araç denetimleri (yalnızca büyüme medya) tedavi edilmeyen kuyular için ekleyin.
Not: Lipopolysaccharide 1 µg/mL [uyarıcı] ve insan amnion epitel hücre (hAEC)-klimalı ortam [tedavi] temsilcisi sonuçlar üretmek için kullanılmıştır. - Konjuge boya bir şişe çözülme, 2 mL alımını arabellek ve kısaca girdap ekleyin. Temiz cam tüp içine tüp içeriğini aktarmadan ve parçacıklar eşit dağınık emin olmak için 5 min için solüsyon içeren temizleyicide.
- Mikroplaka wells kültür ortamından Aspire edin ve hemen boya süspansiyon 100 μL ile değiştirin. Kapak ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
Not: kontrol tüpleri de leke unutmayın. - Akış Sitometresi Analizi kullanarak, konjuge pHrodo boncuk için olumlu boyama hücreleri ölçmek ve aktif microglia phagocytosing, bir yüzdesi (üst) olarak mevcut.
7. Microglia inflamatuar hakaret takip Apoptosis miktar
- 1-7 "microglia saflık doğrulama" bölümündeki adımları yineleyin.
- Hücreleri (FACS arabelleği, kullanım 400 μL 500 μL hücrelerde resuspended Eğerörneğin ) çoğunluğu bir örnek tüp içine yerleştirin. Kalan hücreleri kontrol tüpleri arasında dağıtmak ve denetim tüp (örneğin 6 kontrol tüpleri, her denetim tüp ve üst 83.33 μL FACS önbellekle 16.67 μL katlanmak için) başına 100 μL top. Gruplar (kontrol tüpleri kalın harflerle gösterilmiştir): günahı, tek lekeleri (AnnexinV, Propidium iyodür), tek canlı/ölü leke, FMOs, örnek tüpler.
- Tüpler hücrelerde 500 x g 5 min için de centrifuging tarafından cips.
- İle 1 μL antikor/100 μL FACS arabellek/5 x 106 hücreler 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
Not: Eğer daha az 50 μL kullanın 2 x 106 hücreler. - Hücreleri 500 x g 5 min için de 500 μL FACS arabellek ve santrifüj ekleyerek yıkayın.
- Hücre Pelet 300 μL FACS arabellekte resuspend.
Not: Eğer hücre sayısı az 2 x 106~ 100 μL. - Her çeyrek daire içindeki hücreleri ölçmek (Q1: nekrotik, Q2: geç apoptotik, Q3: uygun, Q4: erken apoptotik).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, saf microglia nüfusa ayrılmış olabilir ve vitro ve FACS çözümlemesi kullanarak karakterizasyonu için hazır olabilir. İlk olarak, kadar 18 hayvan itlaf, beklenen bir verim yaklaşık 450.000-600.000 mikroglial hücre ile başına kullanılabilir. İlk izole hücreler saflığı onaylamak çok önemlidir ve microglia tarafından ifade edilen birçok işaretleri de tarafından ifade edilir gibi FACS analiz için iki işaretleri CD45 ve CD11b. microglia tanımlaması boyama tarafından gerçekleştirilen yapmak zahmetli, ispat makrofajlar ve bu iki işaretleri kullanımı doğru ve güvenilir miktar sağlar. Özellikle, microglia CD45 CNS ve periferik makrofajlar, görülen yüksek ifadesine göre düşük bir ifade ve ayrıca CD11b için pozitif (Resim 1). Bu özel izolasyonu %89,3 saflığı bildirildi. CD11b için boyama sonra biz unutmayın bizim birincil microglia (ile daha küçük, daha fazla ramified için benzer Morfolojik özellikleri, türleri Morfoloji vücuttan belirgin unramified (büyük küresel hücre az veya hiç genişletilmiş süreçleri ile) bir dizi ile paylaşmak Oval somata ve genellikle en fazla ikincil sipariş işlemleri) etkinleştirme Birleşik, bir dizi için in vivo (Şekil 2) görmek için beklendiği gibi birleştiriliyor.
Bunu, microglia fonksiyonu ve hayatta kalmak için iki karakterizasyonu deneyleri işletilmiştir. Microglia MSS büyük fagositik hücrede, ve pHrodo tahlil miktar bu belirli işlevsel özellik sağlar. Floresan pHrodo parçacıklar miktar tarafından ölçülen sonra 24-h ortak kültür hAEC ile orta (şekil 3) şartına fagositik işlevi bir çevre 3 kat artış belirtilmişti. Son olarak, bir AnnexinV-PI boyama aşağıdaki ortak kültür inflamatuar hakaret takip microglia yaşama tanımlamak için gerçekleştirildi. Bir azalma şartına orta (şekil 4) ile tedavi gözlenmiştir sonra microglia apoptosis. Bu bulgular bu şartına hAEC orta microglia korur ve perinatal beyin hasarı ve neuroinflammatory bozukluklarında tedavi olabilir onların fagositik aktivite geliştirir öneririz.
Resim 1 : CD45 ve microglia tarafından CD11b ifade. Her nokta etiketli bir hücreyi temsil eden ve FACS analiz ayrı hücre popülasyonlarının aydınlatma sağlar. Microglia periferik monosit kaynaklı makrofajlar karşılaştırıldığında CD45 antijen daha düşük bir ifade var ve sayıları CD11b. antikor etiketinin altında Geçitli hücreler üst nüfus yüzdesi cinsinden ifade edilen oranda olduğunu gösterir için olumludur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Morfoloji izole birincil microglia. Bu şekilde görüldüğü gibi korumak microglia onların küresel hücre vücut ve farklı ramified yapısı. Ölçek çubuğu 20 µm =.
Şekil 3 : Miktar fagositik fonksiyonunu kullanabilirsiniz izole birincil microglia. pHrodo etiketli parçacıklar asidik ortamlarda zaman, hücresel endosomes fagositoz aşağıdaki gibi sadece belli. Burada, pHrodo parçacık anlamazdın şartına hAEC orta ile tedavi microglia bir artış görülmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Analiz inflamatuar hakaret sonra microglia yaşama. (A) temsilcisi FACS araziler izole microglia. AnnexinV ve propidium iyodür kombine boyama stimülasyon LPS ile sonra apoptotik, çürümüş, veya canlı hücre içine sınıflandırma sağlar. (B) hAEC denetimleri, düşündüren bir form koruma bu hücre türüne göre orta önemli ölçüde azaltılmış microglia apoptosis şartına. * p ettiğinizi < 0,05, Öğrenci t-testi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Yıkama orta |
| Düşük glikoz Dulbecco kartal orta değiştiren'ın |
| % 1 v/v penisilin-streptomisin |
| Orta (beyin) başına sindirmek |
| 150 µL Dnaz ben |
| 100 µL papain (17U/mg stok) |
| 3 ml yıkama orta |
| Büyüme orta |
| Düşük glikoz Dulbecco kartal orta değiştiren'ın |
| % 10 fetal sığır serum |
| % 1 v/v penisilin-streptomisin |
Tablo 1: Tablo Çözümleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microglia çevre uyaranlara tarafından değiştirilmiş hem pro - ve anti-inflamatuar, yeteneği vardır. Önceki çalışmalar microglia harekete geçirmek modülasyon neuroprotection görüşmek göstermiştir. Yeteneklerini nöronlar koruma sağlamak ve hasarı onarmak için bu karmaşık hücrelerin geçerli anlayışı ilerletmek için daha fazla araştırma gerektirir. Böylece, yüksek saflıkta birincil microglia işlemleri olan bir önemli ve yararlı bir tekniktir. Bu son derece saf birincil microglia 2 gün içinde vitro deneyler için hazır almak için nispeten hızlı bir yöntemdir.
Fare beyni gelen birincil microglia yalıtım için literatürde açıklanan protokoller bir dizi vardır. Asıl sorun verimli bir şekilde üretmek yeterli örnek, canlılık ve saflık yüksek etmektir. Bu iletişim kuralı en büyük avantajı son derece saf bir örnek kültür zamanında gerek kalmadan verimidir. Böylece, yöntem 2 hafta 2 gün olarak kısaltılır, bu hızlı sonuçlar kolaylaştırır. Karakterizasyonu adımları sağlam işlevsel veri microglia, bu karmaşık hücrelerinin şimdiki anlayış geliştirme hakkında verim. Protokol iki güncel yaklaşımlar - yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma birleştirir. Manyetik Ayırma de edebiyat microglia yalıtım için diğer yalıtım teknikleri14,15,-16ile karşılaştırıldığında nispeten yumuşak bir şekilde doğrulandı. Hiç şüphesiz onların yerli devlet in vivokarşılaştırıldığında izole birincil microglia fonksiyonel özellikleri yapılan değişiklikler yaparken herhangi bir değişiklik üzerinde geliştirilen deneyleri içinde gözlemlediği gibi microglia özellikleri üzerinden hesaplanır bir sonrası sindirim taban çizgisi, bu bağışıklık alt doğrudan modülasyon yansıtıcı edilmeliler.
Iken nispeten basit bir protokoldür, bakım kritik adımları sırasında iyi bir verim sağlamak için yardımcı olacaktır. İlk olarak, gliyal büyümeyi desteklemek için düşük glikoz medya kullanımı için çok önemlidir. Ayrıca, fare beyni buz soğuk, her zaman sırasında yalıtım tutulması gerekir. Böylece, tüm Orta yanı sıra aletleri mümkünse önceden soğuk ve buza yordamı uygulamanız önerilir. Önemlisi, uzun süreli yalıtım kez yoksul hücre sağlık için kurşun ve verim, böylece hızlı bir şekilde çalışması için önemlidir. Ayrıca, meninjeal katmanı uygun kaldırılması, Yetişkin fare ile aksi takdirde fibroblastlar çalışma gliyal hücreler büyüme açısından kul ne zaman önemli bir adımdır. Enzimatik sindirim beyin sırasında beyin bu çok küçük parçalar halinde kesmek için hücre ölümü artırabilir önemli değil, ideal için doku 1 mm2 adet nişan al. Doku hücre süzgeç aracılığıyla taşlama iyice durulayın medya ile tüm hücreleri emin olmak için birkaç dakikada ile yıkanır ve süzgeç tuzağa değil, ayrıca bir 100 mikron hücre süzgeç kullanmak için tavsiye edilir, daha küçük filtreleri neden olup bir Düşük verim. Başka bir kritik adım bu adımı dikkatle performans % 70 yoğunluğu degrade orta katman underlaying ve yavaş yavaş böylece net bir interfaz görülür sağlamak için çok önemlidir, Pasteur pipet kullanılması önerilir. Ayrıca, ne zaman 50 mL konik borular kullanılmıştır hücreleri ayrılması daha az etkili olduğu kadar 15 mL konik boru kullanılması önerilir. Son olarak, sıcaklık yoğunluk gradient etkileyebilir gibi yoğunluk gradient Santrifüjü oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir.
Bu iletişim kuralı CD45 yüksek ifadesi ve Cd11b olumlu ifade (karşılaştırıldığında düşük CD45 ifade periferik monosit görülen) tarafından gösterildiği gibi son derece saf birincil microglia hücreleri üreten güvenilir bir yöntem açıklanır. Hücreler de nispeten hızlı bir şekilde izole olabilir, böylece önemli ölçüde artmış anlayış bu glia hücreleri kapsama sahiptir. Hasta/yaralı ve sağlıklı hayvanlardan izole microglia arasındaki farklar ortaya çıkarabilir çalışmaları için izin farklı microglia nüfus farklı alanlardan tanımlamak için kullanılabilir. Yalıtım saf microglia nüfusun Bu bağışıklık hücre nüfusunun tedavi modülasyon tespit edilebilir. Örneğin, hAEC klimalı ortam fagositoz, hem de microglia hayatta kalma böylece terapötik yararları17saglayan bir enflamatuar uyarıcı sırasında geliştirilmiş bulundu. Bu için korelasyon apoptotik enkaz azalır ve böylece bu enkaz temizleme nöroprotektif etkileri olabilir göstermektedir.
Protokol ancak büyük fareler bir düşük verim üretecek yenidoğan veya yetişkin fareler için uygulanabilir. Ayrıca, birincil astrocytes yenidoğan veya yetişkin fareler gelen yalıtmak için adapte olabilir, daha büyük fareler bir azalan verim neden olur. Buna ek olarak, daha büyük gözenek boyutu 100 mikron hücre süzgeç karşı olan özel yapım naylon fileli mekanik ayrışma adım değişiklik daha fazla geliştirmek hücre verim18.
Bu protokol sınırlamaları daha düşük verim ve bu iletişim kuralı için gereken süreyi içerir. Yaklaşık 150.000-200.000 hücre, hücre kültürü hafta boyunca elde edilebilir milyonlarca karşı altı hayvanların itlaf başına verimidir. Ayrıca, hücreleri iki gün içinde elde edilebilir iken, ilk gün bu işlem oldukça zaman alıcı, yaklaşık altı saat alarak demek.
Yine de, bu yöntem microglia hastalığında, yalıtma ve hücreleri iki gün içinde karakterize yeteneğine sahip rolünün anlaşılması son derece yararlı bir araç olduğunu. Yüksek saflıkta birincil microglia hücreleri, doğru ve verimli araştırma kolaylaştırmak üretir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
