Summary
기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.
Abstract
Microglia, 두뇌에 있는 면역 세포 염증 또는 중앙 신경 조직에 상해에 초 동 조치입니다. 최근 연구는 동적, 프로-염증 성 및 안티-염증 고기 가정 수 microglia를 밝혔다. 둘 다 (프로-염증 성) M1 및 M2 (프로) 고기 플레이 perinatal 뇌 손상 등 전시 다른 neuroinflammatory 조건에서 중요 한 역할은 특정 환경 자극에 대 한 응답에서 기능. Microglial 활성화의 변조는 따라서 microglia 뇌 손상에 치료 잠재력을 할 수 있습니다 제안 하는 neuroprotection 부여 하는 것 주의 되었다. 그러나, 더 많은 연구가 더 나은 microglia 질병에서의 역할을 이해 하는 데 필요한 이며이 프로토콜을 용이 하 게 한다. 프로토콜 아래에 설명 된 결합 밀도 그라데이션 원심 분리 과정에서 시험관 실험 없이 사용할 수 있는 기본 microglial 세포의 매우 순수한 샘플 생산 자력 분리와 세포 파편을 줄이기 위해는 2-3 주 배양에 대 한 필요 합니다. 또한, 특성화 단계 microglia, 분극의 우리의 이해를 더 나은 연구를 방 조 하 고 이러한 세포의 못쓰게는 재생 의학 분야에서 강한 영향에 대 한 강력한 기능 데이터를 얻을.
Introduction
염증, hypoxic 뇌 출혈에서 perinatal 기간 동안 손상 장기 sequelae의 배열을 가질 수 있습니다. Perinatal 뇌 손상의 복잡 한 이상 염증 그리고 이어지는 신경 및 axonal 죽음1허 혈 이론 이다. 타고 난 면역 반응 부상2로 이어지는 이벤트의 캐스케이드에 중요 한 역할을 한다.
Microglia, 중앙 신경 시스템 (CNS) 내 거주 면역 세포는 부상3초 동 조치. Microglia 용량4환경 보호 또는 독성, 종속을 가진 플라스틱 셀 종류가 있습니다. 그들은 chemotaxis, 식 균 작용, 항 원 프레 젠 테이 션 및 cytokines 및 반응성 산소 종4,5의 생산에서 포함 된다. 노화 microglia 끊임없이 환경을 조사 하 고4외국 또는 유해한 물질 존재에 의해 활성화 됩니다. 활성화는 CNS 보호4중요 한 프로 염증 반응을 이끌어 낸다. 이 m 1 "프로-염증 성" 형 microglia 주로 항 원 프레 젠 테이 션 및 병원 체4의 죽음에서 포함 된다. Neuroprotection에서 염증 반응의 중요 한 역할에도 불구 하 고 유해 하 고 신경 손상4에 통제 또는 장기간 염증이 될 수 있습니다. 그러나, 특정 환경 자극에 노출 되 면 microglia 염증 형을 전시 수 있습니다. 이러한 프로 M2 microglia 상처 치유 및 복구6, cytokines의 범위를 해제에서 중요 한 역할 그리고 다른 수용 성 중재자 downregulate 염증, 식 균 작용을 증가 하 고 홍보 복구4, 7. microglia의 역할 다양 하 고 다시 myelination8, 뇌졸중 모델9 에 산소와 포도 당 소모 하는 동안 뉴런을 보호 하 고 홍보에 neurite 결과 중 운전 oligodendrocyte 차별화를 포함 척수 부상10모델.
이러한 glial 세포의 연구는 이해 및 조작 neuroinflammation에 대 한 응답에서 중요 한 측면을 나타냅니다. 설명된 프로토콜 microglia 변조 neuroinflammatory 장애에서의 치료 잠재력에 추가 조사에 대 한 수 있습니다.
신경 보호 역할을 향해 microglial 활성화의 변조 조건11,,1213의 범위에 관찰 되었습니다. 따라서, 현재 이해 하 고 더 공부 microglial 활성화의 향상이 중요, 체 외에서 그리고 vivo에서모두를 포함 하 여 다양 한 모델의 사용을 필요로 합니다. 생체 외에서 연구는 그들의 더 큰 효율성, 낮은 비용 및 고립 된 세포 인구 조사 수는 중요 한 도구를 나타냅니다.
다양 한 프로토콜 microglia murine 두뇌에서 효율적으로 좋은 생존 및 고 순도 높은 수익률 샘플 생산에 도전의 격리에 대 한 문헌에 설명 되어 있습니다. 기본 microglia의 절연의 일반적으로 사용 되는 방법 자력 분리와 혼합 glial 문화의 장기간 떨고 있습니다. 개인적인 경험을 통해 자기 열을 저지 한 세포질 파편의 높은 수준의 있었다는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 다음 프로토콜 이용 되었다, 어떤 CD11b 자력 분리 뒤 초기 밀도 그라데이션 원심 분리 단계를 통합. 아래에 설명 된 프로토콜은 충분 한 수량에 매우 순수한 샘플 생산 최적화 되었습니다. 그것은 그것의 높은 순도 짧은 기간으로 인해 유리-한 문화 2-3 주에 대 한 필요 없이 2 일 이내에 분석 실험을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜 기본 murine 이다의 격리에 대 한 적응 될 수 있다.
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Protocol
다음 절차는 모나 쉬 대학에서 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 건강 한 치료 신생아 C57Bl6/J P3-6 쥐 대표적인 결과 생성 하기 위해 사용 되었다.
1. 효소 소화
참고: 그것은 무 균 분리 하 고 1 차 셀을 경작 하는 경우를 고려 하는 것이 중요입니다. 확보 가능한 무 균입니다, 반면 초기 해 부와 murine 두뇌의 수확 완료할 수 있습니다 laminal 흐름 후드, 외부 층 류 후드 내에서 수행 하는 이후의 모든 단계.
- 불 임 악기를 사용 하 여, 자 궁 경부 전위에 의해 마우스를 안락사, 동물을 목을 벨 고 100% 에탄올으로 씻어. 메 마른 작은 위를 사용 하 여, 머리의 오른쪽과 왼쪽 측면을 따라 작은 절 개를 확인 합니다. 이 나이에 피부 껍질 떨어져 쉽게. Bregma 포함 두개골 노출 연단 쪽으로 조직을 밀어 부드럽게 곡선된 겸 자의 팁을 사용 하 여.
- 척추 운하의 개통에가 위 끝을 삽입 하 고 외가도에 측면 절 개를 만들기. 부드럽게 위쪽으로 손상을 방지 하기 위해 두뇌가 위 끝을 가리키는 Bregma에 화살 봉합을 따라 절 개를 확인 합니다. Bregma에가 위 팁을 삽입 하 고 코로나 봉합 따라 머리의 오른쪽과 왼쪽된 측면 절 개에 게.
- 집게를 사용 하 여, 부드럽게 껍질 멀리 두개골 두뇌를 노출 합니다. 이렇게 하려면 측면 절 개에 의해 노출 되는 두개골의 가장자리를 잡고 하 고 측면에 두개골을 가볍게 당깁니다. 두개골 쉽게 떨어져 껍질 해야 합니다. 곡선된 겸 자 사용 하 여, 부드럽게 그것을 제거 하는 두뇌에서 특 종.
- 5 mL 살 균 컨테이너에서 두뇌, 혈액을 제거 하, 세척 당 약 5 mL 미디어 차가운 세척 미디어 (낮은 포도 당 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 1% 페니실린-스 보충), 2-3 번 씻어.
- 층 류 공기 후드에서 얼음에 작은 페 트리 접시 (35mm)에 5 mL 컨테이너의 내용을 놓습니다. 살 균 메스 블레이드 또는 살 균가 위를 사용 하면, 소 뇌 및 후 각 전구 제거할. 두 개의 반구를 분리를 잘라 중간을 확인 합니다.
- 신중 하 게 멀리는 외피가 손상 하지 않도록 주의 복용 좋은 집게와 meningeal 레이어 껍질. 보이는 혈관과 뇌의 표면에 붉은 가미와 매우 얇은 층의 세포로 meningeal 레이어를 식별 합니다. 두뇌를 차가운 유지 하는 것은 적절 한 meninges 제거를 위해 필수적 이다. Meningeal 레이어 나누기, 필 링 멀리 찢어진된 조각 완전히 제거 될 때까지 계속 합니다.
- (얼음)에 새로운 작은 페 트리 접시를 세척 미디어 채우기 반구를 전송 합니다. 뇌 살 균 메스 칼/가 위 작은 조각으로 잘라.
참고:이 크기에 ~ 1 m m2 이어야 하며 해야 주의 하지이 생산량을 줄일 수 있습니다 너무 작은 조각으로 그들을 잘라. - 100 µ L papain (17 U/mg 증권) 및 150 µ L 추가 DNase 미디어에 나 고 37 ° C에서 30 분 동안 품 어
- 소화, 다음 조직 P1000 피 펫을 사용 하 여 triturate. 조직 조각을 피펫으로 입력 너무 큰 경우, 피 펫 팁을 넓혀 쌍 또는 살 균가 위를 사용 하는 것이 좋습니다. 이 과정 동안, 주의 하지 거품 미디어에 소개 하 고이 세포 생존 능력을 줄일 수 있습니다.
2. myelin 파편 제거
- 층 류 흐름 후드 살 균 장비를 사용, 50 mL 원뿔 튜브는 100 µ m 셀 스 트레이너와, 각 두뇌에 대 한 준비. 스 트레이너에 다이제스트 매체와 뇌 조각을 포함 하는 배양 접시의 내용을 붓는 다. 볼 수 없는 더 많은 조직까지 연 삭 모션의 살 균 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 뇌의 조각을 통해 밀어. 소화, 다음 뇌 조직 한다가 떨어져 쉽게.
- 지속적으로이 과정을 통해 셀 스 트레이너를 토 핑에 의해 세척 미디어 필터를 세척. 이 스 트레이너에 갇혀 셀 통해 씻어 것입니다.
참고:이 할 수 있을 때까지 튜브에 약 ~ 15 mL. 이것은 스 트 레 통해 씻어 충분히 보장 수집 셀의 양을 최대화 하 고입니다. -
4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 단일 세포 현 탁 액을 원심 이 시간 동안 설명한 밀도 그라데이션 매체를 준비 합니다.
- 밀도 그라데이션 매체 사용 되는 재고 isotonic percoll (SIP)을 준비 합니다. 이렇게 살 균 행 크 스 균형된 소금물 (HBSS) x 10에 밀도 그라데이션 매체의 9:1 비율을 추가 합니다.
- 30으로 그라디언트를 준비 %DMEM SIP 및 70 %1 x HBSS에 SIP. 예를 들어, 30의 10 mL를 준비 %SIP, 7 ml DMEM SIP의 3 개 mL를 추가.
- 30%의 8 mL와 셀 펠 릿 DMEM에 SIP 원뿔 관 및 resuspend에서 상쾌한 발음 신선한 15 mL 원뿔 튜브로 전체 볼륨을 전송.
- 70 %SIP 솔루션 아래에 배치 이렇게 하려면 전송 피 펫을 70 %SIP 신중 하 게 원뿔 튜브의 하단에 전송 피 펫을 통해 푸시 채우십시오. 일단 팁 하단 가까이, 전송 피 펫의 내용을 통해 밀어 부드럽게.
참고: 이렇게 천천히 30/70 인터페이스를 중단 시킬 수 없습니다. 분명 선 두 레이어를 분리 해야 합니다. - 650 x g 0 브레이크와 가속 4, 실 온에서 25 분에는 셀을 포함 하 여 SIP 레이어 원심
참고: 스핀 오프 브레이크 완료 하 고 천천히와 서 중단, 브레이크의 응용 프로그램은 interphase 중단 되며 극적으로 SIP 레이어 사이 셀 컬렉션을 줄일 수를 원심 분리기에 필수적 이다. - 튜브의 상단에 세포질 파편을 발음 하 고 상단에서 약 4 mL 미디어를 제거 합니다. 이 다음 단계에서 단 세포의 제거를 쉽게 것입니다. P1000 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게는 interphase 향해 피 펫 팁 낮은. 30/70 밀도 그라데이션 중간 인터페이스에서 단 세포를 분리. 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 흐린 인터페이스와 전송에서 약 3 mL를 수집 합니다. 이 따라, HBSS 밀도 그라데이션 매체의 제거를 돕기 위해의 9 mL와 혼합 희석.
- 원심 희석된 밀도 그라데이션 중간 interphase, 단 세포를 포함 하 5 분에 대 한 500 x g에서 상쾌한 발음 1 mL 성장 매체 (DMEM 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 항생제로 보충) resuspend. 이 따라, resuspended 셀 trypan 푸른 얼룩 하 고는 haemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 수행 합니다.
3. 자석 활성화 된 세포 분류
참고: 다음이 단계는 제조업체의 프로토콜에서 수정 됩니다.
- 이 자석 절연을 방해할 것 이다 성장 매체 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 300 x g에서 수집 된 단 세포 원심 단계 2.8에서 얻은 동일한 셀 수를 사용 하 여, 1 x 108 에서 resuspend nucleated 세포/mL PBS (+ + Ca와 Mg ++ 무료)에 포함 된 0.1-2.5의 볼륨 범위 내에서 2 %FBS 및 1 mM EDTA mL.
- 신선한 5 mL (12 x 75 mm) 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브에 이전 단계에서 PBS에 nucleated 세포의 전체 볼륨을 추가 합니다. 추가 50 µ L CD11b PE 라벨 시 샘플의 1 mL 당. 빛에서 보호 하는 15 분 동안 실 온에서 품 어.
- 70 µ L 칵테일 선택의 (PBS에 CD11b에 대 한 단일 클론 항 체의 조합) 샘플의 1 mL 당을 추가 합니다. 빛에서 보호 하는 15 분 동안 실 온에서 품 어.
- 5 번 이상 아래로 pipetting으로 마그네틱 입자를 혼합. 샘플에 50 µ L/mL를 추가 합니다. 빛에서 보호 하는 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
참고: 이러한 입자는 항 체와 tetrameric 복잡 한 형성 그리고 자기 열에 연결 된 얻을 것 이다. - 셀 혼합물의 총 볼륨은 2.5 mL 미만, PBS (+ + Ca와 Mg ++ 무료)이이 볼륨까지 상위 2 %FBS 및 1 mM EDTA를 포함 하 고 부드럽게 2-3 번 pipetting으로 혼합. 자석 (뚜껑) 없이 튜브를 삽입 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.
- 한 연속 움직임에 완벽 하 게는 상쾌한 떨어져 따르고 2-3 s에 대 한 튜브를 포함 하는 자석 반전. 자석, 수직 위치를 반환 하 고 자석에서 튜브를 제거 합니다. 열에서 나머지를 준비 합니다.
참고:는 상쾌한 자석에 튜브를 거꾸로 하 여 제거 됩니다 unlabelled 및 원치 않는 셀을 포함 합니다. 튜브 연결 된 Cd11b 포함+ 세포. - 3.5, 3.6 두 번 더 단계를 반복 하 여 세포를 씻어. 샘플 1 mL 보다 큰 경우, 추가 반복 단계 3.5과 3.6의 것이 좋습니다.
- 원하는 성장 매체에 셀 resuspend 린스 뿐만 아니라 컬렉션 그릇의 측면 (예. 15 mL 튜브) 튜브의 측면에서 세포를 수집 하 여 수익률을 극대화.
4입니다. Microglia 순도의 확인
참고: 기본 microglia 3 L에서 격리 (n = 5 동물 총) 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 순도 대표 결과 대 한 확인을 통해 확인 했다.
- 10 %FBS 하룻밤, 1-2 플라스 크 당 106 세포 x의 밀도에서 시드를 포함 하는 성장 매체에서 T-25 플라스 크에 문화 세포.
- PBS 3 가진 T-25 플라스 크에 세포를 씻어 x 5 분 나머지 성장 미디어는 trypsinization 방해할 수도 제거.
- 0.25 %trypsin 플라스 크에서 세포를 분리 하는 것의 2 개 mL를 추가 합니다. 트립 신 양의 플라스 크의 전체 표면을 커버 하기에 충분 한지 확인 합니다. 부드러운 trypsin의 획 일 한 적용을 보장 하기 위해 플라스 크의 소용돌이, 다음 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
- 10%를 포함 하는 성장 매체의 2 개 mL를 추가 하 여 trypsinization 프로세스를 끄다 FBS 플라스 크로.
- Trypsinized 셀과 셀 수집 하 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리기를 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다.
- 상쾌한 성장 매체 및 트립 신을 제거 하 고 500 μ FACS 버퍼에 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루를 사용 하 여 셀 수를 수행 합니다.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리기 Fc 수용 체 블록 50 μ FACS 버퍼 + 5 x 106 세포 당 1 μ FcR 차단기를 추가 하 여 수행 합니다. 4 ° c.에 15 분 동안 품 어
참고: Fc 수용 체 블록 면역 세포 인구에 있는 Fc 수용 체 면역 글로불린의 비 특정 바인딩 방지 얼룩 절차에서 중요 한 단계입니다. 이 봉쇄 대는 다른 항 체의 다운스트림 바인딩에 영향을 미치지 않습니다. - 500 μ FACS 버퍼 diluting 하 여 차단 프로세스를 종료 합니다. 이 따라 원심에서 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 세포를 포함 하는 혼합물
- 신선한 500 μ FACS 버퍼에 resuspend.
- 샘플 튜브로 셀 (예: resuspending FACS 버퍼, 사용 400 μ의 500 μ 셀 하는 경우)의 대다수를 놓습니다. 제어 튜브 사이 나머지 셀을 배포 하 고 제어 튜브 당 최대 100 μ 톱 (예: 6 제어 튜브, 참아 16.67 μ 각 제어 튜브 상단에 83.33 μ FACS 버퍼). Unstained, 단일 스테인드 (CD45, CD11b), 단일 라이브/죽은 얼룩, FMOs, 및 샘플 튜브도 그룹 (굵게 컨트롤 튜브)를 확인 합니다.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 centrifuging 여 모든 튜브에 세포를 작은
- 셀 당 5 x 106 셀 당 100 μ FACS 버퍼 1 μ 항 체와 튜브에 얼룩. 4 ° c.에 20 분 동안 품 어
참고: 2 x 10 보다 작은6 셀 사용 하는 경우 50 μ 항 체 칵테일을 사용 합니다. - 워시 500 μ FACS 버퍼 셀. 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 세포를 원심
- 300 μ FACS 버퍼에 셀 resuspend
참고: 셀 count가 2 x 10 보다 작은6~ 100 μ를 사용 합니다. - 사용 하 여 흐름 cytometry 분석, CD45낮은 고 CD11b 얼룩에 대 한 긍정적인 셀 계량. 이 백분율은 고립 된 기본 microglia에 해당합니다.
5. Immunohistochemical 기본 Microglia의 얼룩
- 1 x 105 셀의 밀도에서 96 잘 접시의 세포 성장 매체 접시 하 고 밤새 품 어.
- 상쾌한을 제거 하 고 PBS로 3 회 세척.
- 15 분 제거 P1000 피펫은와 PFA에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 셀 고정 후 PBS + 0.1 %3 번 그들을 씻어 트리톤-X.
- 3% 소 혈 청 알 부 민 실 온에서 1 h와 일반적인 바인딩에 대 한 블록.
- 토끼 Iba-1 (1: 100) 4 ° c.에 24 시간으로 품 어 이 따라, 기본 항 체 혼합물을 제거 하 고 PBS로 3 회 세척.
- 실 온에서 1 h에 대 한 보조 안티 토끼 GFP 켤레 (1: 200)으로 품 어. 이것 다음, 이차 항 체 혼합물을 제거 하 고 PBS로 3 회 세척 합니다.
- 형광 현미경을 사용 하 여 매체 및 캡처 이미지를 마운트 하는 형광으로 슬라이드를 탑재 합니다.
6. Microglia 사용 하 여 pHrodo 분석 결과의 정량화
참고: pHrodo 분석 결과 경작된 한 세포에 먹어서 레벨의 식별에 대 한 수 있습니다. Endocytosis 통해 통풍 관에 더 산 성 환경으로 국제화 bioparticle 어원이 같은 말의 형광의 수준 증가 한다. 형광 수준 다음 FACS에 의해 측정할 수 있습니다. 다음 단계는 제조업체의 프로토콜에서 수정 됩니다.
- 문화 성장 매체에서 T-25 플라스 크에 세포 하룻밤, 1-2 플라스 크 당 106 세포 x의 밀도에 시드. T-25 PBS 3 시간 5 분에 대 한 플라스 크에 세포를 씻어.
- 2 mL 0.25 %trypsin 사용 하 여 셀을 분리 합니다. 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
- 10%를 포함 하는 성장 매체의 2 개 mL를 추가 하 여 trypsinisation 프로세스를 끄다 FBS 플라스 크로.
- 세포 현 탁 액 셀 펠 렛을 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g에서 원심
- 상쾌한을 제거 하 고 resuspend 106 셀/mL에서 문화 매체에서 기본 microglia를 포함 하는 펠 릿.
참고: 또는 플레이트 96 잘 접시에 적어도 하루 전에 셀 하 고 수행 하는 것입니다 분석 결과 하루에 잘 당 1 x 105 가능한 셀에 대 한 목표. - 접시에 1 x 105 셀/잘 96 잘 접시, 잘 당 100 μ 셀. 하십시오 컨트롤 및 3 중, 실험적인 우물 그리고 no-셀 컨트롤 배경 빼기에 대 한 긍정적인 통제 당 한 빈 잘 두고.
- No-셀 배경 빼기 비어 우물에 성장 매체의 100 μ를 추가 합니다.
참고: 모든 다른 시험관에서 분석 결과, 같은 적절 한 제어는 판독의 정확성에 대 한 생명 이다. No-셀과 함께 컨트롤 (배경 독서), 또한 부정적인 컨트롤 잘 포함 (pHrodo 켤레 추가, 하지만 얼음에). - 접시를 커버 하 고 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 1 시간에 대 한 품 어
- 자극 제와 치료를 추가 하 여 실험 웰 스를 준비 합니다. 치료 되지 않는 우물을 차량 컨트롤 (성장 매체에만)를 추가 합니다.
참고: Lipopolysaccharide 1 µ g/mL [흥분 제]와 인간 amnion 상피 세포 (항구적)-바른된 미디어 [치료]는 대표적인 결과 생성 하는 데 사용 했다. - 활용 된 염료의 유리병을 녹여, 추가 2 mL 글귀 버퍼와 짧게 소용돌이. 깨끗 한 유리 튜브로 튜브 내용을 전송 하 고 입자는 균일 하 게 분산 되도록 5 분 sonicate.
- 미 판 우물에서 문화 매체를 발음 하 고 신속 하 게 염료의 서 스 펜 션의 100 μ로 바꿉니다. 커버 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
참고: 컨트롤 튜브도 얼룩 기억 해요. - 교류 cytometry 분석을 사용 하 여, 셀 활용된 pHrodo 구슬에 대 한 긍정적인 얼룩을 계량 하 고 microglia를 적극적으로 phagocytosing의 (부모)의 백분율로 제시.
7. 다음과 같은 염증 성 모욕 Microglia Apoptosis의 정량화
- "Microglia 순도의 확인" 섹션에서 1-7 단계를 반복 합니다.
- 샘플 튜브로 셀 (예: 만약 당신이 resuspended FACS 버퍼, 사용 400 μ의 500 μ 셀)의 대다수를 놓습니다. 제어 튜브 사이 나머지 셀 고 상위 컨트롤 (예: 6 제어 튜브, 참아 16.67 μ 각 제어 튜브 상단에 83.33 μ FACS 버퍼) 튜브 당 최대 100 μ. 그룹 (굵게 컨트롤 튜브): 흠 없는, 단일 얼룩 (AnnexinV, Propidium 요오드 화물), 단일 라이브/죽은 얼룩, FMOs, 샘플 튜브.
- 5 분 동안 500 x g에서 centrifuging 여 모든 튜브에 세포를 작은.
- 1 μ 항 체/100 μ FACS 버퍼/5 x 106 셀 4 ° c.에 20 분 동안 품 어
참고: 경우 50 μ를 사용 2 x 106 셀. - 5 분 동안 500 x g에서 500 μ FACS 버퍼 및 원심 분리기를 추가 하 여 셀을 씻어.
- 300 μ FACS 버퍼에 셀 펠 릿을 resuspend.
참고: ~ 100 μ 셀 count가 2 x 10 보다 작은6 - 각 사분면 내에서 셀을 계량 (1 분기: 괴 사 성, 2 분기: 늦은 apoptotic, Q3: 가능한, 4 분기: 초기 apoptotic).
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Representative Results
여기에 설명 된 방법을 사용 하 여, microglia의 순수한 인구 고립 될 수 있다 하 고 생체 외에서 및 FACS 분석을 사용 하 여 특성에 대 한 준비가 될 수 있습니다. 로 시작 되기 위하여는, 18 동물까지 사용할 수 있습니다 약 450000 600000 microglial 셀의 예상된 수확량을 가진 추려 당. 먼저 격리 된 세포의 순도 확인 하는 중요 한 및 FACS 분석 두 마커 CD45 및 CD11b. microglia 신분증에 대 한 얼룩에 의해 수행 됐다 할 수 증명 귀찮은, 많은 마커 microglia 표현으로 표현 됩니다. 대 식 세포, 그리고이 두 개의 마커를 사용 하 여 정확 하 고 신뢰할 수 있는 정량화를 허용 한다. 특히, microglia CD45, CNS와 주변 세포에서 높은 식에 비해 낮은 표현의 있으며 또한 CD11b에 대 한 긍정적인 (그림 1). 이 특정 격리에서 89.3%의 순으로 알려졌다. CD11b에 대 한 얼룩, 후 우리 유의 (와 더 작은, 더 더 없는에 형태학 분명히 unramified (큰 구형 셀 시체에서 거의 또는 전혀 확장 프로세스)의 범위와 유사한 형태학 기능을 공유 하는 우리의 기본 microglia 타원형 somata 그리고 일반적으로 보조 주문 프로세스) 볼 vivo에서 (그림 2) 예상 대로 활성화 상태의 범위에 상관.
이 따라 microglia 기능과 생존에 대 한 두 개의 특성 분석 실험 실행 되었습니다. Microglia CNS에 주요 phagocytic 셀 이며 pHrodo 분석 결과이 특정 기능 속성의 정량화를 허용 한다. PHrodo 형광 입자의 부 량에 의해 측정 된 phagocytic 함수 24 h 공동 문화 항구적으로 단련 매체 (그림 3) 후에 근처 3 증가 지적 했다. 마지막으로,는 AnnexinV PI 얼룩 다음 공동 문화 microglia 염증 성 모욕을 다음의 생존을 식별 하기 위해 수행 되었다. Microglia apoptosis 조절된 매체 (그림 4)와 치료 관찰 되었다 후에 감소. 이 결과 그 단련 항구적 매체 microglia를 보호 하 고 주 뇌 부상과 neuroinflammatory 장애에 치료를 할 수도 있습니다 그들의 phagocytic 활동 강화 좋습니다.
그림 1 : CD45 microglia에 의해 CD11b의 식. 각 점 이라는 셀 나타내고 FACS 분석의 별도 세포 인구 수 있습니다. Microglia는 CD45 항 원 주변 monocyte 파생 된 세포에 비해 낮은 표현의 있고 긍정적인입니다 CD11b. 항 체 레이블 아래 숫자 부모 인구의 백분율로 표시 문이 셀의 비율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 고립 된 기본 microglia의 형태. 이 그림에서 볼 수 있듯이 microglia 그들의 구형 셀 몸과 별개 없는 구조를 유지 합니다. 눈금 막대 = 20 µ m.
그림 3 : 고립 된 기본 microglia phagocytic 함수의 정량화. pHrodo 이라는 입자 등 셀룰러 endosomes 먹어서 다음 산 성 환경에서 때만 형광. 여기, microglia 항구적 조절 매체 처리에 pHrodo 입자 통풍 관 증가 관찰 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 염증 성 모욕 후 microglia 생존의 분석. (A) 대표 FACS 격리 microglia의 구획. AnnexinV 및 propidium 요오드 화물의 결합 된 얼룩 LPS로 자극 후 apoptotic, 괴 사 성, 또는 라이브 셀으로 분류 수 있습니다. (B) 항구적 단련이 셀 형식에 대 한 보호의 한 형태를 제안 하는 컨트롤을 기준으로 중간 크게 감소 microglia apoptosis. p를 의미 < 0.05, 스튜던트 t-검정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 워시 매체 |
| 낮은 포도 당 Dulbecco의 독수리 매체를 수정 |
| 1 %v / v 페니실린-스 |
| (뇌) 당 다이제스트 매체 |
| 150 µ L DNase I |
| 100 µ L papain (17U/mg 주식) |
| 3 ml 세척 매체 |
| 성장 매체 |
| 낮은 포도 당 Dulbecco의 독수리 매체를 수정 |
| 10% 태아 둔감 한 혈 청 |
| 1 %v / v 페니실린-스 |
표 1: 솔루션의 테이블입니다.
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Discussion
Microglia 환경 자극에 의해 변경 둘 다 프로 및 안티-염증, 기능이 있다. 이전 연구 microglia 활성화의 변조 neuroprotection 부여 수 있습니다 나타났습니다. 뉴런을 보호 하 고 부상을 복구 하는 능력은 이러한 복잡 한 세포의 현재 이해를 심화 하기 위해 더 많은 연구를 필요로 합니다. 따라서, 절연 고 순도 기본 microglia의 중요 하 고 유용한 기술입니다. 이것은 높은 순수 기본 microglia 2 일 이내 생체 외에서 실험에 대 한 준비를 얻기에 상대적으로 빠른 방법입니다.
다양 한 기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 문학에 설명 된 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 주요 도전은 효율적으로 충분 한 샘플, 생존에 순도 높은 생산 이다. 이 프로토콜의 주요 이점은 문화에 시간에 대 한 필요 없이 매우 순수한 샘플의 수익률 이다. 따라서, 메서드는 2 주에서 2 일 단축, 빠른 결과 용이 하 게이. 특성화 단계 microglia, 이러한 복잡 한 세포의 현재 이해 향상에 대 한 강력한 기능 데이터를 얻을. 프로토콜 2 개의 현재 접근-조밀도 기온 변화도 원심 분리 및 자력 분리 결합합니다. 자력 분리 잘 microglia의 격리에 대 한 문학에 다른 절연 기술14,,1516에 비해 상대적으로 부드러운 방식에서를 검증 했다. 의심할 여 지 없이 그들의 네이티브 국가 비보에비해 절연된 기본 microglia의 기능적 특성에 변화는 하는 동안 변경한 microglia 속성 위에 개발 분석 실험에서 관찰에서 계산 되는 후 소화 초기와 같은 면역이 하위 집합의 직접 변조의 반사.
프로토콜은 비교적 간단 하 고, 하는 동안 중요 한 단계 동안 케어 좋은 수익률을 보장 하기 위해 도움이 됩니다. 첫째, glial 성장을 지원 하기 위해 낮은 포도 당 미디어를 사용 하 여이 생명 이다. 또한, murine 두뇌 유지 되어야 한다 얼음 추위에 항상 고립 중. 따라서, 미리 매체 뿐 아니라 모든 악기 가능 하다 면, 진정 하 고 얼음에서 절차를 수행 하는 것이 좋습니다. 중요 한 것은, 장기간된 격리 시간 가난한 세포 건강으로 이어질 것입니다 및 항복, 따라서 그것은 신속 하 게 작업에 중요 한. 또한, meningeal 계층의 적절 한 제거 작업 성인 쥐, 그렇지 않은 경우는 섬유 아 세포 성장 측면에서 glial 세포 노르만족은 때 중요 한 단계입니다. 두뇌의 효소 소화 하는 동안 그것은 중요 하지 세포 죽음을 증가할 수 있다 두뇌가 너무 작은 조각으로 잘라, 이상적으로 조직의 1 m m2 조각에 대 한 목표. 미디어와 함께 철저 하 게 린스 셀 스 트레이너를 통해 조직을 분쇄 하는 때 모든 셀 되도록 몇 분 간격 통해 세척 되 고는 여과기에 갇혀 얻을 하지 않습니다, 또한 100 μ 셀 스 트레이너를 사용 하는 것이 좋습니다, 작은 필터 결과에 감소 수익률입니다. 또 다른 중요 한 단계는 70% 밀도 그라데이션 중간 계층,이 단계를 신중 하 게 수행의 바탕 이며 천천히 분명 interphase 볼 수 있도록 필수적 이다, 파스퇴르 피 펫의 사용을 권장. 또한, 15 mL 원뿔 튜브의 사용은 50 mL 원뿔 튜브 활용 했다 세포의 분리는 덜 효과적을 권장 하 고 있다. 마지막으로, 조밀도 기온 변화도 원심 분리 온도 밀도 그라데이션에 영향을 미칠 수 있습니다, 실내 온도에 수행 되어야 합니다.
이 프로토콜 CD45의 높은 식와 (낮은 CD45 식 주변 monocytes에 본)에 비교 하 여 Cd11b의 긍정적인 표현에서와 같이 높은 순수 기본 microglia 셀을 생산 하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 셀 수 또한 상대적으로 신속 하 게 격리할 수 없는, 따라서 그것은이 명과 셀의 이해에 크게 증가 범위. Microglia 질병/부상 및 건강 한 동물에서 분리 된 차이 보여줄 수 있는 연구에 대 한 수 있도록 서로 다른 배경에서 다른 microglia 인구를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 순수한 microglia 인구의 격리를 통해이 면역 세포 인구의 치료 변조 평가 될 수 있습니다. 예를 들어,는 항구적 조절 미디어 먹어서, 증가 뿐 아니라 염증 성 자극, 따라서 치료 혜택17affording 동안 microglia 생존을 향상 발견 했다. 이에 서로 apoptotic 파편을 감소 하 고 따라서 이러한 파편의 신경 보호 효과 있을 수 있습니다 제안 합니다.
그러나 이전 마우스 감소 수익률을 생산할 예정 이다 신생아 또는 성인 마우스 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 또한, 그것은 기본 이다 신생아 또는 성인 쥐에서 격리를 적용할 수 있습니다, 그리고 다시 이전 마우스 감소 수확량 귀 착될 것 이다. 또한, 100 μ 셀 스 트레이너, 반대로 더 큰 기 공 크기를 가진 주문 품 나일론 메쉬 기계적 분리 단계 수정 추가 셀 수율18향상 됩니다.
이 프로토콜의 한계는 낮은 수율과이 프로토콜에 필요한 시간을 포함 합니다. 수익률 6 동물 세포 배양의 주를 통해 얻을 수 있는 수백만 대의 추려 당 약 150000-200, 000 셀입니다. 또한, 세포는 2 일 안에 얻어질 수 있다, 하는 동안 첫날에 절차는 매우 시간이 오래 걸릴, 약 6 시간.
그럼에도 불구 하 고,이 방법은 질병, 분리 하 고 2 일 이내 셀 characterising microglia의 역할 이해에 매우 유용한 도구입니다. 그것은 정확 하 고 효율적인 연구를 촉진 하는 고 순도 기본 microglia 셀 생산.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
