Summary
murine दिमाग से प्राथमिक microglia के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । इस तकनीक मस्तिष्क संबंधी स्थितियों की वर्तमान समझ को आगे बढ़ाने में एड्स । घनत्व ढाल केंद्रापसारक और चुंबकीय जुदाई के लिए एक उच्च शुद्ध नमूना की पर्याप्त उपज का उत्पादन करने के लिए संयुक्त कर रहे हैं । इसके अलावा, हम microglia के लक्षण वर्णन के लिए कदम रूपरेखा ।
Abstract
Microglia, मस्तिष्क में निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सूजन या चोट करने के लिए पहले प्रतिक्रिया कर रहे हैं । हाल के शोध से पता चला है microglia गतिशील हो, दोनों समर्थक भड़काऊ और विरोधी भड़काऊ phenotypes संभालने में सक्षम है । दोनों एम 1 (प्रो-भड़काऊ) और M2 (pro-प्रतिकारक) phenotypes प्रसवकालीन मस्तिष्क चोट जैसे neuroinflammatory शर्तों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और कुछ पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के जवाब में भिन्न कार्यों प्रदर्शन. microglial सक्रियण के मॉडुलन neuroprotection इस प्रकार microglia सुझाव मस्तिष्क चोट में चिकित्सीय क्षमता हो सकता है प्रदान करने के लिए उल्लेख किया गया है । हालांकि, और अधिक अनुसंधान के लिए बेहतर रोग में microglia की भूमिका को समझने की आवश्यकता है, और इस प्रोटोकॉल की सुविधा है कि । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल एक घनत्व ढाल केंद्रापसारक प्रक्रिया को जोड़ती है सेलुलर मलबे को कम करने के लिए, चुंबकीय जुदाई के साथ, प्राथमिक microglial कोशिकाओं है कि इन विट्रो प्रयोग में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक अत्यधिक शुद्ध नमूना उत्पादन, बिना 2-3 सप्ताह संवर्धन के लिए की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, लक्षणात्मक कदम microglia के बारे में मजबूत कार्यात्मक डेटा उपज, अध्ययन सहायता के ध्रुवीकरण और इन कोशिकाओं है, जो अपक्षयी दवा के क्षेत्र में मजबूत प्रभाव पड़ता है की हमारी समझ बेहतर है ।
Introduction
सूजन, hypoxic-ischaemia और रक्तस्त्राव से प्रसवकालीन अवधि के दौरान प्राप्त नुकसान दीर्घकालिक sequelae की एक सरणी हो सकता है । प्रसवकालीन मस्तिष्क चोट के जटिल pathophysiology है theorized सूजन और आगामी न्यूरॉन और axonal मौत के साथ ischemia शामिल करने के लिए1. सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की घटनाओं के झरना में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है2चोट करने के लिए अग्रणी ।
Microglia, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं,3चोट करने के लिए पहले प्रतिक्रिया करने वालों हैं । Microglia क्षमता के साथ प्लास्टिक सेल प्रकार के होते है दोनों सुरक्षा या विषाक्त, पर्यावरण पर निर्भर4। वे chemotaxis, phagocytosis, प्रतिजन प्रस्तुति और साइटोकिंस और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों में से4,5के उत्पादन में शामिल हैं । वृद्ध होनेवाला microglia लगातार पर्यावरण सर्वेक्षण और एक विदेशी या हानिकारक पदार्थ की उपस्थिति के द्वारा सक्रिय कर रहे हैं 4. सक्रियण एक समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया करने के लिए, सीएनएस संरक्षण4में महत्वपूर्ण होता है । ये M1 "प्रो भड़काऊ" phenotype microglia मुख्य रूप से प्रतिजन प्रस्तुति और रोगज़नक़ों की मौत में शामिल है4। neuroprotection, अनियंत्रित या लंबे समय तक सूजन में भड़काऊ प्रतिक्रिया की महत्वपूर्ण भूमिका के बावजूद हानिकारक हो सकता है और4ंयूरॉन क्षति के लिए सीसा । हालांकि, जब कुछ पर्यावरणीय उत्तेजनाओं को उजागर, microglia एक विरोधी भड़काऊ phenotype प्रदर्शन कर सकते हैं । ये प्रो प्रतिकारक M2 microglia घाव भरने में एक महत्वपूर्ण भूमिका है और6की मरंमत, साइटोकिंस और अंय घुलनशील मध्यस्थों की एक श्रृंखला जारी है कि सूजन downregulate, phagocytosis वृद्धि और मरंमत4को बढ़ावा, 7. microglia की भूमिकाओं में विविध रहे है और पुनः के दौरान oligodendrocyte भेदभाव ड्राइविंग शामिल है8, ऑक्सीजन और स्ट्रोक मॉडल9 में ग्लूकोज की कमी के दौरान ंयूरॉंस की रक्षा और neurite में वृद्धि को बढ़ावा देने के रीढ़ की हड्डी की चोट मॉडल10।
इन glial कोशिकाओं के अध्ययन को समझने और neuroinflammation के जवाब में हेरफेर में एक महत्वपूर्ण पहलू का प्रतिनिधित्व करता है । वर्णित प्रोटोकॉल neuroinflammatory विकारों में microglia मॉडुलन की चिकित्सीय क्षमता में आगे की जांच के लिए अनुमति देता है ।
एक न्यूरोप्रोटेक्टिव भूमिका की दिशा में microglial सक्रियण के मॉडुलन11,12,13शर्तों की एक श्रेणी में देखा गया है । इस प्रकार, वर्तमान समझ में सुधार और आगे microglial सक्रियण के मॉडुलन का अध्ययन महत्वपूर्ण है, दोनों में इन विट्रो और vivo मेंसहित विभिन्न मॉडलों के उपयोग की आवश्यकता होती है. इन विट्रो अध्ययन एक महत्वपूर्ण उनके अधिक से अधिक दक्षता, कम लागत और एक अलग सेल जनसंख्या की जांच करने की क्षमता के कारण उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
वहां murine दिमाग से microglia के अलगाव के लिए साहित्य में वर्णित प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला है, को कुशलतापूर्वक अच्छी व्यवहार्यता और उच्च शुद्धता के साथ एक उच्च उपज नमूना उत्पादन चुनौती है । आमतौर पर प्राथमिक microglia के अलगाव के तरीकों का इस्तेमाल चुंबकीय जुदाई से कर रहे है और मिश्रित glial संस्कृतियों के लंबे समय तक मिलाते । व्यक्तिगत अनुभव के माध्यम से यह पाया गया कि वहां सेलुलर मलबे की एक उच्च डिग्री है जो चुंबकीय कॉलम बाधित किया गया था । इस प्रकार, निंनलिखित प्रोटोकॉल, जो एक प्रारंभिक घनत्व ढाल केंद्रापसारक CD11b चुंबकीय जुदाई के बाद कदम शामिल उपयोग किया गया था । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त मात्रा में एक उच्च शुद्ध नमूना उत्पादन अनुकूलित किया गया है । यह अपनी उच्च शुद्धता और कम समय अवधि के कारण लाभप्रद है-एक 2 दिनों के भीतर परख प्रदर्शन कर सकते है 2-3 सप्ताह के लिए संस्कृति के बिना । इस प्रोटोकॉल संभावित प्राथमिक murine astrocytes के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
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Protocol
मोनाश विश्वविद्यालय में पशु आचार समिति द्वारा निम्नलिखित प्रक्रियाओं को अनुमोदित किया गया है । स्वस्थ अनुपचारित neonate C57Bl6/J p-6 चूहों प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
1. एंजाइमी पाचन
नोट: यह जब अलग और संवर्धन प्राथमिक कोशिकाओं बाँझ पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. पर्यावरण सुनिश्चित करने Whilst के रूप में संभव के रूप में बाँझ है, प्रारंभिक विच्छेदन और murine दिमाग की फसल एक laminal प्रवाह हुड के बाहर पूरा किया जा सकता है, बाद में सभी चरणों के साथ एक लामिना प्रवाह हुड के भीतर प्रदर्शन किया ।
- बाँझ उपकरणों का प्रयोग, गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा माउस euthanize, पशु decapitate और १००% इथेनॉल के साथ कुल्ला. छोटे बाँझ कैंची का प्रयोग, सिर के दाईं और बाईं ओर के साथ छोटे चीरा बनाते हैं. इस उम्र में त्वचा के छिलके आसानी से दूर हो जाते हैं । घुमावदार संदंश के सुझावों का प्रयोग, धीरे Bregma सहित खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए चबूतरा की ओर ऊतक स्लाइड ।
- रीढ़ की हड्डी में नहर के उद्घाटन में कैंची की नोक डालें और कान नहर के लिए एक पार्श्व चीरा बनाते हैं । Bregma को sagittal टांका के साथ एक चीरा बनाओ, धीरे से ऊपर की ओर कैंची की नोक इशारा करते हुए मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाने को रोकने के लिए । Bregma में कैंची के टिप डालें और कोरोनरी सीवन के साथ सिर के दाईं और बाईं ओर करने के लिए पार्श्व चीरा बनाते हैं ।
- संदंश का प्रयोग, धीरे दूर खोपड़ी छील करने के लिए मस्तिष्क का पर्दाफाश । ऐसा करने के लिए, पार्श्व चीरा द्वारा उजागर खोपड़ी के किनारों समझ, और धीरे पक्ष को खोपड़ी खींच । खोपड़ी को दूर से आसानी से छील लेना चाहिए । घुमावदार संदंश का प्रयोग, मस्तिष्क के नीचे धीरे स्कूप इसे दूर करने के लिए ।
- मस्तिष्क को 5 मिलीलीटर बाँझ कंटेनर में रखें, आइस-कोल्ड वॉश मीडिया के साथ 2-3 बार धोएं (कम ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (DMEM) का सप्लीमेंट 1% पेनिसिलिन-streptomycin के साथ), लगभग 5 मिलीलीटर मीडिया प्रति वाश, रक्त निकालने के लिए ।
- एक लामिना airflow हूड में, 5 मिलीलीटर कंटेनर की सामग्री एक छोटी सी पेट्री डिश में रखें (३५ mm), बर्फ पर आराम । एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड या बाँझ कैंची का उपयोग कर, सेरिबैलम और घ्राण बल्ब निकालें. दो गोलार्द्धों को अलग करने के लिए एक midline कट बनाओ ।
- ध्यान से दूर ठीक संदंश के साथ मस्तिष्कावरणीय परत छील, ध्यान cortices नुकसान नहीं ले । दिखाई देने वाले रक्त वाहिकाओं के साथ, मस्तिष्क की सतह पर एक लाल रंग के साथ कोशिकाओं की एक बहुत पतली परत के रूप में मस्तिष्कावरणीय परत की पहचान । मस्तिष्क को ठंडा रखना उचित मेनिन्जेस हटाने के लिए आवश्यक है. यदि मस्तिष्कावरणीय परत टूटता है, दूर फटे टुकड़े छीलने जारी रखें जब तक यह पूरी तरह से हटा दिया है ।
- गोलार्द्धों स्थानांतरित करने के लिए एक नई छोटी पेट्री डिश (बर्फ पर) और धो मीडिया के साथ भरें । बाँझ स्केलपेल ब्लेड के साथ छोटे टुकड़ों में मस्तिष्क काटना/
नोट: इन आकार में ~ 1 mm2 होना चाहिए, और देखभाल के लिए उंहें भी छोटे टुकड़ों में कटौती के रूप में इस उपज को कम कर सकते है नहीं लिया जाना चाहिए । - जोड़ें १०० µ l papain (17 यू/एमजी स्टॉक) और १५० µ l DNase मैं मीडिया में और 30 मिनट के लिए मशीन में ३७ ° c
- पाचन के बाद, triturate एक P1000 पिपेट का उपयोग ऊतक । यदि ऊतक टुकड़े पिपेट में प्रवेश करने के लिए बहुत बड़े हैं, पिपेट टिप को चौड़ा करने के लिए एक जोड़ी या बाँझ कैंची का उपयोग करने पर विचार करें. इस प्रक्रिया के दौरान, ध्यान रखना मीडिया में बुलबुले परिचय नहीं के रूप में यह सेल व्यवहार्यता कम हो सकती है ।
2. Myelin मलबा हटाना
- एक लामिना फ्लो हुड के तहत बाँझ उपकरण का उपयोग करें, प्रत्येक मस्तिष्क के लिए एक १०० µm सेल छलनी के साथ एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब तैयार करते हैं । पेट्री पकवान की सामग्री डालो, एक छलनी पर डाइजेस्ट मध्यम और मस्तिष्क के टुकड़े युक्त । एक पीसने की गति में एक बाँझ 3 मिलीलीटर सिरिंज के गोताख़ोर का उपयोग करके मस्तिष्क के टुकड़ों के माध्यम से पुश जब तक कोई और अधिक ऊतक दिखाई है । पाचन के बाद, मस्तिष्क ऊतक के अलावा आसानी से गिर जाना चाहिए ।
- लगातार इस प्रक्रिया में सेल छलनी ऊपर टॉपिंग द्वारा, धोने मीडिया के साथ फिल्टर धो । यह छलनी में फंसे किसी भी कोशिकाओं के माध्यम से धोना होगा ।
नोट: यह किया जाना चाहिए जब तक वहां लगभग है ~ ट्यूब में 15 मिलीलीटर । यह सुनिश्चित करने के लिए है कि छलनी पर्याप्त के माध्यम से धोया जाता है और एकत्र कोशिकाओं की मात्रा को अधिकतम करने के लिए है । -
4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर एकल सेल निलंबन केंद्रापसारक । इस समय के दौरान, के रूप में वर्णित घनत्व ढाल माध्यम तैयार करते हैं ।
- स्टॉक isotonic percoll (SIP) तैयार करें, जो घनत्व ग्रैडिएंट माध्यम का उपयोग किया जाता है । घनत्व ढाल माध्यम के 9:1 अनुपात 10x बाँझ हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) के लिए जोड़कर ऐसा करें ।
- DMEM में 30% sip और 1x HBSS में ७०% sip के रूप में ग्रेडिएंट्स तैयार करें । उदाहरण के लिए, 10 मिलीलीटर 30% घूंट तैयार करने के लिए, 7 मिलीलीटर DMEM के लिए एसआईपी के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
- महाप्राण शंकु ट्यूबों से supernatant और DMEM में 30% घूंट की 8 मिलीलीटर के साथ सेल गोली reसस्पेंड । एक ताजा 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए पूर्ण मात्रा स्थानांतरण ।
- बुनियाद ७०% सिप समाधान । ऐसा करने के लिए, एक हस्तांतरण पिपेट के साथ ७०% घूंट भरें और ध्यान से हस्तांतरण पिपेट के माध्यम से शंकु ट्यूब के नीचे करने के लिए पुश । एक बार टिप नीचे के करीब है, धीरे हस्तांतरण पिपेट की सामग्री के माध्यम से धक्का ।
नोट: यह धीरे ऐसा करने के रूप में 30/70 इंटरफ़ेस को बाधित नहीं है । वहां एक स्पष्ट दो परतों को अलग लाइन होना चाहिए । - कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए, ब्रेक 0 और त्वरण 4 के साथ ६५० x g पर, कोशिकाओं सहित घूंट परतों, केंद्रापसारक ।
नोट: यह ब्रेक के साथ स्पिन को पूरा करने के लिए आवश्यक है और एक को रोकने के लिए धीरे से आने के लिए केंद्रापसारक की अनुमति देने के लिए, ब्रेक के आवेदन के रूप में चरण बाधित होगा और नाटकीय रूप से घूंट परतों के बीच सेल संग्रह को कम । - महाप्राण के ऊपर से सेलुलर का मलबा निकलता है, और ऊपर से लगभग 4 मिलीलीटर मीडिया को हटा दें । यह निंन चरण में mononuclear कक्षों को निकालने में आसानी होगी । एक P1000 पिपेट का प्रयोग, ध्यान से चरण की ओर पिपेट टिप कम । 30/70 घनत्व ढाल माध्यम अंतरफलक से mononuclear कोशिकाओं को अलग । बादल इंटरफेस से लगभग 3 मिलीलीटर ले लीजिए और एक नया 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण । इस के बाद, HBSS के 9 मिलीलीटर के साथ मिश्रण पतला करने के लिए घनत्व ढाल माध्यम से हटाने सहायता ।
- पतला घनत्व ढाल मध्यम चरण, 5 min. महाप्राण supernatant के लिए ५०० x g पर mononuclear कोशिकाओं युक्त और 1 मिलीलीटर विकास मध्यम (DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक) के साथ reसस्पैंड । इस के बाद, trypan नीले रंग के साथ reसस्पैंड कोशिकाओं दाग और एक सेल एक haemocytometer का उपयोग कर गिनती करते हैं ।
3. चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई
नोट: इन चरणों से निर्माता ' प्रोटोकॉल संशोधित किए गए हैं ।
- ३०० x g पर एकत्र mononuclear कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए वृद्धि मध्यम हटाने के रूप में इस चुंबकीय अलगाव के साथ हस्तक्षेप करेगा । २.८ चरण से प्राप्त एक ही सेल गणना का उपयोग कर, 1 x 108 nucleated कोशिकाओं/पंजाब में एमएल (सीए ++ और मिलीग्राम+ + मुक्त) 2% FBS और 1 मिमी EDTA से युक्त, 0.1-2.5 मिलीलीटर की एक मात्रा रेंज के भीतर ।
- पिछले कदम से पंजाब में nucleated कोशिकाओं की पूरी मात्रा को एक ताजा 5 मिलीलीटर (12 x ७५ मिमी) polystyrene दौर नीचे ट्यूब जोड़ें । Add ५० µ l CD11b PE ्र रिएजेंट प्रति 1 मिलीलीटर का नमूना । 15 मिनट प्रकाश से सुरक्षित के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
- चयन कॉकटेल के ७० µ एल जोड़ें (पंजाब में CD11b के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का एक संयोजन) नमूना के 1 मिलीलीटर प्रति । 15 मिनट प्रकाश से सुरक्षित के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
- ऊपर और नीचे से अधिक 5 बार pipetting द्वारा चुंबकीय कणों का मिश्रण । नमूने के लिए ५० µ l/एमएल जोड़ें । 10 प्रकाश से सुरक्षित मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
नोट: इन कणों तो एंटीबॉडी के साथ एक tetrameric जटिल फार्म और चुंबकीय स्तंभ से जुड़ी हो जाएगा. - यदि सेल मिश्रण की कुल मात्रा २.५ मिलीलीटर से कम है, तो इस खंड को ऊपर ऊपर (Ca+ + और मिलीग्राम+ + मुक्त) 2% FBS और 1 मिमी EDTA युक्त, और धीरे से pipetting 2-3 बार द्वारा मिश्रण । चुंबक में ट्यूब (ढक्कन के बिना) प्लेस और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
- एक सतत गति में, पूरी तरह से उलटा 2-3 एस के लिए ट्यूब युक्त चुंबक, बंद supernatant डालना । एक ईमानदार स्थिति के लिए चुंबक लौटें, और चुंबक से ट्यूब हटा दें । शेष कक्षों को स्तंभ से बाहर धोने के लिए तैयार करें ।
नोट: supernatant में अनलेबल्ड और अवांछित कोशिकाएं होती हैं, जो कि चुंबक में रहते हुए भी ट्यूब को पलटने से हटा दी जाती हैं । ट्यूब में अनुलग्न Cd11b+ कक्ष हैं । - चरणों दोहराएं ३.५ और ३.६ दो बार और अधिक से कोशिकाओं को धो लें । नमूना 1 मिलीलीटर से अधिक है, तो चरण ३.५ और ३.६ की एक और दोहराएँ अनुशंसित है ।
- एक वांछित विकास माध्यम में कोशिकाओं reसस्पेंड । के रूप में अच्छी तरह से संग्रह पोत के पक्ष कुल्ला (एक 15 मिलीलीटर ट्यूब) ट्यूब के पक्ष से कोशिकाओं को इकट्ठा करने और पैदावार को अधिकतम करने के लिए ।
4. Microglia शुद्धता का सत्यापन
नोट: प्राथमिक microglia 3 एल से अलग (n = 5 पशु कुल) फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के माध्यम से सत्यापित करने के लिए प्रतिनिधि परिणामों के लिए पवित्रता का निर्धारण किया गया.
- एक टी में संस्कृति कोशिकाओं-25 वृद्धि मध्यम में 10% FBS रात भर की कुप्पी, 1-2 के घनत्व पर सीडिंग x10 6 कोशिकाओं की कुप्पी प्रति.
- trypsinization के साथ हस्तक्षेप हो सकता है जो किसी भी शेष विकास मीडिया को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए पंजाब 3x के साथ टी-25 कुप्पी में कोशिकाओं को धो लें ।
- trypsin की कुप्पी से कोशिकाओं को अलग करने के लिए ०.२५% की 2 मिलीलीटर जोड़ें । सुनिश्चित करें कि trypsin की मात्रा कुप्पी की पूरी सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त है । trypsin के समान कवरेज सुनिश्चित करने के लिए कुप्पी के कोमल घूमता के बाद, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
- वृद्धि की कुप्पी में 10% FBS युक्त मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़कर trypsinization प्रक्रिया बुझाने ।
- trypsinized कोशिकाओं से युक्त supernatant लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए केंद्रापसारक ।
- विकास मध्यम और trypsin युक्त supernatant निकालें और ५०० μL FACS बफर में गोली reसस्पेंड । trypan नीले रंग का उपयोग कर सेल गिनती प्रदर्शन ।
- 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०० x g पर केंद्रापसारक । ५० μL FACS बफर + 1 μL FcR अवरोधक प्रति 5 x 106 कोशिकाओं को जोड़कर एफसी रिसेप्टर ब्लॉक करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
नोट: एफसी रिसेप्टर ब्लॉक धुंधला प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम इम्युनोग्लोबुलिन के गैर विशिष्ट बाध्यकारी प्रतिरक्षा कोशिका आबादी में एफसी रिसेप्टर्स करने के लिए रोकने के लिए है । इस नाकाबंदी अंय एंटीबॉडी के बहाव बाध्यकारी को प्रभावित नहीं करता है । - ५०० μL FACS बफर के साथ कमजोर द्वारा अवरुद्ध प्रक्रिया को समाप्त । इस के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर कोशिकाओं वाले मिश्रण केंद्रापसारक ।
- ताज़ा ५०० μL FACS बफ़र में पुनर्निलंबित ।
- अधिकांश कक्षों को रखें (उदा. यदि FACS बफ़र के ५०० μL में कक्ष reसस्पैंड करते हैं, तो ४०० μL का उपयोग करें) एक नमूना ट्यूब में । नियंत्रण ट्यूबों के बीच शेष कोशिकाओं को वितरित और नियंत्रण ट्यूब प्रति १०० μL करने के लिए ऊपर ऊपर (उदाहरण के लिए 6 नियंत्रण ट्यूबों, प्रत्येक नियंत्रण ट्यूब में १६.६७ μL डाल दिया और ८३.३३ μL FACS बफर के साथ शीर्ष). समूहों (बोल्ड में नियंत्रण ट्यूबों) के रूप में दाग, एक दाग (CD45, CD11b), एक जीवित/मृत दाग, FMOs, और नमूना ट्यूबों बनाओ ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा सभी ट्यूबों में कोशिकाओं गोली ।
- 5 x 106 कोशिकाओं प्रति १०० μL FACS बफर प्रति 1 μL एंटीबॉडी के साथ ट्यूब में कोशिकाओं दाग । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
नोट: ५० μL एंटीबॉडी कॉकटेल का उपयोग करें यदि 2 x 10 से कम6 कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है । - ५०० μL FACS बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
- ३०० μL FACS बफ़र में कक्षों को पुनर्स्थगित ।
नोट: का प्रयोग करें ~ १०० μl अगर सेल गिनती से कम है 2 x 106। - प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग करना, कोशिकाओं है कि CD45 रहे हैकम और CD11b धुंधला के लिए सकारात्मक मात्रा । यह प्रतिशत पृथक प्राथमिक microglia से मेल खाती है ।
5. प्राथमिक Microglia के Immunohistochemical दाग
- प्लेट एक ९६-अच्छी तरह से थाली में वृद्धि मध्यम और रात भर के साथ 1 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर थाली ।
- supernatant को हटा दें और पंजाबियों के साथ 3 बार धो लें ।
- 15 मिनट के लिए पंजाब में 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक करें । एक P1000 पिपेट के साथ पीएफए को हटा दें, फिर उन्हें पंजाबियों के साथ 3 बार + ०.१% ट्राइटन-X धो लें ।
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 3% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के साथ गैर-विशिष्ट बाइंडिंग के लिए ब्लॉक ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए (1:100) आईबीए खरगोश-1 के साथ मशीन । इस के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण निकालें और पंजाबियों के साथ 3 बार धो लो ।
- माध्यमिक विरोधी खरगोश GFP संयुग्मी (1:200) के साथ 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । इस के बाद, माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण निकालें और पंजाबियों के साथ 3 बार धो लो ।
- एक फ्लोरोसेंट बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड माउंट और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों पर कब्जा ।
6. pHrodo परख का उपयोग Microglia का ठहराव
नोट: pHrodo परख प्रसंस्कृत कोशिकाओं में phagocytosis के स्तर की पहचान के लिए अनुमति देता है । endocytosis के माध्यम से ऊपर उठाना, अधिक अंलीय वातावरण में internalization के प्रतिदीप्ति के कण conjugates के स्तर में वृद्धि हुई है । प्रतिदीप्ति का स्तर तो FACS द्वारा quantified जा सकता है. निंन चरणों से निर्माता ' प्रोटोकॉल संशोधित किए गए हैं ।
- संस्कृति एक टी-25 कुप्पी में वृद्धि के माध्यम में रात भर में कोशिकाओं, 1-2 की एक घनत्व पर बोने x10 6 कुप्पी प्रति कोशिकाओं । पंजाब के साथ टी-25 कुप्पी में सेल 5 मिनट के लिए 3 बार धो लें ।
- 2 मिलीलीटर ०.२५% trypsin का उपयोग कर कोशिकाओं को अलग । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
- वृद्धि की कुप्पी में 10% FBS युक्त मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़कर trypsinisation प्रक्रिया बुझाने ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर सेल निलंबन के लिए गोली कोशिकाओं को केंद्रापसारक ।
- supernatant निकालें और 106 कोशिकाओं/एमएल में संस्कृति माध्यम में प्राथमिक microglia युक्त गोली reसस्पेंड ।
ध्यान दें: वैकल्पिक रूप से, एक ९६-अच्छी तरह से थाली में प्लेट कोशिकाओं से कम एक दिन पहले और 1 एक्स के लिए उद्देश्य 105 प्रति अच्छी तरह से दिन पर परख प्रदर्शन किया जाना है । - प्लेट कोशिकाओं में ९६-अच्छी तरह से थाली पर 1 x 105 कोशिकाओं को अच्छी तरह से, १०० μL प्रति । प्लेट नियंत्रण और तपसिल में प्रयोगात्मक कुओं, और एक नहीं सेल नियंत्रण पृष्ठभूमि घटाव के लिए सकारात्मक नियंत्रण प्रति एक खाली अच्छी तरह से छोड़ दें ।
- वृद्धि मीडिया के कुओं को १०० μL जोड़ें कोई सेल पृष्ठभूमि घटाव के लिए खाली छोड़ दिया ।
नोट: किसी भी अंय इन विट्रो परख की तरह, उचित नियंत्रण readouts की सटीकता के लिए महत्वपूर्ण हैं । कोई सेल नियंत्रण (पृष्ठभूमि पढ़ने) के साथ, यह भी नकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से शामिल है (pHrodo संयुग्मी जोड़ा है, लेकिन बर्फ पर रखा) । - प्लेट को कवर और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% सह2 के साथ एक मशीन में 1 घंटे के लिए मशीन ।
- उत्तेजक और उपचार जोड़कर प्रयोगात्मक कुओं तैयार करते हैं । वाहन नियंत्रण जोड़ें (केवल विकास मीडिया) अनुपचारित कुओं के लिए ।
नोट: Lipopolysaccharide 1 µ g/mL [उत्तेजक] और मानव amnion उपकला कोशिका (hAEC)-वातानुकूलित मीडिया [उपचार] प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया. - गल संयुग्मित डाई की एक शीशी, 2 मिलीलीटर के रूप में ले लो बफर और संक्षेप में भंवर जोड़ें । 5 मिनट के लिए एक स्वच्छ ग्लास ट्यूब और sonicate में ट्यूब सामग्री हस्तांतरण, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कणों समान रूप से फैला रहे हैं ।
- कल्चरल मीडियम को microplate वेल्स से महाप्राण और जल्दी से १०० μL ऑफ डाई सस्पेंशन के साथ बदलें । कवर और 1 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
नोट: नियंत्रण ट्यूबों के रूप में अच्छी तरह से दाग याद है । - प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग करना, संयुग्मित pHrodo मोतियों के लिए सकारात्मक धुंधला कोशिकाओं और एक प्रतिशत के रूप में मौजूद (जनक का) सक्रिय रूप से phagocytosing microglia के ।
7. भड़काऊ अपमान के बाद Microglia Apoptosis के ठहराव
- "microglia शुद्धता का सत्यापन" खंड से 1-7 चरणों को दोहराएँ ।
- अधिकांश कक्षों को रखें (उदा. यदि आप FACS बफ़र के ५०० μL में कक्षों को reसस्पैंड करते हैं, तो ४०० μL का उपयोग करें) एक नमूना ट्यूब में । नियंत्रण ट्यूबों के बीच शेष कोशिकाओं को वितरित करने और नियंत्रण ट्यूब प्रति १०० μL करने के लिए ऊपर शीर्ष (उदा. 6 नियंत्रण ट्यूबों के लिए, प्रत्येक नियंत्रण ट्यूब में १६.६७ μL डाल दिया और ८३.३३ μL FACS बफर के साथ शीर्ष) । समूह (बोल्ड में नियंत्रण ट्यूबों): दाग, एकल दाग (AnnexinV, Propidium आयोडाइड), एकल जीवित/मृत दाग, FMOs, नमूना ट्यूबों ।
- सभी ट्यूबों में 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1 μL एंटीबॉडी/100 μL FACS बफर/5 x 106 कोशिकाओं के साथ मशीन ।
नोट: 2 x 106 कक्षों से कम होने पर ५० μL का उपयोग करें । - ५०० μL FACS बफर जोड़कर कोशिकाओं को धोने और 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक ।
- ३०० μL FACS बफर में सेल गोली reसस्पेंड ।
नोट: ~ १०० μL अगर सेल गिनती से कम है 2 x 106। - प्रत्येक वृत्त का चक्र (Q1: गल, Q2: देर अपोप्तोटिक, Q3: व्यवहार्य, Q4: अर्ली अपोप्तोटिक) के भीतर कोशिकाओं को बढ़ाता है ।
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Representative Results
यहां उल्लिखित तरीकों का उपयोग करना, microglia की शुद्ध आबादी अलग किया जा सकता है और इन विट्रो और FACS विश्लेषण में उपयोग कर लक्षण वर्णन के लिए तैयार किया जा सकता है । के साथ शुरू करने के लिए, अप करने के लिए 18 जानवरों के प्रति चुनना, लगभग ४५०,०००-६००,००० microglial कोशिकाओं की एक उम्मीद की उपज के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । यह पहले अलग कोशिकाओं की पवित्रता की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है, और ऐसा करने के लिए FACS विश्लेषण दो मार्करों CD45 और CD11b के लिए दाग द्वारा प्रदर्शन किया गया था । microglia की पहचान साबित हो सकती है परेशानी, के रूप में कई मार्करों द्वारा व्यक्त microglia द्वारा भी व्यक्त कर रहे है मैक्रोफेज, और इन दो मार्करों का उपयोग सटीक और विश्वसनीय ठहराव की अनुमति देता है । विशेष रूप से, microglia CD45 की एक कम अभिव्यक्ति है, उच्च सीएनएस और परिधीय मैक्रोफेज में देखा अभिव्यक्ति की तुलना में, और भी CD11b के लिए सकारात्मक है (चित्रा 1). इस विशेष अलगाव से ८९.३% की शुद्धता की सूचना थी । CD11b के लिए दाग के बाद, हम ध्यान दें कि हमारी प्राथमिक microglia साझा समान रूपात्मक सुविधाओं, morphologies की एक सीमा के साथ अलग unramified से (बड़े गोलाकार कोशिका शरीर कम या कोई विस्तारित प्रक्रियाओं के साथ) अधिक ramified के लिए (छोटे, अधिक के साथ ओवल सोमता और आम तौर पर माध्यमिक आदेश प्रक्रियाओं के लिए) सक्रियण राज्यों की एक श्रेणी के लिए correlating, के रूप में vivo में देखने की उम्मीद (चित्रा 2).
इस के बाद, दो microglia समारोह और अस्तित्व के लिए लक्षण वर्णन परख चला रहे थे । Microglia सीएनएस में प्रमुख phagocytic सेल हैं, और pHrodo परख इस विशेष कार्यात्मक संपत्ति के ठहराव की अनुमति देता है । एक के पास 3-24 के बाद phagocytic समारोह में वृद्धि गुना-एच सह संस्कृति hAEC वातानुकूलित माध्यम के साथ (चित्रा 3) नोट किया गया था, के रूप में फ्लोरोसेंट pHrodo कणों की ठहराव द्वारा मापा । अंत में, एक AnnexinV-PI के बाद सह संस्कृति धुंधला एक भड़काऊ अपमान के बाद microglia के अस्तित्व की पहचान करने के लिए किया गया था । वातानुकूलित माध्यम (चित्रा 4) के साथ उपचार के बाद microglia apoptosis में कमी देखी गई । इन निष्कर्षों का सुझाव है कि hAEC वातानुकूलित माध्यम microglia की रक्षा करता है और उनके phagocytic गतिविधि है, जो प्रसवकालीन मस्तिष्क चोट और neuroinflammatory विकारों में चिकित्सा हो सकता है बढ़ाता है ।
चित्र 1 : microglia द्वारा CD45 और CD11b की अभिव्यक्ति। प्रत्येक डॉट एक लेबल्ड सेल का प्रतिनिधित्व करता है और FACS विश्लेषण अलग सेल आबादी के elucidation की अनुमति देता है । Microglia परिधीय monocyte-व्युत्पंन मैक्रोफेज की तुलना में CD45 प्रतिजन की एक कम अभिव्यक्ति है और CD11b के लिए सकारात्मक हैं । एंटीबॉडी लेबल के नीचे की संख्याएं पैरेंट जनसंख्या के प्रतिशत के रूप में व्यक्त gated कोशिकाओं के अनुपात का संकेत देती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : पृथक प्राथमिक microglia की आकृति विज्ञान । के रूप में इस आंकड़े में देखा जा सकता है, microglia अपने गोलाकार कोशिका शरीर और विशिष्ट ramified संरचना को बनाए रखने । स्केल बार = 20 µm ।
चित्र 3 : पृथक प्राथमिक microglia में phagocytic फ़ंक्शन का ठहराव. pHrodo-बला के कण ही fluoresce जब अम्लीय वातावरण में होते हैं, ऐसे में सेलुलर endosomes निम्न phagocytosis. यहाँ, hAEC वातानुकूलित माध्यम के साथ इलाज microglia में pHrodo कण में वृद्धि मनाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : भड़काऊ अपमान के बाद microglia अस्तित्व का विश्लेषण। (क) प्रतिनिधि FACS के भूखंड पृथक microglia. AnnexinV और propidium आयोडाइड के संयुक्त धुंधला अपोप्तोटिक के साथ उत्तेजना के बाद या तो एलपीएस, गल, या जीवित कोशिकाओं में वर्गीकरण की अनुमति देता है । (B) इस कक्ष प्रकार पर सुरक्षा का एक प्रपत्र सुझाते हुए, नियंत्रणों के सापेक्ष hAEC वातानुकूलित मध्यम काफी कम microglia apoptosis । * का प्रतीक है < 0.05, student ' s t-test. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| धो मध्यम |
| कम ग्लूकोज है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम |
| 1% v/v पेनिसिलिन-streptomycin |
| डाइजेस्ट मध्यम (प्रति मस्तिष्क) |
| १५० µ l DNase I |
| १०० µ l Papain (17U/एमजी स्टॉक) |
| 3 मिलीलीटर धो मध्यम |
| विकास माध्यम |
| कम ग्लूकोज है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम |
| 10% foetal गोजातीय सीरम |
| 1% v/v पेनिसिलिन-streptomycin |
तालिका 1: समाधानों की तालिका ।
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Discussion
Microglia दोनों समर्थक और विरोधी भड़काऊ, पर्यावरण उत्तेजनाओं द्वारा बदल सकता है की क्षमता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है microglia सक्रियण के मॉडुलन neuroprotection प्रदान कर सकते हैं. उनकी क्षमता ंयूरॉंस और मरंमत की चोट आवश्यक को सुरक्षा प्रदान करने के लिए और अधिक अनुसंधान के लिए इन जटिल कोशिकाओं की वर्तमान समझ आगे । इस प्रकार, उच्च शुद्धता प्राथमिक microglia के अलगाव एक महत्वपूर्ण और उपयोगी तकनीक है । यह उच्च शुद्ध प्राथमिक microglia के लिए तैयार प्राप्त करने के लिए एक अपेक्षाकृत त्वरित विधि है 2 दिनों के भीतर प्रयोग में इन विट्रो ।
murine दिमाग से प्राथमिक microglia के अलगाव के लिए साहित्य में वर्णित प्रोटोकॉल की एक सीमा है । प्रमुख चुनौती कुशलतापूर्वक पर्याप्त नमूना, व्यवहार्यता और पवित्रता में उच्च उत्पादन करने के लिए है । इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ संस्कृति में समय की आवश्यकता के बिना एक अत्यधिक शुद्ध नमूना की उपज है । इस प्रकार, विधि 2 सप्ताह से 2 दिनों के लिए छोटा है, यह तेजी से परिणाम की सुविधा । लक्षणीय कदम microglia के बारे में मजबूत कार्यात्मक डेटा उपज, इन जटिल कोशिकाओं की वर्तमान समझ को बढ़ाने । प्रोटोकॉल दो वर्तमान दृष्टिकोण-घनत्व ढाल केंद्रापसारक और चुंबकीय जुदाई को जोड़ती है । चुंबकीय जुदाई अच्छी तरह से अंय अलगाव तकनीक14,15,16की तुलना में एक अपेक्षाकृत कोमल तरीके से microglia के अलगाव के लिए साहित्य में मांय किया गया है । Whilst वहां निस्संदेह अलग प्राथमिक microglia के कार्यात्मक विशेषताओं में परिवर्तन कर रहे है vivo मेंअपने पैतृक राज्य में की तुलना में, microglia गुणों में किसी भी परिवर्तन के रूप में ऊपर विकसित की परख में देखा एक से गणना कर रहे है पोस्ट-पाचन आधारभूत, और इस तरह के रूप में इस प्रतिरक्षा सबसेट के प्रत्यक्ष मॉडुलन के चिंतनशील हैं ।
Whilst प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है, महत्वपूर्ण कदम के दौरान देखभाल के लिए एक अच्छी उपज सुनिश्चित करने में मदद मिलेगी । सबसे पहले, यह glial विकास का समर्थन करने के लिए कम ग्लूकोज मीडिया का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, murine दिमाग हर समय में अलगाव के दौरान बर्फ ठंडा रखा जाना चाहिए । इस प्रकार, यह पूर्व ठंडा सभी माध्यम के लिए सिफारिश की है, साथ ही उपकरणों यदि संभव हो तो, और बर्फ पर प्रक्रिया प्रदर्शन करते हैं । महत्वपूर्ण बात, लंबे समय तक अलगाव बार गरीब सेल स्वास्थ्य और उपज को बढ़ावा मिलेगा, इस प्रकार यह महत्वपूर्ण है जल्दी से काम करने के लिए । इसके अलावा, मस्तिष्कावरणीय परत के उचित हटाने एक महत्वपूर्ण कदम जब वयस्क चूहों के साथ काम कर रहा है, अंयथा fibroblasts विकास के मामले में glial कोशिकाओं से दूर होगा । दिमाग के एंजाइमी पाचन के दौरान, यह महत्वपूर्ण है के रूप में भी छोटे टुकड़ों में दिमाग में कटौती नहीं यह सेल मौत बढ़ा सकते हैं, आदर्श ऊतक के 1 mm2 टुकड़े के लिए लक्ष्य । जब सेल छलनी के माध्यम से ऊतक पीसने, अच्छी तरह से हर कुछ मिनट मीडिया के साथ कुल्ला सुनिश्चित करने के लिए सभी कोशिकाओं के माध्यम से धोया और छलनी में फंस नहीं कर रहे हैं, इसके अलावा यह एक १०० माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, छोटे फिल्टर एक में परिणाम कम उपज । एक और महत्वपूर्ण कदम है ७०% घनत्व ढाल मध्यम परत के बिछाने, इस कदम को ध्यान से प्रदर्शन और धीरे से इतना के रूप में एक स्पष्ट चरण देखा है सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है, एक पाश्चर पिपेट के उपयोग की सिफारिश की है । इसके अलावा, 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के उपयोग की सिफारिश की है के रूप में कोशिकाओं की जुदाई कम प्रभावी था जब ५० एमएल शंकु ट्यूबों का उपयोग किया गया । अंत में, घनत्व ढाल केंद्रापसारक कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए, के रूप में तापमान घनत्व ढाल को प्रभावित कर सकते हैं ।
इस प्रोटोकॉल CD45 और Cd11b की सकारात्मक अभिव्यक्ति की दोनों उच्च अभिव्यक्ति द्वारा दिखाए गए के रूप में अत्यधिक शुद्ध प्राथमिक microglia कोशिकाओं के उत्पादन की एक विश्वसनीय विधि का वर्णन (के रूप में कम CD45 परिधीय monocytes में देखा अभिव्यक्ति की तुलना में) । कोशिकाओं को भी अपेक्षाकृत जल्दी अलग किया जा सकता है, इस प्रकार यह काफी इन glia कोशिकाओं की समझ में वृद्धि की गुंजाइश है । यह अलग पृष्ठभूमि से अलग microglia आबादी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो अध्ययनों से अलग microglia के बीच मतभेद प्रकट हो सकता है के लिए अनुमति/ एक शुद्ध microglia जनसंख्या के अलगाव के माध्यम से, इस प्रतिरक्षा कोशिका जनसंख्या के चिकित्सीय मॉडुलन का आकलन किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, यह पाया गया कि hAEC-कंडीशन्ड मीडिया phagocytosis वृद्धि हुई है, साथ ही साथ एक भड़काऊ उत्तेजना के दौरान सुधार microglia अस्तित्व, इस प्रकार चिकित्सकीय लाभ17वहन । यह कम अपोप्तोटिक मलबे को संबंधित है और इस तरह इन मलबे की मंजूरी का पता चलता है न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव हो सकता है ।
प्रोटोकॉल दोनों नवजात या वयस्क चूहों के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन पुराने चूहों एक कम उपज का उत्पादन होगा. इसके अलावा, यह नवजात या वयस्क चूहों से प्राथमिक astrocytes को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, फिर पुराने चूहों एक कम उपज में परिणाम होगा. इसके अतिरिक्त, एक कस्टम के साथ यांत्रिक पृथक्करण कदम के संशोधन के रूप में बड़ा ताकना आकार के साथ नायलॉन जाल १०० माइक्रोन सेल छलनी करने के लिए विरोध किया, आगे सेल में सुधार हो सकता है18उपज.
इस प्रोटोकॉल की सीमाएं कम उपज और इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक समय शामिल हैं । उपज लगभग १५०,०००-छह पशुओं के चुनना प्रति २००,००० कोशिकाओं है, लाखों कि सेल संस्कृति के सप्ताह के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है बनाम । इसके अतिरिक्त, whilst कोशिकाओं दो दिनों के भीतर प्राप्त किया जा सकता है, पहले दिन पर प्रक्रिया काफी समय लेने वाली है, लगभग छह घंटे ले ।
बहरहाल, इस विधि रोग में microglia की भूमिका को समझने में एक अत्यंत उपयोगी उपकरण है, अलग करने में सक्षम है और दो दिनों के भीतर कोशिकाओं characterising । यह उच्च शुद्धता प्राथमिक microglia कोशिकाओं का उत्पादन, सटीक और कुशल अनुसंधान की सुविधा ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
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