Summary
Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.
Abstract
Microglia, las células inmunes residentes en el cerebro, son los primeros respondientes a los inflamación o lesiones en el sistema nervioso central. La investigación reciente ha revelado microglia a ser dinámico, capaz de asumir fenotipos pro inflamatorias y antiinflamatorios. Tanto M1 (pro inflamatorio) y M2 fenotipos (pro-reparadora) juego un papel importante en capensis condiciones tales como lesión cerebral perinatal y exposición de diferentes funciones en respuesta a ciertos estímulos ambientales. La modulación de la activación microglial se ha observado para conferir neuroprotección así sugiriendo la microglía puede tener potencial terapéutico en el daño cerebral. Sin embargo, se requiere más investigación para comprender mejor el papel de la microglia en la enfermedad, y este protocolo facilita. El protocolo describe a continuación combina un proceso de centrifugación del gradiente de densidad para reducir desechos celulares, con separación magnética, produciendo una muestra muy pura de las células microgliales primaria que pueden utilizarse para la experimentación in vitro , sin la necesidad de 2 a 3 semanas de cultivo. Además, los pasos de caracterización rendimiento robustos datos funcionales sobre la microglia, ayudando a los estudios para mejorar nuestra comprensión de la polarización y cebado de estas células, que tiene fuertes implicaciones en el campo de la medicina regenerativa.
Introduction
Daño adquirido durante el período de inflamación, hipoxia isquemia y hemorragia perinatal puede tener una serie de secuelas a largo plazo. La teoría de la compleja Fisiopatología de la lesión cerebral perinatal es involucrar a la inflamación y la isquemia con posterior muerte neuronal y axonal1. La respuesta inmunitaria innata desempeña un papel importante en la cascada de eventos que llevan a lesión2.
Microglia, las células inmunes residentes en sistema nervioso central (SNC), son los primeros respondientes a lesiones3. Microglia son tipos de células de plástico con capacidad de ser protector o tóxico, dependiente en el medio ambiente4. Están involucrados en la quimiotaxis, fagocitosis, presentación del antígeno y la producción de citocinas y especies de oxígeno reactivo4,5. Microglia senescente constantemente encuesta sobre el medio ambiente y se activan por la presencia de una sustancia perjudicial o extranjeros4. La activación conduce a una respuesta proinflamatoria, crítica en el CNS protección4. Estos M1 "inflamatorias" fenotipo microglia participan principalmente en la presentación del antígeno y la muerte de patógenos4. A pesar del papel crucial de la respuesta inflamatoria en la neuroprotección, inflamación incontrolada o prolongada puede ser perjudicial y conducir a daño neuronal4. Sin embargo, cuando se expone a ciertos estímulos ambientales, microglia puede exhibir un fenotipo antiinflamatorio. Estos pro-reparadora microglia M2 tienen un papel fundamental en la cicatrización de heridas y reparación6, lanzando una gama de citoquinas y otros mediadores solubles que regular a la baja la inflamación, aumentan la fagocitosis y promover la reparación de4, 7. los papeles de microglia son diversos e incluyen diferenciación de oligodendrocyte conducción durante re-mielinización8, protegiendo las neuronas durante la depleción de oxígeno y glucosa en tiempos modelos9 y promoción de la consecuencia del neurite en 10los modelos de lesión de la médula espinal.
El estudio de estas células gliales representa un aspecto importante en la comprensión y manipulación de la respuesta a la neuroinflamación. El protocolo descrito permite más investigación sobre el potencial terapéutico de la modulación de la microglia en afecciones capensis.
La modulación de la activación microglial hacia un papel neuroprotector se ha observado en una amplia gama de condiciones11,12,13. Por lo tanto, mejorar la comprensión actual y estudiar más la modulación de la activación microglial es crítica, que requieren el uso de varios modelos, incluyendo tanto in vitro como in vivo. In vitro los estudios representan una herramienta importante debido a su mayor eficiencia, menor costo y su capacidad para investigar una población aislada de la célula.
Hay una gama de protocolos descritos en la literatura para el aislamiento de la microglia del cerebro murino, el desafío de producir eficientemente una muestra de alto rendimiento con buena viabilidad y pureza elevada. Utilizado métodos de aislamiento de microglia primaria son por separación magnética y prolongado temblor de cultivos gliales mixtos. A través de la experiencia personal, se encontró que existía un alto grado de desechos celulares que obstruyó la columna magnética. Por lo tanto, se utilizó el siguiente protocolo, que incorpora un paso de centrifugación del gradiente de densidad inicial seguido por la separación magnética de CD11b. El protocolo que se describe a continuación ha sido optimizado para producir una muestra muy pura en cantidad suficiente. Es ventajoso debido a su alta pureza y el corto período de tiempo, uno puede realizar análisis dentro de 2 días sin tener a la cultura durante 2-3 semanas. Potencialmente se puede adaptar este protocolo para el aislamiento de astrocitos murinos primarios.
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Protocol
Los siguientes procedimientos han sido aprobados por el Comité de ética Animal en la Universidad de Monash. Se utilizaron ratones C57Bl6/J P3-6 de recién nacido sano para generar resultados representativos.
1. enzimática digestión
Nota: Es importante considerar la esterilidad al aislamiento y cultivo de células primarias. Y asegurando que el ambiente es tan estéril como sea posible, la disección inicial y la cosecha de cerebros murinos pueden completarse fuera una campana de flujo laminal, con pasos posteriores realizados dentro de una campana de flujo laminar.
- Utilizar instrumentos estériles, eutanasia el ratón mediante dislocación cervical, decapitar al animal y enjuagar con etanol al 100%. Con pequeñas tijeras estériles, hacer pequeñas incisiones a lo largo de los lados derecho e izquierdos de la cabeza. A esta edad, la piel se pela fácilmente. Usando las puntas de las pinzas curvas, deslice suavemente el tejido hacia la tribuna para exponer el cráneo, incluyendo el Bregma.
- Inserte la punta de la tijera en la apertura del canal medular y haga una incisión lateral en el conducto auditivo externo. Hacer una incisión a lo largo de la sutura sagital Bregma, suavemente hacia la punta de las tijeras hacia arriba para evitar daños en el cerebro. Introduzca la punta de la tijera en el Bregma y hacer incisiones laterales a los lados derecho e izquierdos de la cabeza a lo largo de la sutura coronal.
- Con unas pinzas, con cuidado retire el cráneo para exponer el cerebro. Para ello, sujete los bordes del cráneo expuesto por la incisión lateral y Jale suavemente el cráneo al lado. El cráneo debe despegar fácilmente. Suavemente con unas pinzas curvas, primicia en el cerebro para sacarlo.
- Colocar el cerebro en un recipiente estéril de 5 mL, lavar 2 - 3 veces con medios helada colada (de baja glucosa Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 1% de penicilina-estreptomicina), aproximadamente 5 mL los medios de comunicación por lavado, para eliminar la sangre.
- En una campana de flujo laminar, colocar el contenido del envase de 5 mL en una placa Petri pequeña (35 mm), descansando en el hielo. Utilizando una cuchilla estéril de bisturí o tijeras estériles, quite el cerebelo y el bulbo olfatorio. Haga una línea media para separar los dos hemisferios.
- Cuidadosamente retire la capa meníngea con pinzas finas, teniendo cuidado de no para dañar las cortezas. Identificar la capa meníngea como una capa muy delgada de células con una tonalidad rojiza en la superficie del cerebro, con visibles vasos sanguíneos. Manteniendo el cerebro frío es esencial para la eliminación adecuada de meninges. Si se rompe la capa meníngea, siguen pelando lejos los fragmentos rotos hasta que se quita totalmente.
- Transferir los hemisferios a un nuevo plato de petri pequeñas (sobre hielo) y llenar con los medios de lavado. Cortar el cerebro en pedazos pequeños con cuchilla estéril bisturí/tijeras.
Nota: Estos deben ser de ~ 1 mm2 de tamaño, y debe tener cuidado de no cortarlas en trozos muy pequeños, esto puede reducir el rendimiento. - Añadir 100 μl papaína (acción de 17 U/mg) y 150 μL de DNasa I en los medios de comunicación e incubar 30 min a 37 ° C
- Después de la digestión, triturate tejido usando una pipeta P1000. Si pedazos de tejido son demasiado grandes para entrar en la pipeta, considere el uso de un par o tijera estéril para ensanchar la punta de la pipeta. Durante este proceso, asegúrese de no para introducir burbujas en los medios de comunicación como esto puede reducir la viabilidad de las células.
2. retiro de escombros mielina
- Bajo campana de flujo laminar utilizar equipo estéril, preparación de un tubo cónico de 50 mL con un 100 μm filtro de célula, de cada cerebro. Vierta el contenido de la caja Petri, que contiene las piezas de medio y el cerebro de digerir en un colador. Empuje a través de las piezas del cerebro utilizando el émbolo de una jeringa estéril 3 mL en un movimiento de pulido hasta que hay no hay tejido más accesibles. Después de la digestión, el tejido cerebral debe desmoronarse fácilmente.
- Constantemente lavar el filtro con los medios de lavado por rellenar el filtro de la célula a lo largo de este proceso. Esto va a lavado a través de las células atrapadas en el filtro.
Nota: Esto debe hacerse hasta que haya aproximadamente ~ 15 mL en el tubo. Esto es para asegurar que el filtro se lava suficientemente a través de y para maximizar la cantidad de células recogidas. -
Centrifugar la suspensión unicelular a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Durante este tiempo, preparar el medio de gradiente de densidad como se describe.
- Preparar el percoll isotónica stock (SIP), que es el medio de gradiente de densidad utilizado. Para ello, agregando la relación 9:1 de medio de gradiente de densidad a 10 x estéril madejas de solución salina balanceada (HBSS).
- Preparación de gradientes como 30% SIP en DMEM y 70% SIP en 1 x HBSS. Por ejemplo, para preparar 10 mL de 30% SIP, añadir 3 mL de SIP a 7 mL DMEM.
- Aspirar el sobrenadante de los tubos cónicos y resuspender el sedimento celular con 8 mL de 30% SIP en DMEM. Transferir el volumen completo a un nuevo tubo cónico 15 mL.
- La SIP solución al 70% de la arpillera. Para ello, llene una pipeta de transferencia con 70% SIP y cuidadosamente empuje a través de la pipeta hasta el fondo del tubo cónico. Una vez que la punta está cerca de la parte inferior, suavemente empuje por el contenido de la pipeta de transferencia.
Nota: Hacer esto lentamente para no perturbar la interfaz 30/70. Debe haber una línea clara que separa las dos capas. - Centrifugue las capas SIP, incluyendo las células, en 650 g de x con freno 0 y aceleración 4, durante 25 minutos a temperatura ambiente.
Nota: Es esencial para completar el giro con freno OFF y para permitir que la centrífuga lentamente llegar a un alto, como aplicación del freno de alterar la interfase y reducir dramáticamente la recolección de células entre las capas de la SIP. - Aspire los detritos celulares en la parte superior del tubo y eliminar aproximadamente 4 mL de medios de la parte superior. Esto facilitará la eliminación de las células mononucleares en el siguiente paso. Con una pipeta P1000, baje con cuidado la punta de la pipeta hacia la interfase. Aislar las células mononucleares de la interfaz medio gradiente de densidad de 30/70. Recoger aproximadamente 3 mL de la interfaz de nublado y transferencia a un nuevo tubo cónico de 15 mL. A continuación, diluir la mezcla con 9 mL de HBSS para ayudar a la eliminación del medio de gradiente de densidad.
- Centrifugar la interfase medio degradado densidad diluida, que contiene las células mononucleares a 500 x g por 5 min aspirar el sobrenadante y resuspender con medio de cultivo 1 mL (DMEM suplementado con 10% bovino fetal del suero y el 1% antibióticos). A continuación, mancha las células resuspendidas con trypan azul y realizar un conteo usando un hemocitómetro.
3. magnético celular activado clasificación
Nota: Estos pasos son modificados del protocolo del fabricante.
- Centrifugar las células mononucleares recogidas a 300 x g durante 10 min a 4 ° C para eliminar el medio de crecimiento, esto va a interferir con el aislamiento magnético. Utilizando la misma cuenta de célula de paso 2.8, resuspender en 1 x 108 nucleated células/mL en PBS (++ de Ca y Mg++ libre) que contiene 2% de SBF y 1 mM de EDTA, dentro de un rango de volumen de 0.1-2.5 mL.
- Agregar el volumen completo de las células nucleadas en PBS desde el paso anterior a un tubo de poliestireno fondo redondo 5 mL fresco (12 x 75 mm). Añadir 50 μl de reactivo de etiquetado CD11b PE por 1 mL de muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos protegido de la luz.
- Añadir 70 μl de selección cocktail (una combinación de anticuerpos monoclonales contra CD11b en PBS) por 1 mL de muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos protegido de la luz.
- Mezcla de partículas magnéticas mediante pipeteo arriba y abajo más de 5 veces. Añadir 50 μl/mL para la muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos protegido de la luz.
Nota: Estas partículas forman un complejo tetramérica con los anticuerpos y se conseguir atadas a la columna magnética. - Si el volumen total de la mezcla de células es inferior a 2,5 mL, tapa hasta este volumen con PBS (++ de Ca y Mg++ libre) que contiene 2% FBS y 1 mM EDTA y mezclar mediante pipeteo suave 2 - 3 veces. Coloque el tubo (sin tapa) en el imán e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- En un movimiento continuo, totalmente invertir el imán que contiene el tubo de 2-3 s, verter fuera el sobrenadante. Regrese el imán a una posición vertical y retire el tubo del imán. Preparación lavar las células restantes de la columna.
Nota: El sobrenadante contiene células sin etiquetar y no deseadas, que se eliminan por inversión del tubo mientras que en el imán. El tubo contiene el Cd11b adjunto+ las células. - Lavar las células repitiendo los pasos 3.5 y 3.6 dos veces más. Si la muestra es mayor de 1 mL, se recomienda una mayor repetición de pasos 3.5 y 3.6.
- Resuspender las células en un medio de crecimiento deseado. Enjuague el lado del recipiente de colección así (ej. un tubo de 15 mL) para recoger células de los lados del tubo y maximizar los rendimientos.
4. verificación de pureza de la Microglia
Nota: La microglia primaria aislada de 3 L (n = total de 5 animales) fueron verificados mediante fluorescente celular activada (FACS) para determinar pureza para obtener resultados representativos de clasificación.
- Células en cultivo en un matraz T-25 en el medio de crecimiento que contiene 10% FBS durante la noche, siembra a una densidad de 1-2 x 106 células cada frasco.
- Lavar las células en los matraces T-25 con PBS 3 x 5 min eliminar cualquier medio de crecimiento restante que podría interferir con la tripsinización.
- Añadir 2 mL de tripsina 0.25% para separar las células de los frascos. Asegúrese de que el volumen de la tripsina es suficiente para cubrir toda la superficie del frasco. Tras suave remolino del frasco para asegurar una cobertura uniforme de la tripsina, incubar por 5 min a 37 ° C.
- Apagan el proceso tripsinización añadiendo 2 mL de medio de crecimiento que contiene 10% FBS en el matraz.
- Recoger el sobrenadante que contiene las células tripsinizaron y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C para recoger células.
- Quite el sobrenadante que contiene el medio de cultivo y tripsina y resuspender el precipitado en tampón de FACS de 500 μL. Realizar el conteo de células con azul tripán.
- Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Realizar el bloqueo de receptores Fc añadiendo 50 tampón FACS de μL + bloqueador de FcR de 1 μL por 5 x 106 células. Incubar por 15 min a 4 ° C.
Nota: El bloque del receptor de Fc es un paso crítico en el procedimiento de tinción para evitar atascamiento no específico de inmunoglobulinas a los receptores de Fc en las poblaciones de células inmunitarias. Este bloqueo no afecta aguas abajo Unión de otros anticuerpos. - Terminar el proceso de bloqueo mediante la dilución con tampón de FACS de 500 μL. A continuación, centrifugar la mezcla que contiene las células a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender en tampón de FACS de μL 500 frescos.
- Lugar la mayoría de las células (por ejemplo si resuspender las células en 500 μL de tampón FACS, uso 400 μL) en un tubo de muestras. Distribuir las células restantes entre los tubos de control y superior a 100 μL por tubo de control (e.g. para 6 tubos de control soportar 16.67 μL en cada tubo de control y top 83,33 tampón FACS de μL). Hacer grupos (tubos de control en negrita) como Unstained, solo manchado (CD45, CD11b), solo la mancha en vivo/muerto, consistente y tubos de muestras.
- Sedimenten las células en todos los tubos por centrifugación a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Se tiñen las células en el tubo con 1 anticuerpo μL por tampón FACS de 100 μL por 5 x 106 células. Incubar por 20 min a 4 ° C.
Nota: Utilice 50 μL del anticuerpo cóctel si se utilizan menos de 2 x 106 células. - Lavar las células con buffer de FACS de 500 μL. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender las células en solución tampón FACS de 300 μL.
Nota: Use ~ 100 μl si el recuento es inferior a 2 x 106. - Usando análisis de citometría de flujo, cuantificar las células CD45bajo y positivo para la tinción de CD11b. Este porcentaje corresponde a la microglia primaria aislada.
5. inmunohistoquímica tinción de Microglia primaria
- Placa las células en una placa de 96 pozos a una densidad de 1 x 105 células con el medio de cultivo e incubar durante la noche.
- Quite el sobrenadante y lavar 3 veces con PBS.
- Fijar las células con paraformaldehído al 4% en PBS para eliminar las AFP con una pipeta P1000 a 15 minutos, luego lavar 3 veces con PBS + 0.1% Triton-X.
- Bloque de fijación no específica con seroalbúmina bovina al 3% durante 1 h a temperatura ambiente.
- Incubar con conejo Iba-1 (1: 100) por 24 h a 4 ° C. A continuación, retire la mezcla del anticuerpo primario y lavar 3 veces con PBS.
- Incubar con el conjugado GFP secundario anti-conejo (1: 200) por 1 h a temperatura ambiente. A continuación, retire la mezcla del anticuerpo secundario y lavar 3 veces con PBS.
- Montaje de diapositivas con un fluorescente montaje medio y captura imágenes mediante un microscopio de fluorescencia.
6. cuantificación de Microglia pHrodo ensayo
Nota: El ensayo de pHrodo permite la identificación de los niveles de fagocitosis en células cultivadas. A absorción a través de endocitosis, la internalización en el ambiente más ácido aumenta los niveles de fluorescencia de los conjugados de bioparticle. Entonces pueden cuantificar niveles de fluorescencia por FACS. Modificación de los pasos del protocolo del fabricante.
- Cultura durante la noche las células en un frasco de T-25 en el medio de crecimiento, siembra a una densidad de 1-2 x 106 células cada frasco. Lavar las células en frascos T-25 con PBS 3 veces durante 5 minutos.
- Separar las células utilizando tripsina de 0.25% de 2 mL. Incubar por 5 min a 37 ° C.
- Apagan el proceso de trypsinization mediante la adición de 2 mL de medio de crecimiento que contiene 10% FBS en el matraz.
- Centrifugue la suspensión de células a 500 x g durante 5 min a 4 ° C para que sedimenten las células.
- Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado que contiene la microglia primaria en medio de cultivo 106 células/ml.
Nota: Alternativamente, placa de células en una placa de 96 pocillos por lo menos un día antes y busca 1 x 105 células viables por pozo en el día el ensayo debe ser realizado. - Células de placa en placa de 96 pocillos en 1 x 105 células/pozo, 100 μL por pozo. Placa de controles y pozos experimentales por triplicado y dejar un pozo vacío por control positivo para realizar una sustracción de fondo del control no celular.
- Añada 100 μL de medio de crecimiento para los pozos vacíos para fondo de celular no.
Nota: Como cualquier otro en vitro ensayo, controles adecuados son vitales para la exactitud de las lecturas. Junto a la celda de no control (fondo de la lectura), también incluyen el control negativo bien (conjugado pHrodo añadido, pero colocado en hielo). - Cubrir la placa e incubar durante 1 h en una incubadora con 5% CO2 a 37 ° C.
- Preparar pozos experimentales agregando estimulante y tratamiento. Agregar controles de vehículo (sólo medios de crecimiento) a pozos no tratadas.
Nota: Lipopolisacárido 1 μg/mL [estimulante] y células epiteliales del amnios humano (hAEC)-media condicionada [tratamiento] se utilizaron para generar resultados representativos. - Descongelar un vial de conjugado colorante, añadir vortex y brevemente 2 mL de tampón de absorción. Transferir el contenido del tubo a un tubo de vidrio limpio y someter a ultrasonidos durante 5 minutos, para asegurarse de que las partículas se dispersan uniformemente.
- Aspire el medio de cultivo de los pozos de la microplaca y reemplazar rápidamente con 100 μL de suspensión de tinte. Cubrir e incubar a 37 ° C durante 1 h.
Nota: Recuerde a los tubos de control así como la mancha. - Usando análisis de citometría de flujo, cuantificar células de tinción positiva para los granos de pHrodo conjugado y se presentan como un porcentaje (del padre) de phagocytosing activamente la microglia.
7. cuantificación de la Microglia Apoptosis tras insulto inflamatorio
- Repita los pasos 1-7 de la sección "Verificación de pureza de microglía".
- Lugar la mayoría de las células (por ejemplo, si se resuspendió las células en 500 μL de tampón FACS, uso 400 μL) en un tubo de muestras. Distribuir las células restantes entre los tubos de control y superior a 100 μL por tubo de control (por ejemplo, para tubos de control 6, poner 16.67 μL en cada tubo de control y top con tampón FACS de 83,33 μL). Grupos (tubos de control en negrita): sin manchas, solos las manchas (AnnexinV, yoduro de propidio), solo la mancha en vivo/muerto, consistente, tubos.
- Sedimenten las células en todos los tubos por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos.
- Incubar con 1 μL del anticuerpo/100 μL FACS buffer/5 x 106 células por 20 min a 4 ° C.
Nota: Utilice 50 μL si tienen menos de 2 x 106 células. - Lavar las células añadiendo 500 μL de buffer de FACS y centrifugar a 500 x g durante 5 minutos.
- Resuspender el precipitado de células en solución tampón FACS de 300 μL.
Nota: ~ 100 μL si el recuento es inferior a 2 x 106. - Cuantificar las células dentro de cada cuadrante (Q1: necrótico, Q2: apoptosis tardía, Q3: viable, Q4: apoptotic temprana).
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Representative Results
Utilizando los métodos descritos aquí, poblaciones puras de microglia pueden ser aisladas y pueden estar listas para la caracterización mediante el análisis FACS y en vitro . Con 18 animales se pueden utilizar hasta por cull, con un rendimiento esperado de aproximadamente 450.000-600.000 las células microgliales. Es crucial confirmar primero la pureza de las células aisladas, y para ello análisis FACS fue realizada por la coloración de los dos marcadores CD45 y CD11b. identificación de la microglia puede resultar molesta, como muchos marcadores expresados por microglía se expresan también por los macrófagos y el uso de estos dos marcadores permite la cuantificación exacta y confiable. Específicamente, microglia tienen una baja expresión de CD45, comparado con la alta expresión en SNC y periférico macrófagos y también son positiva para CD11b (figura 1). De este aislamiento particular, informó de una pureza de 89.3%. Después de la tinción para CD11b, observamos que nuestro microglia primaria comparten características morfológicas similares, con una variedad de morfologías del claramente unramified (grandes células cuerpo esférico con poca o ninguna procesos extendidos) a la más ramificada (con más pequeño, más Somas ovales y típicamente hasta procesos de orden secundaria) correlacionando a una gama de Estados de activación, como era de esperar para ver en vivo (figura 2).
Después de esto, llevaron a cabo dos ensayos de caracterización para la supervivencia y función de la microglia. Microglia son la célula fagocítica importante en el SNC, y el ensayo de pHrodo permite la cuantificación de esta propiedad funcional particular. Se observó un aumento de 3-fold cercano de función fagocítica después de 24 h co-cultivo con hAEC acondicionado medio (figura 3), medida por la cuantificación de partículas fluorescentes pHrodo. Por último, una cultura de cooperación siguiente tinción de AnnexinV-PI se realizó para identificar supervivencia de microglía después de un insulto inflamatorio. Una reducción en la apoptosis de la microglía después de tratamiento con medio condicionado (figura 4) se observó. Estos resultados sugieren ese medio hAEC acondicionado protege microglia y aumenta su actividad fagocítica, que podría tener la terapia en trastornos de lesiones y capensis de cerebro perinatal.
Figura 1 : Expresión de CD45 y CD11b por microglia. Cada punto representa una celda etiquetada y análisis FACS permite la aclaración de poblaciones celulares separadas. Microglia tienen una menor expresión de CD45 antígeno en comparación con los macrófagos derivados de monocitos periféricos y son positivo para CD11b. números debajo de etiqueta de anticuerpos indican la proporción de células cerradas, expresado como porcentaje de la población de padres. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Morfología de microglia primaria aislada. Como puede verse en esta figura, microglia conservan su cuerpo celular esférico y distinta estructura ramificada. Barra de escala = 20 μm.
Figura 3 : Cuantificación de la función fagocítica en microglia primaria aislada. partículas marcadas pHrodo fluorescencia sólo cuando en ambientes ácidos, tales como endosomas celulares tras la fagocitosis. Aquí, se observa un aumento en la absorción de partículas pHrodo en microglia tratado con hAEC acondicionado medio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Análisis de la supervivencia de la microglía después de insulto inflamatorio. (A) representante FACS parcelas aislada microglia. Tinción combinada de AnnexinV con yoduro de propidio permite categorización en apoptosis, necrosis, o células vivas después de la estimulación con LPS. (B) hAEC había acondicionado medio apoptosis microglia significativamente reducido en comparación con controles, sugiriendo una forma de protección en este tipo celular. * indica p < 0.05, prueba de t de student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio de lavado |
| Glucosa baja Dulbecco de modificado medio de Eagle |
| 1% v/v penicilina-estreptomicina |
| Medio de la recopilación (al cerebro) |
| 150 de μl de DNasa I |
| 100 μl papaína (acción de 17U/mg) |
| medio de lavado de 3 ml |
| Medio de crecimiento |
| Glucosa baja Dulbecco de modificado medio de Eagle |
| 10% de suero bovino fetal |
| 1% v/v penicilina-estreptomicina |
Tabla 1: Tabla de soluciones.
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Discussion
Microglia tienen la capacidad de ser pro - y antiinflamatoria, alterada por los estímulos del medio ambiente. Estudios anteriores han demostrado que la modulación de la activación de la microglía puede conferir neuroprotección. Su capacidad para proporcionar protección a las neuronas y reparar lesiones requiere más investigación para la comprensión actual de estas células complejas. Así, aislamiento de alta pureza primaria microglia es una técnica importante y útil. Este es un método relativamente rápido para la obtención de microglia primario altamente puro listo para en vitro experimentación dentro de 2 días.
Hay una gama de protocolos descritos en la literatura para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. El principal reto es producir eficientemente suficiente muestra, alta viabilidad y pureza. La principal ventaja de este protocolo es el rendimiento de una muestra muy pura sin la necesidad de que el tiempo en la cultura. Así, el método se reduce de 2 semanas a 2 días, esto facilita resultados rápidos. Los pasos de caracterización rendimiento robustos datos funcionales sobre la microglia, mejorar la comprensión actual de estas células complejas. El protocolo combina dos enfoques actuales - centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética. Separación magnética ha sido bien validada en la literatura para el aislamiento de microglia en forma relativamente suave comparada a otras técnicas de aislamiento14,15,16. Mientras que, sin duda, hay cambios en las características funcionales de la microglia primaria aislada en su estado nativo en vivo, cualquier cambio en microglía propiedades observadas en los ensayos desarrollados sobre calculados a partir de un línea de base después de la digestión y como tal son reflejo de la modulación directa de este subconjunto inmune.
Mientras que el protocolo es relativamente sencillo, cuidado durante pasos críticos ayudará a asegurar un buen rendimiento. En primer lugar, es vital utilizar glucosa baja los medios para apoyar el crecimiento glial. Además, el cerebro murino debe guardarse hielo frío en todo momento durante el aislamiento. Por lo tanto, es aconsejable enfriado previamente todos los medio, así como instrumentos si es posible y realizar el procedimiento en hielo. Importante, veces aislamiento prolongado conducirá a más pobre salud celular y rendimiento, por lo tanto es fundamental para trabajar con rapidez. Por otra parte, correcta eliminación de la capa meníngea es un paso crucial cuando se trabaja con ratones adultos, de lo contrario los fibroblastos se vierten las células glial en términos de crecimiento. Durante la digestión enzimática de los cerebros, es importante no cortar el cerebro en pedazos demasiado pequeños ya que esto puede incrementar la muerte celular, buscan idealmente de 1 mm2 piezas de tejido. Al moler el tejido a través de la coladera de la célula, enjuague a fondo con los medios de comunicación cada pocos minutos para todas las células se lavan a través y no quedar atrapados en el filtro, además es aconsejable usar un colador de celda de 100 μm, filtros más pequeños resultan en un rendimiento reducido. Otro paso fundamental es el enfasis de la capa media gradiente de densidad 70%, realizar este paso con cuidado y lentamente para asegurar que una interfase clara es visto es esencial, se recomienda el uso de una pipeta Pasteur. También, se recomienda el uso de tubos cónicos de 15 mL, como la separación de las células era menos efectiva cuando se utilizaron tubos cónicos de 50 mL. Por último, la centrifugación del gradiente de densidad debe realizarse a temperatura ambiente, pues la temperatura puede afectar el gradiente de densidad.
Este protocolo describe un método confiable de producir las células de la microglia primario altamente puro tal como se muestra por la alta expresión de CD45 y positiva expresión de Cd11b (en comparación con baja expresión de CD45 en monocitos periféricos). Las células también se puede aisladas relativamente rápidamente, así tiene el alcance que significativamente mayor comprensión de estas células de glia. Puede utilizarse para identificar microglia diferentes poblaciones de diferentes orígenes, teniendo en cuenta los estudios que pueden revelar diferencias entre aislados de animales enfermos, heridos y sanos de la microglia. A través del aislamiento de una población pura de la microglia, puede evaluarse la modulación terapéutica de esta población de células inmunitarias. Por ejemplo, se encontró que los medios condicionados de hAEC aumentaron de la fagocitosis, así como mejoraron la supervivencia de la microglia en un estímulo inflamatorio, brindando así beneficios terapéuticos17. Esto correlaciona a redujo apoptotic ruina y así sugiere la separación de estos residuos puede tener efectos neuroprotectores.
El protocolo se puede aplicar a ratones neonatales o adultos, sin embargo mayores ratones producirá un rendimiento reducido. Además, puede ser adaptado para aislar astrocitos primarios de ratones adultos o neonatales, otra vez ratones mayores resultará en un rendimiento disminuido. Además, la modificación de la etapa de disociación mecánica con una malla de nylon por encargo con tamaños de poro más grandes en comparación con el filtro de célula μm 100, podría mejorar aún más la célula rendimiento18.
Limitaciones de este protocolo incluyen el rendimiento más bajo y el tiempo requerido para este protocolo. El rendimiento es de aproximadamente 150.000-200.000 células por sacrificio de seis animales, frente a los millones que pueden obtenerse a través de semanas de cultivo celular. Además, mientras que las células se pueden obtener dentro de dos días, el procedimiento en el primer día es bastante tiempo, toma aproximadamente seis horas.
Sin embargo, este método es una herramienta muy útil en la comprensión de la función de la microglia en la enfermedad, capaz de aislar y caracterizar las células dentro de dos días. Produce las células de microglía primaria alta pureza, facilitando la investigación exacta y eficiente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
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