Summary
En protokol til isolering af primære mikroglia fra murine hjerner er præsenteret. Denne teknik hjælper med at fremme den nuværende forståelse af neurologiske tilstande. Tæthed gradient centrifugering og magnetisk separation er kombineret for at producere tilstrækkelig udbytte af en meget ren prøve. Desuden redegøre vi for fremgangsmåden for karakterisering af mikroglia.
Abstract
Mikroglia, de bosiddende immune celler i hjernen, er de første respondere betændelse eller skader i centralnervesystemet. Nyere forskning har afsløret mikroglia at være dynamisk, i stand til at påtage sig såvel pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske fænotyper. Både (pro-inflammatoriske) M1 og M2 (pro-reparative) fænotyper spille en vigtig rolle i neuroinflammatory lidelser som perinatal hjerneskade, og udstiller forskellige funktioner som svar på visse miljømæssige stimuli. Graduering af microglial aktivering er blevet konstateret for at overdrage neuroprotection tyder således på mikroglia kan have terapeutiske potentiale i hjerneskade. Men mere forskning er nødvendig for bedre at forstå rollen af mikroglia i sygdom, og denne protokol letter der. Protokollen beskrevet nedenfor kombinerer en tæthed gradient centrifugering proces for at reducere celleaffald med magnetisk separation, producerer en meget ren prøve af primær microglial celler, der kan uden anvendes til in vitro forsøg, de behov for 2-3 uger dyrkning. Derudover udbytte karakterisering trin robuste funktionelle data om mikroglia, medvirken undersøgelser at bedre vores forståelse af polariseringen og priming af disse celler, som har stærke konsekvenser i feltet af regenerativ medicin.
Introduction
Skader erhvervet i den perinatale periode fra betændelse, hypoksiske blandt og blødning kan have en bred vifte af langsigtede sequelae. Den komplekse Patofysiologi af perinatal hjerneskade er teoretiseret for at inddrage betændelse og iskæmi med efterfølgende neuronal og cytoskeletale død1. Det medfødte immunforsvar spiller en vigtig rolle i kaskade af begivenheder, der førte til skade2.
Mikroglia, bosiddende immunceller inden for det centrale nervesystem (CNS), er de første respondere til skade3. Mikroglia er plast celletyper med kapacitet til at være både beskyttende eller giftige, afhængig af miljø4. De er involveret i chemotaxis, fagocytose, antigen præsentation og produktion af cytokiner og reaktive ilt arter4,5. Senescent mikroglia konstant undersøgelsen miljøet og er aktiveret ved tilstedeværelsen af en udenlandsk eller skadeligt stof4. Aktivering fører til et pro-inflammatoriske respons, kritisk i CNS beskyttelse4. Disse M1 "pro-inflammatoriske" fænotype mikroglia er primært involveret i antigen præsentation og død af patogener4. Trods den afgørende rolle i den inflammatoriske reaktion i neuroprotection, kan ukontrolleret eller langvarig betændelse være skadelige og medføre neuronal skade4. Men når de udsættes for visse miljømæssige stimuli, mikroglia kan udstille en anti-inflammatorisk fænotype. Disse pro-reparative M2 mikroglia har en kritisk rolle i sårheling og reparere6, frigive en vifte af cytokiner og andre opløselige mæglere at nedregulere betændelse, øge fagocytose og fremmer reparation4, 7. mikroglia roller er mangfoldige og omfatter drivende oligodendrocyte differentiering under re-myelination8, beskytte neuroner under ilt og glucose iltsvind i slagtilfælde modeller9 og fremme neurite udvækst i rygmarvsskade modeller10.
Studiet af disse gliaceller repræsenterer et vigtigt aspekt i forståelse og manipulere svar på neuroinflammation. Den beskrevne protokol giver mulighed for yderligere undersøgelse den terapeutiske potentiale af mikroglia graduering i neuroinflammatory lidelser.
Graduering af microglial aktivisering hen imod en neuroprotektive rolle er blevet observeret i en række betingelser11,12,13. Således er forbedre nuværende forståelse og yderligere studerer graduering af microglial aktivering kritisk, der kræver brug af forskellige modeller herunder både in vitro og i vivo. In vitro undersøgelser udgør et vigtigt værktøj på grund af deres større effektivitet, lavere omkostninger og evne til at undersøge befolkningens isolerede celle.
Der er en række protokoller er beskrevet i litteraturen til isolering af mikroglia fra murine hjerner, udfordringen at effektivt producere en højtydende prøve med god levedygtighed og høj renhed. Almindeligt anvendte metoder til isolering af primære mikroglia er magnetisk separation og langvarig ryster af blandet glial kulturer. Gennem personlig erfaring konstateredes det, at der var en høj grad af celleaffald, som blokerede den magnetiske kolonne. Således blev følgende protokol udnyttet, der inkorporerer en indledende tæthed gradient centrifugering skridt efterfulgt af CD11b magnetisk separation. Protokollen beskrevet nedenfor er blevet optimeret til at producere en meget ren prøve i tilstrækkelig mængde. Det er en fordel på grund af sin høje renhed og den korte periode — man kan udføre assays inden 2 dage uden at kultur for 2-3 uger. Denne protokol kan potentielt være tilpasset til isolering af primære murine astrocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende procedurer er blevet godkendt af dyr etiske komité ved Monash University. Sund Ubehandlet nyfødte C57Bl6/J P3-6 mus blev brugt til at generere de repræsentative resultater.
1. Enzymatisk nedbrydning
Bemærk: Det er vigtigt at overveje sterilitet når isolering og dyrkning primærelementer. Samtidig med at miljøet er så sterilt som muligt, kan indledende dissektion og høst af murine hjerner fuldføres uden for en laminal flow hætte, med alle efterfølgende trin udføres inden for en laminar flow hætte.
- Brug sterile instrumenter, aflive mus af cervikal dislokation, Hug hovedet af dyret og skyl med 100% ethanol. Brug små steril saks, lave små indsnit langs højre og venstre side af hovedet. I denne alder peels hud væk nemt. Ved hjælp af spidsen af en buet pincet, blidt skub væv mod talerstol at eksponere kraniet, herunder Bregma.
- Indsæt spidsen af saksen i åbningen af rygmarvskanalen og lave et tværgående snit til øregangen. Gøre et snit langs den sagittal sutur til Bregma, forsigtigt peger spidsen af saksen opad for at forhindre skader på hjernen. Indsæt spidsen af saksen på Bregma og laver lateral indsnit til højre og venstre side af hovedet langs den koronale sutur.
- Bruge pincet, skræl forsigtigt væk kraniet for at udsætte hjernen. For at gøre det, tag fat i kanten af kraniet udsættes af den laterale indsnit og forsigtigt trække kraniet til side. Kraniet bør skræl væk nemt. Bruger buet pincet, forsigtigt scoop under hjernen til at fjerne den.
- Læg hjernen i 5 mL steril beholder, vaske 2 - 3 gange med iskold vask medier (lav glucose Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM) suppleret med 1% penicillin-streptomycin), ca 5 mL media pr. vask, at fjerne blod.
- I en laminar airflow hætte, opstille den indhold af 5 mL beholder i en lille petriskål (35 mm), hviler på is. Med en steril skalpel blade eller steril saks, fjerne lillehjernen og olfaktoriske pære. Gøre en midterlinjen, skåret til at adskille de to hjernehalvdele.
- Omhyggeligt skræl væk det meningeal lag med fine pincet, pas på ikke for at beskadige cortex. Identificere de meningeal lag som et meget tyndt lag af celler med et rødt skær på overfladen af hjernen, med synlige blodkar. At holde hjernen koldt er afgørende for korrekt meninges fjernelse. Hvis laget meningeal bryder, fortsætte peeling væk de revet fragmenter, indtil det er helt fjernet.
- Overføre hjernehalvdele til en ny lille petriskål (på is) og fyld med vask medier. Hak hjernen i små stykker med en steril skalpel blade/saks.
Bemærk: Disse bør være ~ 1 mm2 i størrelse og pleje bør tages ikke til at skære dem i alt for små stykker, som dette kan reducere udbyttet. - Tilsæt 100 µL papain (17 U/mg materiel) og 150 µL DNase jeg i medierne og Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C
- Efter fordøjelse, hakkede væv ved hjælp af en P1000 pipette. Hvis væv stykker er for stor til at indtaste pipetten, kan du overveje at bruge et par eller steril saks til at udvide pipette spidsen. Under denne proces, passe på ikke for at indføre bobler i medierne, da dette kan nedsætte cellers levedygtighed.
2. myelin vragrester fjernelse
- Under en laminar flow hood bruge sterilt udstyr, forberede en 50 mL konisk slange med en 100 µm celle si, for hver hjerne. Hæld indholdet i petriskålen, der indeholder digest medium og hjernen stykker på en si. Skubbe gennem stykker af hjernen ved hjælp af stemplet en steril 3 mL sprøjte i en slibning bevægelse, indtil der ses ingen mere væv. Efter fordøjelse, hjernevæv skal falde fra hinanden let.
- Løbende vask filteret med medierne vask af topping op celle sien i hele denne proces. Dette vil vaske gennem eventuelle celler, der er fanget i sien.
Bemærk: Dette bør ske, indtil der er ca ~ 15 mL i røret. Dette er at sikre, at sien er tilstrækkeligt vasket gennem og maksimere mængden af celler, der opsamlet. -
Centrifugeres enkelt cellesuspension ved 500 x g i 5 min. ved 4 ° C. I løbet af denne tid, forberede tæthed gradient medium som beskrevet.
- Forberede den bestand isotonisk percoll (SIP), som er tæthed gradient mediet bruges. Gøre dette ved at tilføje 9:1 forholdet mellem tæthed gradient medium 10 x sterile Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS).
- Forberede forløb som 30% SIP i DMEM og 70% SIP i 1 x HBSS. For eksempel, at forberede 10 mL 30% SIP, tilsættes 3 mL SIP til 7 mL DMEM.
- Opsug supernatanten fra koniske rør og resuspend celle pellet med 8 mL 30% SIP i DMEM. Overføre den fulde volumen til en frisk 15 mL konisk slange.
- Underlag 70% SIP løsning. For at gøre det, skal du udfylde en overførsel pipette med 70% SIP og forsigtigt skubbe gennem overførsel pipette til bunden af den koniske rør. Når spidsen er tæt på bunden, skub forsigtigt gennem indholdet af overførsel pipette.
Bemærk: Gør dette langsomt for ikke at forstyrre den 30/70 grænseflade. Der skal være en klar linje mellem de to lag. - Der centrifugeres SIP lag, herunder celler på 650 x g med bremse 0 og acceleration 4, i 25 min. ved stuetemperatur.
Bemærk: Det er vigtigt at fuldføre spin med bremse ned og at tillade centrifuge til langsomt gå i stå, da anvendelsen af bremse vil forstyrre interphase og dramatisk reducere celle samling mellem SIP lag. - Opsug celleaffald øverst i røret, og fjerne ca 4 mL medier fra toppen. Dette vil lette fjernelsen af mononukleære celler i de følgende trin. Bruger en P1000 pipette, Sænk forsigtigt pipette spidsen mod interfasen. Isolere mononukleære celler fra 30/70 tæthed gradient medium interface. Indsamle ca 3 mL fra overskyet interface og overførsel til en ny 15 mL konisk slange. Efter dette, fortyndes blandingen med 9 mL HBSS til at støtte fjernelsen af tæthed gradient medium.
- Centrifugeres fortyndet tæthed gradient medium interfase, indeholdende de mononukleære celler ved 500 x g i 5 min. Aspirér supernatanten og resuspend med 1 mL vækstmediet (DMEM suppleret med 10% føtal bovin serum og 1% antibiotika). Efter dette, bejdse de resuspenderede celler med trypan blå og udføre en celletal, ved hjælp af en hæmocytometer.
3. magnetisk aktiveret celle sortering
Bemærk: Disse trin er ændret fra producenternes protokol.
- Der centrifugeres de indsamlede mononukleære celler ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C for at fjerne vækstmediet, da det vil forstyrre den magnetiske isolation. Ved hjælp af den samme celletal fremstillet af trin 2.8 resuspend på 1 x 108 nukleeret celler/mL i PBS (Ca++ og Mg++ gratis) der indeholder 2% FBS og 1 mM EDTA, inden for et volumen 0,1-2,5 mL.
- Tilføje den fuld volumen af nukleeret celler i PBS fra forrige trin til en frisk 5 mL (12 x 75 mm) polystyren rund bund tube. Tilføje 50 µL CD11b PE mærkning reagens per 1 mL af prøven. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min. beskyttet mod lys.
- Tilføje 70 µL af udvalg cocktail (en kombination af monoklonale antistoffer mod CD11b i PBS) per 1 mL af prøven. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min. beskyttet mod lys.
- Bland magnetiske partikler af pipettering op og ned mere end 5 gange. Tilsættes 50 µL/mL til prøven. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min. beskyttet mod lys.
Bemærk: Disse partikler derefter danne en tetramert kompleks med antistoffer og vil blive knyttet til den magnetiske kolonne. - Hvis den samlede mængde af celle blanding er mindre end 2,5 mL, top op til denne diskenhed med PBS (Ca++ og Mg++ gratis) der indeholder 2% FBS og 1 mM EDTA, og bland forsigtigt når der afpipetteres 2 - 3 gange. Placer røret (uden låg) i magneten og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- I en kontinuerlig bevægelse, inverter fuldt magnet der indeholder rør til 2-3 s, hælde ud supernatanten. Returnere magneten til en oprejst position, og fjerne røret fra magneten. Forbered dig på at udviske de resterende celler i kolonnen.
Bemærk: Supernatanten indeholder umærkede og uønskede celler, som er fjernet ved at vende røret mens stadig i magneten. Røret indeholder den vedlagte Cd11b+ celler. - Cellerne vaskes ved at gentage trin 3.5 og 3.6 to gange mere. Hvis prøven er større end 1 mL, anbefales en yderligere Gentag trin 3.5 og 3.6.
- Resuspend celler i en ønskede vækstmediet. Skyl side indsamlingen fartøjets samt (fx. en 15 mL tube) at indsamle celler fra siderne af røret og maksimere udbyttet.
4. kontrol af mikroglia renhed
Bemærk: Den primære mikroglia isoleret fra 3 L (n = 5 dyr samlede) blev kontrolleret via fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS) for at bestemme renhed for de repræsentative resultater.
- Kultur celler i en T-25 kolben i vækstmediet indeholdende 10% FBS natten, såning med en tæthed på 1-2 x 106 celler pr. flaske.
- Vaske cellerne i T-25 kolber med PBS 3 x i 5 min. til at fjerne enhver resterende vækst medier, som kan interferere med trypsinization.
- Der tilsættes 2 mL 0,25% trypsin Adskil celler fra kolberne. Sikre, at mængden af trypsin er tilstrækkelig til at dække hele overfladen af kolben. Efter blid hvirvlende kolbens at sikre ensartet dækning af trypsin, inkuberes i 5 min. ved 37 ° C.
- Slukke trypsinization processen ved tilsætning af 2 mL af vækst medier indeholdende 10% FBS i kolben.
- Indsamle supernatanten indeholdende trypsinized celler og centrifugeres 500 g ved x i 5 min. ved 4 ° C for at samle celler.
- Fjern supernatanten indeholdende vækstmediet og trypsin og resuspenderes i 500 μL FACS buffer. Udføre celletal benytter trypan blå.
- Der centrifugeres 500 g ved x i 5 min. ved 4 ° C. Udføre Fc receptor blok ved at tilføje 50 μL FACS buffer + 1 μL FcR blocker pr. 5 x 106 celler. Inkuber i 15 min. ved 4 ° C.
Bemærk: Fc receptor blok er et kritisk skridt i proceduren farvning at forhindre ikke-specifik binding af immunoglobuliner til Fc receptorer i immun cellepopulationer. Denne blokade påvirker ikke downstream binding af andre antistoffer. - Opsige den blokerende proces ved fortynding med 500 μL FACS buffer. Herefter centrifugeres blandingen indeholder celler ved 500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Resuspend i frisk 500 μL FACS buffer.
- Placere fleste celler (f.eks. hvis resuspending celler i 500 μL FACS buffer, brug 400 μL) i et prøveglas. Distribuere de resterende celler blandt kontrol rør og top op til 100 μl pr. kontrol tube (f.eks. for 6 kontrol rør, lagt 16.67 μL i hver kontrol tube og top med 83.33 μL FACS buffer). Gøre grupper (kontrol rør med fed skrift) som Unstained, enkelt farves (CD45, CD11b), enkelt live/døde pletter, FMO'er og prøveglassene.
- Sammenpresse cellerne i alle rør ved centrifugering ved 500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Pletten celler i rør med 1 μl antistof pr. 100 μL FACS buffer pr. 5 x 106 celler. Inkuber i 20 min. ved 4 ° C.
Bemærk: Brug 50 μl antistof cocktail, hvis mindre end 2 x 106 celler anvendes. - Cellerne vaskes med 500 μL FACS buffer. Centrifugeres celler ved 500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Resuspend celler i 300 μL FACS buffer.
Bemærk: Bruge ~ 100 μl hvis celletal er mindre end 2 x 106. - Ved hjælp af flow flowcytometri analyse, kvantificere de celler, der CD45lav og positiv for CD11b farvning. Denne procentdel svarer til den isolerede primære mikroglia.
5. immunhistokemisk farvning af primære mikroglia
- Plade celler i en 96-brønd plade med en tæthed på 1 x 105 celler med vækstmediet, og der inkuberes natten over.
- Fjern supernatanten og vask 3 gange med PBS.
- Fix cellerne med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS for 15 min. Fjern PFA med P1000 pipette, så vask dem 3 gange med PBS + 0,1% Triton-X.
- Blokere for ikke-specifik binding med 3% bovint serumalbumin i 1 time ved stuetemperatur.
- Der inkuberes med kanin Iba-1 (1: 100) i 24 timer ved 4 ° C. Efter dette, fjerne den primære antistof blanding og vask 3 gange med PBS.
- Inkuber med sekundære anti-kanin normal god landbrugspraksis konjugat (1:200) i 1 time ved stuetemperatur. Efter dette, fjerne sekundær antistof blandingen og vask 3 gange med PBS.
- Montere dias med en fluorescerende montering medium og fange billeder ved hjælp af et mikroskop for fluorescerende.
6. kvantificering af mikroglia ved hjælp af pHrodo analyse
Bemærk: PHrodo analysen giver mulighed for identifikation af niveauer af fagocytose i kulturperler celler. Ved optagelse via endocytose øger internalisering i den mere sure miljø niveauer af fluorescens af bioparticle konjugater. Fluorescens niveauer kan derefter kvantificeres ved FACS. Følgende trin er ændret fra producenternes protokol.
- Kultur celler i en T-25 kolben i vækstmediet natten, såning med en tæthed på 1-2 x 106 celler pr. flaske. Vaske cellerne i T-25 kolber med PBS 3 gange i 5 min.
- Frigør de celler ved hjælp af 2 mL 0,25% trypsin. Inkuber i 5 min. ved 37 ° C.
- Slukke trypsinisation processen ved tilsætning af 2 mL af vækst medier indeholdende 10% FBS i kolben.
- Der centrifugeres cellesuspension ved 500 x g i 5 min. ved 4 ° C at sammenpresse cellerne.
- Fjern supernatanten og resuspenderes indeholdende den primære mikroglia dyrkningsmedium med 106 celler/mL.
Bemærk: Alternativt plade celler i en 96-brønd plade mindst en dag før og sigter til 1 x 105 levedygtige celler pr. brønd på den dag, analysen er der skal udføres. - Plade celler i 96-brønd plade på 1 x 105 celler/brønd, 100 μl pr. brønd. Plade kontrol og eksperimentelle brønde i tre eksemplarer, og efterlade en tom godt pr. positiv kontrol for en no-celle kontrol baggrund subtraktion.
- Tilsæt 100 μL af vækst medier brønde venstre tomme for no-cellebaggrund subtraktion.
Bemærk: Som alle andre i vitro assay, passende kontrol er afgørende for nøjagtigheden af udlæsninger. Sammen med no-celle kontrol (baggrund læsning), omfatter også den negative kontrol godt (pHrodo konjugat tilføjet, men lagt på is). - Dække nummerpladen og Inkuber i 1 time i en inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C.
- Forbered eksperimentelle brønde ved at tilføje stimulerende og behandling. Tilføje køretøjets forskellige betjeningsapparater (vækst medier kun) til ubehandlet brønde.
Bemærk: LPS 1 µg/mL [stimulerende] og menneskelige dyr epitelcelle (hvis)-konditioneret medier [behandling] blev brugt til at generere de repræsentative resultater. - Optø et hætteglas af konjugeret farvestof, tilsættes 2 mL optagelse buffer og kortvarigt vortex. Overføre tube indholdet til en ren glasrør og Rens med ultralyd i 5 min, for at sikre, at partikler er jævnt spredt.
- Opsug næringssubstratet fra mikrotiterplade brønde og hurtigt udskifte med 100 μL af farvestof suspension. Dække og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
Bemærk: Husk at plette kontrol-rør. - Brug flow flowcytometri analyse, kvantificere celler farvning positive for konjugeret pHrodo perler og præsentere som en procentdel (af forælder) af aktivt phagocytosing mikroglia.
7. kvantificering af mikroglia apoptose efter inflammatoriske fornærmelse
- Gentag trin 1-7 fra "Verifikation af mikroglia renhed" sektion.
- Placere fleste celler (f.eks. hvis du genopslemmes celler i 500 μL FACS buffer, brug 400 μL) i et prøveglas. Distribuere de resterende celler blandt kontrol rør og top op til 100 μl pr. kontrol tube (f.eks. til 6 kontrol rør, sætte 16.67 μL i hver kontrol tube og top med 83.33 μL FACS buffer). Grupper (kontrol rør i fed): Unstained, enkelt pletter (AnnexinV, Propidium Iodid), single lever/døde pletter, FMO'er, prøveglassene.
- Sammenpresse cellerne i alle rør ved centrifugering ved 500 x g i 5 min.
- Der inkuberes med 1 μl antistof/100 μL FACS buffer/5 x 106 celler i 20 min. ved 4 ° C.
Bemærk: Brug 50 μL, hvis mindre end 2 x 106 celler. - Cellerne vaskes ved at tilføje 500 μL FACS buffer, og der centrifugeres 500 g ved x i 5 min.
- Resuspenderes celle i 300 μL FACS buffer.
Bemærk: ~ 100 μL hvis celletal er mindre end 2 x 106. - Kvantificere celler inden for hver kvadrant (Q1: nekrotisk, Q2: sent apoptotiske, Q3: levedygtige, Q4: tidlig apoptotiske).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af de metoder, der er skitseret her, rene bestande af mikroglia kan isoleres og kan være klar til karakterisering ved hjælp af in vitro- og FACS analyse. Til at begynde med kan op til 18 dyr bruges per udsættersøer, med en forventet afkast på ca 450,000-600.000 microglial celler. Det er afgørende at først bekræfte renhed af de isolerede celler, og for at gøre så FACS analyse blev udført af farvning for de to markører CD45 og CD11b. identifikation af mikroglia kan bevise generende, som mange markører udtrykt af mikroglia er også udtrykt ved makrofager og brugen af disse to markører tillader nøjagtig og pålidelig kvantificering. Specifikt, mikroglia har en lav udtryk for CD45, sammenlignet med den høje udtryk set i CNS og perifere makrofager, og er også positiv for CD11b (figur 1). Fra denne særlige isolation, blev en renhed på 89,3% rapporteret. Efter farvning for CD11b, vi bemærke, at vores primære mikroglia del tilsvarende morfologiske træk, med en vifte af morfologier fra udpræget unramified (store kugleformede cellen kroppen med lidt eller ingen udvidede processer) til de mere forgrenet (med mindre, mere ovale somata og typisk op til sekundære ordre processer) korrelerede til en række aktivering stater, som forventet at se i vivo (figur 2).
Efter dette, blev der kørt to karakterisering assays til mikroglia funktion og overlevelse. Mikroglia er den store fagocyterende celler i CNS, og pHrodo analyse giver mulighed for kvantificering af denne særlige funktionelle egenskab. En i nærheden af 3-fold stigning i fagocyterende funktion efter 24-h Co kultur med hvis aircondition medium (figur 3) blev bemærket, målt ved kvantificeringen af fluorescerende pHrodo partikler. Endelig, en AnnexinV-PI farvning følgende fælles kultur blev udført for at identificere overlevelse af mikroglia efter en inflammatorisk fornærmelse. En reduktion i mikroglia apoptose efter behandling med konditioneret medium (figur 4) blev observeret. Disse resultater tyder på, at hvis aircondition medium beskytter mikroglia og forbedrer deres Fagocytisk aktivitet, som kan have terapi i perinatal hjerne skade og neuroinflammatory lidelser.
Figur 1 : Udtryk for CD45 og CD11b af mikroglia. Hver prik repræsenterer en mærket celle og FACS analyse giver mulighed for belysning af separate cellepopulationer. Mikroglia har en lavere udtryk for CD45 antigen i forhold til perifere monocyt-afledte makrofager og er positive for CD11b. tallene nedenfor antistof etiket Angiver andelen af gated celler udtrykt som procentdel af befolkningen, forælder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Morfologi af isolerede primære mikroglia. Som det kan ses i denne figur, mikroglia bevarer deres sfæriske cellen kroppen og tydelig forgrenet struktur. Skalalinjen = 20 µm.
Figur 3 : Kvantificering af fagocyterende funktion i isolerede primære mikroglia. pHrodo-mærket partikler kun fluorescerer i sure miljøer, såsom i cellulære endosomes efter fagocytose. Her, er en stigning i pHrodo partikel optagelse i mikroglia behandlet med hvis aircondition medium observeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Analyse af mikroglia overlevelse efter inflammatoriske fornærmelse. (A) repræsentative FACS parceller af isolerede mikroglia. Den kombinerede farvning af AnnexinV og propidium Iodid tillader kategorisering i enten apoptotiske, nekrotisk, eller levende celler efter stimulation med LP'ER. (B) Hvis aircondition medium betydeligt reduceret mikroglia apoptose i forhold til kontrol, hvilket tyder på en form for beskyttelse på denne celletype. * betegner p < 0,05, student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Vask medium |
| Lav Glucose Dulbecco ændrede Eagle Medium |
| 1% v/v penicillin-streptomycin |
| Fordøje medium (pr. hjerne) |
| 150 µL DNase jeg |
| 100 µL papain (17U/mg stock) |
| 3 ml vask medium |
| Vækstmediet |
| Lav Glucose Dulbecco ændrede Eagle Medium |
| 10% føtale bovint serum |
| 1% v/v penicillin-streptomycin |
Tabel 1: Oversigt over løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroglia har evnen til at være både pro- og anti-inflammatoriske, ændret af miljø stimuli. Tidligere undersøgelser har vist, graduering af mikroglia aktivering kan overdrage neuroprotection. Deres evne til at yde beskyttelse til neuroner og reparere skade kræver mere forskning for at fremme den aktuelle forståelse for disse komplekse celler. Isolering af høj renhed primære mikroglia er således en vigtig og nyttig teknik. Dette er en forholdsvis hurtig metode til at opnå meget ren primære mikroglia klar til in vitro- eksperimenter inden for 2 dage.
Der er en række protokoller er beskrevet i litteraturen til isolering af primære mikroglia fra murine hjerner. Den vigtigste udfordring er at effektivt producere tilstrækkelig prøve, højt levedygtighed og renhed. Den største fordel ved denne protokol er udbyttet af en meget ren prøve uden behov for tid i kultur. Derfor, metoden er forkortet fra 2 uger til 2 dage, Dette muliggør hurtige resultater. Karakterisering trin udbytte robuste funktionelle data om mikroglia, forbedre nuværende forståelse for disse komplekse celler. Protokollen kombinerer to nuværende tilgange - tæthed gradient centrifugering og magnetisk separation. Magnetisk separation er blevet godt valideret i litteraturen for isolation af mikroglia i en forholdsvis blid måde i forhold til andre isolation teknikker14,15,16. Mens der er utvivlsomt ændringer til den isolerede primære mikroglia i forhold til deres hjemstat i vivofunktionelle kendetegn, eventuelle ændringer mikroglia egenskaber som observeret i assays udviklet ovenfor er beregnet ud fra en efter fordøjelsen grundlinjen, og som sådan er reflekterende af direkte graduering af denne immun undersæt.
Mens protokollen er relativt ligetil, vil pleje under kritiske trin bidrage til at sikre et godt udbytte. For det første, det er vigtigt at bruge lav glucose medier til at understøtte glial vækst. Derudover skal murine hjerner holdes is koldt på alle tidspunkter under isolationen. Det anbefales således, at pre chill alle medium samt instrumenter hvis det er muligt, og udføre proceduren på is. Vigtigere, langvarig isolation gange vil føre til dårligere celle sundhed og udbytte, det er derfor kritisk at arbejde hurtigt. Desuden, ordentlig fjernelse af meningeal laget er et afgørende skridt, når arbejder med voksne mus, ellers fibroblaster vil outcompete gliaceller med hensyn til vækst. Under den enzymatiske fordøjelsen af hjernen, det er vigtigt ikke at skære hjerner i alt for små stykker som dette kan øge celledød, ideelt sigte mod 1 mm2 stykker af væv. Når slibning vævet gennem sien celle grundigt skylles med medierne hver par minutter til at sikre, at alle celler er skyllet igennem og ikke bliver fanget i sien, desuden anbefales det at bruge en 100 μm celle si, mindre filtre resultere i en reduceret udbytte. En anden kritisk trin er underlaying af 70% tæthed gradient medium lag, udfører dette trin omhyggeligt og langsomt for at sikre en klar interfase ses er væsentlige, brugen af Pasteur pipette anbefales. Brug af 15 mL konisk rør anbefales også, da adskillelsen af celler var mindre effektiv når 50 mL konisk rør blev udnyttet. Endelig skal tæthed gradient centrifugering udføres ved stuetemperatur, da temperaturen kan påvirke tæthed farveforløb.
Denne protokol beskriver en pålidelig metode til at producere meget ren primære mikroglia celler, som det fremgår af både høj udtryk for CD45 og positivt udtryk for Cd11b (i forhold til lav CD45 udtryk set i perifere monocytter). Celler kan også isoleres relativt hurtigt, det har således anvendelsesområdet til betydeligt øget forståelse for disse glia celler. Det kan bruges til at identificere forskellige mikroglia befolkninger fra forskellige baggrunde, giver mulighed for undersøgelser, som kan afsløre forskelle mellem mikroglia isoleret fra syge/tilskadekomne og sunde dyr. Gennem isolation af en ren mikroglia befolkning, kan terapeutiske graduering af denne immun celle population vurderes. For eksempel blev det konstateret, at hvis airconditionerede medier øget fagocytose, samt forbedret mikroglia overlevelse under en inflammatorisk stimulus, således giver terapeutiske fordele17. Dette korreleret til reduceret apoptotiske debris og dermed antyder clearance af disse rester kan have neuroprotektive effekter.
Protokollen kan anvendes til både neonatal eller voksen mus, men ældre mus vil producere et reduceret udbytte. Derudover det kan tilpasses isolere primære astrocytter fra neonatal eller voksen mus, igen ældre mus vil resultere i en forringet udbytte. Derudover kan ændringen af det mekaniske dissociation skridt med en specialfremstillet nylon mesh med større pore størrelser i modsætning til 100 μm celle sien, yderligere forbedre celle udbytte18.
Begrænsninger af denne protokol omfatter det lavere udbytte og den nødvendige tid til denne protokol. Udbyttet er ca 150.000-200.000 celler pr. frasortering af seks dyr, versus de millioner, der kan opnås gennem uger af cellekultur. Derudover, mens celler kan fås i to dage, er procedure på den første dag ganske tidskrævende, idet cirka seks timer.
Denne metode er dog et yderst nyttigt værktøj oplysninger om betydningen af mikroglia i sygdom, i stand til at isolerer og karakteriserer cellerne inden to dage. Det producerer høj renhed primære mikroglia celler, lette præcis og effektiv forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
