Summary
Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.
Abstract
Microglia, de resident immune cellen in de hersenen, zijn de eerste responders aan ontsteking of een letsel in het centrale zenuwstelsel. Recent onderzoek heeft geopenbaard microglia als dynamische, staat van de veronderstelling dat zowel pro-inflammatoire en anti-inflammatoire fenotypen. Zowel M1 (pro-inflammatoire) en M2 (pro-herstellend) fenotypen spelen een belangrijke rol in neuroinflammatoire aandoeningen zoals perinatale hersenletsel en vertonen verschillende functies in reactie op bepaalde milieu stimuli. De modulering van de activering van het microglial is te verlenen neuroprotectie dus suggereren microglia wellicht therapeutisch potentieel in hersenletsel geconstateerd. Echter meer onderzoek nodig om de rol van microglia in de ziekte beter te begrijpen is, en dit protocol dat vergemakkelijkt. Het protocol beschreven hieronder combineert een dichtheid kleurovergang centrifugeren proces ter vermindering van de cellulaire puin, met magnetische scheiding, produceren een zeer zuiver voorbeeld van primaire microglial cellen die kunnen worden gebruikt voor in vitro experimenten, zonder de nodig voor 2-3 weken kweken. Bovendien, opbrengst de karakterisering stappen robuuste functionele gegevens over microglia, medeplichtigheid aan studies om beter ons begrip van de polarisatie en priming van deze cellen, die sterke implicaties op het gebied van regeneratieve geneeskunde heeft.
Introduction
Schade verworven in de perinatale periode van ontsteking, hypoxische-ischemie en bloedingen kan een matrix van lange termijn gevolgen hebben. De complexe pathofysiologie van perinatale hersenletsel is theorie ontsteking en ischemie met daaropvolgende neuronale en axonale dood1te betrekken. De aangeboren immuunrespons speelt een belangrijke rol in de opeenvolging van gebeurtenissen die leiden tot letsel2.
Microglia, de resident immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CNS), zijn de eerste responders aan schade3. Microglia zijn kunststof celtypes met het vermogen om zowel beschermende of giftig, afhankelijk van de milieu-4. Ze zijn betrokken bij chemotaxis, fagocytose, antigeen presentatie en productie van cytokines en reactieve zuurstof soorten4,5. Verouderend microglia voortdurend onderzoek van het milieu en worden geactiveerd door de aanwezigheid van een buitenlandse of schadelijke stof4. Activering leidt tot een pro-inflammatoire respons, kritische in CNS bescherming4. Deze M1 "pro-inflammatoire" fenotype microglia zijn vooral betrokken bij antigeen presentatie en dood van ziekteverwekkers4. Ondanks de cruciale rol van de inflammatoire respons in neuroprotectie kunnen ongecontroleerde of langdurige ontsteking schadelijke en leiden tot neuronale schade4. Echter wanneer blootgesteld aan bepaalde milieu stimuli, kan microglia vertonen een anti-inflammatoire fenotype. Deze pro-herstellend M2 microglia hebben een cruciale rol in de wondgenezing en het herstel van6, het vrijgeven van een reeks van cytokines en andere oplosbare bemiddelaars dat downregulate ontsteking, verhogen van fagocytose en bevorderen herstellen4, 7. de rol van microglia zijn divers en omvatten drijvende Oligodendrocyt differentiatie tijdens re-myelinisering8, bescherming van neuronen tijdens uitputting van zuurstof en glucose in lijn modellen9 en bevordering van neurite uitgroei in dwarslaesie modellen10.
De studie van deze gliale cellen vertegenwoordigt een belangrijk aspect in het begrip en het manipuleren van het antwoord op neuroinflammation. Het beschreven protocol voorziet in verdere onderzoek naar de therapeutische mogelijkheden van microglia modulatie in neuroinflammatoire aandoeningen.
De modulering van de activering van de microglial naar de rol van een neuroprotectieve geconstateerd in een aantal voorwaarden11,12,13. Dus, verbetering van de huidige kennis en verder studeren modulatie van de activering van het microglial is essentieel, waarbij het gebruik van diverse modellen, met inbegrip van zowel in vitro als in vivo. In vitro studies zijn een belangrijk instrument als gevolg van hun grotere efficiëntie, lagere kosten en de mogelijkheid te onderzoeken van een geïsoleerde-celpopulatie.
Er zijn een aantal protocollen die zijn beschreven in de literatuur voor de isolatie van microglia vanuit lymfkliertest brains, de uitdaging om een steekproef van hoge opbrengst efficiënt te produceren met goede levensvatbaarheid en hoge zuiverheid. Veelgebruikte methoden van isolatie van primaire microglia zijn door magnetische scheiding en langdurig schudden van gemengde gliale culturen. Door persoonlijke ervaring bleek dat er een hoge mate van cellulaire puin die belemmerd de magnetische kolom. Zo werd het volgende protocol gebruikt, waarin een oorspronkelijke dichtheid kleurovergang centrifugeren stap gevolgd door magnetische scheiding van CD11b. Het protocol die hieronder beschreven is geoptimaliseerd voor het produceren van zeer zuivere eenmonstervan in voldoende hoeveelheid. Het is gunstig als gevolg van de hoge zuiverheid en de korte periode — een testen binnen 2 dagen kunt uitvoeren zonder cultuur voor 2-3 weken. Dit protocol kan mogelijk worden aangepast voor de isolatie van primaire lymfkliertest astrocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De volgende procedures zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het dier aan de Monash Universiteit. Gezonde onbehandelde neonate C57Bl6/J P3-6 muizen werden gebruikt om de representatieve resultaten te genereren.
1. enzymatische spijsvertering
Opmerking: Het is belangrijk dat de steriliteit bij isoleren en kweken van primaire cellen. Waarbij dat het milieu zo steriel mogelijk is, kunnen de eerste dissectie en de oogst van lymfkliertest hersenen worden uitgevoerd buiten een laminaal stroom kap, met alle volgende stappen die worden uitgevoerd binnen een laminaire flow-kap.
- Met behulp van steriele instrumenten, de muis door cervicale dislocatie euthanaseren, onthoofden van het dier en spoel met 100% ethanol. Maak met kleine steriele schaar kleine incisies langs de linker- en zijkanten van het hoofd. Op deze leeftijd, de huid pelt weg gemakkelijk. Met behulp van de tips van de gebogen verlostang, schuif zachtjes het weefsel naar het rostrum tot aan het blootstellen van de schedel, inclusief de Bregma.
- Breng de tip van schaar in de opening van het spinale kanaal en maak een laterale incisie aan de gehoorgang. Een sneetje langs de Sagittaal hechtdraad aanbrengen op de Bregma, zachtjes wijzen de punt van de schaar naar boven om te voorkomen beschadiging van de hersenen. Breng de tip van schaar op Bregma en maak zijdelingse insnijdingen aan de linker- en zijkanten van het hoofd langs de coronale hechtdraad.
- Met behulp van Tang, schil zachtjes weg de schedel blootstellen van de hersenen. Om dit te doen, begrijpen de randen van de schedel blootgesteld door de laterale incisie en trek voorzichtig de schedel naar de kant. De schedel moet weg gemakkelijk schil. Met gebogen Tang, schep voorzichtig onder de hersenen te verwijderen.
- Plaats van de hersenen in een steriele container van 5 mL en was na 2 - 3 keer met ijskoude wassen media (lage glucose Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 1% penicilline-streptomycine), ongeveer 5 mL media per wasbeurt, voor het verwijderen van bloed.
- In een laminaire luchtstroming kap, plaatst u de inhoud van de 5 mL flacon in een kleine petrischaal (35 mm), rustend op ijs. Met een steriel scalpel blad of steriele schaar, verwijder het cerebellum en de bulbus olfactorius. Maak een middellijn gesneden te scheiden van de twee hemisferen.
- Zorgvuldig schil weg de meningeal laag met een fijne Tang, verzorgen niet tot schade van de cortices. Identificeer de meningeal laag als een zeer dunne laag van cellen met een rode tint op het oppervlak van de hersenen, met zichtbare bloedvaten. De hersenen koud houden is essentieel voor goede hersenvliezen verwijdering. Als de meningeal laag breekt, blijven peeling weg de gescheurde fragmenten totdat deze volledig wordt verwijderd.
- De hemisferen overbrengen in een nieuwe kleine petrischaal (op ijs) en vul met wassen media. Hak de hersenen in kleine stukjes met een steriel scalpel blad/schaar.
Opmerking: Deze moeten ~ 1 mm,2 in grootte en zorg moet worden genomen niet om hen in te kleine stukjes gesneden zoals dit rendement kan beperken. - Voeg 100 µL papaïne (17 U/mg stock) en 150 µL DNase ik in de media en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C
- Triturate na vertering, weefsel met behulp van een precisiepipet P1000. Als weefsel stukken te groot om in te voeren van de pipet zijn, kunt u een pair of steriele schaar om te verbreden het uiteinde van de pipet. Tijdens dit proces, wees voorzichtig niet te introduceren bubbels in de media zoals dit levensvatbaarheid van de cellen kan beperken.
2. myeline puin verwijderen
- Onder de motorkap van een laminaire flow gebruiken steriel injectiemateriaal, een conische buis van 50 mL te bereiden met een 100 µm cel zeef, voor elke hersenen. Giet de inhoud van de petrischaal, met de digest medium en hersenen stuks op een zeef. De stukken van hersenen erdoor met behulp van de zuiger van een steriele 3 mL spuit in een schuurmachine beweging, zolang er geen geen meer weefsel zichtbaar. Na de spijsvertering, het hersenweefsel moet uit elkaar vallen gemakkelijk.
- Continu was het filter met het wassen-media, door topping-up van de cel zeef gedurende het hele proces. Dit zal wassen via cellen opgesloten in de zeef.
Opmerking: Dit moet gebeuren totdat er ongeveer ~ 15 mL in de tube. Dit is om ervoor te zorgen dat de zeef voldoende wordt gewassen door en om de hoeveelheid cellen verzameld te maximaliseren. -
Centrifugeer de eencellige schorsing bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Gedurende deze tijd, door het verloop medium dichtheid te bereiden zoals beschreven.
- Bereid de voorraad isotone percoll (SIP), oftewel het dichtheid kleurovergang medium gebruikt. Hiervoor 9:1-verhouding van gradient medium dichtheid aan 10 x steriele Hanks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) toe te voegen.
- Bereiden van verlopen als 30% SIP in DMEM en 70% SIP in 1 x HBSS. Om bijvoorbeeld te bereiden 10 mL van 30% SIP, voeg 3 mL SIP tot 7 mL DMEM.
- De bovendrijvende vloeistof uit de conische buisjes en resuspendeer de pellet cel met 8 mL 30% SIP in DMEM gecombineerd. Het volledige volume overbrengen in een conische buis van vers 15 mL.
- Onderlaag de 70% SIP-oplossing. Om dit te doen, door een overdracht pipet met 70% SIP en zorgvuldig Duw via de overdracht pipet naar de onderkant van de conische buis te vullen. Zodra de tip dicht bij de bodem is, duw voorzichtig door de inhoud van de Pipet van de overdracht.
Opmerking: Dit langzaam doet dus niet te verstoren de 30/70-interface. Er moet een duidelijke lijn tussen de twee lagen. - Centrifugeer het SIP-lagen, met inbegrip van de cellen, bij 650 x g met rem 0 en versnelling 4, gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Het is essentieel te voltooien de spin met rem af en de centrifuge komen langzaam tot stilstand, zoals toepassing van rem zal de interfase verstoren en drastisch de collectie van de cel tussen de lagen van de SIP verminderen. - Gecombineerd het cellulaire puin aan de bovenkant van de buis en verwijderen van ongeveer 4 mL media vanaf de bovenkant. Dit zal het verlichten van de verwijdering van de mononucleaire cellen in de volgende stap. Het uiteinde van de pipet naar de interfase met behulp van een pipet P1000, zorgvuldig worden lager. Isoleren van de mononucleaire cellen uit de 30/70 dichtheid kleurovergang middellange-interface. Verzamelen ongeveer 3 mL van de bewolkt interface en overdracht aan een nieuwe conische tube van 15 mL. Verdun het mengsel met 9 mL HBSS om te helpen verwijderen van de dichtheid kleurovergang medium daarop.
- Centrifugeer de kleurovergang middellange interfase verdunde dichtheid, met de mononucleaire cellen bij 500 x g gedurende 5 min. gecombineerd supernatant en resuspendeer met 1 mL groeimedium (DMEM aangevuld met 10% foetale boviene serum en 1% antibiotica). Daarop de geresuspendeerde cellen met trypan blauwe vlek en het uitvoeren van een telling van de cel met behulp van een haemocytometer.
3. magnetische geactiveerde cel sorteren
Opmerking: Deze stappen zijn gewijzigd van fabrikanten protocol.
- Centrifugeer de verzamelde mononucleaire cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het verwijderen van het groeimedium als dit met de magnetische isolatie interfereren zal. Met behulp van de dezelfde cel telling verkregen stap 2.8, resuspendeer op 1 x 108 cellen/mL in PBS (++ Ca en Mg++ gratis) nucleated met 2% FBS en 1 mM EDTA, binnen een volume variëren van 0,1 tot 2,5 mL.
- Het volledige volume van genucleëerde cellen in PBS toevoegen uit de vorige stap aan een vers 5 mL (12 x 75 mm) polystyreen ronde onderkant-buis. Voeg 50 µL CD11b PE etikettering reagens per 1 mL van het monster. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten beschermd tegen licht.
- Voeg 70 µL van selectie cocktail (een combinatie van monoklonale antilichamen tegen CD11b in PBS) per 1 mL van het monster. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten beschermd tegen licht.
- Meng magnetische deeltjes op en neer waarbij eveneens meer dan 5 keer. Voeg 50 µL/mL aan het monster. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten beschermd tegen licht.
Opmerking: Deze deeltjes vervolgens vormen een tetramere complex met de antilichamen en zal krijgen gehecht aan de magnetische kolom. - Als het totale volume van cel mengsel minder dan 2,5 mL is, boven tot dit volume met PBS (++ Ca en Mg++ gratis) bevattende 2% FBS en 1 mM EDTA, en meng door zachtjes pipetteren 2 - 3 keer. Plaats de buis (zonder deksel) in de magneet en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- In een continue beweging, volledig omkeren de magneet met de buis voor de 2-3 s, uit het supernatant gieten. De magneet terug naar rechtop en verwijder de buis van de magneet. Voorbereidingen treffen voor het wassen de resterende cellen in de kolom.
Opmerking: Het supernatant bevat en ongewenste cellen, die zijn verwijderd door het omkeren van de buis terwijl nog steeds in de magneet. De buis bevat de bijgevoegde Cd11b+ cellen. - Het wassen van de cellen door stappen 3.5 en 3.6 tweemaal meer te herhalen. Als het monster groter dan 1 mL is, wordt een verder Herhaal stappen 3.5 en 3.6 aanbevolen.
- Resuspendeer de cellen in een gewenste groeimedium. Spoelen van de kant van de collectie vaartuig ook (bv. een tube van 15 mL) voor het verzamelen van cellen uit de zijkanten van de buis en maximaliseren van de opbrengst.
4. verificatie van Microglia zuiverheid
Opmerking: De primaire microglia geïsoleerd van 3 L (n = 5 dieren totale) werden geverifieerd via fluorescerende geactiveerde cell sorting (FACS) als u wilt vaststellen van zuiverheidseisen voor de representatieve resultaten.
- De cellen van de cultuur in een maatkolf van de T-25 in het groeimedium bevattende 10 gewichtspercenten FBS's nachts, zaaien bij een dichtheid van 1-2 x 106 cellen per kolf.
- Wassen van de cellen in de T-25 kolven met PBS 3 x voor 5 min om eventuele resterende groei media die met de trypsinebehandeling interfereren kunnen te verwijderen.
- Voeg toe 2 mL trypsine van 0,25% los van de cellen van de kolven. Zorg ervoor dat het volume van de trypsine voldoende is voor het gehele oppervlak van de kolf. Na de zachte zwenken van de kolf om uniforme dekking van trypsine, Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Doven van het trypsinebehandeling-proces door toevoeging van 2 mL van groei media bevattende 10 gewichtspercenten FBS in de kolf.
- Het verzamelen van het supernatans dat met de trypsinized cellen en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C voor het verzamelen van cellen.
- Verwijder het supernatant met het groeimedium en trypsine en resuspendeer de pellet in 500 μL FACS buffer. Het uitvoeren van de telling van de cel met behulp van de trypan blauw.
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Fc receptor blok uitvoeren door toevoeging van 50 μl FACS buffer + 1 μL FcR blocker per 5 x 106 cellen. Incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C.
Opmerking: Het Fc receptor blok is een cruciale stap in de kleuring procedure om te voorkomen dat niet-specifieke binding van immunoglobulinen aan Fc receptoren in immuun cel populaties. Deze blokkade heeft geen invloed op downstream binding van andere antistoffen. - De blokkerende proces beëindigen door verder verdunnen met 500 μL FACS buffer. Centrifugeer daarop het mengsel met de cellen die bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer in verse 500 μL FACS buffer.
- De meerderheid van de cellen (bijvoorbeeld als de cellen in 500 μL van FACS buffer, gebruik 400 μL resuspending) in een monsterbuisje plaatsen. Distribueren van de resterende cellen onder de controle buizen en bovenaan maximaal 100 μl per besturingselement buis (bijvoorbeeld voor 6 buizen van de controle, opgemaakt 16.67 μL in elk besturingselement buis en top met 83.33 μL FACS buffer). Maak de groepen (controle buizen vetgedrukt) als Unstained, gekleurd (CD45, CD11b), één leven/dode vlek, FMO, en enkele monster buizen.
- De cellen in alle buizen pellet door centrifugatie bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Vlek van de cellen in de buis met 1 μL antilichaam per 100 μl FACS buffer per 5 x 106 cellen. Incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C.
Opmerking: Gebruik 50 μl antilichaam cocktail als minder dan 2 x 106 cellen worden gebruikt. - Wassen van de cellen met 500 μL FACS buffer. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de cellen in 300 μL FACS buffer.
Opmerking: Gebruik ~ 100 µl als cellen minder dan 2 x 106 is. - Met behulp van stroom cytometry analyse, kwantificeren de cellen die CD45laag en positief voor CD11b vlekken zijn. Dit percentage komt overeen met de geïsoleerde primaire microglia.
5. immunohistochemische kleuring van primaire Microglia
- Plaat van de cellen in een 96-wells-plaat duikt met een dichtheid van 1 x 105 cellen met het groeimedium, en na een nacht bebroeden.
- Verwijder het supernatant en 3 keer wassen met PBS.
- Herstellen van de cellen met de 4% paraformaldehyde in PBS voor 15 min. verwijderen de PFA met een pipet P1000, dan was ze 3 keer met PBS + 0,1% Triton-X.
- Blok voor de niet-specifieke binding met 3% bovien serumalbumine gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer met konijn Iba-1 (1:100) gedurende 24 uur bij 4 ° C. Na dit, verwijder het primaire antilichaam mengsel en 3 keer wassen met PBS.
- Incubeer met secundaire anti-konijn GFP geconjugeerde (1:200) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na dit, verwijder het secundair antilichaam mengsel en 3 keer wassen met PBS.
- Mount dia's met een fluorescerende medium en capture afbeeldingen met behulp van een fluorescente microscoop koppelen.
6. kwantificering van Microglia met behulp van de pHrodo Assay
Opmerking: De pHrodo-bepaling maakt het mogelijk voor de identificatie van de niveaus van fagocytose in gekweekte cellen. Bij opname via endocytose verhoogt de internalisering in het zuurder milieu niveaus van fluorescentie van de geconjugeerde bioparticle. Fluorescentie niveaus kunnen vervolgens worden gekwantificeerd door FACS. De volgende stappen worden gewijzigd uit fabrikanten protocol.
- Cultuur de cellen in een maatkolf van de T-25 in het groeimedium 's nachts, zaaien bij een dichtheid van 1-2 x 106 cellen per kolf. De cellen in T-25 kolven met PBS 3 keer gedurende 5 minuten wassen.
- Loskoppelen van de cellen met behulp van 2 mL 0,25% trypsine. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Doven van het trypsinisation-proces door toevoeging van 2 mL van groei media bevattende 10 gewichtspercenten FBS in de kolf.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot pellet cellen.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met de primaire microglia in een kweekvloeistof bij 106 cellen/mL.
Opmerking: U kunt ook, plaat cellen in een 96-wells-plaat ten minste een dag voor en streven naar 1 x 105 levensvatbare cellen per putje op de dag dat de test wordt uitgevoerd. - De cellen van de plaat in 96-wells-plaat bij 1 x 105 cellen/well, 100 μl per putje. Plaat van besturingselementen en experimentele wells in drievoud, en laat een lege goed per positieve controle voor een neen-cel controle achtergrond aftrekken.
- Breng 100 μl van de media van de groei in de putjes voor neen-celachtergrond aftrekken opengelaten.
Opmerking: Net als elke andere in vitro assay, passende controles zijn van vitaal belang voor de juistheid van de uitlezingen. Naast de neen-cel controle (achtergrond lezen), omvatten ook de negatieve controle goed (pHrodo geconjugeerde toegevoegd, maar geplaatst op ijs). - De afdekplaat en incubeer gedurende 1 uur in een broedmachine met 5% CO2 bij 37 ° C.
- Bereiden experimentele putten door toevoeging van stimulerende middelen en behandeling. Voertuig besturingselementen (alleen groei media) toevoegen aan onbehandelde putjes.
Opmerking: Lipopolysaccharide 1 µg/mL [genotmiddel] en menselijke amnion epitheliale cellen (hAEC)-geconditioneerde media [behandeling] werden gebruikt om de representatieve resultaten te genereren. - Een flesje van geconjugeerd kleurstof ontdooien, voeg 2 mL opname buffer en kort vortex. Breng de inhoud van de buis in een schone glazen buis en bewerk ultrasone trillingen ten voor 5 min, om ervoor te zorgen dat de deeltjes gelijkmatig zijn verspreid.
- Gecombineerd het kweekmedium microplate putjes en snel vervangen door 100 μl van kleurstof schorsing. Cover en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
Nota: Herinner me om de controle buizen alsmede vlek. - Met behulp van stroom cytometry analyse, kwantificeren cellen kleuring positief voor de geconjugeerd pHrodo kralen en presenteren als een percentage (van ouder) van actief phagocytosing microglia.
7. kwantificering van Microglia Apoptosis na inflammatoire belediging
- Herhaal de stappen 1-7 van de sectie van de "Verificatie van microglia zuiverheid".
- De meerderheid van de cellen (bijvoorbeeld als u de cellen in 500 μL van FACS buffer, gebruik 400 μL resuspended) in een monsterbuisje plaatsen. Distribueren van de resterende cellen onder de controle buizen en bovenaan maximaal 100 μl per besturingselement buis (bijvoorbeeld voor 6 controle buizen, opgemaakt 16.67 μl in elk controle buis en top met 83.33 μL FACS buffer). Groepen (controle buizen in vet): onbevlekt, enkele vlekken (AnnexinV, Propidium jodide), single live/dode vlek, FMO, monster buizen.
- Pellet cellen in alle de buizen door centrifugatie bij 500 x g gedurende 5 min.
- Incubeer met 1 μL antilichaam/100 μl FACS buffer/5 x 106 cellen gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
Opmerking: Gebruik 50 μl als minder dan 2 x 106 cellen. - Het wassen van de cellen door toevoeging van 500 μL FACS buffer en centrifuge bij 500 x g gedurende 5 min.
- Resuspendeer de pellet cel in 300 μL FACS buffer.
Opmerking: ~ 100 μl als cellen is minder dan 2 x 106. - Kwantificeren van de cellen binnen elk kwadrant (Q1: necrotische, Q2: laat apoptotic, Q3: levensvatbaar, Q4: vroege apoptotic).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gebruik de methoden hier, kunnen pure populaties van microglia kunnen worden geïsoleerd en klaar voor karakterisering met behulp van in vitro en FACS analyse. Om te beginnen met, kunnen tot 18 dieren worden gebruikt per slachten, met een verwachte opbrengst van ongeveer 450.000-600.000 microglial cellen. Het is cruciaal dat de zuiverheid van de geïsoleerde cellen eerst te bevestigen, en hiervoor FACS analyse werd uitgevoerd door de kleuring van de twee markeringen, CD45 en CD11b. identificatie van microglia kan blijken lastig, zoals veel markers uitgedrukt door microglia zijn eveneens uitgedrukt door macrofagen, en het gebruik van deze twee markeringen kunt nauwkeurige en betrouwbare kwantificatie. Specifiek, microglia een lage uitdrukking van CD45, in vergelijking met de hoge expressie in CNS en perifere macrofagen, gezien hebben en zijn ook positief voor CD11b (Figuur 1). Uit deze bijzondere isolement, werd een zuiverheid van 89,3% gemeld. Na kleuring voor CD11b, merken we dat onze primaire microglia delen vergelijkbare morfologische kenmerken, met een aantal morphologies uit de duidelijk unramified (grote bolvormige cel lichaam met weinig of geen uitgebreide processen) naar de meer waarvoor (met kleinere, meer ovale waarin en meestal tot de orde van de secundaire processen) correleren aan een scala van activering Staten, zoals verwacht te zien in vivo (Figuur 2).
Daarop werden twee karakterisering tests voor microglia functie en overleving geleid. Microglia zijn de grote fagocytische cel in het VNV, en de bepaling van de pHrodo kunt kwantificering van deze bijzondere functionele eigenschap. Een in de omgeving van 3-voudig toename fagocytische functie na 24u co cultuur met hAEC geconditioneerd medium (Figuur 3) geconstateerd, zoals afgemeten aan de kwantificering van fluorescerende pHrodo deeltjes. Tot slot, een AnnexinV-PI kleuring volgende co cultuur werd uitgevoerd ter identificatie van de overleving van microglia na een inflammatoire belediging. Een afname van de microglia apoptosis na behandeling met geconditioneerde medium (Figuur 4) werd waargenomen. Deze bevindingen stellen voor dat hAEC geconditioneerd medium microglia beschermt en verbetert hun fagocytische activiteit, welke therapie zou kunnen in perinatale hersenafwijkingen letsel en neuroinflammatoire hebben.
Figuur 1 : Uitdrukking van CD45 en CD11b door microglia. Elke stip vertegenwoordigt een gelabelde cel en FACS analyse laat opheldering van aparte cel populaties. Microglia hebben een lagere expressie van het CD45 antigeen vergeleken met perifere monocyt-afgeleide macrofagen en zijn positieve voor CD11b. de nummers onder antilichaam label geven het aandeel van de gated cellen uitgedruct als percentage van de bevolking ouder. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Morfologie van geïsoleerde primaire microglia. Zoals kan worden gezien in deze figuur, microglia behouden hun sferische cel lichaam en verschillende vertakte structuur. Schaal bar = 20 µm.
Figuur 3 : Kwantificering van fagocytische functie in geïsoleerde primaire microglia. pHrodo-gelabelde deeltjes alleen lichten wanneer zure omgevingen, zoals cellulaire Endosomen na fagocytose. Hier, wordt een toename van het pHrodo deeltje opname in microglia behandeld met hAEC geconditioneerd medium waargenomen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Analyse van microglia voortbestaan na de inflammatoire belediging. (A) representatieve FACS percelen van geïsoleerde microglia. De gecombineerde kleuring van AnnexinV en propidium jodide kunt categoriseren in apoptotic, necrotische, of levende cellen na stimulatie met LP's. (B) hAEC geconditioneerd middellange aanzienlijk verminderd microglia apoptosis ten opzichte van de besturingselementen, hetgeen wijst op een vorm van bescherming op dit celtype. * betekent p < 0,05, student t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Wassen van medium |
| Lage Glucose Dulbecco gewijzigd van Eagle Medium |
| 1% v/v penicilline-streptomycine |
| Digest medium (per hersenen) |
| 150 µL DNase ik |
| 100 µL papaïne (17U/mg stock) |
| 3 ml wassen medium |
| Groeimedium |
| Lage Glucose Dulbecco gewijzigd van Eagle Medium |
| 10% foetale runderserum |
| 1% v/v penicilline-streptomycine |
Tabel 1: Tabel van oplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microglia hebben de mogelijkheid om zowel pro- en anti-inflammatoire, gewijzigd door prikkels van de omgeving. Eerdere studies hebben aangetoond dat de modulatie van microglia activering neuroprotectie kan verlenen. Hun vermogen om te beveiligen neuronen en schade reparatie vereist meer onderzoek ter bevordering van de huidige kennis van deze complexe cellen. Isolatie van hoge zuiverheid primaire microglia is dus een belangrijke en nuttige techniek. Dit is een relatief snelle methode voor het verkrijgen van zeer zuivere primaire microglia klaar voor in vitro experimenten binnen 2 dagen.
Er zijn een aantal protocollen die zijn beschreven in de literatuur voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains. De belangrijkste uitdaging is het efficiënt produceren voldoende monster, hoog in de levensvatbaarheid en zuiverheid. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is het rendement van een zeer zuivere monster zonder de noodzaak voor de tijd in cultuur. Zo heeft de methode is teruggebracht van 2 weken tot 2 dagen, dit vergemakkelijkt de snelle resultaten. De karakterisering van het stappen opbrengst robuuste functionele gegevens over microglia, verbetering van de huidige kennis van deze complexe cellen. Het protocol combineert twee huidige benaderingen - dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding. Magnetische scheiding is goed gevalideerd in de literatuur voor isolatie van microglia in een relatief zachte wijze ten opzichte van andere isolatie technieken14,15,16. Hoewel er ongetwijfeld wijzigingen aan de functionele kenmerken van de geïsoleerde primaire microglia t.o.v. in hun geboortestaat in vivo, wijzigingen in microglia eigenschappen zoals waargenomen in de testen ontwikkeld boven zijn berekend op basis van een na vertering basislijn, en als zodanig zijn een afspiegeling van de directe modulatie van deze immuun subset.
Maar het protocol relatief eenvoudig is, zal zorg tijdens kritische stappen helpen om een goede opbrengst. Ten eerste, het is essentieel voor het gebruik van lage glucose media gliale groei te ondersteunen. Bovendien, de lymfkliertest hersenen moeten worden bewaard ijs koud op alle tijden tijdens het isolement. Dus, is het aanbevolen om vooraf chill alle medium, alsmede instrumenten indien mogelijk, en voer de procedure uit op ijs. Bovenal langdurige isolatie tijden zal leiden tot een slechtere gezondheid van cel en opleveren, dus is het essentieel om te snel te werken. Bovendien de juiste verwijdering van de meningeal laag is een cruciale stap bij het werken met volwassen muizen, anders de fibroblasten zal outcompete de gliacellen in termen van groei. Tijdens de enzymatische vertering van de hersenen, het is belangrijk niet te snijden van de hersenen in te kleine stukjes als dit kan verhogen celdood, ideaal doel voor 1 mm2 stuks van weefsel. Bij het slijpen van het weefsel door de cel zeef, spoel met media om de paar minuten zodat alle cellen worden gewassen door en doen niet krijgen gevangen in de zeef, bovendien het is aanbevolen om gebruik van een zeef 100 μm cel, kleinere filters resulteren in een verminderde opbrengst. Een andere belangrijke stap is de onderliggende van de kleurovergang middellange laag 70% dichtheid, uitvoeren van deze stap zorgvuldig en langzaam zodat een duidelijk interfase wordt gezien is essentieel, het gebruik van een pipet van Pasteur wordt aanbevolen. Ook wordt het gebruik van 15 mL conische buisjes aanbevolen als de scheiding van de cellen minder effectief was toen 50 mL conische buizen werden gebruikt. Tot slot, de dichtheid kleurovergang centrifugeren moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, zoals temperatuur kan invloed hebben op het verloop van de dichtheid.
Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor het produceren van zeer zuivere primaire microglia cellen, zoals blijkt uit zowel de hoge uitdrukking van CD45 en de positieve uitdrukking van Cd11b (in vergelijking met de lage CD45 expressie gezien in perifere monocyten). Cellen kunnen ook worden geïsoleerd relatief snel, het heeft dus het bereik aanzienlijk toegenomen inzicht in deze glia cellen. Het kan worden gebruikt om te identificeren van de bevolking van de verschillende microglia uit verschillende achtergronden, waardoor voor studies die verschillen tussen microglia geïsoleerd van zieke/gewond en gezonde dieren kunnen onthullen. Door de isolatie van een zuivere microglia bevolking, kan therapeutische modulatie van deze immuun-celpopulatie worden beoordeeld. Bijvoorbeeld, bleek dat hAEC-geconditioneerd media verhoogde van fagocytose, evenals microglia overleven tijdens een inflammatoire stimulans, dus bieden therapeutische voordelen17verbeterd. Dit gecorreleerd aan apoptotic puin gereduceerd en dus stelt Goedkeuringvande deze puin kan hebben op neuroprotectieve effecten.
Het protocol kan worden toegepast op zowel neonatale of volwassen muizen, maar oudere muizen een verminderde opbrengst zal produceren. Bovendien, het kan worden aangepast aan het isoleren van primaire astrocyten van neonatale of volwassen muizen, opnieuw oudere muizen zal resulteren in een verminderde opbrengst. Bovendien kan de wijziging van de mechanische dissociatie stap met een op maat gemaakte nylon gaas met grotere maten van de porie in tegenstelling tot de 100 μm cel zeef, verder verbeteren cel opbrengst18.
Beperkingen van dit protocol zijn de lagere opbrengst en de tijd die nodig is voor dit protocol. De opbrengst is ongeveer 150.000-200.000 cellen per ruiming van zes dieren, ten opzichte van de miljoenen die worden door weken van celkweek verkregen kunnen. Bovendien, terwijl cellen kunnen worden verkregen binnen twee dagen, is de procedure op de eerste dag nogal tijdrovend, nemen ongeveer zes uur.
Deze methode is echter een zeer nuttig hulpmiddel in het begrip van de rol van microglia in ziekte, geschikt voor het isoleren en karakteriseren van de cellen binnen twee dagen. Het produceert hoge zuiverheid primaire microglia cellen, nauwkeurig en efficiënt onderzoek te vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
