Summary
Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.
Abstract
Microglia, le cellule immunitarie residente nel cervello, sono i primi soccorritori per infiammazione o lesioni nel sistema nervoso centrale. La ricerca recente ha rivelato microglia di essere dinamico, capace di assumere fenotipi sia pro-infiammatorie e anti-infiammatori. Sia M1 (pro-infiammatori) e M2 (pro-riparativa) fenotipi giocare un ruolo importante in condizioni neuroinfiammatorie come lesione cerebrale perinatale e mostre differenti funzioni in risposta a determinati stimoli ambientali. La modulazione dell'attivazione microglial è stata notata per conferire neuroprotezione suggerendo le microglia possono avere potenziale terapeutico nella ferita di cervello. Tuttavia, più ricerca è necessaria per comprendere meglio il ruolo della microglia nella malattia, e questo protocollo che facilita. Il protocollo descritto sotto combina un processo di centrifugazione su gradiente di densità per ridurre i detriti cellulari, con separazione magnetica, produrre un campione altamente puro di cellule microgliali primario che può essere utilizzato per la sperimentazione in vitro , senza la bisogno per 2-3 settimane di coltura. Inoltre, le operazioni di caratterizzazione resa solida funzionale dei dati sulla microglia, aiutando gli studi per migliorare la nostra comprensione della polarizzazione e l'innesco di queste cellule, che ha forti implicazioni nel campo della medicina rigenerativa.
Introduction
Danni acquisiti durante il periodo perinatale da infiammazione, ipossia-ischemia ed emorragia possono avere una serie di conseguenze a lungo termine. La patofisiologia complessa di lesione cerebrale perinatale è teorizzata per coinvolgere l'infiammazione e ischemia con conseguente morte neuronale ed assonale1. La risposta immunitaria innata svolge un ruolo importante nella cascata di eventi che portano a lesioni2.
Microglia, le cellule immunitarie residente all'interno del sistema nervoso centrale (CNS), sono i primi soccorritori a lesioni3. Le microglia sono tipi di cella in plastica con la capacità di essere sia protettiva o tossiche, dipende l' ambiente4. Essi sono coinvolti nella chemiotassi, fagocitosi, presentazione dell'antigene e produzione di citochine e di specie reattive dell'ossigeno4,5. Senescenti microglia costantemente l'ambiente di indagine e vengono attivati dalla presenza di una sostanza straniera o nocivo4. Attivazione conduce ad una risposta pro-infiammatoria, critica in CNS protezione4. Queste microglia "pro-infiammatorie" fenotipo M1 sono principalmente coinvolti nella presentazione dell'antigene e la morte di agenti patogeni4. Nonostante il ruolo cruciale della risposta infiammatoria nella neuroprotezione, infiammazione incontrollata o prolungata può essere nocivo e portare a danno di un neurone4. Tuttavia, quando esposti a determinati stimoli ambientali, le microglia possono esibire un fenotipo anti-infiammatorio. Queste microglia M2 pro-riparativi hanno un ruolo critico nella guarigione delle ferite e la riparazione6, rilasciando una serie di citochine e altri mediatori solubili che downregulate l'infiammazione, aumentare la fagocitosi e promuovere la ripristino4, 7. i ruoli di microglia sono diversi e comprendono guida differenziazione del oligodendrocyte durante re-mielinizzazione8, proteggere i neuroni durante lo svuotamento di ossigeno e glucosio nel tratto modelli9 e promuovere neuriti in ferita del midollo spinale modelli10.
Lo studio di queste cellule gliale rappresenta un aspetto importante nel comprendere e manipolare la risposta al neuroinflammation. Il protocollo descritto consente ulteriore indagine il potenziale terapeutico della modulazione di microglia in malattie neuroinfiammatorie.
La modulazione dell'attivazione microglial verso un ruolo neuroprotettivo è stata osservata in una gamma di circostanze11,12,13. Così, migliorando la comprensione corrente e ulteriormente studiando la modulazione dell'attivazione microglial è critica, che richiedono l'uso di vari modelli tra cui sia in vitro che in vivo. Studi in vitro rappresentano uno strumento importante a causa della loro maggiore efficienza, basso costo e capacità di indagare su una popolazione di cellule isolate.
Ci sono una serie di protocolli descritti nella letteratura per l'isolamento di microglia dal cervello murino, la sfida di produrre in modo efficiente un campione ad alto rendimento con elevata purezza e buona redditività. Metodi comunemente usati di isolamento della microglia primaria sono separazione magnetica e scuotendo prolungata delle colture miste gliale. Attraverso l'esperienza personale, è stato trovato che c'era un alto grado di detriti cellulari che hanno ostruito la colonna magnetica. Così, è stato utilizzato il seguente protocollo, che incorpora un passo di centrifugazione su gradiente di densità iniziale seguito da separazione magnetica CD11b. Il protocollo descritto di seguito è stato ottimizzato per produrre un campione altamente puro in quantità sufficiente. È vantaggioso grazie alla sua elevata purezza e il breve periodo di tempo — uno può eseguire le analisi entro 2 giorni senza dover fare cultura per 2-3 settimane. Questo protocollo potenzialmente può essere adattato per l'isolamento di astrociti di murini.
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Protocol
Le procedure seguenti sono state approvate dal comitato di etica animale presso l'Università di Monash. Topi C57Bl6/J P3-6 neonato in buona salute non trattati sono stati utilizzati per generare i risultati rappresentativi.
1. enzimatica digestione
Nota: È importante considerare la sterilità quando isolamento e coltura di cellule primarie. Garantendo nel contempo che l'ambiente è come sterile come possibile, la dissezione iniziale e la raccolta del cervello murino può essere completati di fuori di una cappa a flusso laminare, con tutti i successivi passaggi eseguiti all'interno di una cappa a flusso laminare.
- Utilizzando strumenti sterili, eutanasia il mouse di dislocazione cervicale, decapitare l'animale e risciacquare con etanolo al 100%. Utilizzando piccole forbici sterili, fare piccole incisioni lungo i lati destro e sinistro della testa. A questa età, la pelle si stacca facilmente. Usando le punte della pinzetta, far scorrere delicatamente il tessuto verso il rostro per esporre il cranio, compreso il Bregma.
- Inserire la punta delle forbici nell'apertura del canale spinale e fare un'incisione laterale per il canale uditivo. Fare un'incisione lungo la sutura sagittale di Bregma, puntando delicatamente la punta delle forbici verso l'alto per evitare di danneggiare il cervello. Inserire la punta delle forbici al Bregma e fare incisioni laterali ai lati destro e sinistro della testa lungo la sutura coronale.
- Usando il forcipe, togliere delicatamente il cranio per esporre il cervello. A tale scopo, afferrare i bordi del cranio esposti dall'incisione laterale e tirare delicatamente il cranio al lato. Il cranio deve staccarsi facilmente. Usando il forcipe curvo, delicatamente scoop sotto il cervello per rimuoverlo.
- Mettere il cervello in un contenitore sterile 5 mL, lavare 2 - 3 volte con wash ghiacciata media (di glucosio basso Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 1% di penicillina-streptomicina), diluitore da circa 5 mL per lavaggio, per rimuovere il sangue.
- In un cappuccio di flusso d'aria laminare, inserire il contenuto del contenitore da 5 mL in un piccolo piatto di petri (35 mm), che riposa sul ghiaccio. Usando un bisturi sterile o forbici sterili, rimuovere il cervelletto e bulbo olfattivo. Fare un midline taglio per separare i due emisferi.
- Con attenzione togliere lo strato meningeo con una pinzetta, facendo attenzione a non per danneggiare le cortecce. Identificare il livello meningeo come uno strato molto sottile di cellule con una tinta rossa sulla superficie del cervello, con visibili i vasi sanguigni. Mantenere il cervello freddo è essenziale per rimozione corretta meningi. Se si rompe lo strato meningeo, continuare staccando i frammenti strappati fino a quando viene completamente rimosso.
- Trasferire gli emisferi un nuovo piccolo piatto di petri (su ghiaccio) e riempirlo con lavaggio media. Tritare il cervello in piccoli pezzi con lama bisturi sterile/forbici.
Nota: Dovrebbe trattarsi di ~ 1 mm2 dimensioni e dovrebbe prestare attenzione a non tagliarle in pezzi troppo piccoli, in quanto ciò potrebbe ridurre il rendimento. - Aggiungere 100 µ l papaina (stock 17 U/mg) e 150 µ l della dnasi I in media ed incubare per 30 min a 37 ° C
- A seguito di digestione, triturare tessuto utilizzando una pipetta P1000. Se pezzi di tessuto sono troppo grandi per penetrare la pipetta, considerare l'utilizzo di una coppia o forbici sterili per allargare la punta della pipetta. Durante questo processo, fare attenzione a non introdurre bolle in media, in quanto ciò potrebbe ridurre la vitalità cellulare.
2. mielina rimozione detriti
- Sotto cappa a flusso laminare utilizzare attrezzature sterili, preparare una provetta conica da 50 mL con un colino di cella µm 100, per ogni cervello. Versare il contenuto del piatto petri, contenente i pezzi di medie e cervello di digest su un colino. Far passare i pezzi di cervello utilizzando lo stantuffo di una siringa sterile da 3 mL in un movimento di rettifica, finché non ci sarà nessun tessuto più visibile. A seguito di digestione, il tessuto cerebrale dovrebbe cadere a pezzi facilmente.
- Continuamente lavare il filtro con i media di lavaggio, di rabbocco del filtro cella in tutto questo processo. Questo si laverà attraverso qualsiasi cellule intrappolate nel colino.
Nota: Questo dovrebbe essere fatto fino a quando c'è di circa ~ 15 mL nel tubo. Questo è per assicurare che il filtro è sufficientemente lavato attraverso e per massimizzare la quantità di cellule raccolte. -
Centrifugare la sospensione unicellulare a 500 x g per 5 min a 4 ° C. Durante questo tempo, preparare il mezzo del gradiente di densità come descritto.
- Preparare il magazzino percoll isotonico (SIP), che è il mezzo di gradienti di densità utilizzato. Fare questo con l'aggiunta di 9:1 rapporto di medio gradiente di densità a 10x sterile Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS).
- Preparare le sfumature come 30% SIP in DMEM e 70% SIP in 1 x HBSS. Ad esempio, per preparare 10 mL di 30% SIP, aggiungere 3 mL di SIP a 7 mL DMEM.
- Aspirare il supernatante dal provette coniche e risospendere il pellet cellulare con 8 mL di 30% SIP in DMEM. Trasferire il volume completo a un tubo conico di fresco 15ml.
- Alla base della soluzione SIP di 70%. A tale scopo, è possibile riempire una pipetta di trasferimento con 70% SIP e attentamente spingere attraverso la pipetta di trasferimento al fondo del tubo conico. Una volta che la punta è vicino al fondo, spingere delicatamente attraverso il contenuto della pipetta di trasferimento.
Nota: Eseguire questa operazione lentamente per non disturbare l'interfaccia 30/70. Ci deve essere una chiara linea che separa i due strati. - Centrifugare gli strati SIP, comprese le cellule, a 650 x g con freno 0 e 4, l'accelerazione per 25 min a temperatura ambiente.
Nota: È essenziale per completare la rotazione con freno disinserito e consentire la centrifuga a venire lentamente una battuta d'arresto, come applicazione del freno perturbare l'interfase e ridurre drasticamente il prelievo di cellule tra gli strati SIP. - Aspirare i detriti cellulari nella parte superiore del tubo e rimuovere circa 4 mL media dall'alto. Ciò faciliterà la rimozione delle cellule mononucleari nel passaggio seguente. Utilizzando una pipetta P1000, abbassare con cautela la punta della pipetta verso l'interfase. Isolare le cellule mononucleate dall'interfaccia di medio gradiente di densità di 30/70. Raccogliere circa 3 mL dall'interfaccia nuvoloso e trasferimento ad un nuovo tubo conico da 15 mL. In seguito, stemperate il composto con 9 mL di HBSS per facilitare la rimozione del mezzo di gradienti di densità.
- Centrifugare il interphase medio gradiente di densità diluito, contenente le cellule mononucleari a 500 x g per 5 min. aspirare il supernatante e risospendere con 1 mL di terreno di crescita (DMEM completati con 10% fetale bovino del siero e l'1% antibiotici). In seguito, macchia le cellule sedimento con trypan blue ed eseguire un conteggio delle cellule usando un emocitometro.
3. ordinamento delle cellule attivate magnetica
Nota: Questi passaggi vengono modificati dal protocollo di costruttori.
- Centrifugare le cellule mononucleari raccolte a 300 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere il mezzo di crescita, in quanto ciò interferirà con l'isolamento magnetico. Utilizzando lo stesso conteggio di cellule ottenuto da passo 2.8, risospendere a 1 x 108 nucleate cellule/mL in PBS (Ca+ + e Mg ++ libero) contenenti 2% FBS e 1 mM EDTA, all'interno di un intervallo di volume di 0,1-2,5 mL.
- Aggiungere il volume completo di cellule nucleate in PBS dal passaggio precedente in una provetta di polistirene fondo tondo fresco 5 mL (12 x 75 mm). Aggiungere 50 µ l di reagente etichettatura CD11b PE per 1 mL di campione. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti al riparo dalla luce.
- Aggiungere 70 µ l di selezione cocktail (una combinazione di anticorpi monoclonali contro CD11b in PBS) per 1 mL di campione. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti al riparo dalla luce.
- Mescolare particelle magnetiche pipettando su e giù più di 5 volte. Aggiungere 50 µ l/mL al campione. Incubare a temperatura ambiente per 10 min al riparo dalla luce.
Nota: Queste particelle quindi formano un complesso tetramerica con gli anticorpi e saranno ottenere collegate alla colonna magnetica. - Se il volume totale della miscela delle cellule è inferiore a 2,5 mL, alto fino a questo volume con PBS (Ca+ + e Mg ++ libero) contenenti 2% FBS e 1 mM EDTA e Miscelare pipettando delicatamente 2 - 3 volte. Inserire il tubo (senza coperchio) il magnete e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- In un movimento continuo, completamente invertire il magnete contenente il tubo per 2-3 s, versando il sovranatante. Restituire il magnete in posizione verticale e rimuovere il tubo dal magnete. Preparare per lavare le cellule restanti fuori dalla colonna.
Nota: Il surnatante contiene cellule non etichettate e indesiderate, che vengono rimossi capovolgendo la provetta mentre ancora nel magnete. Il tubo contiene l'allegato Cd11b+ cellule. - Lavare le cellule ripetendo i punti 3.5 e 3.6 di altre due volte. Se il campione è maggiore di 1 mL, è consigliato un ulteriore ripetizione di passaggi 3.5 e 3.6.
- Risospendere le cellule in un mezzo di crescita desiderata. Sciacquare il fianco della nave collezione pure (ad es. un tubo da 15 mL) per raccogliere le cellule dai lati del tubo e massimizzare i rendimenti.
4. Verifica della purezza di Microglia
Nota: La microglia primaria isolata da 3 L (n = 5 animali totali) sono stati verificati tramite cella attivata fluorescente ordinano (FACS) per determinare la purezza per i risultati rappresentativi.
- Cellule di coltura in una beuta, T-25 nel terreno di coltura contenente 10% FBS durante la notte, semina ad una densità di 1-2 x 106 cellule per fiaschetta.
- Lavare le cellule in beute T-25 con PBS 3 x per 5 min rimuovere eventuali restanti supporti di crescita che potrebbero interferire con il trypsinization.
- Aggiungere 2 mL di tripsina 0,25% per staccare le cellule dai palloni. Assicurarsi che il volume della tripsina sia sufficiente a coprire l'intera superficie del pallone. In seguito agitando delicatamente del pallone per garantire una copertura uniforme di tripsina, incubare per 5 min a 37 ° C.
- Placare il processo di trypsinization con l'aggiunta di 2 mL di coltura contenente 10% FBS nel pallone.
- Raccogliere il surnatante contenente cellule tripsinizzate e centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C per raccogliere le cellule.
- Rimuovere il supernatante contenente il terreno di coltura e la tripsina e risospendere il pellet in 500 μL FACS tampone. Eseguire il conteggio delle cellule usando del blu di trypan.
- Centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C. Eseguire il blocco del recettore Fc aggiungendo 50 μL FACS buffer + blocco FcR 1 μL a 5 x 106 cellule. Incubare per 15 min a 4 ° C.
Nota: Il blocco del recettore Fc è un passaggio fondamentale nella procedura di colorazione per impedire il legame non specifico delle immunoglobuline ai recettori Fc nelle popolazioni delle cellule immuni. Questo blocco non influisce l'associazione a valle di altri anticorpi. - Termina il processo bloccante diluendo con buffer di FACS 500 μL. In seguito, centrifugare la miscela che contiene le cellule a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
- Risospendere in fresco 500 μL FACS tampone.
- Inserire la maggior parte delle cellule (per esempio se risospendere le cellule in 500 μL di tampone di FACS, uso 400 μL) in una provetta. Distribuire le celle rimanenti tra i tubi di controllo e fino a 100 µ l per provetta di controllo in cima (ad es. per 6 provette di controllo, messo 16.67 μL in ogni provetta di controllo e superiore con buffer di FACS 83.33 μL). Rendere i gruppi (controllo tubi in grassetto) come Immacolata, single macchiato (CD45, CD11b), singolo live/dead macchia, protocolli e provette.
- Appallottolare le celle in tutte le provette mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
- Macchia le cellule nel tubo con 1 anticorpo μL a 100 μL FACS di tampone per 5 x 106 cellule. Incubare per 20 min a 4 ° C.
Nota: Utilizzare 50 μL anticorpo cocktail se meno di 2 x 106 cellule vengono utilizzate. - Lavare le cellule con buffer di FACS 500 μL. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
- Risospendere le cellule in buffer di FACS 300 μL.
Nota: Utilizzare ~ 100 μl se il conteggio delle cellule è minore di 2 x 106. - Utilizzando l'analisi di citometria a flusso, quantificare le cellule che sono CD45basso e positivo per la macchiatura di CD11b. Questa percentuale corrisponde alla microglia primaria isolata.
5. la macchiatura di Immunohistochemical di Microglia primaria
- Le cellule in una piastra a 96 pozzetti ad una densità di 1 x 105 celle del piatto con il mezzo di crescita e incubare per una notte.
- Eliminare il surnatante e lavare 3 volte con PBS.
- Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS per 15 min. Rimuovi il PFA con una pipetta P1000, quindi lavare 3 volte con PBS + 0.1% Triton-X.
- Blocco per legame non specifico con albumina di siero bovino di 3% per 1 h a temperatura ambiente.
- Incubare con coniglio Iba-1 (1: 100) per 24 h a 4 ° C. In seguito, è necessario rimuovere la miscela di anticorpo primario e lavare 3 volte con PBS.
- Incubare con secondario coniugato GFP anti-coniglio (1: 200) per 1 h a temperatura ambiente. In seguito, è necessario rimuovere la miscela di anticorpo secondario e lavare 3 volte con PBS.
- Montare diapositive con una fluorescente montaggio medio e catturare le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza.
6. quantificazione delle Microglia utilizzando il pHrodo Assay
Nota: Il dosaggio di pHrodo consente per l'identificazione dei livelli di fagocitosi in cellule coltivate. Al momento l'assorbimento tramite endocitosi, internalizzazione nell'ambiente più acido aumenta i livelli di fluorescenza dei coniugati bioparticle. Livelli di fluorescenza possono quindi essere quantificati da FACS. I passaggi seguenti vengono modificati dal protocollo di costruttori.
- Cultura le cellule in una beuta, T-25 in medium della crescita durante la notte, semina ad una densità di 1-2 x 106 cellule per fiaschetta. Lavare le cellule in boccette di T-25 con PBS 3 volte per 5 min.
- Staccare le cellule usando tripsina di 0,25% di 2 mL. Incubare per 5 min a 37 ° C.
- Placare il processo tripsinizzazione aggiungendo 2 mL di coltura contenente 10% FBS nel pallone.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 min a 4 ° C per agglomerare le cellule.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet contenente la microglia primaria nel terreno di coltura a 106 cellule/mL.
Nota: In alternativa, piastra di celle in una piastra a 96 pozzetti con almeno un giorno prima e mirare 1x105 cellule vitali per pozzetto il giorno il test deve essere eseguito. - Celle di piastra in piastra a 96 pozzetti a 1 x 105 cellule/pozzetto, 100 μL per pozzetto. Piastra controlli e pozzi sperimentali in triplice copia e lasciare un pozzetto vuoto al controllo positivo per una sottrazione di sfondo del controllo no-cella.
- Aggiungere 100 μL di crescita media dei pozzetti lasciati vuoti per sottrazione sfondo no-cella.
Nota: Come qualsiasi altro in vitro test, controlli appropriati sono vitali per la precisione delle letture. A fianco la no-cella controllo (lettura di base), includono anche il controllo negativo ben (coniugato pHrodo aggiunto, ma posti su ghiaccio). - Coprire la piastra e incubare per 1 h in un'incubatrice con 5% CO2 a 37 ° C.
- Preparare pozzi sperimentali aggiungendo stimolante e trattamento. Aggiungere comandi del veicolo (solo per i mezzi di sviluppo) a pozzetti non trattati.
Nota: Lipopolysaccharide 1 µ g/mL [stimolante] e delle cellule epiteliali umane Amnios (hAEC)-media condizionati [trattamento] sono stati usati per generare i risultati rappresentativi. - Scongelare una fiala di colorante coniugati, aggiungere vortice e brevemente 2 mL di tampone per l'assorbimento. Trasferire il contenuto del tubo in un tubo di vetro pulito e Sonicare per 5 min, per garantire che le particelle sono disperse uniformemente.
- Aspirare il terreno di coltura da pozzi di micropiastre e sostituire rapidamente con 100 μL della sospensione di tintura. Coprire e incubare a 37 ° C per 1 h.
Nota: Ricordarsi di macchiare i tubi di controllo pure. - Utilizzando l'analisi di citometria a flusso, quantificare cellule macchiatura positiva per le perle di coniugati pHrodo e presentare come una percentuale (del genitore) di attivamente phagocytosing microglia.
7. quantificazione di Microglia apoptosi dopo insulto infiammatorio
- Ripetere i passaggi 1-7 nella sezione "Verifica della purezza di microglia".
- Inserire la maggior parte delle cellule (per esempio se risospese le cellule in 500 μL di tampone di FACS, uso 400 μL) in una provetta. Distribuire le celle rimanenti tra i tubi di controllo e top fino a 100 µ l per provetta di controllo (ad es. per provette di controllo 6, messo 16.67 μL in ogni provetta di controllo e superiore con buffer di FACS 83.33 μL). Gruppi (controllo tubi in grassetto): non macchiate, singole macchie (AnnexinV, ioduro di propidio), singolo live/dead mordente, protocolli, provette.
- Appallottolare le celle in tutte le provette mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min.
- Incubare con 1 μL anticorpo/100 μL FACS buffer/5 x 106 cellule per 20 min a 4 ° C.
Nota: Utilizzare 50 μL se meno di 2 x 106 cellule. - Lavare le cellule con l'aggiunta di 500 μL FACS buffer e centrifugare a 500 g per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare nel buffer di FACS 300 μL.
Nota: ~ 100 μL se il conteggio delle cellule è minore di 2 x 106. - Quantificare le celle all'interno di ogni quadrante (Q1: necrotico, Q2: tardo apoptotico, Q3: vitali, Q4: apoptotica precoce).
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Representative Results
Utilizzando i metodi descritti qui, puri popolazioni di microglia possono essere isolati e possono essere pronti per la caratterizzazione utilizzando in vitro e analisi al FACS. Per cominciare, fino a 18 animali possono essere utilizzati per abbattimento, con un rendimento atteso di circa 450.000-600.000 cellule microglial. È fondamentale per confermare la purezza delle cellule isolate, e per farlo in quanto l'analisi Citofluorimetrica è stata eseguita dalla macchiatura per due marcatori CD45 e CD11b. identificazione di microglia può risultare fastidioso, come molti indicatori espressi da microglia sono anche espresse da macrofagi e l'uso di questi due indicatori permette la quantificazione accurata ed affidabile. In particolare, la microglia hanno una bassa espressione di CD45, rispetto all'espressione alta visto nel sistema nervoso centrale e periferici macrofagi e sono anche positive per CD11b (Figura 1). Da questo particolare isolamento, è stata segnalata una purezza del 89,3%. Dopo la colorazione per CD11b, notiamo che nostro microglia primaria condividere simili caratteristiche morfologiche, con una gamma di morfologie dal distintamente unramified (grande cella corpo sferico con poco o nessun processi estesi) per il più ramificato (con più piccolo, più somata ovale e in genere fino a processi di ordine secondario) correlare a una gamma di Stati di attivazione, come previsto da vedere in vivo (Figura 2).
In seguito, sono stati eseguiti due saggi di caratterizzazione per funzione di microglia e la sopravvivenza. Microglia sono le principali cellule fagocitiche nel SNC, e il dosaggio di pHrodo permette la quantificazione di questa particolare proprietà funzionali. È stato notato un aumento di 3 volte vicino a funzione fagocitica dopo 24 h co-coltura con hAEC condizionata medio (Figura 3), come misurato tramite la quantificazione delle particelle fluorescenti pHrodo. Infine, una AnnexinV-PI colorazione seguenti co-coltura è stata effettuata per identificare la sopravvivenza di microglia seguendo un insulto infiammatorio. Una riduzione in microglia apoptosi dopo trattamento con medium condizionato (Figura 4) è stato osservato. Questi risultati suggeriscono quel mezzo hAEC condizionata protegge microglia e migliora la loro attività fagocitaria, che potrebbe avere la terapia nella ferita e neuroinfiammatorie malattie neurologiche perinatali.
Figura 1 : Espressione di CD45 e CD11b da microglia. Ogni punto rappresenta una cella etichettata e analisi Citofluorimetrica permette delucidazione delle popolazioni distinte delle cellule. Microglia hanno una bassa espressione dell'antigene CD45 rispetto ai macrofagi monocito-derivati periferici e sono positive per CD11b. numeri sotto etichetta anticorpo indicano la proporzione di cellule con cancello, espresso come percentuale della popolazione padre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Morfologia della microglia primaria isolata. Come si può vedere in questa figura, microglia mantengono la loro corpo sferico cellula e struttura ramificata distinta. Barra della scala = 20 µm.
Figura 3 : Quantificazione della funzione fagocitica in microglia primaria isolata. pHrodo-etichettati particelle reagiscono solo quando in ambienti acidi, ad esempio in endosomi cellulari seguendo la fagocitosi. Qui, si osserva un aumento nell'assorbimento di particelle di pHrodo in microglia trattata con hAEC condizionata medio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Analisi di sopravvivenza di microglia dopo insulto infiammatorio. (A), FACS rappresentativi appezzamenti di microglia isolata. La macchiatura combinato di AnnexinV e propidio ioduro consente la categorizzazione in apoptosi, necrosi, o cellule vive dopo stimolazione con LPS. (B) hAEC condizionata media microglia significativamente ridotta apoptosi rispetto ai controlli, indicando una forma di protezione su questo tipo di cella. * significa p < 0.05, test t di student. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Lavaggio medio |
| Glucosio basso Dulbecco s Modified Eagle Medium |
| 1% v/v penicillina-streptomicina |
| Medio di digest (al cervello) |
| 150 µ l dnasi I |
| 100 µ l papaina (stock 17U/mg) |
| 3 ml liquido di lavaggio |
| Crescita media |
| Glucosio basso Dulbecco s Modified Eagle Medium |
| 10% di siero fetale bovino |
| 1% v/v penicillina-streptomicina |
Tabella 1: Tabella delle soluzioni.
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Discussion
Microglia hanno la capacità di essere sia pro - e anti-infiammatori, alterato da stimoli di ambiente. Studi precedenti hanno dimostrato che la modulazione dell'attivazione di microglia può conferire neuroprotezione. Loro capacità di fornire protezione ai neuroni e riparare lesioni richiede ulteriori ricerche per favorire la comprensione corrente di queste cellule complesse. Così, l'isolamento di elevata purezza primaria microglia è una tecnica importante ed utile. Si tratta di un metodo relativamente rapido per ottenere altamente pura primaria microglia pronta per la sperimentazione in vitro entro 2 giorni.
Ci sono una serie di protocolli descritti nella letteratura per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino. La sfida principale è quello di produrre in modo efficiente campione sufficiente, alto redditività e la purezza. Il vantaggio principale di questo protocollo è la resa di un campione altamente puro senza la necessità per il tempo nella cultura. Così, il metodo è ridotto da 2 settimane a 2 giorni, questo facilita risultati veloci. Le operazioni di caratterizzazione resa funzionali robusti dati sulla microglia, migliorando la comprensione corrente di queste cellule complesse. Il protocollo combina due approcci attuali - centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica. Separazione magnetica è stata convalidata anche nella letteratura per l'isolamento di microglia in maniera relativamente delicata rispetto alle altre tecniche di isolamento14,15,16. Mentre ci sono senza dubbio le modifiche alle caratteristiche funzionali della microglia primaria isolata rispetto a nel loro stato nativo in vivo, eventuali modifiche alle proprietà di microglia come osservato nelle analisi sviluppate sopra sono calcolate da un linea di base post-digestione e come tali sono riflettenti di modulazione diretta di questo sottoinsieme immune.
Mentre il protocollo è relativamente semplice, cura durante fasi critiche contribuirà a garantire una buona resa. In primo luogo, è fondamentale utilizzare glucosio basso media per sostenere la crescita gliale. Inoltre, il cervello murino dovrà essere tenuto ghiaccio freddo di tutti i tempi durante l'isolamento. Pertanto, si consiglia di pre-raffreddare tutte le medie, nonché strumenti se possibile ed eseguire la procedura sul ghiaccio. Soprattutto, volte l'isolamento prolungato porterà a godano di buona salute delle cellule e la resa, quindi è fondamentale per lavorare rapidamente. Inoltre, la corretta rimozione dello strato meningeo è un passo cruciale quando lavorando con i topi adulti, altrimenti i fibroblasti sarà prevalere le cellule gliali in termini di crescita. Durante la digestione enzimatica dei cervelli, è importante non tagliare i cervelli in pezzi troppo piccoli come questo può aumentare la morte delle cellule, idealmente obiettivo per 1 mm2 pezzi di tessuto. Quando il tessuto di macinazione attraverso il filtro delle cellule, sciacquare abbondantemente con media ogni pochi minuti per garantire tutte le celle vengono lavati attraverso e non rimanere intrappolati nel colino, inoltre si raccomanda di utilizzare un filtro di cella di 100 μm, filtri più piccoli si tradurrà un rendimento ridotto. Un altro punto critico è il sottostante del livello medio sfumatura 70% densità, eseguire questo passaggio con attenzione e lentamente in modo da garantire che una chiara interfase è visto è essenziale, è consigliato l'uso di una pipetta Pasteur. Inoltre, l'uso di provette coniche da 15 mL è raccomandato come la separazione delle cellule era meno efficace quando sono state utilizzate provette coniche da 50 mL. Infine, la centrifugazione in gradiente di densità deve essere eseguita a temperatura ambiente, come temperatura può influenzare il gradiente di densità.
Questo protocollo descrive un metodo affidabile di produrre cellule di microglia primario altamente puro, come mostrato da un'alta espressione di CD45 ed espressione positiva di Cd11b (rispetto a bassa espressione di CD45 visto in monociti periferici). Cellule possono anche essere isolate in tempi relativamente brevi, così ha lo scopo di comprensione significativamente aumentata di queste cellule di glia. Può essere utilizzato per identificare microglia diverse popolazioni di diversa provenienza, che consente per gli studi che possono rivelare differenze tra microglia isolati da animali sani e malati/feriti. Attraverso l'isolamento di una popolazione di microglia puro, può essere valutata la modulazione terapeutica di questa popolazione di cellule immunitarie. Per esempio, è emerso che hAEC-condizionato media aumentata fagocitosi, come pure ha migliorato la sopravvivenza di microglia durante uno stimolo infiammatorio, così offrendo benefici terapeutici17. Questo correlato alla ridotta detriti apoptotici e così suggerisce la clearance di questi detriti può avere effetti neuroprotective.
Il protocollo può essere applicato ai topi sia neonatali o adulti, tuttavia più vecchi topi produrrà un rendimento ridotto. Inoltre, può essere adattato per isolare astrociti primari dai topi neonatali o adulti, ancora più vecchi topi si tradurrà in una resa in diminuzione. Inoltre, la modifica del punto dissociazione meccanica con una maglia di nylon su misura con dimensioni maggiori del poro in contrasto con il filtro di cella 100 μm, potrebbe migliorare ulteriormente la cella resa18.
Le limitazioni del presente protocollo comprendono la resa più bassa e il tempo richiesto per questo protocollo. La resa è di circa 150.000-200.000 cellule per abbattimento di sei animali, contro i milioni che possono essere ottenuti attraverso settimane della coltura delle cellule. Inoltre, mentre le cellule possono essere ottenute entro due giorni, la procedura il primo giorno è un tempo piuttosto lungo, prendendo circa sei ore.
Tuttavia, questo metodo è uno strumento molto utile nella comprensione del ruolo della microglia in malattia, in grado di isolare e caratterizzare le cellule entro due giorni. Produce le cellule di microglia primaria di elevata purezza, facilitando la ricerca accurata ed efficiente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
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