Summary

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

Published: March 29, 2018
doi:

Summary

Este estudo apresenta um protocolo para o tecido reversível compensação, imunocoloração, renderização 3D e análise de redes vasculares em amostras de vilosidades da placenta humana na ordem de 1-2 mm3.

Abstract

Troca de nutrientes e gases entre mãe e feto ocorre na interface do sangue intervillous materno e a vasta rede de capilar das vilosidades que torna-se muito do parênquima da placenta humana. A rede capilar vilosa distal é o terminal da fonte de sangue fetal, depois de várias gerações de ramificação dos vasos que se estendem desde o cordão umbilical. Esta rede tem uma bainha celular contígua, a camada de barreira trofoblasto sincicial, que impede a mistura do sangue do feto e o sangue materno, no qual é continuamente banhado. Insultos à integridade da rede capilar placentária, ocorrendo em doenças como diabetes materna, hipertensão e obesidade, têm consequências que presentes sérios riscos de saúde para o feto, infantil e adulto. Para melhor definir os efeitos estruturais destes insultos, um protocolo foi desenvolvido para este estudo que capta a estrutura capilar rede na ordem de 1-2 mm3 onde um pode investigar suas características topológicas em sua total complexidade. Para realizar isto, clusters de terminais vilosidades da placenta são dissecados e a camada de trofoblasto e o endothelia capilar é immunolabeled. Estas amostras são então esclarecidas com um tecido novo, processo que torna possível adquirir pilhas imagem confocal para z-profundidades de ~ 1 mm de compensação. As renderizações tridimensionais dessas pilhas são então processadas e analisadas para gerar medidas básicas de rede capilar, tais como o volume, o número de ramificações capilares e pontos de extremidade do ramo capilar, como validação da adequação dessa abordagem para caracterização da rede capilar.

Introduction

Nosso entendimento de suas patologias e a placenta em desenvolvimento é, em grande medida, limitado para inferir relações espaciais entre vilosidades adjacentes e capilares contidos derivados de cortes histológicos. Neste estudo, abordámos esta questão ao desenvolver os meios para gerar os renderizações tridimensionais (3D) das redes de capilares placentários humanos que são adequados para análises das características da rede capilar (por exemplo, ramificação, solidez). Para fazer isso que combinamos coloração imunofluorescente com dois produtos de limpeza do tecido comercial, Visikol-1 e Visikol-2 (referido abaixo como solução-1 e 2 de solução).

A placenta humana é um vasto complexo de vasos sanguíneos localizados na interface entre o sangue da mãe intervillous e o desenvolvimento do feto. Estendendo-se para fora de sua inserção na placa coriônica, o cordão umbilical ramifica-se em uma rede de artérias e veias que ramify para cobrir a superfície coriônica com uma elaborada rede vascular. Suas extremidades então penetram para o interior ou a profundidade do disco placentário onde eles passam por várias gerações mais ramificação e terminam no terminal villi e suas redes capilares contidos, o site da troca de gases, nutrientes, e metabólica resíduos entre o sangue fetal e materno.

Insultos à rede capilar placentário durante o desenvolvimento tem consequências duradouras para a saúde do feto, recém-nascido e o adulto emergente 1,2,3. Tendo em conta as patologias relacionadas com a gravidez, como aborto, restrição de crescimento intra-uterino, diabetes pré-eclâmpsia e maternal 4,5,6 lá é um alto valor colocado no desenvolvimento de métodos de medição e caracterização de redes capilares das vilosidades da placenta. Um grande obstáculo é que redes vasculares placentárias abrangem uma vasta gama de escala. As redes de superfície vasculares podem ser tão grandes como 4-5 mm de diâmetro. Os capilares das vilosidades terminais são da ordem de 10 -20 µm de diâmetro; a placenta contém mais de 300 km de vasos sanguíneos 7. Presentemente, existem algumas técnicas de rápida e fácil de usar que podem capturar esses extremos da escala de navio. Até à data, apenas um pequeno número de vilosidades pode ser processado por microscopia. Por exemplo, Jirkovska et al enfoca as vilosidades da placenta no prazo, combinando a microscopia confocal com seriais seções óticas intervalos 1 µm obtidos de 120 µm de espessura seções; Não há dados sobre o número de amostras estudadas nem estatísticas foram fornecidos 8. Estruturas capilares foram identificadas, e contornos de vilosidades e capilares foram desenhados à mão, com traçados exportados para análise de imagem. Enquanto os autores discutem as implicações de suas descobertas para a “rede vascular vilosa crescente”, tais conclusões são problemáticos, quando apenas “termo” (36 + semana idade gestacional) tecido é estudado. Da mesma forma, Mayo et uml. e. Pearce et al baseou-se no tecido da mesma idade, para suas simulações de transferência de fluxo e oxigênio do sangue, mas suas análises eram limitados a apenas algumas termo, vilosidades terminal 9,10 . Stereology também foi aplicada ao estudo da estrutura dos vasos das vilosidades. Mas, novamente, o foco tem sido geralmente em gravidezes posteriores entregando bebês nascidos vivos, com uma ou mais gravidez complicações 11,12.

Até recentemente, microscopia confocal foi limitada a imagem para profundidades de tecido de 100-200 µm por causa da absorção de excitação e emissão de fluorescência pela tecido sobrejacente 13 . Apesar de tecido limpando e histologia 3D têm sido amplamente descritos na literatura e há inúmeros métodos para tecido limpar muitos são inadequados para uso com tecidos em geral, pois danificar irreversivelmente morfologia celular através do hyperhydration de proteínas ou remoção de lipídeos. Portanto, não é possível validar que estes resultados são indicativos do próprio tecido e não artefatos de processamento considerando nosso tecido em processo de compensação é uma técnica reversível que é capaz de validar contra histologia tradicional. Clareira de tecido geralmente envolve uma das três abordagens principais: 1) correspondência uniforme de índice de refração (RI) dos componentes do tecido por submersão em soluções correspondentes do RI, que remove o espalhamento de luz cumulativo causado da lente devido à contínua flutuação de baixo RI (citosol) e altas constituintes de RI (proteína/lipídios); 2) removendo componentes lipídicos por meio de incorporação em hidrogel e utilizando eletroforese/difusão para remover componentes lipídicos; 3) expansão/desnaturação da estrutura da proteína para permitir que o aumento da penetração dos solventes para incentivar a uniformidade do RI 13. Enquanto essas abordagens podem processar tecidos transparentes e permitem representações 3D de biomarcadores para ser gerado, essas representações 3D são de valor questionável clínico como é desafiador para determinar se estas imagens são indicativas de propriedades de tecido ou do tecido processo de compensação. Por outro lado, desde que nosso tecido de compensação é reversível padrão histológico e/ou imuno-histoquímica pode ser aplicado no mesmo tecido para avaliar se as alterações são clinicamente significativas.

Este estudo apresenta uma análise de 47 amostras das vilosidades distais obtido um total de 23 gravidezes clinicamente normais e electively encerrados entre 9-23 concluídas semanas gestação e duas entregas normais do termo. Imunofluorescência rotulagem do trofoblasto e endothelia permitiu uma análise quantitativa e automatizada de alterações nas redes de vascular vilosa e sua complexidade.

Com este protocolo, nós isolado e analisado villi terminal e suas redes capilares em uma escala não é possível anteriormente. Esta abordagem, quando aplicada ao desenvolvimento das vilosidades e capilar rede através de gestação irá identificar as propriedades que são a base para o nascimento de uma criança saudável. Quando aplicado a estudos de gravidezes complicadas, ele também esclarecer quando e como as patologias da placenta modificar as árvores das vilosidades e as redes de capilares que eles da bainha, e como estas afectem bem-estar fetal.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes do Instituto Estadual de Nova York para a pesquisa básica no Comitê de ética de pesquisa humana inabilidades desenvolventes. 1. das vilosidades árvore dissecação Enxágue o formol fixada tecido de placenta com salina desbastado de fosfato (PBS)14 para remover o formol e coloque em um prato de Petri no palco de um microscópio de dissecação. Usar o bisturi e pinça fina para arreliar o tecido de placenta separados para…

Representative Results

Os renderings 3D gerados de capilares em clusters de vilosidades terminais na placenta humana da idade gestacional de 8 semanas para a entrega do termo foram contados como clusters individuais e esqueletizados para análise de rede. As unidades funcionais da placenta (Figura 1A) são as árvores de vilosidades que são uma extensão dos navios de superfície onde eles penetraram o parênquima de placenta (Figura 1</strong…

Discussion

O Conselho de revisão institucional aprovado a coleção de tecidos das vilosidades da placenta para fixação de formol de gravidezes electively rescindidos. Antes que as cirurgias foram realizadas, uma breve revisão do registro médico observou idade materna, paridade e confirmada a ausência de médicos subjacente (por exemplo, hipertensão, diabetes e lúpus) ou do feto (anomalias cromossômicas ou estruturais, realizou-se um crescimento anormal). Folha de dados e quaisquer espécimes coletados foram rotul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pela Secretaria de estado de New York para povos com inabilidades desenvolventes e placentária Analytics LLC, New Rochelle, NY.

Materials

10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer Macron Fine Chemicals H-121-08 General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic
Scalpel blades ThermoFisher Scientific 08-916-5B No. 11
Scalpel ThermoFisher Scientific 08-913-5
Fine forceps Electron Microscopy Services 78354-119
Micro Tube (1.7 mL) PGC Scientifics 505-201
Phosphate buffered saline Sigma D8537 PBS
Pipette VWR 52947-948 disposable, 3ml transfer pipette
Triton X-100 Boehriner Mannheim 789 704 Dilute to 0.1% from stock
Goat Serum Gibco 16210-064 Dilute to 2% in PBS solution
Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) ThermoFisher Scientific MS-1352-RQ
Rabbit Anti-CD31 antibody Abcam ab28364
green emitting (520 nm) fluorochrome  Invitrogen A11017 Alexa-Fluor 488
infrared emitting (652 nm) fluorochrome Invitrogen A21072 Alexa Fluor 633
Ethanol alcohol 200 proof Pharmco-Aaper 111000200 Dilute down to lower concentrations using PBS as needed
Solution-1 Visikol Inc. Visikol Histo-1
Solution-2 Visikol Inc. Visikol Histo-2
Skyes-Moore chambers BellCo Glass Inc. P/N 1943-11111
25 gauge needle ThermoFisher Scientific 14-826AA BD Precision Glide Needes
3 mL syringe ThermoFisher Scientific 14-823-40 BD disposable syringe
PDMS silicon sheets McMaster-Carr P/N 578T31
confocal microscope Nikon Inc. Nikon C1 Confocal Microscope
Deconvolution software Media Cybernetics AutoQuant X22
Fiji image processing software free, Open source  software available at https://fiji.sc
Hematoxylin Leica Biosystems 3801570 Component 1 of SelecTech H&E staining system
Alcoholic Eosin Leica Biosystems 3801615 Component 2 of SelecTech H&E staining system
Blue Buffer Leica Biosystems 3802918 Component 3 of SelecTech H&E staining system
Aqua Define MCX Leica Biosystems 3803598 Component 4 of SelecTech H&E staining system
Immunohistochemistry detection system ThermoFisher Scientific TL-125-QHD UltraVision Quanto Detection System HRP DAB

References

  1. Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, 47-53 (2016).
  2. Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
  3. Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
  4. Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
  5. Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
  6. Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
  7. Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
  8. Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
  9. Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
  10. Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
  11. Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
  12. Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
  15. Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
  16. Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).

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Cite This Article
Merz, G., Schwenk, V., Shah, R., Salafia, C., Necaise, P., Joyce, M., Villani, T., Johnson, M., Crider, N. Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks. J. Vis. Exp. (133), e57099, doi:10.3791/57099 (2018).

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