Summary
تقدم هذه الدراسة وضع بروتوكول للأنسجة يمكن عكسها المقاصة، إيمونوستينينج، 3D--تقديم وتحليل شبكات الأوعية الدموية في المشيمة البشرية الزوائد عينات تتراوح بين 1-2 مم3.
Abstract
تبادل المغذيات والغاز بين الأم والجنين يحدث في الواجهة من الدم إينتيرفيلوس الأمهات والشبكة الشعرية فيلوس الواسعة التي تشكل جزءا كبيرا من حمة المشيمة البشرية. الشبكة الشعرية فيلوس القاصي هو المحطة إمدادات الدم الجنين بعد عدة أجيال من تفريع السفن تمتد خارجاً من الحبل السري. هذه الشبكة قد غمد خلوية متجاورة، طبقة حاجز تروفوبلست المخلوي، مما يمنع اختلاط دم الجنين ودم الأم الذي هو اغتسل بشكل مستمر. الإهانات لسلامة الشبكة الشعرية المشيمة، التي تحدث في اضطرابات مثل الأمهات مرض السكري وارتفاع ضغط الدم والبدانة، عواقب تلك المخاطر الصحية الخطيرة الحالية للجنين، وفيات الرضع، والكبار. لتحديد الآثار الهيكلية لهذه الإهانات بشكل أفضل، تم وضع بروتوكول لهذه الدراسة، أن يلتقط بنية الشبكة الشعرية بناء على أمر من 1-2 مم3 فيه أحد يمكن التحقيق معالمه طوبولوجي بتعقيداتها كاملة. لتحقيق هذا الهدف، يتم تشريح مجموعات من الزوائد الطرفية من المشيمة، وطبقة تروفوبلست والجهاز الشعرية إيمونولابيليد. ثم توضح هذه العينات مع أنسجة جديدة تطهير العملية التي تجعل من الممكن الحصول على رصات الصور [كنفوكل] إلى أعماق z ~ 1 مم. اﻷداءات ثلاثية الأبعاد هذه المكدسات ثم معالجتها وتحليلها لتوليد شبكة الشعرية الأساسية تدابير مثل الحجم وعدد الفروع الشعرية، ونقاط النهاية فرع الشعرية، كالتحقق من مدى ملاءمة هذا النهج وصف الشبكة الشعرية.
Introduction
فهمنا للمشيمة النامية وعن الأمراض، محدودة إلى حد كبير، الاستدلال على العلاقات المكانية بين الزوائد المتاخمة والشعيرات الدموية الواردة المستمدة من أقسام النسيجي. في هذه الدراسة، تناولنا هذه المسألة بوضع الوسائل اللازمة لتوليد اﻷداءات ثلاثية الأبعاد (3D) للشبكات الشعرية المشيمة البشرية التي تصلح لإجراء تحليلات لميزات الشبكة الشعرية (مثل المنطق التفريعي، صلابة). للقيام بذلك جمعنا بين تلطيخ إيممونوفلوريسسينت مع اثنين من المنتجات إزالة الأنسجة التجارية، فيسيكول-1 وفيسيكول-2 (المشار إليها أدناه كحل-1 والحل-2).
المشيمة البشرية مجمع واسعة من الأوعية الدموية التي تقع في مجال التفاعل بين الدم إينتيرفيلوس الأم والجنين النامي. تمتد خارجاً من أن الإدراج في لوحة المشيمة، الحبل السري وفروع في شبكة من الشرايين والاوردة التي تتشعب لتغطية سطح المشيمة مع وضع شبكة الأوعية الدموية. تحقق غاياتها ثم تخترق أسفل الداخلية أو عمق القرص المشيمة حيث يخضع لعدة أجيال أكثر التفريع وينتهي في الزوائد الطرفية وشبكاتها الشعرية الواردة، الموقع لتبادل الغازات، المواد الغذائية، والأيضية النفايات بين دم الأم والجنين.
الإهانات إلى شبكة الشعيرات الدموية المشيمية خلال التنمية عواقب دائمة على صحة الجنين والرضع حديثي الولادة و الكبار الناشئة 1،،من23. ونظرا للأمراض المرتبطة بالحمل مثل الإجهاض، وتقييد النمو داخل الرحم، 4،السكري مقدمات الارتعاج والأمهات5،6 هناك قيمة عالية على وضع أساليب لقياس و توصيف الشبكات الشعرية فيلوس المشيمة. حاجز رئيسي أن شبكات الأوعية الدموية المشيمية تشمل طائفة واسعة من النطاق. يمكن أن تكون شبكات الأوعية الدموية السطحية كبيرة كما 4-5 مم في القطر. الشعيرات الدموية فيلوس المحطة الطرفية يتم بناء على أمر من 10-20 ميكرومتر في القطر؛ تحتوي المشيمة على أكثر من 300 كيلومتر من الأوعية الدموية 7. وفي الوقت الحاضر، هناك تقنيات سهلة الاستخدام وسريعة القليلة التي يمكن التقاط هذه النهايات من حجم السفينة. وحتى الآن، يمكن أن يصبح سوى عدد صغير من الزوائد بالفحص المجهري. على سبيل المثال، جيركوفسكا et al. ركز على الزوائد المشيمية في الأجل، الجمع بين الفحص المجهري [كنفوكل] مع أقسام الضوئية المسلسل على 1 ميكرومتر فترات تم الحصول عليها من 120 ميكرومتر سميكة الأقسام؛ لا توجد بيانات عن عدد العينات التي درست ولا إحصاءات قدمت 8. وحددت هياكل الشعرية، وملامح من الزوائد والشعيرات الدموية كانت مرسومة باليد، مع وسم تصديرها لتحليل الصور. بينما الكتاب مناقشة المترتبة على نتائجها "شبكة الأوعية الدموية فيلوس المتزايد"، هذه الاستنتاجات إشكالية عندما فقط "مصطلح" (36 + الأسبوع الحملي العمر) درس الأنسجة. وبالمثل، مايو كلينيك etلام وبيرس et al. تعتمد على الأنسجة من نفس الفئة العمرية، لهذه المحاكاة لنقل الدم تدفق والأكسجين، ولكن تحليلاتها محدودة لمدة قليلة فقط، الزوائد الطرفية 9،10 . كما طبق ستيريولوجي لدراسة هيكل السفن فيلوس. ولكن مرة أخرى، انصب التركيز عموما على الحمل فيما بعد تسليم الرضع قوبلن مع واحد أو أكثر الحمل مضاعفات 11،12.
حتى وقت قريب، الفحص المجهري [كنفوكل] اقتصر على التصوير إلى أعماق الأنسجة من 100-200 ميكرون بسبب امتصاص إثارة والانبعاثات من الأسفار ب الأنسجة السطحية 13 . على الرغم من إزالة الأنسجة والأنسجة ثلاثية الأبعاد قد وصفت على نطاق واسع في الأدب، وهناك أساليب عديدة لانسجة تطهير العديد غير صالحة للاستخدام مع الأنسجة بشكل عام، كما أنهم لا رجعة فيه الضرر مورفولوجيا الخلوية من خلال هايبرهيدريشن لإزالة الدهون أو البروتينات. ولذلك، من غير الممكن للتحقق من أن هذه النتائج إرشادية للأنسجة نفسها ولا التحف من تجهيز بينما الأنسجة لدينا عملية مسح تقنية عكسها قادرة على التحقق من صحة ضد الأنسجة التقليدية. إزالة الأنسجة عموما ينطوي على إحدى الطرق الرئيسية الثلاث: 1) مطابقة موحدة للانكسار (RI) لمكونات الأنسجة بغمر في حلول مطابقة ري، الذي يزيل بعثرة الخفيفة التراكمية تسبب من لينسينج بسبب استمرار تقلب ري منخفضة (cytosol) ومكونات ري (بروتين/الدهون) عالية؛ 2) إزالة مكونات المادة الدهنية عن طريق التضمين في المائية واستخدام التفريد/نشر لإزالة مكونات الدهون؛ 3) توسيع هيكل البروتين للسماح بزيادة تغلغل المذيبات لتشجيع التوحيد ري 13/تمسخ. في حين أن هذه النهج يمكن أن تجعل الأنسجة شفافة وتسمح بتمثيل ثلاثي الأبعاد للمؤشرات الحيوية توليد، هذه تمثيلات ثلاثية الأبعاد ذات قيمة السريرية مشكوك فيها كما أنها تشكل تحديا لتحديد ما إذا كانت هذه الصور يدل على خصائص الأنسجة أو أنسجة تطهير العملية. من ناحية أخرى، نظراً للأنسجة لدينا مسح عكسها يمكن تطبيق معيار النسيجي و/أو إيمونوهيستوتشيميستري للنسيج نفسه تقييم ما إذا كانت التعديلات الهامة سريرياً.
تقدم هذه الدراسة تحليلاً لعينات فيلوس القاصي 47 التي تم الحصول عليها من إجمالي 23 سريرياً العادية والانتخابية إنهاء الحمل بين 9-23 إتمام أسبوعا من الحمل والشحنتين العادي المدى الكامل. وقد مكن الفلورة وسم تروفوبلست والجهاز إجراء تحليل كمي والآلي من تغييرات في شبكات الأوعية الدموية فيلوس وتعقيدها.
مع هذا البروتوكول، ونحن عزل وتحليل الزوائد الطرفية وشبكاتها الشعرية على نطاق لا يمكن سابقا. وسيحدد هذا النهج، عند تطبيقها على تطوير شبكة فيلوس والشعرية عبر الحمل تلك الخصائص التي هي الأساس لولادة طفل سليم. عند تطبيقها على دراسات لحالات الحمل معقدة، فإنه سيوضح أيضا عند وكيفية تعديل الأمراض المشيمية الأشجار فيلوس والشبكات الشعرية أنها غمد، وكيف هذه تؤثر على رفاه الجنين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية لمعهد الدولة لنيويورك "البحوث الأساسية" في لجنة أخلاقيات البحوث البشرية العاهات الخلقية.
1. تشريح شجرة فيلوس
- شطف الفورمالين الثابتة أنسجة المشيمة مع الفوسفات مصقول المالحة (PBS)14 لإزالة في الفورمالين ووضعه في طبق بتري في مرحلة مجهر التشريح. استخدام المبضع، والملقط غرامة لندف أنسجة المشيمة بعيداً لتحديد موقع الأشجار فيلوس (الهياكل المتفرعة ثريدليكي الأبيض). تشريح بقطعة من شجرة زغابة (طويلة عدة مم) ونقل الأنسجة PBS ~ 1 مل تحتوي على أنبوب الصغرى.
2. تلوين إيمونوفلوريسسينت
- مع ماصة، إزالة برنامج تلفزيوني واستبدل ببرنامج تلفزيوني جديد. اسمحوا الوقوف لمدة 10 دقيقة مع دوامات عرضية. كرر مرة أخرى.
ملاحظة: هذه الخطوة وكل الخطوات الأخرى تتم في درجة حرارة الغرفة فيما عدا الحضانة جسم الأولية. - استخدام ماصة، إزالة واستبدال برنامج تلفزيوني مع برنامج تلفزيوني 0.1% تريتون X100 + 2% الماعز المصل (برنامج تلفزيوني-تي-فئة الخدمات العامة) بيرميبيليزي الربط غير محددة الأنسجة وكتلة الأجسام المضادة الثانوية. احتضان لمدة 30 دقيقة.
- استبدال برنامج تلفزيوني-تي-ع مع برنامج تلفزيوني المحتوية على مصل الماعز 2%، على حد سواء الماوس [مونوكلونل] مكافحة--CK7 وارنب المضادة-CK7.
- احتضان الأنسجة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إزالة الأجسام المضادة المتبقية بالغسيل مع برنامج تلفزيوني-فئة الخدمات العامة لمدة 10 دقائق مع دوامات عرضية.
- إزالة برنامج تلفزيوني-فئة الخدمات العامة، واستبدال مع برنامج تلفزيوني-فئة الخدمات العامة التي تحتوي على كلا الماعز الماوس المضادة مفتش مقرونا انبعاث الخضراء (520 nm) fluorophore والماعز الأرنب المضادة مفتش مقرونة انبعاث الأشعة تحت الحمراء (652 nm) فلوروفوري.
- قم بإزالة الأجسام المضادة بتكرار الخطوة 2، 1.
- تخزين الأنسجة إيمونولابيليد في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
3-توضيحاً للأنسجة
- تغسل العينات 3 مرات مع برنامج تلفزيوني في فترات بعد 10 دقائق.
- يذوي الأنسجة عن طريق إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة والاستعاضة عنه بنسبة 50% إيثانول (يمكن استخدام الميثانول كذلك). احتضانها للحد الأدنى 10 استبدال طازجة 50% إيثانول واحتضانها للحد الأدنى 10 تكرار هذا مرة أخرى ليصبح مجموع إينكوبيشنز 3. كرر إينكوبيشنز مع 70%. ثم استبدال مع الإيثانول 100% واحتضان لمدة 15 دقيقة (بدلاً من الميثانول يمكن استخدامها).
- مع ملقط غرامة ذات الرؤوس، نقل الأنسجة إلى أنبوب مايكرو جديدة تحتوي على ~ 1 مل الحل-1 ح 4.
- مع الملقط الجميلة ذات الرؤوس، نقل الأنسجة إلى طازجة اﻷنبوبية الصغيرة التي تحتوي على حل-2 ل ~ ح 4.
ملاحظة: عند تخزينها في الظلام، الفلورة مستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 أشهر على الأقل. - لا تخلط مع أي محلول مائي، (مثل تصاعد المتوسطة) كما سيتم تطهير فقدت.
4-تصاعد للفحص المجهري
- عدم تحميل الأنسجة بين شريحة زجاجية قياسية وساترة كما الأنسجة اللينة ومشوهة بسهولة.
- يشير إلى الرقم 5ب وجبل الأنسجة في دائرة سايكس-مور على النحو التالي؛
- مع الملقط الجميلة ذات الرؤوس مكان ساترة جولة 25-مم في الدائرة قاعدة.
- مع ملقط مقلوب غرامة مكان طوقا المطاط في القاعدة ساترة.
- مع ماصة مكان قطره (~ 40 ميكروليتر) الحل-2 في مركز ساترة.
- مع الملقط مقلوب غرامة نقل أنسجة قطعة من الحل-2 للهبوط في مركز ساترة.
- مكان ساترة ثانية على رأس طوقا.
- الموضوع قفل حلقة في الجزء العلوي من قاعدة ضغط كوفيرسليبس وطوقا حتى شركة.
ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم المبالغة في تشديد أو سوف تتحطم ساترة. - أدخل إبرة عيار 22 في منفذ على القاعدة، ومن خلال طوقا.
- ملء المحاقن 3 مل مع ~ 1.5 مل من الحل-2.
- جبل إبرة قياس 25 في المحاقن.
- أدخل إبرة حقنه بمنفذ المقابلة وعن طريق طوقا.
- التأكد من أن الجو في الغرفة هو التنفيس عن طريق الإبرة 25-قياس أخرى، حقن التعبئة 2and حل الدائرة بلطف.
- إزالة الإبر والمحاقن ووضع الدائرة على شريحة زجاجية كبيرة في مرحلة مجهر [كنفوكل].
- وبدلاً من ذلك، قطع الآبار المخصصة من صفائح السيليكون PDMS.
- مع مقص قص 25.4 × 25.4 مم2 قطعة من ورقة PDMS.
- مع مشرط قطع ~ 12.7 × 12.7 مم2 جيدا في القطعة.
- اضغط القطعة بثبات إلى شريحة مجهر.
- سد البئر إلى الأعلى مع الحل-2.
- نقل قطعة النسيج من مايكرو-الأنبوبة إلى مركز البئر.
- مع الملقط الجميلة ذات الرؤوس مكان ساترة على رأس البئر يكون الجزء السفلي من ساترة ترطب مع الحل-2.
- جبل الجمعية "سايكس مور الدائرة" مع الأنسجة في مرحلة مجهر [كنفوكل].
5-[كنفوكل] مجهرية
- تجلب الأنسجة في الدائرة في التركيز مع هدف 10 x.
- نقل مرحلة مجهر صعودا وهبوطاً من خلال المستوى البؤري لقياس المسافة بين أعلى وأسفل للأنسجة.
- نقل المسرح في 2.5 ميكرون الخطوات لتجميع صورة [كنفوكل] ملف يحتوي على مجموعة من الصور عن طريق الأنسجة من أعلى إلى أسفل.
6-عكس تطهير
- عكس تطهير بنقل الأنسجة الأنبوبة الصغيرة التي تحتوي على > 20 x حجم الإيثانول 100%. في ح 1 استبدال الفواصل مع الإيثانول 70%، ثم الإيثانول 50%، وأخيراً برنامج تلفزيوني. تخزين في 4 درجات مئوية في الظلام.
ملاحظة: الآن عملية النسيج للتضمين القياسية البارافين، تقطيع وغذائها أو تلطيخ المناعية histochemical.
7-deconvolution
ملاحظة: للخطوات التالية، أوامر البرمجيات، وعلامات التبويب والقوائم المنسدلة بالخط المائل.
- بدء تشغيل البرنامج deconvolution وفتح ملف الصورة.
- أدخل المعلمات المسرودة في الإطار 'سامرص'.
- ل ' إدخالالمباعدة في فوكسل x و y و z الأبعاد في ميكرومتر.
- لكل قناة لون، حدد صبغة الفلورسنت التي تستخدم إيمونوستينينج من القائمة المنسدلة.
- 'طريقة'، حدد ليزر المسح [كنفوكل] من القائمة المنسدلة.
- 'الهدف عدسة، حدد 10 x من القائمة المنسدلة.
- '"المتوسطة الغمر"'، حدد الهواء من القائمة المنسدلة.
- انقر فوق 'تطبيق' زر.
- انقر فوق علامة التبويب 'نديكونفولوتيو'.
- انقر فوق '3D Deconvolution' في القائمة المنسدلة.
- في '3D-Deconvolution' تأمين نافذة الإعدادات: 1) التكيف PSF المكفوفين، PSF 2) النظرية، 3) استخدام (الافتراضي PSF التكيفية، 10 تكرارات، الضوضاء المتوسطة)، واسم القاعدة 4).
- انقر فوق 'زر التحقق الأخضر' بدء تشغيل البرنامج.
- عند الانتهاء، كرر الخطوات-7.6 7.3 إعادة تشغيل البرنامج. عند الانتهاء من إعادة تشغيله للمرة الثالثة والأخيرة.
- في 'إدارة البيانات' إطار، انقر على الملف مسبوقة ب "10-10-10-".
- انقر فوق 'ملف' علامة التبويب، ثم انقر فوق 'حفظ باسم.
- في إطار 'sحفظ أ' حدد '8 بت عدد صحيح غير موقعة' من '"نوع البيانات"' القائمة المنسدلة وانقر فوق على الحفظ.
8. معالجة الصورة
- بدء تشغيل البرنامج فيجي.
- انقر فوق 'ملف'، انقر فوق 'مفتوحة' وحدد ملف الصورة ديكونفولفيد، وانقر فوق 'مفتوحة' زر في 'مفتوحة' نافذة.
- انقر فوق ' ملفالصورة/اللون/تقسيم قنوات وتحويل ألوان الصورة إلى ثلاثة ملفات جديدة تحتوي على لون واحد فقط. حفظ ملف الصورة الحمراء التي تحتوي على مجموعة الصور الشعرية فيلوس إيمونولابيليد. حذف ملفات الصور الخضراء والزرقاء.
- طرح fluorescence الخلفية من ملف صورة حمراء مع: 'خلفية عملية/استقطاع'.
- في القائمة المنسدلة تعيين نصف قطر الكرة المتداول بمقدار 10 بكسل.
- اترك الخيارات القائمة 4 دون رادع، وانقر فوق 'موافق'.
- انقر فوق 'نعم في القائمة"عملية مكدس الذاكرة المؤقتة".
- إزالة الأنسجة الكامنة الفلورية (أوتوفلوريسسينسي) عن طريق فتح 'الصورة/ضبط-السطوع' القائمة وضبط إعدادات الحد الأدنى والحد الأقصى، والسطوع والتباين. احرص على عدم إزالة أي من الفلورة الشعرية.
- تصغير المتبقية الأسفار غير ذي صلة بفتح 'الصورة/ضبط/عتبة' القائمة وضبط مربعات التمرير مثل أن يتم إبراز الفلورة الشعرية. تحقق من 'الخلفية المظلمة' مربع وانقر فوق 'تطبيق'. على 'تحويل إلى القائمة المنسدلة ثنائي' الاختيار القائمة 'خلفية سوداء' مربع وانقر فوق 'موافق'. حفظ ملف صورة بالأبيض والأسود (ثنائي) لتحليلات أدناه.
9-تحليل
- عد الكائن وسكيليتونيزيشن.
- حدد ملف الصورة الثنائية التي تم إنشاؤها في الخطوة 8.1.8.
- انقر فوق 'تحليل/OC 3D خيارات والاختيار فقط'حجم ' و'تخزين النتائج... ' مربعات القائمة المنسدلة. التأكد من أن مربع 'إظهار أرقام' غير محدد. انقر فوق 'موافق' زر.
- Cliجك في 'تحليل 3D كائنات العداد'. في القائمة المنسدلة، قم بتعيين '"تصفية الحجم": الحد الأدنى' إلى 5000. ضمان أن 'استبعاد الكائنات على حواف مربع غير محدد. تحقق من أن 'sالكائن، وإحصاءات و'ملخص ' يتم التحقق من مربعات. انقر فوق 'موافق' زر.
ملاحظة: قد يستغرق هذا عدة دقائق اعتماداً على تكوين الكمبيوتر وحجم الملف. - حفظ جدول الإحصاءات وملف مخطط الكائنات.
- حدد ملف مخطط الكائنات. انقر فوق 'سكيليتونيزي/الإضافات/هيكل عظمى 2D 3D' سكيليتونيزي الشبكة الشعرية في الملف الثنائي. انقر فوق 'ملف/حفظ باسم. حدد 'Tiff...' في القائمة المنسدلة. في حفظ كنافذة TIFF إضافة "سكيل-" إلى اسم ملف خريطة الكائن، وانقر فوق 'حفظ' زر.
- انقر فوق 'تحليل/الهيكل العظمى/تحليل هيكل عظمى 2D 3D'. قبول الإعدادات الافتراضية القائمة المنسدلة وانقر فوق 'موافق' زر. حفظ الجدول فرع 'المعلومات' ، ' جدولالنتائج ، وهما ملفات الإخراج (سكيل--الكائنات المسماة-الهياكل العظمية وهيكل عظمى معلم).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اﻷداءات ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها من الشعيرات الدموية في مجموعات من الزوائد الطرفية في المشيمة البشرية من العمر الحملي 8 أسابيع للتسليم الأجل كانت تحسب كمجموعات فردية والعظمية لتحليل الشبكة. هي الوحدات الوظيفية للمشيمة (الشكل 1أ) الأشجار الزوائد التي هي امتداد لسفن السطح حيث أنها قد تغلغلت حمة المشيمة (الشكل 1ب، والموسع في ج 1). وكانت قطعة من الجزء الأعلى من شجرة تشريح (Figure1D و 1E) ثم إيمونولابيليد لإظهار طبقة تروفوبلست زغابة وفي الشعيرات الدموية (الشكل 2). وكان حاسما بالنسبة للتقديم ثلاثي الأبعاد القدرة على استخدام هذا النظام لإزالة الأنسجة.
مع النظام [كنفوكل] المستخدمة لهذه الدراسة، لا يمكن اكتساب الفلورة من الأنسجة المدفونة في أعماق ~ 100 ميكرون أو أقل (الشكل 3أ). في أعماق أعمق، تمتصه الأنسجة السطحية. وفي المقابل، يسمح الأنسجة المجازين (الشكل 3ب) للتصوير بعمق أعمق بكثير.
الأنسجة المطهرة يمكن إرجاعها إلى حالتها التي لم تتم إزالتها قبل القيام بالخطوات الجفاف في الاتجاه المعاكس والعودة إلى برنامج تلفزيوني. للتحقق من صحة هذا الانعكاس، كان imbedded الأنسجة المزالة في البارافين، مقطوع وملطخة إيممونوهيستوتشيميكالي CK7 (الشكل 4أ) أو الأشيع الملون مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) (الشكل 4ج). وفي كلتا الحالتين، تلطيخ الأنسجة "لغم" كان مماثلاً للفروع التقليدية ملطخة CK7 (الشكل 4ب أو ح & ه (الشكل 4د) التحقق من أن المقاصة لا كثيرا تغير الأنسجة.
بسبب حجمها، أدى متصاعدة عينات الأنسجة على شريحة مجهر قياسية مع ساترة تسطيح غير مقبول. وهذا يمكن التغلب عليه باستخدام "الدوائر مور سايكس" أن تستوعب القطع تصل إلى عمق 4 مم (الشكل 5ب)، أو دوائر متفاوتة الأحجام وأعماق أدلى باللكم من الآبار في سيليكون المطاط صفائح (الشكل 5ألف).
واستخدمت اﻷداءات ثلاثية الأبعاد من الكدسات [كنفوكل] (الشكل 6A) لفصل الشبكات الشعرية، (الشكل 6ب) التعرف الزوائد مجموعات (الكائنات، الشكل 6ج)، عد المجموعات زغابة و سكيليتونيزي الشبكات الشعرية (الشكل 6د). اﻷداءات ثلاثية الأبعاد المتحركة هذه مدرجة في قائمة/Video/Figures المتحركة.
ويعتبر قدرتنا على صورة مفيدة إلى أعماق ~ 1 مم في اﻷداءات ثلاثية الأبعاد التي تظهر في أربعة ملفات mp4 (انظر المواد التكميلية). الصورة المحددة المستخدمة كانت حجم 1.47 ملم3 (10 × عرض الحقل الهدف التربيعية مرات عمق z أو 1.25 مم ×2 مم 0.94). إظهار ملفات mp4 أن الأنسجة فيلوس إيمونوستينيد الأصلي هو موزعة بعمق كامل لوحدة التخزين (original.mp4)، كما كان الأنسجة الشعرية فيلوس الموزعة على نحو مماثل (red.mp4)، الكائنات الشعرية المقابلة من الكائن عد التحليل (objects.mp4) وشبكاتها العظمية (skeleton.mp4). هذا التوزيع الحجم والأنسجة نموذجية لمجموعات لدينا صورة [كنفوكل]. على سبيل المثال، هي z-الأعماق لمجموعات الصور المستخدمة الرقم 7 ملم 0.95 ل 8 أسابيع، 1.045 مم لمدة 14 أسبوعا، 1.242 مم لمدة 17 أسبوعا، 1.092 ملم لمدة 22 أسبوعا و 0.94 مم للمصطلح (عرض الحقل هو نفسه بالنسبة للجميع).
وتبين النتائج في الجدول 1 مدى ملاءمة تطبيق تحليلات شبكة للاداءات ثلاثية الأبعاد من الزوائد شبكات الأوعية الدموية. بالإجمال هذه الدراسة تحليل شبكات الزوائد الشعرية 47 رصات الصور التي تحتوي على مجموعات زغابة ~ 900 في عينات تتراوح من 8 إلى 36 أسبوعا من عمر الحمل. الشكل 7 يوضح كيفية تغيير الشبكات السفينة عبر العمر الحملي. كل مكدس يتضمن مجموعة من الصور ~ 400 تشمل Z-عمق ~ 1000 ميكرومتر. يتم تلخيص النتائج في الجدول 1. وحدات التخزين هي متوسط الحجم الإجمالي للمجموعات زغابة في المكدس. 3 أعمدة أخرى تظهر النتائج لثلاثة تدابير الشبكة التي تم الحصول عليها للكائنات العظمية. وهذه التدابير الأساسية البسيطة، ويمكن بسهولة توسيعها إلى تدابير أكثر شمولاً وتعقيداً.
الشكل 1 . العيانية لآراء مجهرية من شبكات الأوعية الدموية المشيمية البشرية. (أ) عرض سطح اللوحة المشيمة المشيمة البشرية العادية. وهو يبين شبكة سفن السطح يشع خارجاً من الإدراج الحبل السري. (ب) قطعة من المشيمة التي ستستخدم للتشريح. لوحة المشيمة الحق والكامنة وراء المشيمة حمة على اليسار مع الأشجار زغابة (أنابيب بيضاء) والزوائد الطرفية وردية، وكثافة. (ج) طريقة عرض موسع من (ب) تسليط الضوء على الأشجار زغابة الأبيض. (د) 20 x صورة من الزوائد الطرفية قليلة وعلى الشعيرات الدموية. (ه) الجزء القاصي من شجرة الزوائد حيث أنه ينهي في مجموعات الزوائد الطرفية. بعض الشعيرات الدموية التي تحتوي على الكريات الحمراء الجنينية مرئية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . مثال نموذجي من الزوائد المشيمية إيمونولابيليد. طبقة تروفوبلست الخارجي باللون الأخضر والشعيرات الدموية (الداخلية) باللون الأحمر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . آراء متعامد (س ص [1]، xz [2]، [3] yz) أنسجة المشيمة. (أ) قبل و (ب) بعد تطهير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . مقارنة تلطيخ أقسام الأنسجة التقليدية وعكس الأنسجة المطهرة. التقليدية المناعي تلطيخ لقسم من أنسجة المشيمة الأجل مع CK7 (A). عكس CK7 الملون الأنسجة بعد تطهير (ب). تلطيخ نسيجية التقليدية من مقطع المشيمة مع ح & ه (ج). ح & ه تلطيخ إيممونوهيستوتشيميكالي بعد أن يتم تطهير عكس (د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . هناك خياران لتركيب الأنسجة للفحص المجهري [كنفوكل]- (أ) سيليكون المطاط ورقة (ب) سايكس مور للدائرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 . الحد الأقصى من إسقاطات لتجهيز وتحليل رصات الصور [كنفوكل]. مجموعة [كنفوكل] الصورة الأصلية (A). (ب) فصل القناة الحمراء. (ج) خريطة للكائنات التي تم جردها. (د) العظمية الكائنات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 . الممثل إسقاطات الحد الأقصى من مداخن [كنفوكل] اكتسبت في الإعمار الحملية عدة- (أ) 8 أسابيع، (ب) 14 أسبوعا، (ج) 17 أسبوعا، (د) 22 أسبوعا و (ﻫ) 36 أسبوعا الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الجمعية العامة (أسابيع) | يعني وحدة التخزين (مم ^ 3) | عادي تطوير وحدة التخزين (مم ^ 3) | يعني الفروع | عادي تطوير الفروع | يعني فروع/مم ^ 3 | عادي تطوير فروع/م ^ 3 | يعني فرع الطول (مم) | طول الفرع تطوير عادي (مم) |
| 8 | 0.00059 | 0.0125 | 113.44 | 192.74 | 304321.3 | 15465.9 | 0.0451 | 0.0178 |
| 10 | 0.00074 | 0.016 | 182.09 | 349.61 | 346849 | 21884.81 | 0.0325 | 0.0132 |
| 12 | 0.00103 | 0.044 | 226.56 | 788.53 | 306438.7 | 17924.66 | 0.0434 | 0.0835 |
| 14 | 0.00108 | 0.0219 | 233.59 | 430.54 | 344598.1 | 19680.42 | 0.031 | 0.016 |
| 16 | 0.00065 | 0.0106 | 180.81 | 265.26 | 392412 | 25007.06 | 0.0271 | 0.0049 |
| 18 | 0.00056 | 0.0124 | 154.43 | 313.7 | 355264 | 25370.6 | 0.0283 | 0.0041 |
| 22 | 0.00089 | 0.0229 | 161.95 | 494.21 | 290176 | 21602.3 | 0.0383 | 0.013 |
الجدول 1. الممثل نتائج تحليل العينات زغابة المجازين في مختلف الإعمار الحملية الشبكة. يوضح الجدول المتوسطات لحجم، وعدد الفروع، فروع كل وحدة طول الصوت وفرع لمسح العينات زغابة في الإعمار الحملية من 8 من خلال 22 أسبوعا من الحمل.
"المواد التكميلية": الأرقام المتحركة والفيديو عرض 3D اﻷداءات من الكدسات [كنفوكل] في الشكل 6.
ألف رصة [كنفوكل] الأصلي. (Original.mp4). من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
ب-فصل قناة الأحمر (Red.mp4) الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
ج-"تحديد الكائنات" (Objects.mp4) الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
د. سكيليتونيزيد الكائنات (Skeleton.mp4) الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وأقر "المجلس استعراض المؤسسية" جمع الأنسجة فيلوس المشيمية للتثبيت الفورمالين من الانتخابية إنهاء الحمل. قبل الإجراءات التي أجريت، استعراضاً موجزاً للسجل الطبي أشار إلى سن الأمهات، التكافؤ، وأكد عدم وجود أي الطبية الأساسية (مثلارتفاع ضغط الدم، والسكري ومرض الذئبة) أو الجنين (الشذوذ الهيكلي أو الكروموسومات، كان أداء النمو غير طبيعي). تم تسمية ورقة البيانات وأي من العينات التي تم جمعها فقط مع "دراسة" معرف "." وهكذا، كانت جميع العينات إزالة الألغام التي تم تحديدها قبل أن تغادر في جناح التشغيل. وقد جمعت الزوائد المراقبين مدربين (CMS)؛ وأزيلت أوروبية ولوحة المشيمة، وجمعت فقط الحرة كتل عائمة فيلوس.
عند إزالة الأنسجة مع التقنيات المستندة إلى المذيبات، وهناك عدة اعتبارات هامة. أولاً، يجب أن تكون الأنسجة المجففة بما فيه الكفاية لمسح، حيث يجب غسل الأنسجة من خلال تدرج من الإيثانول (أو الميثانول) إلى 100%. عند استخدام الإيثانول، من الأهمية بمكان استخدام "الصف الكاشف الجافة الإيثانول، الذي يحتوي على لا توجد مياه. من المهم أيضا أن استخدام كمية كافية من التجفيف الحل في كل خطوة؛ حوالي 10-20 x حجم الأنسجة مطلوب لنجاح الجفاف. سيؤدي إلى الجفاف غير مكتملة للأنسجة في مظهر غائم بعد المقاصة. ثمة اعتبار هام آخر هو تركيز الأجسام المضادة تستخدم لتلطيخ. جسم المفرط يمكن أن يسبب ملزمة غير محددة وغير مكتملة اختراق الأنسجة بسبب حجب قنوات نشر. أقل من تركيز كاف من جسم سيؤدي إلى تلطيخ غير كاملة كما الجسم استنفدت قبل الوصول إلى مركز الأنسجة. ينبغي أن يكون الأمثل تركيز الأجسام المضادة على قطع صغيرة من الأنسجة قبل الارتقاء إلى عينات كبيرة. على الرغم من أن هناك القليل جداً من السيارات-الأسفار في المشيمة غير المثبتة الطازجة يمكن أن يكون مشكلة كبيرة في الأنسجة الثابتة، خاصة بعد فترات طويلة في مثبت. المستويات المفرطة، يمكن أن تخفي أوتوفلوريسسينسي نيون إشارات مع الخلفية. حين بارزة في 488 و 543 شمال البحر الأبيض المتوسط، فإنها أقل بكثير عند أطوال موجية أعلى مثل 633 نانومتر. أفضل طريقة لتجنب أوتوفلوريسسينسي القيام بكافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة أو أدناه.
المشيمة نسيج لينة جداً، وفتح في أن يتم فصل جميع الشعيرات الدموية زغابة من الفضاء دم الأم بغشاء رقيق تروفوبلست. وهكذا، اختراق الأجسام والأنسجة تبادل الحلول السريعة نسبيا وهي الأمثل مع الحضانة بين عشية وضحاها. تطبيق البروتوكول على الأنسجة الصلبة مثل الدماغ، الكلي سوف تتطلب الحضانة أطول بشكل ملحوظ الأوقات التي يجب أن تحدد تجريبيا.
على الرغم من أن مسح إمكانية عدم وضوح الأنسجة ووصمة عار مع إجراءات قياسية نسيجية قد سمح لنا بالتحقق من صحة عملية تطهير محدود في ذلك أنه لا يمكن لتتناسب مع قسم الملون من الأنسجة المزالة بالمقابل "شريحة" بعد في مجموعة صورة [كنفوكل]. ستكون هناك حاجة إلى هذه المراسلات إذا أردنا أن تكون قادرة على تتصل تغييرات محددة الشبكة الشعرية وجدت في اﻷداءات ثلاثية الأبعاد مع نظرائهم في أقسام نسيجية القياسية.
في هذا التطبيق، يقتصر الأنسجة عملية مسح z-أعماق ~ 1 مم بعدها يزيد امتصاص الإثارة والانبعاثات حتى أنها فقدت تماما. هذا ويمكن الحصول على تعويض جزئي مع البرنامج المساعد فيجي "ضبط تباين المكدس". هذه الخسارة هي جزء من سبب هذا النظام [كنفوكل] 12 عاماً والأهداف الجوية التي استخدمت لتصوير. الأهداف الجوية التي استخدمت لتصوير يكون عدم تطابق ري مع ري الحل-2 عالية (ري = 1.52) الذي يسبب خسارة في تصوير عمق. أي من العديد من النظم المتاحة حاليا (ورقة التقليدية، على ضوء الفحص المجهري، تصوير اثنين-فوتون يمكن تقديم أعماق z تحسنت بشكل ملحوظ، جودة الصورة وطائفة من الفلورة وإدارة أوتوفلوريسسينسي عندما تقترن بأعلى ري مطابقة الأهداف ينخفض.
وجمعت كل الرصات مع هدف 10 x (نا = 0.30، العمل عن بعد (WD) = 16 مم) الذي وضع أية قيود على حجم العينة. واستخدمت أحياناً هدفا 20 x مع WD 1 مم. في تكبير أعلى من هذا يقلل يسترن ديجيتال بأنه يحول وحدات تخزين أكبر من الزوائد مفردة.
هذا البروتوكول يمكن الآن جمع مجموعات الصور مع وحدات التخزين التي 5-10 إضعاف أعلى من الحصول عليها سابقا. في هذا النطاق، يمكن أن تحقق الربط الشبكي والأوعية الدموية الجماعية لمئات الزوائد الطرفية.
وهذا سيؤدي بدوره نماذج جديدة ومحسنة من هذه الميزات الهامة كجملة-ونشر الأوكسجين إينترافيلوس استناداً إلى هندسة إينتراكابيلاري كما فعلت سابقا في 2D في عينات الأنسجة الروتينية في 10-20 x 15 وفعل الآخرون أصغر بكثير عينات 8،16. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن المعونة المداخن التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول في نمذجة الهندسة إينتيرفيلوس. على الصعيد من العينات المستخدمة في هذه الدراسة، إينتيرفيلوس تدفق بطيء جداً تصور باستخدام تقنيات دوبلر أو غيرها. ومع ذلك، سواء كانت هندسة إينتيرفيلوس يسمح تعرض موحدة لكل سطح فيلوس (وفي الشعيرات الدموية السفلي) إلى تدفق الأمهات أو ما إذا كانت مساحة إينتيرفيلوس ضئيلة جداً أو مزدحمة للغاية يجعل نقل الأم الجنين أقل كفاءة يتم بعد درست.
في المستقبل، سيتم استخدام هذا البروتوكول وضع تعريف أفضل لتنمية المفرج المشيمة أثناء تطوير وتحديد مسارات لتغييرات شبكة الأوعية الدموية عبر الحمل العادي. ثم يمكن قياس هذه المسارات في الحمل باثولوجي تقديم معلومات عن عندما تبدأ مضاعفات في الحمل الحمل لتأثير المشيمة الأوعية الدموية فيلوس القاصي، وكيفية تغيير تلك الانحرافات الدالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد "مكتب نيويورك التابع للدولة" هذا العمل للأشخاص ذوي العاهات الخلقية والمشيمة تحليلات LLC، نيو روشيل، نيويورك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, Suppl 1 47-53 (2016).
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
