Tredimensionell Rendering och analys av Immunolabeled, klargöras mänskliga placenta villösa vaskulär nätverk
Summary
Denna studie presenterar ett protokoll för reversibel vävnaden clearing, immunfärgning, 3D-rendering och analys av vaskulär nätverk i placenta hos människa villi prover storleksordningen 1-2 mm3.
Abstract
Näringsämne och gas utbyte mellan mor och foster uppstår på gränssnittet för moderns intervillous blod och stora villösa välutbyggt nät som gör upp mycket av parenkymet av placenta hos människa. Distala villösa välutbyggt nät är slutstationen för fostrets blodtillförseln efter flera generationers förgrening av fartyg som sträcker sig ut från navelsträngen. Detta nätverk har en sammanhängande cellulära slida, syncytial trofoblaster barriär lagret, vilket förhindrar blandning av fostrets blod och moderns blod där det kontinuerligt badar. Förolämpningar mot integriteten i placenta välutbyggt nät, som förekommer i störningar såsom moderns diabetes, högt blodtryck och fetma, konsekvenser som förevarande allvarliga hälsorisker för foster, spädbarn och vuxna. För att bättre definiera strukturella effekterna av dessa förolämpningar, utvecklades ett protokoll för denna studie som fångar kapillär nätverksstruktur storleksordningen 1-2 mm3 vari man kan undersöka dess topologiska funktioner i dess fulla komplexitet. För att åstadkomma detta, kluster av terminal villi från moderkakan är dissekeras och lagret trofoblaster och de kapillära endothelia är immunolabeled. Dessa prover då förtydligas med en ny vävnad bort process som gör det möjligt att förvärva confocal bildstaplar till z-djup ~ 1 mm. De tredimensionella renderingarna av dessa staplar sedan bearbetas och analyseras för att generera grundläggande kapillära nätverk åtgärder såsom volym, antal kapillär grenar och kapillär gren slutpunkter, som validering av lämpligheten av detta tillvägagångssätt för kapillära nätverk karakterisering.
Introduction
Vår förståelse av utveckla moderkakan och dess patologier begränsas i stor utsträckning kan slutsatsen rumsliga relationer mellan intilliggande villi och innehöll kapillärer härrör från histologiska sektioner. I denna studie har vi tagit upp denna fråga genom att utveckla medel för att skapa tredimensionella (3D) renderingar av mänsklig placenta kapillära nätverk som är lämpliga för analyser av kapillär nätverksfunktioner (e.g. förgrening, soliditet). För att göra detta har vi kombinerat Immunofluorescerande färgning med två kommersiella vävnad clearing produkter, Visikol-1 och Visikol-2 (nedan benämnd lösning-1 och lösning-2).
Placenta hos människa är ett stort komplex av blodkärl som ligger i gränssnittet mellan moderns intervillous blod och det växande fostret. Sträcker sig ut från dess införande i koriongonadotropin plattan, grenarna navelsträngen i ett nätverk av artärer och vener som förgrena sig för att omfatta koriongonadotropin ytan med ett avancerat vaskulär nätverk. Sina syften sedan tränga ner in i inredningen eller djup av placenta disken där de genomgår flera mer förgrenade generationer och avsluta i de terminal villina och deras innehöll kapillära nätverk, platsen för utbyte av gaser, näringsämnen, och metaboliska avfall mellan fetal och maternell blod.
Förolämpningar till placenta kapillära nätverk under utveckling har varaktiga konsekvenser för hälsan hos fostret, nyfödda barnet och den framväxande vuxna 1,2,3. Med tanke på graviditetsrelaterade sjukdomar såsom missfall, intrauterin tillväxt begränsning, havandeskapsförgiftning och moderns diabetes 4,5,6 det är ett högt värde på att utveckla mätmetoder och karakterisering av placenta villösa kapillära nätverk. En stor vägspärr är att placenta vaskulär nätverk omfattar ett brett spektrum av skala. De ytan vaskulär nätverk kan vara lika stor som 4-5 mm i diameter. Terminal villösa kapillärerna är storleksordningen 10 -20 µm i diameter; moderkakan innehåller över 300 km av blodkärl 7. För närvarande finns det några lätt att använda och snabba tekniker som kan fånga dessa ytterligheter av fartyget skala. Hittills har kan endast ett litet antal villi renderas genom mikroskopi. Exempelvis Jirkovska et al. fokuserade på den placenta villus på sikt kombinera konfokalmikroskopi med seriell optiska sektioner med 1 µm mellanrum erhållits från 120 µm tjocka sektioner; inga uppgifter om antalet prover som studerade eller statistik lämnades 8. Kapillär strukturer identifierades och konturerna av villi och kapillärer var handritade, med tracings exporteras för bildanalys. Även författarna diskuterar konsekvenserna av sina resultat för ”växande villösa vaskulär nätverk”, är sådana slutsatser problematiskt när endast ”termen” (36 + vecka gestationsålder) vävnad studeras. Likaså Mayo et enl. och Pearce et al. förlitat sig på vävnad i samma ålder, för deras simuleringar av blod och syretillförseln överföring, men deras analyser var begränsade till endast några valperiod, terminal villi 9,10 . Stereology har också använts för att studera strukturen av villösa fartyg. Men igen, fokus i allmänhet varit på senare graviditeter leverera levande födda spädbarn med en eller flera graviditet komplikationer 11,12.
Tills nyligen, begränsades konfokalmikroskopi till imaging att vävnad djupet av 100-200 µm för absorption av magnetiseringen och utsläpp av fluorescensen av den överliggande vävnad 13 . Om vävnad clearing och 3D histologi allmänt har beskrivits i litteraturen och det finns är många metoder för vävnaden rensar många olämpliga för användning med vävnader i allmänhet, eftersom de oåterkalleligt skada cellernas morfologi genom övervätskning proteiner eller borttagning av lipider. Det går därför inte att validera att dessa resultat är vägledande i vävnaden själv och inte artefakter från bearbetning medan vår vävnad bort process är en reversibel teknik som kan verifieras mot traditionella histologi. Vävnaden clearing innebär i allmänhet en av tre huvudinriktningar: 1) enhetliga matchning av brytningsindex (RI) vävnad komponenter genom nedsänkning i RI matchande lösningar, som tar bort den kumulativa ljusspridning som orsakade från lensing på grund av kontinuerlig fluktuationer i låg RI (cytosol) och hög RI (protein/lipider) beståndsdelar. (2) ta bort lipid komponenter genom inbäddning i hydrogel och utnyttja elektrofores/diffusion för att ta bort lipid komponenter; (3) expansion/denaturering av proteinstruktur att tillåta ökad penetration av lösningsmedel för att främja enhetlighet i RI 13. Medan dessa synsätt kan återge vävnader transparent och möjliggöra 3D representationer av biomarkörer som ska genereras, är dessa 3D representationer av tveksamt kliniskt värde eftersom det är utmanande att avgöra om dessa bilder är vägledande för vävnad boenden eller av vävnad bort process. Däremot, eftersom vår vävnad clearing är reversibel kan standarden histologiska och/eller immunohistokemi tillämpas på samma vävnad att utvärdera huruvida förändringarna är kliniskt signifikanta.
Denna studie presenterar en analys av 47 distala villösa produktproverna sammanlagt 23 kliniskt normal och electively avbrutna graviditeter mellan 9-23 slutförda veckor dräktighet och två fullgången normala leveranser. Immunofluorescens märkning av trofoblaster och endothelia har möjliggjort en kvantitativ och automatiserad analys av förändringar i de villösa vaskulär nätverk och deras komplexitet.
Med detta protokoll, vi isolerade och analyserat terminal villi och deras kapillära nätverk i skala inte möjligt tidigare. Detta tillvägagångssätt, när de appliceras på villösa och kapillära nätverksutveckling över dräktigheten kommer att identifiera de egenskaper som är grunden för födelsen av ett friskt barn. När tillämpas på studier av komplicerade graviditeter, kommer det också att klargöra när och hur de placenta patologier ändra villösa träden och de kapillära nätverk de slida, och hur dessa påverkar fostrets välbefinnande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den institutionella Review Board godkänd insamling av placenta villösa vävnader för formalin fixering från electively avbrutna graviditeter. Innan förfarandena utfördes, en kort genomgång av journalen noterade moderns ålder, paritet, och bekräftade avsaknad av eventuella underliggande medicinska (t.ex., hypertoni, diabetes och lupus) eller fostrets (strukturell eller kromosomala anomalier, onormal tillväxt) utfördes. Datablad och eventuella insamlade exemplaren var märkt endast med en studie-ID. Så…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av New York State kontoret för personer med utvecklingsstörning och placenta Analytics LLC, New Rochelle, NY.
Materials
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, 47-53 (2016).
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
