そのネイティブなバインディング先のコンテキストと生物物理特性 x 線蛍光と radiometal の吸収を提示してその基板の内容でペリプラズム遷移金属シャペロンの抽出のためのプロトコル。
我々 は細胞質から細菌ペリプラズムの分離のためのスケーラブルな方法を示します。生物物理学的特性とペリプラズム、細胞質コンパートメント間測定基板搬送を目的としてペリプラズム蛋白質を浄化するために用いられます。慎重に制限するペリプラズム、細胞質から区切られた時間と、実験者は興味の蛋白質を抽出し、コンパートメント間繰越汚染なし基板に対して個別に各区画を分析できます。分別から抽出されたタンパク質は、三次元構造の決定または基質結合プロファイルをさらに分析できます。また、別の細菌のコンパートメントの間で合計のパーセント吸収としてトレーサーの分布を決定する (およびそれ故に金属の輸送) するラジオト レーサーの孵化後このメソッドを実行できます。実験、検査は生理基板と artefactual 基板、mismetallation によって引き起こされるものなどの区別を助けることができます。
蛍光 x 線は、成長条件、精製条件および/または結晶化条件の製品として金属混入で生じる変化を測定し同様、サンプル、金属混入の有無を発見する使用ことができます。蛍光 x 線も異常 x 線散乱データの収集に使用する最高の金属エネルギー吸収ピークを決定する使用ことができますそれぞれの金属の豊かさの指標を提供します。Radiometal の取り込みは、蛍光 x 線検出基板の生理的特性を検証するだけでなく、新規基板の検出をサポートする方法として使用できます。
グラム陰性菌は、遷移金属原子の細胞質のプールを増加し、内膜に金属の転流を軽減する内膜 ABC (ATP 結合カセット) 輸入者によって補充されます。ペリプラズム クラスター A-1 基質結合タンパク質 (SBPs) は、金属原子を直接バインドし、同種の ABC の輸入業者の1にそれらを提供するペリプラズムを介してそれらをフェリー シャペロンのグループを作成します。キレート金属 (クラスター A-2)、(クラスター B と D-1)、炭水化物、アミノ酸などの基質の輸送に専念して SBPs の他のクラスター (クラスター B、C、F-2 と F-4);それにもかかわらず、関係なく、基板、SBPs c クランプ倍の進化的に保存されている2に従ってください。SBP 基板搬送機構一般化された提案には、一連のハエトリグサ3のようにこじつけ c クランプが含まれています。一般に、これら SBPs の研究は実験4のための蛋白質の apo (メタルフリー) フォームを生成するの難しさによって制限されますが、クラスター A-1 SBPs はホロ (金属-バインド) 形式で浄化します。までに、apo を研究するための戦略クラスター A-1 SBPs は変異誘発・透析・ エチレンジアミン酸 (EDTA) キレート剤5,6,7,8部分変性に限られています。,9,10,11. これらの実験からの構造データは、クラスター A-1 SBPs がハエトリグサ メカニズムに正確に従っていないことを示唆しています。Apo クラスター A-1 SBPs生体内の生理学的な結合パートナーを使用しての製造方法は、文献から現在行方不明します。
YfeA、ペストからクラスター A-1 SBP、YfeBCDE ABC その生理学的な同種の輸入業者との対話を通じて apo 形式に変換されたペストの病原体を浄化するためにセル分別を使用して最初の時間を示すセル。YfeA は、エネルギー分散型 x 線分光 (EDS)、として知られている蛍光 x 線による apo フォームを紹介します。また、外側の膜の間で金属の取り込みと内膜の間で金属のインポートと区別するために機密性の高い放射性金属吸収研究細胞分画を組み合わせることによって YfeBCDE 機能を示します。このような技術として誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS) または原子吸光分析 (原子吸光) の pg/L 金属、検出限界よりはるかに低い量の検出のため放射性トレーサーの使用が可能します。検討されているシステムの最小限の摂動が可能になります。さらに、大量のサンプル、追加の後処理とターンアラウンド時間が長く、ラジオト レーサーの試金のために典型的ではない頻繁に記載されている従来の方法が必要です。したがって、するラジオト レーサーを使用して金属分布と細胞内取り込みを監視するための便利で簡単なメソッドを提供します。クラスター A-1 SBP はこのメソッドを使用して生成される apo apo タンパク質を生成するために使用する現在の慣行から構造観察をエコーでしょうかどうか決定するが残っています。
セル分別は分離12でその内容を具体的にプロービングの暗黙の目的のための細胞コンパートメントを分離するための確立された方法です。セル分別は、細胞周期の間に分子の場所を確認または特定区画13の活動を測定する使用されます。たとえば、金属輸送活動は、金属基板の細胞コンパートメントをプロービングによって試金することができます。セル分別の統合により、区別と外側の膜の間で金属の取り込みと内膜を介した金属転送と比較できます。これらのプロセスは、その後は時間をかけて測定順番できます。蛋白質の浄化、セル換散の最も一般的な方法と非水溶性成分の水溶性成分の分離が機械的破壊 (すなわち、粉砕、ブレンド)、高圧均質化 (すなわち、フランス圧力セル出版、セル撹乱物質) と超音波の周波数 (すなわち。、超音波)14。細胞を溶解する超音波の周波数を使用は、一般的に小さなボリュームに最適ただし、超音波は、タンパク質を変性することが過度の熱を生成する知られています。過度の熱を生成する避けるために、超音波の周波数はシーケンシャルの短いバーストは、時間がかかることが誤って小さな断片に DNA 分子を低下でき、通常に適用されます。また、複数の高価な超音波プローブと、各プローブには処理することができますサンプル ボリュームの限られた範囲にことがあります分取および分析実験のため必要。セル換散の中に溶解する前にフランス圧力セル プレス部品を低温または寒い部屋など寒冷環境下で細胞攪乱を動作によって過度の熱を生成する細胞を溶解する高圧の使用を回避できます。超音波プローブのようなフランス圧力セル プレス部品の複数のセットはサンプル ボリュームの広い範囲を処理する購入する必要があります。アセンブリは、簡単に接続しますが、動作し、きれいな、厄介なフランス圧力セル出版は移動する重いことができ、密なサンプルから目詰まりしやすい。細胞を溶解する超音波の周波数および高圧システムを使用する利点は、高回収、最小限の交差汚染と複数のサンプルを処理する能力と、調節可能なせん断力、換散の最適化に対応できます。サンプルの種類の広い範囲。超音波の周波数を調整することによって最適化することができます発生するバースト、ピストン圧力ポンド平方インチ (psi)、マスコミを通じてパス数あたりの期間。細胞を溶解する機械の中断のセル換散のため技術的には最も簡単な少なくとも高価な戦略があります。機械的破壊サンプル回復に課題を提示することができます、複数のサンプルの処理には適していません。機械的破壊サンプルより高圧や超音波の周波数よりも高スループットではありません、非能率的な換散になりやすいです。機械的破壊、高圧均質化と超音波周波数の重要な実験的制限は全体の細胞構造の手に負えない中断すべて水溶液中の細胞成分の混合溶解後、一緒に。さらに、すべての細胞コンパートメントを同じ時に中断しません。したがって、早く溶解するコンパートメントの内容は遅く溶解コンパートメントの内容よりも長く継続的な破壊的な影響されることが。セル分別分離でき、安価な技術的に簡単に、効率的なコンパートメントに基づくセルの内容の高価な機器と厳しく、破壊的な力をサンプルの露出のための必要性を回避しながら。
、SBP の場合インポートされた基板はアポ蛋白質潜在的に再導入し、下流クロマトグラフィーまたはその他の浄化技術の前に、換散の中にホロ タンパク質を再生します。溶解中に EDTA キレート剤の封入は、蛋白質の浄化の第一歩として金属アフィニ ティーが可能な EDTA はクロマトグラフィー樹脂から金属を除去し、15を結合蛋白質を防ぐため、追加の障害を示します。シンプルで安価なソリューションは、差動遠心分離および共通の研究用試薬は、慎重に十分な蛋白質の機能解析を抽出する調査官を有効に浸透圧刺激による細胞分画です。高浸透圧刺激の分別は、別の細胞コンパートメントに浸透圧の 2 段階変化を利用しています。まず、高張バッファーにより細胞水の葉各セルと第二に、低張性のバッファーが膨らむように水を再入力の各セルにセルに crenate。外側の膜細胞がどのくらい膨らむを精緻に制御、(のために入って来る水から浸透圧の蓄積)、選択的に分離することができますこのようにバッファーにその内容を空にします。内側の粘膜の保全により、細胞質の内容スフェロプ ラストで保持される遠心分離でペリプラズム内容から簡単に区切られます。
YfeA は、polyspecific SBP 鉄, マンガンおよび亜鉛原子16をバインドすることが可能です。株式会社金属の相対的な割合成長、中に金属の補充によって変わることが、よう x 線蛍光アッセイ アルゴンヌ国立研究所の高度な光子源16で利用できます。蛍光 x 線により短時間を必要とせず金属の広いアセンブリをプロファイリングする捜査官大または回折品質結晶タンパク質沈殿物またはタンパク質溶液からデータを収集することができますも。
蛍光 x 線すぐに明らかにできる予期しない結果といった、この場合、亜鉛をされているプライマリ YfeA 基板と、文書化された生理学的基質鉄やマンガンではない16。X 線散乱データを収集する前に使用する蛍光 x 線は異常 x 線散乱データの収集に使用する金属エネルギー エッジなど、実験的なデザインの調査官を知らせることができます。金属、蛍光 x 線の相対的な豊かさはまた金属が存在しないかどうかを判断できますを決定するようにちょうど有用なサンプル ホロ タンパク質からアポ蛋白質を含んでいると推定金属結晶を分離する迅速な方法を提供する信号強度時間のかかるデータ処理の必要性なし信号が強い金属サンプルを識別、多波長異常分散 (MAD) スキャンで異常 x 線散乱データの収集に使用する正確な波長を決定できます。
この詳細なプロトコルは、新しい実験者正常にセル分別を行い総金属含有量をプロファイル化し金属結合タンパク質の研究を進める放射光ビームライン ハードウェアの効果的な利用を支援するものです。
セル分別は細胞内コンパートメントの内容を具体的にプロービングのための便利なツールを金属原子など小さな分子だけでなく、タンパク質などの高分子を抽出するための有用なツールとして使用できます。それはそのセル分別は、絶対的な方法と混合/再懸濁、培養温度、培養時間に細心の注意なしでミスをすることができますは注目に値するです。最小限の膜溶解およびこうして無視分別結果不完全混合、室温で分別が細胞質の内容のペリプラズム画分の汚染の結果として両方の膜の急速な溶解を引き起こすことができ、拡張インキュベーション時間は過剰な換散そしてこうして分数汚染にも します。(内膜を維持する) しながら効率的かつ比較的完全な外膜の溶解を達成するための合理的な妥協は、低張性分別バッファーに氷の上 20 分インキュベーションです。別の考慮事項は、揺れまたは渦流による過酷な抽出が蛋白質の集合の原因など抽出物の品質を妥協できる抽出方法です。ヘラ、反転または下流解析のための高品質の素材を維持するためにピペットで吸引によってなど、穏やかに混合することをお勧めします。精製分取セル分別は変数を効率化図 1によって証明されるように発生します。1 つの実験では、YfeA は、抽出されたペリプラズム コンテンツ (図 1) の 8% として始まったペリプラズム コンテンツ (図 1) の 17% として, 別の実験で YfeA を始めた。これらの違いが可変式の条件 (成長媒体に EDTA が Yfe のプロモーターの毛皮規制などの飢餓のメカニズムによって調整される遺伝子の発現を高めることができますを追加) などのいくつかの理由から発生する可能性の繰り返された使用冷凍永久的な在庫とヒューマン エラー。インキュベーション時間を調整するのではなく、スケール アップ準備することをお勧めします。ペリプラズム画分精製を線形勾配溶出陰イオン交換クロマトグラフィーによるステップを含むように推奨します。ステップのグラジエント溶出戦略移動相組成で使用して離散と急激な変化は、(すなわち。、0 mM の NaCl、50 mM NaCl、 150 mM の NaCl など。)。線形グラデーションの溶出は携帯で漸進的な変更を使用して溶出戦略相組成(すなわち、 0 mM 塩化ナトリウム、塩化ナトリウム、5 mM 10 mM の NaCl など)。ステップのグラデーションは静止した段階の異なる親和性を持つ分子を分割するのに役立ち、線形グラジエントは静止した段階のため同様の親和性を持つ分子を分割するのに役立ちます。ユニークなタンパク質種で豊富である細胞コンパートメントから人工精製タグのない (固定相への親和性を高める) に蛋白質を浄化、場合可能性があります noninterest の蛋白質を分けるのに線形勾配溶出お勧め興味の蛋白質として固定相に似たような親和性があります。その内因性から YfeA を表現する文化の各リットルから精製した apo YfeA の 1-2 mg の利回りを期待する一般的に、 Y. ペストプロモーター。
蛍光 x 線は、調査担当者が、迅速に、サンプルでは金属コンテンツを判断し、それ以外の場合、知られているとありますが予想外の金属混入について調査官に知らせることができる手法です。EDTA は、緩く関連付けられているまたは無料の金属を削除する高張分別バッファーに含まれる、ペリプラズム画分から派生した YfeA は、いくつかのホロの蛋白質を含めることができます。金属輸送は、動的なプロセスは、おそらくホロのタンパク質含有量は、その貨物 YfeBCDE に寄付しなかったまだ YfeA から起きる。蛍光 x 線だけ総金属含有量を測定し、金属が結晶格子を命じたかどうか、または特にタンパク質と結合を示しません注目に値するです。金属は結晶格子を命じたおよび蛋白質分子に具体的にバインドされているかどうかの決定、x 線散乱データの収集と処理が必要です。それにもかかわらず、蛍光 x 線金属汚染や残留ホロ蛋白質の統合のクイック サンプル評価できます。放射時間は限られて、常にすべてのサンプルに x 線散乱データを収集するための戦略を考案する時間がない、従って蛍光 x 線は多くの水晶をスクリーニングおよびサンプル x 線の優先順位を付けるのための貴重な技術散乱データを収集する必要があります。さらに、蛍光 x 線は、x 線を回折がないサンプルからデータを収集できます。X 線蛍光データの収集、時に信号することができます非常に弱いと uninformative 結果のスペクトル。蛍光 x 線や狂牛病のスキャンのいずれかは、信号の強度を改善するために露光時間を増やすことや、x 線ビームの減衰を減少を検討してください。蛍光 x 線、放射線損傷を最小限に抑えるため、データの品質を向上させるためにスキャン MAD に使われていたものよりもサンプルの別の部分に x 線散乱データを収集するために x 線散乱データを収集するためのサンプルが判明したら、お勧めコレクション、異常信号の減少のための潜在性を最小限に抑える。
放射性トレーサーの検出はナノモル数量材料以下を必要とし、分子追跡エージェントとしてこれらのトレーサーの使用細胞プロセスをプロービングのシンプルかつ機密性の高いメソッドを提供します。上記 radiometal のアッセイは、金属マグネシュウムの吸収率と同様、細胞コンパートメント全体に分布を決定する使用できます。確かに、時間の各データ ポイント必要 40 分分別;しかし、時間の各ポイントに達すると、細胞はすぐにペレット、高い塩バッファー (図 5の手順 1) で培養します。後 (図 5、手順 3) メディア, 高破棄された salt のバッファー (図 5の手順 1)、ペリプラズム、細胞質画分の Radiometal 測定を示す高塩バッファー インキュベーションは、正常にすべてを削除します残りの時間ポイントに達した後初期の遠心分離の後に残っている金属の関連付けられていない自由。高塩バッファー内のインキュベーションも追加残りの関連付けられていない金属の自由を削除した後、初期の遠心分離は関連付けられていない無料金属・遠心分離のほとんど (80% まで) を削除します。40 分分別中金属輸送の影響を大幅には、任意の残留関連付けられていない無料の金属は想定されていません。細胞内の金属輸送上 40 分分別の影響は、慎重なデータ解釈のための別の考慮事項です。事実上全体の分別のプロトコル手順の間 30 秒遠心から離れて、氷の上に発生します。金属の輸送時間コース実験金属輸送20,21,22; を放棄 4 ° C で細胞を維持することが示されています。したがって、氷の上実験が行われ、40 分分別、細胞質のペリプラズムにおける金属濃度を大幅増強されないため金属の濃度が予想されるセルがあった時点の代表最初 centrifugalized。
別の細胞コンパートメントにおける相対的な吸収量の定量はさらにメカニズムの分子の詳細を調査する研究者を有効にすると同様 XFS データを知らせる、基板の生理的特性を裏付けるを助けることができます。たとえば、radiometal 吸収実験する遺伝的変異の追加機能の残基を強化する直接法またはに関わる分子群の基質輸送。Radiometal 吸収実験と解析の利点は、迅速、高スループット、高再現性、成長の状態および遺伝的構造の比較実験の並列化に含まれます。
The authors have nothing to disclose.
データは、GM/CA@APS の全部または一部 (ACB-12002) 国立がん研究所、国立科学研究所の一般医療 (AGM-12006) から連邦政府の資金で賄われているでも収集されました。この研究に使用するリソースの高度な光子ソース (AP) の科学ユーザー施設米国エネルギー省 (DOE) オフィス運営契約号下アルゴンヌ国立研究所によって雌しか科学局デ-AC02-06CH11357。光子の高度なソースの使用は、米国エネルギー省、科学局、オフィスの基本的なエネルギー科学研究科契約番号の下に支えられW-31-109-Eng-38。
質量分析の UAB の包括的がんセンター – 質量分析法/プロテオミクス共有施設 (P30CA13148-38) を認めることを思います。
C.D.R. は、アラバマ大学バーミンガムのオフィスの多様性、公平および介在物からの助成金によって支えられました。L.L.R. は、アラバマ大学バーミンガム校の放射線によって支えられました。エネルギー省科学局同位体プログラム サポート52Mn 生産し下 A.V.F.M. は DESC0015773 を付与します。
Chemicals | |||
Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cells | |||
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |